2009,29(2) 张廷宇等 : 猪胞浆内单精子注射研究进展 109 化物的损害, 促进 GSH 合成或减少其降解, 都能提高卵 [8] 母细胞的成熟效果, 促进胚胎的发育,Kobayashi 等发现, 在成熟液中分别添加 100μmol/L 的 Cys 与 100μΜ 的 β 巯基乙醇对 ICS

Size: px

Start display at page:

Download "2009,29(2) 张廷宇等 : 猪胞浆内单精子注射研究进展 109 化物的损害, 促进 GSH 合成或减少其降解, 都能提高卵 [8] 母细胞的成熟效果, 促进胚胎的发育,Kobayashi 等发现, 在成熟液中分别添加 100μmol/L 的 Cys 与 100μΜ 的 β 巯基乙醇对 ICS"

綦弘
5 years ago
Views:

1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(1):108~113 猪胞浆内单精子注射研究进展张廷宇马恒东 ( 四川农业大学动物科技学院雅安 ) 摘要胞浆内单精子注射将体外受精和显微操作技术相结合, 已成功应用于哺乳动物受精机理研究, 家畜性控胚胎生产, 动物转基因等领域综述了猪胞浆内单精子注射的主要影响因素, 包括卵母细胞体外成熟和预处理精子的选择和处理注射卵的人工激活以及操作技术的改进, 为进一步提高猪胞浆内单精子注射的效率以及该技术的应用提供参考关键词猪胞浆内单精子注射预处理激活中图分类号 Q819 胞浆内单精子注射 (intracytoplasmic sperm injection,icsi), 是借助显微操作系统, 将单一精子注射入成熟卵母细胞胞浆内, 使其受精的技术它能使任意单一精子不经自然选择而完成受精对探讨精卵识别精卵相互激活的机制 ; 观测受精效应 ; 确定受精时刻 ; 控制原核极性和胚胎的质量具有重要理论和实践意义由于 ICSI 绕过了透明带, 消除了种属特异性, 因此可以用来探测异种受精过程中精卵互作的某些机制, 并最终运用于种间生殖 1 猪 ICSI 技术的发展概况 1988 年,Hosoi 等首次获得哺乳动物兔的 ICSI 后代后, 人牛小鼠和绵羊等主要哺乳动物的 ICSI 后代相继出生猪的 ICSI 研究起步较晚, 最早 Hosoi 等将猪新鲜精子注入猪卵母细胞胞浆后, 能够形成原核此后许多学者也对猪 ICSI 做了大量研究, 但直到 2000 年, Martin [1] [2] 和 Kolbe 等才相继利用体内成熟的卵母细胞 [3] 经 ICSI 获得存活的仔猪 2001 年 Lai 等首次将 ICSI 与精子载体转基因 (SMGT) 技术相结合, 利用转染了外源基因的精子注射入体外成熟 (IVM) 卵母细胞中, 并获得成功, 为利用 IVM 卵进行体外生产转基因猪提供 [4] 了新的技术模型 2003 年,Probst 等利用流式细胞仪筛选出 Y 染色体精子, 通过 ICSI 产下 13 头雄性仔猪, 这是首次利用猪类选精子 ICSI 生产性控后代收稿日期 : 修回日期 : 通讯作者, 电子信箱 :mahd@sicau.edu.cn [5] 2004 年,Kwon 等首次将猪冻干精子运用于 ICSI, 进一步拓展了 ICSI 的应用范围国内关于猪 ICSI 的报 [6] 道较少, 刘成军等研究 ICSI 转基因时发现, 显微注射台温度为 30 比 38.5 更利于猪 ICSI 转基因效率 ; 并且将注射卵电激活后再利用 6 dimethylaminopurine(6 DMAP) 处理, 能显著提高转基因率和囊胚率猪 ICSI 起步晚, 尚停留在技术完善和理论探讨方面, 但其研究对畜牧业的发展有着巨大的促进作用 ; 对哺乳动物胚胎工程的研究更具有重要价值, 当前论述此问题很有实际意义目前, 如何提高猪 ICSI 的体外生产效率是该领域的研究重点 ICS 技术环节较多, 每一环节都会对 ICSI 的结果产生直接影响, 特别是猪卵母细胞体外成熟精子预处理显微注射的辅助手段注射卵激活等关键步骤 2 猪 ICSI 的关键步骤 2.1 猪卵母细胞 IVM 及预处理猪卵母细胞 IVM 由屠宰场取得卵巢获取卵母细胞, 为 ICSI 的研究及生产实践提供丰富的原料, 因此猪卵母细胞 IVM 成为 ICSI 的关键步骤研究表明, 在体外成熟培养液中添加激素生长因子卵泡液以及小分子量硫化物对卵母细胞体外成熟及胚胎的后期发育有良好的促进作用与传统添加 10IU/mlPMSG hcg 相比, 在 IVM 液中添加 0.1IU/ml 重组人 LH 和 FSH 有着相同的促进卵母细胞成熟及提高 ICSI 胚胎发育的效果 [7] 谷胱甘肽(GSH) 能保护卵母细胞免受氧

2 2009,29(2) 张廷宇等 : 猪胞浆内单精子注射研究进展 109 化物的损害, 促进 GSH 合成或减少其降解, 都能提高卵 [8] 母细胞的成熟效果, 促进胚胎的发育,Kobayashi 等发现, 在成熟液中分别添加 100μmol/L 的 Cys 与 100μΜ 的 β 巯基乙醇对 ICSI 后的囊胚率显著提高, 且前者效果略好于后者另外, 在 IVM 液中添加蛋白质合成抑制剂或蛋白激酶抑制剂, 如放线菌酮 (CHX) 丁内酯 I (butyrolactonei) 等, 可通过抑制成熟促进因子 (MPF) 活性来阻止 GVBD 的发生, 将猪卵母细胞抑制在 GV 期, 从而达到核质成熟同期化的目的 [9], 提高 ICSI 的效 [10] 率 García Roseló 等在 IVM 液中添加周期依赖蛋白激酶 (cyclin dependent kinases,cdk) 抑制剂 Roscovitine, 虽然经 ICSI 后, 原核形成率与不添加差异不显著, 但是注射卵后期发育能力显著优于后者 ; 并且, 在这样成熟液培养 36h 比培养 44h 更能获得较高的受精率尽管 IVM 已经取得了许多不错的效果, 但成熟质量及后期发育能力上, 仍不及体内, 因此如何建立更好的成熟方案, 充分利用屠宰场丰富的资源, 是摆在研究者面前诱人而富有挑战性的课题猪成熟卵的预处理由于猪卵母胞质脂滴含量丰富, 注射前, 通过离心将成熟的卵母细胞脂滴甩向一侧, 使胞质变透明, 便于操作, 减少了操作液过多注入对胚胎发育影响首例 ICSI 猪便使用了此操作 [1] 虽然脂质的发育或退化机制尚不清楚, 但可以确定的是它为受精胚胎完成早期阶段发育提供能量, 均匀分布的脂质能对雄原核 (MPN) 的形成产生积极作用 [11], 所以离心可能会导致 MPN 形成滞后, 对受精卵的发育造成负面影响 [12] 2.2 精子的选择与处理精子的选择 ICSI 使用的精子原则上没有限制, 可以是鲜精冻精附睾精子甚至球形精细胞有人认为冻融造成的膜损伤有利于猪精子释放其生成的卵细胞激活因子 (SOAF), 从而激活卵子并促进胚胎发育 [13] [14] Kurome 等研究发现, 冷冻精子比非冷冻精子更适合于 ICSI SMGT; 即使人为去除非冷冻精子的顶体, 注射后囊胚率和外源基因的表达效率仍然显著低于冷冻精子但有的研究者持相反意见, 由于细胞骨架由微管和微丝组成, 包括猪在内大多数动物的卵子中心体在发生过程中丢失, 受精卵微管的组织重任由精子的中心粒担当深低温冷冻可能会损伤精子中心粒, 影响受精卵的第一次有丝分裂, 导致 ICSI 受精失败, 卵裂率降低 [15] 另外深低温冷冻也会导致猪精子 DNA 断裂, 影响受精和卵裂 [11] [1] [2] 虽然冻精与鲜精都获得了猪 ICSI 后代, 并且精子表型不反映其基因型, 对 ICSI 而言, 注射精子不管形态是否正常或死亡, 只要其基因组完整就能参与胚胎发育, 产生正常后代, 但是选择鲜精还是冻精仍存在争议随着配子深低温冷藏研究的不断深入, 更经济更便捷的冻精必将成为猪 ICSI 的主要供体来源最近, 利用双折射技术挑选精子, 已经开始运用在人的 ICSI 研究中 [16] 该方法通过正常精子核蛋白纤维产生的双折射, 挑选核结构完整的精子进行 ICSI, 虽然仅仅是一种尝试, 但为精子的筛选提供了新的方向, 随着该技术的发展, 有望运用到猪及其他动物精子的挑选研究及 ICSI 的应用中冻干精子的使用冻干精子可在常温或者 4 下长时间保存, 不需要特殊的保存设备和运输设备, 而且使用较为方便, 对优质动物种质资源的保存和繁育有着重要的应用实践价值由于冻干后的精子没有活动能力, 因此必须借助 ICSI 才能完成受精但目前利用冻干精子经 ICSI 只获得了小鼠兔子和老鼠的后代 [5] Kwon 等注射猪冻干精子, 虽然在雄原核 (MPN) 形成率上与注射鲜精没有显著差异, 但没有获得囊胚, 这可 [17] 能是由于冻干精子 DNA 断裂造成的,Nakai 等在冻干缓冲液中添加螯合剂, 以减少精子 DNA 的断裂, 虽然移植 ICSI 胚胎后流产, 但为冻干精子 ICSI 技术的生产应用奠定了坚实的基础精子的预处理原本, 获能精子应从卵子处得到信号, 释放顶体内的水解酶类, 使得精子穿越透明带, 并将释放的酶类保留在卵子质膜上, 精子混合入卵母细胞质中, 顶体内膜散失, 精子核周物质暴露在卵子中, 从而释放该区域的 SOAF 激发卵内 Ca 2+ 振荡, 引发随后的发育 [18], 因此 ICSI 前应对精子进行预处理使其得以准备用异硫氰酸荧光素标记的花生凝集素 (FITC PNA) 标记法发现, 未发生顶体反应的猪精子有精核形成滞后的现象 [19] [20] 于是 Morozumi 等使用血溶性磷酸酯 (LysoPC) 水解膜磷脂从而去除精子质膜及顶体, 使得 ICSI 的胚胎发育得到明显提高 Morozumi 和 Yanagimachi [21] 将 3 个以上顶体完整的小鼠精子注射到卵中, 造成卵子畸变并死亡, 死亡数量与注射精子的数量呈正相关, 而去除顶体不发生此现象 ; 又将仓鼠猪和牛有完整顶体的单一精子分别注射到小鼠卵中, 也造成卵子畸变并死亡, 同样去除顶体不发生此现象, 说明顶体中的水解酶会对胚胎发育产生负面影响, 这种影响还存在物种顶体大小的差别, 从另一角度证明了去除顶体的积极作用将精子在一定浓度的孕酮

3 110 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 孵育 A23187 等中孵育也可以达到诱使顶体反应去除 [22] 精子顶体的效果 Katayama 等把 /ml 的精子添加到浓度为 1mg/ml 孕酮中, 在培养箱中孵育 12h 或 [23] 15h,ICSI 后, 能明显提高受精率 García Roselo 等在优化精子预处理的研究中发现,1μmol/LA23187 诱发活精子发生顶体反应的比率远高于 5μmol/L, 但 MPN 形成以及后期胚胎发育上并没有显著差异猪 ICSI 失败的主要原因之一就是精核不易解聚 [12], 二硫苏糖醇 (DTT) 是一种分解二硫键 (S S) 的化学试剂, 有助于清除精子鱼精蛋白上的 S S, 促使精核解聚, 使组蛋白重新取代鱼精蛋白, 激活精子染色质引 [24] 发原核 DNA 复制 Watanabe 等细致地研究了 DTT 处理时间对 ICSI 胚胎发育的影响, 发现精子在添加了 5μmol/LDTT 的 PBS 中孵育 30min 和 60min 后经 ICSI 受精率最高, 其中 30min 组的囊胚率显著高于其他组但是, 随着 DTT 浓度的增加, 胚胎的质量有下降的趋势, 说明 DTT 在促进精核解聚和雄原核形成的同时, 对精子和注射卵具有一定的毒性, 影响了胚胎的后期发育如何在 ICSI 中合理利用 DTT 来提高精核解聚的效率, 同时减少其他对注射卵早期发育的不利影响值得进一步探讨 2.3 显微注射由于 MI 期卵母细胞的纺锤体位于卵胞浆外周与第一极体 (PbI) 紧邻, 为避免穿刺损伤纺锤体, 通常, 将 PbI 置于 12 点或 6 点钟位置, 从 3 点方向进针但卵母细胞刚排出 PbI 时, 极体可能和纺锤体毗邻, 但随时间的推移 PbI 与纺锤体会形成一个夹角, 所以不能根据 [25] PbI 的位置来准确预测纺锤体的位置 Cohen 等建议利用 Spindle view 成像系统来辅助显微注射, 但是也指出 Spindle view 虽能准确地指示卵母细胞的成熟状 [26] 况, 却不能指示出 PbI 的位置后来, 杨宇等在利用 Spindle view 观察成熟培养 42~48h 猪卵母细胞纺锤体影像与极体相对位置的研究中发现,44 时龄卵纺锤体与 PbI 夹角在 5 以内的比例达 95.5%, 以极体作为纺锤体位置标识是可行的, 并且纺锤体结构紧凑成像明显的猪卵子发育能力较好因此利用 Spindle view 辅助观察纺锤体与极体位置, 更能提高显微注射的准确率和效率, 减少对卵母细胞的机械损伤, 还能对卵的质量进行监控 Piezo actuated 装置最早用于小鼠 ICSI 和体细胞核移植 (SCNT) 的研究, 其将电压效应所产生的脉冲经由显微注射针头直接作用于欲注射的细胞表面, 可轻易地将卵穿刺, 使细胞因显微操作造成的伤害降至最低, [27] 从而提高胚胎存活率 2000 年 Onishi 等运用 piezo [28] 成功生产克隆猪 Katayama 等利用 piezo 辅助猪精子的显微注射时发现, 利用 piezo 制动精子时, 高脉冲更有利于精核解聚, 提高 MPN 形成率如今 piezo 已广泛运用于哺乳动物配子干细胞和胚胎工程的研究以及转基因动物的生产 [29] ; 最近,piezo 也已运用到哺乳动物受精卵 RNA 干扰的研究中 [30] 2.4 注射卵的激活预处理精子, 有助于激活卵子, 但目前预处理条件还不完善, 注入精子并不一定能完成受精, 特别是猪牛等家畜因此往往需要对注射后的卵进行人工激活, 以求 MPN 与雌原核 (FPN) 形成同步, 缩短注射到卵裂的时间, 促进胚胎发育目前常用的激活方式有电脉冲 (EA) 以及 A23187 CHX 6 DMAP 乙醇等化学激活剂 [12] Lee 等发现,ICSI 后经 EA 处理能显著增加囊胚数量,EA EA+CHX A23187 A23187+CHX4 种激活方式对于卵裂以及囊胚形成没有差异, 而且雌雄原核的发育并不能通过 CHX 抑制蛋白合成来实现 ; 他进一步观察发现, 虽然 4 种激活方式都能得到较高的囊胚率, 但有些卵裂的细胞中只有 FPN, 因此认为猪 ICSI 失败的一个主要的原因是 MPN 形成失败, 激活处理虽有利于 MPN 的形成, 但是也增加了孤雌胚胎发育率为避免化学物质处理对 PbI 排出的抑制作用, 减少二倍 [31] FPN 对胚胎发育的限制,Tian 等将猪的 ICSI 卵在激活后间隔一段时间, 待第二极体排出后再采用化学药 [32] 物处理, 从而保证 ICSI 获得正常二倍体胚胎 Lu 等首次提出受精中原核形成的机制, 受精卵卵质中丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 的失活与雄原核的形成一致, [33] 人为激活 MAPK 导致雄原核消失于是 Ito 等利用此原理, 先使用 A23187 激活处理之后, 再以佛波酯 (PMA) 延迟 MAPK 的失活, 待卵子排出 PbI 后, 再形成单倍原核, 从而保证 ICSI 后能形成正常二倍体 ( 雌雄原核各一 ) 胚胎 ICSI 卵的人工激活已获得了许多较为理想的模式, 但仍需要大量的试验进一步优化 2.5 其他技术改进 [34] Yong 等发明了一种新的操作技术, 其拉针后将端部弯成 30 左右的注射针尖插入固定针管口, 利用管口的角度将注射针尖折断, 形成一个 3~4μm 管径 ; 将精子洗涤离心, 挑取小块精子沉淀置于操作液中, 将注射针尖移至液滴边缘, 利用负压将游到液滴边缘精子

4 2009,29(2) 张廷宇等 : 猪胞浆内单精子注射研究进展 111 吸住, 精子刚好以赤道段卡在管口, 再进行注射, 利用穿刺时卵膜对精子的挤压, 使得针尖残留的小齿损伤精子头部质膜, 利于精子释放 SOAF, 从而激活卵子提高受精率和囊胚率 Yong 进一步研究发现, 使用这种 [35] 方法精子既不用 DTT 等预处理也不需注射后人工激活 [36], 还能有与这些处理方式相同的结果不过到目前为止, 还没有其他研究者使用 Yong 的方法进行 ICSI 操作的报道, 这种方法的可行性仍需要进一步地验证若这种方法得到验证, 并在 Piezo pulse 和 Spindle view 系统的辅助下, 有望在提高受精几率的同时, 最大程度地减小注射卵的损伤, 提高胚胎的质量, 为 ICSI 技术产业化提供技术支持近来, 联合评分系统 (combinedscoringsystem, [37] CSS) 已成功运用于对人生殖医学研究中 Qian 等利用 CSS 对体外受精或 ICSI 合子和胚胎形态学进行鉴定, 评分高于 70 的胚胎妊娠率显著高于评分低于 70 分的胚胎 ; 并且 CSS 比先前使用的累积胚胎评分系统 (cumulativeembryoscoresystem,ces) 更为准确随着这项技术研究的继续深入, 势必能为猪以及家畜优质胚胎的体外生产提供更为有效快捷的辅助手段 3 展望自 1976 年 Uehara 和 Yanagimachi 率先将 ICSI 引入哺乳动物, 首次证明雌雄配子质膜融合并非精核去致密和原核形成的必要条件以来,ICSI 技术作为辅助生殖的一种手段, 迅速发展起来, 被广泛运用于治疗男性不育和提高动物配子受精效率的实际应用中虽然目前 ICSI 受精率仍相对较低, 究其原因是由于精核解聚失败雄原核形成滞后卵母细胞效率低 ; 人为选择精子, 动物精子优胜劣汰的自然选择遭到破坏, 无法判定精子的遗传物质是否正常但是 ICSI 能克服体外受精多精受精等问题, 大幅提高冷冻精子 ( 包括干化精子 ) 与冷冻卵母细胞的受精效率和发育能力能为研究动物受精机制, 特别是研究异种受精提供技术与动力支持 [38] 因此, 更深入地研究并逐步完善 ISCI 技术, 解决目前相关问题, 势必对畜牧业生产和野生动物保护起到巨大的推动作用, 为受精机理等发育生物学基础理论的研究提供可靠的技术支持此外, 借助 ICSI 技术, 还可以研究精子中某些蛋白在受精中的具体作用, 以及外源蛋白对精子和受精的影响 [39], 为我们更深入地了解受精机理有着积极作用, 也为该领域提供了新的研究方向与 SMGT 和 SCNT 技术充分结合生产转基因动物, 利用了受精这一自然条件下基因组变化最为激烈的过程, 实现外源基因的有效整合, 大量获得高比例转基因的纯合后代并利用已获转基因子代的生殖细胞和体细胞建立含有外源基因的纯细胞系, 由此形成以 SMGT ICSI SCNT 高效生产转基因动物技术路线, 最终用于基因组 DNA 人造染色体 (BAC 或 YAC) 等大片段 DNA 转基因动物的制备, 利用动物血液或母乳系统作为生物反应器, 最终生产稀有的具有生物活性的人类药用蛋白及人类异种器官移植等 [40,41] 利用流式细胞仪筛选精子, 会导致精子活力下降 [42] ; 若将精子分离控制性别技术与 ICSI 相结合, 可以克服上述问题, 并逐步建立一套完整的 X Y 精子分离 ICSI 技术体系, 不仅为畜牧生产提供新的技术路线, 也为生产应用提供了相应的安全保障综上所述, 尽管 ICSI 技术还存在许多问题, 但随着人们对动物受精机制研究地不断深入, 显微操作设备不断地发展, 各种辅助技术的运用和更新,ICSI 技术必会得到更大空间的运用, 与现代分子生物学相结合, 准确检测并掌握精子表型与基因型之间的关系, 进一步地提高该技术的安全性与可靠性, 推动 ICSI 技术产业化进程, 必将在动物育种和实际生产以及人类医疗方面发挥重要作用参考文献 [1]MartinM J.Developmentofinvivo maturedporcineoocytes folowingintracytoplasmicsperm injection.biolreprod,2000, 63:109~112 [2] KolbT,HoltzW.Birthofapigletderivedfrom anoocyte fertilizedbyintracytoplasmicsperm injection(icsi).anim ReprodSci,2000,64:97~101 [3]LaiLX,SunQ Y,WuG M,etal.Developmentofporcine embryosandofspringafterintracytoplasmicsperminjectionwith liposometransfected ornon transfected sperm into in vitro maturedoocytes.zygote,2001,9:339~346 [4]ProbstS,RathD.Productionofpigletsusingintracytoplasmic sperm injection (ICSI) with flowcytometricalysorted boar semenandartificialyactivatedoocytes.theriogenology,2003, 59:961~973 [5]KwonIK,ParkKE,NiwaK.Activation,pronuclearformation, and development in vitro of pig oocytes folowing intracytoplasmic injection offreeze dried spermatozoa.biol Reprod,2004,71:1430~1436 [6] 刘成军, 曾申明, 万鹏程, 等. 影响猪 ICSI 转基因技术效率的

5 112 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 主要因素研究. 中国畜牧杂志,2006,42(17):7~9 LiuC J,ZengSM,WanPC,etal.Studyonthefactorsafecting transgeniceficiencyofporcinebyintractoplasmicinjectionof sperm.chinesejournalofanimalscience,2006,42(17):7~9 [7]SilvestreM A,AlfonsoJ,García MengualE,etal.Efectof recombinanthumanfolicle stimulatinghormoneandluteinizing hormoninvitromaturationofporcineoocyteevaluatedbythe subsequentinvitrodevelopmentofembryosobtainedbyinvitro fertilization,intracytoplasmicsperminjectionorparthenogenetic activation.janimsci,2007,85:1156~1160 [8] Kobayashi M,Lee E S,Fukui Y.Cysteamine or β mercaptoethanol added to a defined maturation medium improves blastocyst formation of porcine oocytes after intracytoplasmicsperm injection.theriogenology,2006,65: 1191~1199 [9]AdonaPR,PiresPR,QuetglasM D,etal.Nuclearmaturation kineticsand in vitroembryodevelopmentofcatleoocytes prematuredwithbutyrolactoneicombinedornotcombinedwith roscovitine.animreprodsci,2008,104:389~397 [10]García RoselóE,CoyP,GarcíaVázquezFA,etal.Analysisof diferentfactorsinfluencingtheintracytoplasmicsperminjection (ICSI)yieldinpigs.Theriogenology,2006,66(8):1857~ 1865 [11]MartinG,SabidoO,DurandP,etal.Cryopreservationinduces anapoptosis likemechanisminbulsperm.biolreprod,2004, 71:28~37 [12]LeeJW,TianX C,YangX Z.Failureofmalepronucleus formationisthemajorcauseoflackoffertilizationandembryo developmentinpigoocytessubjectedtointracytoplasmicsperm injection.biolreprod,2003,68:1341~1347 [13]MachátyZ,BonkA J,KühholzeR B,etal.Porcineoocyte activationinducedbyacytosolicspermfactor.molreproddev, 2000,57:290~229 [14] Kurome M,Saito H,TomiR,etal.Efects ofsperm pretreatmentoneficiencyoficsi mediatedgenetransferin pigs.jreproddev,2007,53:1217~1226 [15]KimBK,LeeYJ,CuiXS,etal.Chromatinandmicrotubule organization in maturing and pre activated porcine oocytes folowingintracytoplasmicsperm injection.zygote,2002,102: 123~129 [16]GianaroliL,MagliM C,ColodelG,etal.Sperm head s birefringence:anewcriterionforsperm selection.fertilsteril, 2008,90(1):104~112 [17]NakaiM,KashiwazakiN,TakizawaA,etal.Efectsofchelating agentsduring freeze drying ofboarspermatozoa on DNA fragmentationandondevelopmentalabilityinvitroandinvivo afterintracytoplasmicsperm headinjection.zygote,2007,15 (1):15~24 [18]GadeaJ.Sperm factorsrelatedtoinvitroandinvivoporcine fertility.theriogenology,2005,63,431~444 [19]KatayamaM,KoshidaM,MiyakeM.Fateoftheacrosomein ooplasminpigsafterivfandicsi.hum Reprod,2002,17: 2657~2664 [20]MorozumiK,ShikanoT,MiyazakiS,etal.Simultaneousremoval of sperm plasma membrane and acrosome before intracytoplasmic sperm injection improves oocyte activation embryonicdevelopment.procnatlacadsciusa,2006,103: 17661~17666 [21]MorozumiK,YanagimachiR.Incorporationoftheacrosomeinto theoocyteduringintracytoplasmicsperm injectioncouldbe potentialyhazardoustoembryodevelopment.procnatlacad SciUSA,2005,102:14209~14214 [22]KatayamaM,MiyanoT,MiyakeM,etal.Progesteronetreatment ofboarspermatozoaimprovesmalepronuclearformation after intracytoplasmicsperminjectioninto porcineoocytes.zygote, 2002,10:95~104 [23]García RoseloE,MstásC,CánovasS,etal.Influenceofsperm pretreatment on the eficiency of intracytoplasmic sperm injectioninpigs.jandrol,2006,27:268~275 [24] WatanabeH,FukuiY,Efectsofdithiothreitolandboaron pronuclearformation and embryonic developmentfolowing intracytoplasmicsperminjectioninpigs.theriogenology,2006, 65:528~539 [25]CohenY,MalcovM,SchwartzT,etal.Spindleimaging:anew markerforoptimaltimingoficsi?.humreprod,2004,19:649 ~654 [26] 杨宇, 戴建军, 张廷宇, 等.Spindle view 系统在猪卵母细胞去核中的应用. 生物工程学报,2007,23(6):1140~1145 YangY,DaiJJ,ZhangTY,etal.Applicationofspindle view in the enucleation porcine ofoocytes.chinsesjournalof Biotechnology,2007,23(6)1140~1145 [27] OnishiA,Iwamoto M,Akita T,etal.Pig cloning by microinjection offetalfibroblastnuclei.science,2000,289 (5482):1188~1190 [28]KatayamaM,SutovskyP,YangBS,etal.Increaseddisruption ofsperm plasmamembraneatsperm immobilizationpromotes disociationofperinuclearthecafrom sperm chromatinafter intracytoplasmicsperm injectioninpigs.reproduction,2005, 130:907~916 [29]YoshidaN,PeryA C.Piezo actuatedmouseintracytoplasmic sperminjection(icsi).natprotoc,2007,2(2):296~304 [30]ShojiS,YoshidaN,AmanaiM,etal.MammalianEmi2mediates cytostaticarestandtransducesthesignalformeioticexitvia Cdc20.EMBOJ,2006,25(4):834~845

6 2009,29(2) 张廷宇等 : 猪胞浆内单精子注射研究进展 113 [31]TianJH,WuZH,LiuL,etal.Efectsofoocyteactivationand sperm preparation on the developmentofporcine embryos derived from in vitro matured oocytesand intracytoplasmic sperminjection.theriogenology,2006,66:439~448 [32]LuQ,SmithGD,ChenDY,etal.Activationofproteinkinase Cinducesmitogen activatedproteinkinasedephosphorylation andpronucleusformationinratoocytes.biolreprod,2002,67 (1),64~69 [33]ItoJ,ShimadaM.TimingofMAPkinaseinactivationefectson emisionofpolarbodyinporcineoocytesactivatedbyca 2+ ionophore.molreproddev,2004,70:64~69 [34]YongHY,PyoBS,HongJY,etal.AmodifiedmethodforICSI inthepig:injectionofheadmembrane damagedspermusinga 3 4mmdiameterinjectionpipete.HumReprod,2003,18:2390 ~2396 [35]YongHY,HongJY,KangSK,etal.Spermmovementinthe ooplasm,dithiothreitolpretreatmentandsperm freezingarenot requiredforthedevelopmentofporcineembryosderivedfrom injection ofheadmembrane damaged sperm.theriogenology, 2005,63:783~779 [36]YongHY,HongJY,PakSI,etal.Efectofcentrifugationand electrical activation on male pronucleus formation and embryonicdevelopmentofporcineoocytesreconstructedwith intracytoplasmicsperm injection.reprodfertildev,2005,17: 557~563 [37]QianYL,YeYH,XuCM,etal.Accuracyofacombinedscore ofzygpteandembryomorphologyforselectingthebestembryos forivf.jzhejiangnuivscib,2008,9(8):649~655 [38]CanovansS,CoyP,GomezE.Firststepsinthedevelopmentofa functionasayforhumansperm usingpigoocytes.jandrol, 2007,28(2):273~281 [39]WuA T,SutovskyP,ManandharG,etal.PAWP,asperm specific WW domain binding protein, promotes meiotic resumptionandpronucleardevelopmentduringfertilization.j BiolChem,2007,282(16):12164~12175 [40] 张然, 徐慰倬, 孔平, 等. 转基因动物应用的研究进展和发展前景. 中国生物工程杂志,2005,25(8):16~24 ZhangR,XuW Z,KongP,etal.ChinaBiotechnology,2005,25 (8):16~24 [41]KuromeM,UedaH,TomiR,etal.Productionoftransgenic clonepigbythecombinationoficsi mediatedgenetransfer withsomaticcelnucleartransfer.transgenicres,2006,15 (2):229~240 [42] 张明, 路阳清, 卢克焕. 牛分离精子对其 IVF 胚胎染色体影响的研究. 中国生物工程杂志,2006,27(1):98~101 ZhangM,LuYQ,LuKH.ChinaBiotechnology,2006,27(1): 98~101 AdvancesinPorcineIntracytoplasmicSperm Injection ZHANGTing yu MAHeng dong (ColegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAguicultualUniversity,Ya an ,China) Abstract Intracytoplasmic sperm injection, which combined with in vitro fertilization and micromanipulationtechniques,hasbeenappliedtoresearchthemolecularmechanismsoffertilization,and producethesexinglivestockandtransgenicanimals.theresearchadvancesinporcineintracytoplasmicsperm injection,includinginvitromaturationandpretreatmentofoocytes,selectionandtreatmentofspermatozoon, artificialactivationofinjectedoocytesafterinjection,andimprovementoftheoperationtechniquewerereviewed. Keywords Pig Inracytoplasmicsperminjection Pretreatmnet Activation

214 云南农业大学学报第 28 卷数量的扩大水牛的正常发情周期仅为 59 02% [1], 有很大一部分是安静发情或者乏情, 造成水牛人工授精受胎率低, 只有 16 7% [2], 比黄牛低得多通过胚胎移植的方法可以有效的提高母水牛的妊娠率, 加快良种畜群的扩繁但是水牛 IVP 胚胎的囊胚

214 云南农业大学学报第 28 卷数量的扩大水牛的正常发情周期仅为 59 02% [1], 有很大一部分是安静发情或者乏情, 造成水牛人工授精受胎率低, 只有 16 7% [2], 比黄牛低得多通过胚胎移植的方法可以有效的提高母水牛的妊娠率, 加快良种畜群的扩繁但是水牛 IVP 胚胎的囊胚云南农业大学学报 JournalofYunnanAgriculturalUniversity,2013,28(S1):213-225 htp://xb ynau edu cn ISSN1004-390X;CODENYNDXAX E mail:xb@ynau edu cn DOI:10 3969/j isn 1004-390X (n) 2013 z1 039 水牛卵胞浆内单精子注射 (ICSI) 胚胎体外发育潜能研究进展