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棋慕容
5 years ago
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1 乙型肝炎病毒耐药变异检测与监测缪晓辉第二军医大学长征医院

2 HBV 耐核苷类药物几乎无法避免第 1 年第 2 年第 3 年第 4 年第 5 年第 6 年 LAM 1 23% 46% 55% 71% 80% ADV 1 LdT 2,3 0% 5% 3% 25% 11% 18% 29% TDF 4 0% 72W 0%?? ETV* 5 <1% <1% 1.2% 1.2% 1.2% 1.2% ETV 3 年 ITT 耐药数据 : 1.7% 第 72 周时 HBV DNA 400 copies/ml 的患者可以在 TDF 的方案中增加 FTC; 因此,72 周后就无法完全确定对 TDF 单药治疗的耐药性 5, * 耐药的累积概率 ; 初治 HBeAg (+) ; 初治 HBeAg(-); N/A 无法获得

3 HBV 耐药的后果原治疗药物无效肝炎复发或肝病恶化后续治疗的复杂程度增加优化治疗之后的疗程更长联合用药后的副作用增多优化治疗的经济负担加重耐药株传播增加预存耐药

4 核苷类药物治疗中 HBV 耐药的管理策略初始选择抑制病毒能力强高基因耐药屏障的核苷类抗病毒药物加强核苷类药物抗病毒治疗过程中的耐药检测和监测及时发现并及时处理耐药

5 HBV 耐药的基本概念原发耐药突变 : 药物作用靶点的基因及其编码的氨基酸发生突变, 导致突变的病毒株对治疗药物的敏感性下降原发耐药突变株对药物的敏感性降低, 但其复制能力低于野毒株继发耐药突变或代偿性耐药突变 : 在原发耐药突变的基础上, 突变病毒株在其他位点发生突变, 使突变的病毒复制能力部分恢复并对药物的敏感性进一步降低

6 拉米夫定与野生 HBV 株高亲和力结合野生 HBV 株的 DNA Y 拉米夫定 ( 高亲和力 ) 聚合酶 YMDD 基序, 与拉米夫定有较强的核苷酸 M 负链 HBV DNA 亲和力, 结合后终止 HBV 基因组负链合 D 成, 从而抑制病毒复制 D HBV DNA 多聚酶

7 变异导致药物与酶结合的亲和力下降变异 HBV 株的 DNA Y 拉米夫定 ( 亲和力降低 ) 聚合酶 YMDD 基序成为 YIDD 或 YVDD, 与拉米夫定结合的亲核苷酸 I/V 负链 HBV DNA 和力下降, 不能阻止 HBV 基因组负链合 D D HBV DNA 多聚酶成, 变异病毒株大量复制

8 HBV 耐药的基本概念基因型耐药 : 在抗病毒治疗过程中, 检测到与乙型肝炎病毒耐药相关的位点突变表型耐药 : 在体外细胞复制系统中证实 HBV 基因组中 1 个或 1 个以上位点突变, 使病毒对药物的敏感性降低, 以 IC 50 表示以 IC 50 来评估 : IC 50 <5 倍 : 敏感 IC 50 在 5~10 倍 : 部分耐药 IC50 >10 倍 : 耐药

9 耐药变异导致病毒对药物敏感性下降核苷类 ( 酸 ) 类似物耐药变异位点药物敏感性下降倍数 LAM rtm204v/i >1000 ADV rta181v 或 rtn236t 3~15 ETV rti169t 或 rts202g/i 1 LdT rtt184a/g/i/s 或 rtm250v rtm204v/i+1 个 ETV-R rtm204v/i+1 个 ETV-R rtm204i 或 rtl180m+rtm204v 2~10 10~250 >200 >1000

10 HBV 耐药的基本概念交叉耐药 : 针对 1 种抗病毒药物出现的耐药突变, 导致病毒对另 1 种或几种抗病毒药物的敏感性也下降, 甚至出现耐药多药耐药 : 至少对 2 种无交叉耐药谱且是不同类别的 NAs 耐药

11 交叉耐药是因为存在共同耐药位点拉米夫定恩曲他滨替比夫定阿德福韦恩替卡韦 Adapted from: Locarnini S. Monothematic Conference, Istanbul, Turkey, October 2005 Yuen M-F & Lai C-L. Expert Rev Anti Infect Ther 2005; 3: Adapted from: Locarnini S, et al. Antivir Ther 2004; 9:

12 HBV 交叉耐药和多药耐药情况 S S R R R L180M+M204V/I±T184G±S202I/G S S R R R L180M+M204V/I±I169T±V173L±M250V I R S S S N236T I R S R I/R A181T/V S S I R R L180M+M204V S S I R R M204I S S I S R M204V S S S S S 野毒株 TDF ADV ETV LdT LAM 敏感性水平 HBV rt 突变

13 HBV 耐药的基本概念病毒学突破 : 在未更改治疗的情况下, 获得部分或完全病毒学应答的患者, 其 HBV DNA 水平较治疗中最低点上升 1 lg IU/ml, 并在间隔 1 个月以上的第 2 次检测证实生化学突破 : 在未更改治疗的情况下, 基线 ALT 2ULN, 且在治疗中 ALT 已降至正常的患者,ALT 升至高于 ULN 病毒学反弹 : 在未更改治疗的情况下, 获得部分或完全病毒学应答的患者, 其 HBV DNA 载量超过治疗前水平

14 耐药检测和监测的技术平台患者临床耐药表型耐药基因耐药病毒学反弹和生化反弹动物模型细胞培养 PCR 扩增杂交

15 临床耐药与监测概念 : 指临床出现病毒复制不能被抑制, 或 HBV 复制一度被抑制后又出现 HBV DNA 反弹, 伴有 ALT 升高, 或肝炎复发的其他临床证据基于病毒 DNA 定量检测和监测所获得的信息, 未考虑乙肝病毒基因耐药位点及其与临床耐药的关系

16 临床耐药的准确判断根据耐药的临床表现判断病毒学突破是耐药最早的临床表现, 其中 90% 以上的者可出现生化学突破如不及时挽救治疗, 可发生病毒学反弹和肝炎发作, 也可能出现肝脏功能失代偿急性肝衰竭, 甚至死亡主要原因是依从性差和 / 或病毒耐药在病毒学突破前已可检测到基因型耐药和表型耐药不是所有病毒学突破均由抗病毒耐药突变引起, 必须进行确证

17 临床耐药的准确判断 HBV DNA 水平的监测与随访 : HBV DNA 定量检测手段必须符合质控要求同一地区的相同患者应使用相同的检测试剂可以结合核苷类药物的抑制病毒复制的能力, 来分析短期内低水平复制的情况需要正确理解检测技术敏感度 ( 检测下限 ) 与耐药发生的关系

18 HBV DNA 的最低检测极限 log 10 拷贝 /ml 检测敏感度与临床耐药被检出的时间 Digene 杂交获取 II (HC2) 野生型病毒耐药病毒抗病毒治疗持续时间 Niesters HGM, et al. J Clin Microbiol 2000; 38:

19 HBV DNA 的最低检测极限 log 10 拷贝 /ml 检测敏感度与临床耐药被检出的时间 Amplicor HBV 监测 V2.0 野生型病毒耐药病毒抗病毒治疗持续时间 Niesters HGM, et al. J Clin Microbiol 2000; 38:

20 HBV DNA 的最低检测极限 log 10 拷贝 /ml 检测敏感度与临床耐药被检出的时间 Cobas Amplicor HBV 监测 V2.0 野生型病毒耐药病毒抗病毒治疗持续时间 Niesters HGM, et al. J Clin Microbiol 2000; 38:

21 PCR 的线性范围下限与临床耐药监测 2.00E+09 IU/ml 20 IU/ml 小于 20 意味着 0 检测下限尽可能 ~ 低 19 线性范围尽可能宽

22 耐药变异位点的检测和监测采用各种敏感的核酸分子检测技术, 定期或不定期地检测 HBV 基因组多聚酶基因上耐药相关的核苷酸序列的突变, 主要是检测点突变表型耐药检测, 即核苷类药物敏感度 (IC 50 ) 测定, 其技术难度较高且复杂, 目前只用于药物开发或实验研究

23 基因耐药检测技术平台扩增法杂交法

24 耐药变异位点检测技术简介 PCR 产物核酸测序序法 PCR 产物直接测序 PCR 产物克隆测序限制性片段长度多态性技术 (RFLP) 线性探针反向杂交法 (INNO-LiPA) 基因芯片技术其他 : 基于突变引物或突变荧光探针的 PCR 技术

25 耐药变异位点检测技术简介 PCR 产物核酸测序序法 PCR 产物直接测序 PCR 产物克隆测序限制性片段长度多态性技术 (RFLP) 线性探针反向杂交法 (INNO-LiPA) 基因芯片技术其他 : 基于突变引物或突变荧光探针的 PCR 技术

26 HBV YMDD 变异直接测序结果图谱

27 HBV YMDD 变异直接测序结果图谱 ATG 甲硫氨酸 (M)

28 HBV YMDD 变异直接测序结果图谱 ATT 异亮氨酸 (I)

29 HBV YMDD 变异直接测序结果图谱 GTG 颉氨酸 (V)

30 PCR 产物直接测序法的优缺点技术特点 : 直接了解基因的碱基序列, 故为金标准可检测已知和可能的未知耐药变异位点局限性 : 可检测的耐药基因变异株比例需大于 20% 设备成本高, 技术要求高大多需送检, 报告周期长

31 耐药变异位点检测技术简介 PCR 产物核酸测序序法 PCR 产物直接测序 PCR 产物克隆测序限制性片段长度多态性技术 (RFLP) 线性探针反向杂交法 (INNO-LiPA) 基因芯片技术其他 : 基于突变引物或突变荧光探针的 PCR 技术

32 克隆测序法流程图

33 优点 : 克隆测序法的优缺点有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株之间的相对比例检测灵敏度高局限性 : 技术难度较高, 非常繁琐检测周期更长检测的费用高不适合作为常规检测

34 耐药变异位点检测技术简介 PCR 产物核酸测序序法 PCR 产物直接测序 PCR 产物克隆测序限制性片段长度多态性技术 (RFLP) 线性探针反向杂交法 (INNO-LiPA) 基因芯片技术其他 : 基于突变引物或突变荧光探针的 PCR 技术

35 限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP) 在目标酶切位点附近设计 PCR 引物, 野生型含有限制性酶切位点, 而突变型不含有, 或相反, 选择特定的限制性内切酶, 经 PCR 扩增酶切电泳后, 可得到不同的电泳带谱, 从而鉴定不同基因位点突变电泳后, H: 野生型和突变型混合株 N: 野生型 M: 突变型

36 PCR-RFLP 的优缺点技术特点 : 灵敏度高, 最低可检测 5% 的耐药病毒变异株操作相对简便局限性 : 只能检测已知单一位点的变异检测过程比较复杂

37 耐药变异位点检测技术简介 PCR 产物核酸测序序法 PCR 产物直接测序 PCR 产物克隆测序限制性片段长度多态性技术 (RFLP) 线性探针反向杂交法 (INNO-LiPA) 基因芯片技术其他 : 基于突变引物或突变荧光探针的 PCR 技术

38 线性探针反向杂交法 (INNO-LiPA) 检测探针 ( 野生型 / 突变型 ) 通过化学键作用固定在尼龙膜的特定位臵上, 制成包含探针阵列的线性膜条带有生物素标记 ( 引物 ) 的 PCR 扩增产物与膜条上的探针根据碱基互补配对原理进行分子杂交显色

39 INNO LiPA 诊断 HBV YMDD 变异

40 INNO LiPA 的优缺点技术特点灵敏度高, 最低可检测 5% 的耐药变异株高通量, 可检测多种耐药突变位点局限性只能检测已知的突变位点国内尚未普遍开展, 临床应用较少

41 耐药变异位点检测技术简介 PCR 产物核酸测序序法 PCR 产物直接测序 PCR 产物克隆测序限制性片段长度多态性技术 (RFLP) 线性探针反向杂交法 (INNO-LiPA) 基因芯片技术其他 : 基于突变引物或突变荧光探针的 PCR 技术

42 基因芯片技术

43 基因芯片技术的优缺点技术特点 : 灵敏度高, 最低可检测小于 5% 的耐药变异株高通量, 可检测多种耐药突变位点局限性 : 只能检测已知的突变位点设备成本相对较高, 检测费用相对较高

44 耐药变异位点检测技术简介 PCR 产物核酸测序序法 PCR 产物直接测序 PCR 产物克隆测序限制性片段长度多态性技术 (RFLP) 线性探针反向杂交法 (INNO-LiPA) 基因芯片技术其他 : 基于突变引物或突变荧光探针的 PCR 技术

45 关于耐药检测和监测的几点建议与 HBV DNA 定量检测不同, 耐药变异位点的检测一般不需要设定固定时间予以监测对血清 HBV DNA 低于检测限者, 作耐药变异位点检测是很不恰当的核苷类药物抗病毒治疗前不主张常规行变异位点检测根据当地技术水平患者的经济承受能力和不同患者的耐药特征决定是否要检测耐药变异并选择适宜的检测技术

46 关于耐药检测和监测的几点建议确诊临床耐药实施优化治疗前建议行耐药变异位点检测疑为临床耐药, 有条件者建议行耐药变异位点检测或监测疑为临床耐药, 不建议检测并报告所有上市或未上市的核苷类药物的耐药变异位点

47 结语核苷类药物抗病毒治疗过程中应进行耐药检测或监测耐药检测或监测是耐药管理的重要组成部分临床耐药监测主要基于乙肝病毒复制水平的监测随访和肝脏生化指标的监测, 应当采用灵敏的或相对固定的检测技术包括核酸序列分析限制性片段长度多态性线性探针反向杂交技术基因芯片技术在内的耐药突变位点检测技术已被广泛应用, 各有优缺点, 尚需要标准化

216 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 核苷 ( 酸 ) 类似物 [nucleos(t)ide analogues, NAs] 是最主要的抗慢性 HBV 感染药物在我国,

216 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 核苷 ( 酸 ) 类似物 [nucleos(t)ide analogues, NAs] 是最主要的抗慢性 HBV 感染药物在我国, 传染病信息 2018 年 6 月 30 日第 31 卷第 3 期 Infect Dis Info, Vol. 31, No. 3, June 30, 2018 215 专题论著拉米夫定和阿德福韦酯双重耐药 HBV 株临床检出特点与表型特性分析陈容娟, 刘妍, 李晓东, 杜凤霞, 思兰兰, 李乐, 许智慧, 姚增涛, 戴久增, 徐东平, 段昌柱 [ 摘要 ] 目的分析拉米夫定 (lamivudine,