中国现代医学杂志 第 29 卷 observed between the two groups (P >.5). Conclusion PRF promotes the proliferation and inhibits the apoptosis of hdpscs cells through

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1 第 29 卷第 1 期中国现代医学杂志 Vol. 29 No 年 1 月 China Journal of Modern Medicine Jan. 219 DOI: /j.issn 文章编号 : (219) 富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞增殖 凋亡及碱性磷酸酶活性的影响 项海东, 田松波, 陈惠珍 ( 河北医科大学第二医院口腔内科, 河北石家庄 5) 摘要 : 目的探讨富血小板纤维蛋白 (PRF) 对人牙髓干细胞增殖 凋亡及碱性磷酸酶活性的影响及机制 方法从人牙髓组织中分离出人牙髓干细胞 (hdpscs),hdpscs 随机分为及,CCK8 实验检测 PRF 刺激 hdpscs 第 及 7 天时细胞增殖情况 ;RT-PCR 检测 PRF 刺激 hdpscs 第 3 7 及 14 天时碱性磷酸酶 (ALP) 的 mrna 表达情况 ; 流式细胞仪检测 PRF 刺激 hdpscs 7 d 后细胞的凋亡情况,Western blotting 检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3(Cleaved Caspase-3) p38 p-p38 蛋白表达 结果第 1 天时细胞的增殖与比较, 差异无统计学意义 (P >.5), 第 天时细胞的增殖均高于, 差异有统计学意义 (P <.5); 第 3 天时 ALP mrna 表达与比较, 差异无统计学意义 (P >.5), 第 7 和 14 天时 ALP mrna 表达均高于, 差异有统计学意义 (P <.5); 细胞的凋亡率及 Cleaved Caspase-3 蛋白 p-p38 蛋白表达与比较, 差异有统计学意义 (P <.5), 细胞的凋亡率及 Cleaved Caspase-3 蛋白表达均下降,p-p38 蛋白表达上调,p38 蛋白表达两组间比较差异无统计学意义 (P >.5) 结论 PRF 可促进 hdpscs 的增殖, 上调 ALP 的 mrna 表达, 抑制其凋亡, 其机制与激活 p38 信号通路有关 关键词 : 纤维蛋白 ; 人牙髓干细胞 ; 牙髓 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 ; 碱性磷酸酶中图分类号 : R783.4 文献标识码 : A Effect of PRF on proliferation, apoptosis and alkaline phosphatase activity of human dental pulp stem cells Hai-dong Xiang, Song-bo Tian, Hui-zhen Chen (Department of Oral Medicine, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei 5, China) Abstract: Objective To investigate the effect of PRF on proliferation, apoptosis and alkaline phosphatase activity of human dental pulp stem cells. Methods Human dental pulp stem cells (hdpscs) were isolated from human dental pulp tissue, and were randomly divided into control group and experimental group. Cells in experimental group were co-incubated with PRF for 7 days. Cell proliferation and apoptosis were detected by CCK8 assay and flow cytometry on day, 1, 3, 5 and 7, respectively. Expression of alkaline phosphatase, Cleaved Caspase-3, p38 and p-p38 were measured by RT-PCR and Western blotting on day, 3, 7, 14. Results Cell proliferation was enhanced significantly on day 3, 5 and 7 compared with control group (P <.1). Expression of alkaline phosphatase were increased significantly on day 7 and 14 when compared with that in control group (P <.1). Cells apoptosis rate and expression of cleaved Caspase-3 were decreased while expression of p-p38 was increased significantly compared with those in control group (P <.1). No significant difference in p38 protein was 收稿日期 : [ 通信作者 ] 陈惠珍, kqchenhuizhen@ 163.com 45

2 中国现代医学杂志 第 29 卷 observed between the two groups (P >.5). Conclusion PRF promotes the proliferation and inhibits the apoptosis of hdpscs cells through mediation of p38 signaling pathway. Keywords: fibin; stem cells; dental pulp; cell proliferation; apoptosis; alkaline phosphatase 牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs) 来自 于成年机体的牙髓组织, 是具有多向分化潜能和自我 更新的未分化细胞 正常情况下,DPSCs 处于静息状 态, 维持牙髓中细胞的功能及新旧交替的稳态, 当牙 髓中的成牙本质细胞受到损伤后,DPSCs 可参与牙髓 的修复与重建 因此,DPSCs 被认为是影响牙髓牙本 质复合体形成的理想种子细胞 [1-2] 目前已发现多种 在体内及体外影响 DPSCs 增殖及分化的因素 富血 小板纤维蛋白 (platelet-rich fibrin, PRF) 是新一代的 血小板浓缩制品, 富含血管内皮生长因子 血小板衍 生生长因子 转化生长因子等多种生长因子, 这些因 子可构成强大的组织修复功能调节系统, 目前已被应 用于基础细胞的研究 [3-4] 但 PRF 对 DPSCs 的影响及 机制尚不清楚 因此, 本研究旨在探讨 PRF 对 DPSCs 的增殖 分化 凋亡的影响及机制, 以期为牙髓再生 带来新的契机 1 资料与方法 1.1 主要试剂和仪器 DMEM 培养基 胰蛋白酶 胎牛血清均购自美 国 Gibco 公司, 磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 青链霉素购 自美国 Sigma 公司, 二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid, BCA) 试剂盒 细胞计数试剂盒 (cell counting Kit-8, CCK8) 膜联蛋白 V(Annexin V)- 异硫 / 碘化丙锭 (propidium iodide, PI) 凋亡试剂盒均购自中国碧云天 生物技术研究所, 活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白 水解酶 3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved Caspase-3) p38 p-p38 单克隆抗体及辣 根过氧化物标记的二抗均购自美国 abcam 公司, 实时 定量聚合酶链反应 (RT-PCR) 试剂盒 逆转录试剂 盒购自日本 TaKaRa 公司,Trizol 购自美国 Invitrogen 公司 RT-PCR 仪购自美国 Applied Biosystems 公司, CO 2 细胞培养箱购自美国 SIM 公司, 倒置显微镜购自 日本 Olympus 公司, 酶标仪 电泳凝胶图像分析系统 聚丙烯酰胺凝胶电泳仪均购自美国 Bio-Rad 公司 1.2 人牙髓干细胞 (hdpscs) 的分离培养 收集河北医科大学第二医院口腔科志愿者 (16 ~ 25 岁 ) 阻生第 3 磨牙, 即刻放入预冷及加入青 链霉素双抗的 α-mem 培养基中培养保存 无菌条 件下取出牙髓组织, 用.1 mol/l 的 PBS 清洗 2 次, 小剪刀将牙髓组织剪成 1 ~ 2 mm 的小组织块, 按照 1 1 比例加入.4% 的分散酶和.3% 的 Ⅰ 型胶原酶, 37 消化 1 h, 轻轻吹打离散单细胞团块, 过 7 μm 的细胞筛网,1 r/min 离心 5 min,.1 mol/l 的 PBS 清洗 1 遍 细胞沉淀用高糖 DMEM 培养基 ( 含 2% 的胎牛血清 ) 重悬, 以 个 /ml 密度接种于细胞培养瓶中, 置于 37,5% CO 2,95% 饱和湿度的培养箱中培养 每 3 天换液 1 次, 细胞生长密度达到 8% ~ 9% 时, 用 2.5 g/l 的胰蛋白酶消化后传代 收集生长至对数期的第 2 代 hdpscs 进行纯化后再用于后续的实验研究 1.3 PRF 的制备血液来自河北医科大学第二医院口腔科 1 例健康的志愿者, 平均 26 岁 (22 ~ 28 岁 ), 均签署知情同意书 无菌条件下每个志愿者抽取 5 ml 静脉血于真空管中,3 r/min 离心 1 min, 静置数分钟后, 弃去上清, 收集中间层 ( 中间层为 PRF), 将 PRF 凝胶与试管底部的红细胞分离出来, 所获得的 PRF 膜用来制备渗出液 将 PRF 膜放置在预先盛有 2 ml/ 孔的 DMEM 培养基的 6 孔板中,1 孔 / 板, 培养板置于孵育箱中继续孵育, 4 放置 7 d 后收集 6 孔板中的培养液,3 r/min 离心 15 min 以沉淀红血细胞, 然后使用.22 μm 的无菌滤器过滤除菌 将收集的 PRF 浸出液分装, 置于 -8 冰箱冷冻保存备用 1.4 细胞增殖检测 hdpscs 随机分为及 将第 3 代 hdpscs 以 个 / 孔接种于 6 孔细胞培养板中, 37,5% CO 2,95% 饱和湿度的培养箱中培养 培养第 及 7 天时, 每孔细胞中加入 1 μl 的 CCK-8 溶液, 置于 37,5% CO 2 培养箱孵育 2 h, 酶标仪在 49 nm 波长处测定并记录各组的光密度 (OD) 值 计算细胞存活率, 细胞存活率 =( A/ A) 1% 1.5 碱性磷酸酶 (ALP) 活性检测 hdpscs 随机分为及 每组设置第 天 4 个时间点 以 个 /ml 的密度将生长至对数期的第 4 代 hdpscs 的单细胞悬液接种于 6 孔细胞培养板中, 置于 37,5% CO 2 46

3 第 1 期 项海东, 等 : 富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞增殖 凋亡及碱性磷酸酶活性的影响 培养箱中培养至相应时间后, 用 Trizol 法提取细胞 中的总 RNA, 以逆转录试剂盒将总 RNA 逆转录为 cdna, 以 GAPDH 作为内参,RT-PCR 检测 ALP 的 mrna 表达 ALP 引物序列 : 正向 :5'-GGCTGGA GATGGACAAGTTC-3', 反向 :5'-CTCGTTTCCCTGAGT CGTGT-3';GAPDH 引物序列 : 正向 :5'-AAGAGTGGG TTTAAGTGGAAGGCT-3', 反向 :5'-GAAGATGGTGAT GGGATTTC-3' PCR 反应参数 :A, 预变性 95 1 min ;B, 变性 95 1 s ; 退火 6 15 s, 延伸 72 2 s, 共 4 个循环 ;C,72 15 min 4 终止反 应 每个样品设置 3 个重复, 取均值采用 2 - Ct 法对 数据进行相对定量分析 1.6 细胞凋亡检测 收集按照上述分组培养第 7 天的细胞, 预冷的 PBS 及结合缓冲液各洗涤细胞 1 次后, 离心弃上清, 加入 4 μl 的结合缓冲液重悬细胞, 细胞沉淀加入 5 μl 的 PI 和 Annexin-V-FITC, 充分混匀后置于室温 下避光孵育 1 ~ 15 min, 离心沉淀细胞, 缓冲液洗涤 细胞 1 次, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 1.7 Western blotting 检测 Cleaved Caspase-3 p38 p-p38 蛋白表达 收集按照上述分组培养第 7 天的细胞, 按照细 胞蛋白提取试剂盒提取细胞中的蛋白,BCA 试剂盒 检测提取的蛋白质量 将蛋白样品与上样缓冲液等 量混匀后置于 1 变性 1 min, 依次进行聚丙烯酰 氨凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离 转膜 封闭 一抗 孵育 Cleaved Caspase-3 p38 p-p 稀释, 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH),1 1 稀释 二抗孵 育辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG,1 1 稀 释,37 孵育 1 h, 洗膜 3 次,ECL 发光剂显影, 自动 凝胶成像系统采集图像 以 GAPDH 作为内参, 分析 Cleaved Caspase-3 p38 p-p38 的蛋白表达水平 1.8 统计学方法 数据分析采用 SPSS 21. 统计软件, 计量资料以 均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 比较采用 t 检验, 两组 多时间点的比较采用重复测量设计的方差分析,P <.5 为差异有统计学意义 2 结果 (.18±.4) (.25±.6) (.36±.7) (.48±.8) (.63±.9), 在第 及 7 天 的 OD 值分别为 (.2±.5) (.28±.7) (.59±.8) (.73±.9) (.9±.8) 与 PRF 组第 及 7 天的 OD 值比较, 采用重复测量 设计的方差分析, 结果 :1 不同时间点的 OD 值有差 异 (F =13.243,P =.);2 与 PRF 组 OD 值 有差异 (F =17.276,P =.);3 与 PRF 组 OD 值变化趋势有差异 (F =19.417,P =.) 见图 PFR 对 hdpscs 矿化相关基因 ALP 表达的影响 在第 3 7 及 14 天 ALP mrna 表达分 别为 (.883±.112) (1.231±.163) (1.624±.152) (1.913±.164), 分别为 (.925±.144) (1.284±.192) (2.422±.321) (2.695±.371), 两组第 3 7 及 14 天 ALP mrna 表达比较, 采用重复测量设计 的方差分析, 结果 :1 不同时间点间 ALP mrna 表达 有差异 (F =17.191,P =.);2 两组 ALP mrna 表 达有差异 (F =19.841,P =.);3 两组 ALP mrna 表达变化趋势有差异 (F =18.358,P =.) 见图 2 ALP mrna 相对表达 OD 值 与比较,P <.5 图 1 PFR 对 hdpscs 增殖的影响 (x±s) 第 天第 1 天第 3 天第 7 天第 14 天 第 天第 3 天第 7 天第 14 天 2.1 PFR 对 hdpscs 增殖的影响 在第 及 7 天的 OD 值分别为 图 2 与比较,P <.5 PFR 对 hdpscs 的 ALP mrna 表达的影响 (x±s) 47

4 中国现代医学杂志 第 29 卷 2.3 PFR 对 hdpscs 凋亡的影响 细胞的凋亡率 (4.18±.67)% 较 (13.21±1.2)% 下降 (t =12.816,P =.) 见图 3 PI 细胞凋亡率 /% P < A: 流式细胞仪检测结果 ;B: 细胞凋亡率 与比较, 图 3 B PFR 对 hdpscs 凋亡的影响 2.4 PFR 对 Cleaved Caspase-3 p38 p-p38 蛋白表达的影响 Cleaved Caspase-3 p38 p-p38 的蛋白 表达分别为 (.162±.23) (.668±.46) (.41±.16), Cleaved Caspase-3 p38 p-p38 的蛋白 表达分别为 (.63±.16) (.681±.51) (.174±.19), Cleaved Caspase-3 蛋白表达较 下调 (t =.12,P =.4) p-p38 蛋白表达上调 (t = 9.274,P =.1),p38 蛋白在两组间比较差异无统计 学意义 (t =.328,P =.76) 见图 4 Cleaved caspase-3 p38 p-p38 GAPDH A A Annxin V-FITC 32 kd 42 kd 41 kd 36 kd 蛋白表达率 /% 3 讨论 的热点 近些年来, 利用干细胞治疗已成为再生医学研究 [5] 干细胞可分为成体干细胞和胚胎干细胞 DPSCs 是成体干细胞的一员, 可分化为脂肪干细胞和 神经干细胞, 也可形成牙本质牙髓细胞 牙本质牙髓 细胞是未来牙形成的第一步, 这也说明 DPSCs 在活 髓的保存及治疗中有临床应用价值及潜在的优势 PRF 是继富血小板血浆 (platelet rich plasma, PRP) 后 的新一代血小板浓缩制品, 富含纤维蛋白原 多种生 长因子及高浓度的血小板, 可诱导内皮细胞 成骨细 胞等的增殖 分化等过程 [5] [6] 研究显示,PRF 可在体 外促进牙槽骨成骨细胞的增殖及分化, 可以不同的方 式促进犬 DPSCs 的增殖及分化 [7-8] ALP 是一种磷酸 单酯水解酶, 是成骨细胞成熟的早期标志物之一, 参 与骨的形成及代谢过程, 其活性的增强是 DPSCs 向 成牙本质细胞分化的早期标志 PRF 可促进 DPSCs 的增殖和分化 [9] 本研究结果显示, 细胞凋亡过程受到 Caspase 家族的调控,Caspase-3 是 Caspase 家族的一员, 是细胞凋亡通路中关键性的活 化酶, 处在 Caspase 级联反应的下游, 其激活可导致细胞 [1] 的凋亡 研究显示,Caspase-3 的激活可引起 DPSCs 的凋亡 A:Western blotting 检测结果图 ;B: 蛋白表达率 ; 与 比较,P <.5 Cleaved caspase-3 p38 图 4 PFR 对 Cleaved Caspase-3 p38 p-p38 蛋白表达的影响 [11] 本研究结果显示,PRF 可抑制 DPSCs 的凋 亡及下调 Cleaved Caspase-3 蛋白表达 B p-p38 丝裂原活性蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) 属于丝蛋白 / 苏氨酸激酶, 参与细胞 的增殖及死亡 基因表达调控等过程, 在多种信号的传 [12] 递过程中有重要作用 p38 MAPK 信号通路是 MAPK 信号通路家族中重要一员, 参与牙髓干细胞向成牙本 48

5 第 1 期 项海东, 等 : 富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞增殖 凋亡及碱性磷酸酶活性的影响 [13] 质细胞分化等过程 研究显示, 阿司匹林可通过抑制 [14] p38 MAPK 信号通路抑制 DPSCs 的增殖及分化 p38 MAPK 信号通路抑制剂可抑制 ALP 的活性和成牙本质 样细胞的分化, 在初期牙本质及第 3 期反应性牙本质 [15] 形成过程中, 可发现 p38 MAPK 信号通路的激活 本 研究结果显示,PRF 可上调 p-p38 蛋白的表达 综上所述,PRF 可通过激活 p38 信号通路促进 hdpscs 的增殖, 上调 ALP mrna 表达, 抑制其凋亡 该研究为牙髓损伤修复及再生带来了新的思路 参考文献 : [1] HWANG H I, LEE T H, KANG K J, et al. Immunomic screening of cell surface molecules on undifferentiated human dental pulp stem cells[j]. Stem Cells and Development, 215, 24(16): [2] GALLER K M, WIDBILLER M, BUCHALLA W, et al. EDTA conditioning of dentine promotes adhesion, migration and differentiation of dental pulp stem cells[j]. International Endodontic Journal, 216, 49(6): [3] HASAN S, WEINBERG M, KHATIB O, et al. The effect of platelet-rich fibrin matrix on rotator cuff healing in a rat model[j]. International Journal of Sports Medicine, 216, 37(1): [4] KIM T H, KIM S H, SÁNDOR G K, et al. Comparison of plateletrich plasma (PRP), platelet-rich fibrin (PRF), and concentrated growth factor (CGF) in rabbit-skull defect healing[j]. Archives of Oral Biology, 214, 59(5): [5] YASUI T, MABUCHI Y, TORIUMI H, et al. Purified human dental pulp stem cells promote osteogenic regeneration[j]. Journal of Dental Research, 216, 95(2): [6] PATEL S, DHILLON M S, AGGARWAL S, et al. Treatment with platelet-rich plasma is more effective than placebo for knee osteoarthritis: a prospective, double-blind, randomized trial[j]. The American Journal of Sports Medicine, 213, 41(2): [7] PRADEEP A R, KARVEKAR S, NAGPAL K, et al. Rosuvastatin 1.2 mg in situ gel combined with 1: 1 mixture of autologous platelet-rich fibrin and porous hydroxyapatite bone graft in surgical treatment of mandibular class II furcation defects: A randomized clinical control trial[j]. Journal of Periodontology, 216, 87(1): [8] LI X, HOU J, WU B, et al. Effects of platelet-rich plasma and cell coculture on angiogenesis in human dental pulp stem cells and endothelial progenitor cells[j]. Journal of Endodontics, 214, 4(11): [9] FENG G, ZHENG K, SONG D, et al. SIRT1 was involved in TNFα-promoted osteogenic differentiation of human DPSCs through Wnt/β-catenin signal[j]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 216, 52(1): [1] 杨文慧, 郭涛, 杨莉, 等. 体外心脏震波对大鼠心肌梗死后心肌凋亡的影响 [J]. 中国老年学杂志, 216, 36(2): [11] ZHU Q, TIAN G, TANG Z, et al. Adrenomedullin promotes the proliferation and inhibits apoptosis of dental pulp stem cells involved in divergence pathways[j]. Journal of Endodontics, 216, 42(9): [12] 周丹, 涂悦, 张赛. MAPK 信号通路在颅脑创伤中作用的研究进展 [J]. 中华神经外科杂志, 216, 32(4): [13] SHEN S, HUANG D, FENG G, et al. MEF2 Transcription factor regulates osteogenic differentiation of dental pulp stem cells[j]. Cellular Reprogramming (Formerly Cloning and Stem Cells), 216, 18(4): [14] GAO Q, WALMSLEY A D, COOPER P R, et al. Ultrasound stimulation of different dental stem cell populations: role of mitogen-activated protein kinase signaling[j]. Journal of Endodontics, 216, 42(3): [15] FENG X, SHEN S, CAO P, et al. The role of oncostatin M regulates osteoblastic differentiation of dental pulp stem cells through STAT3 pathway[j]. Cytotechnology, 216, 68(6): ( 王荣兵编辑 ) 49

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