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1 急性脑梗死患者单核细胞 CD14 + CD16 + 亚型的表达变化及临床意义 王斌达叶指南唐维国刘春艳周琳续力云 摘要 目的探讨急性脑梗死患者单核细胞 CD14 + CD16 + 亚型的表达及其临床意义 方法选择发病 <24h 入院的 36 例急性脑梗死患者为脑梗死组 同期在神经内科治疗的 32 例头晕患者为对照组, 检测脑梗死组患者及第 2 5 7~1 天以及, 对照组的血清单核细胞计数 单核细胞各亚型百分比, 分析单核细胞亚型与病情的关系 结果 doi:1.1256/j.iss 基金项目 : 舟山市科技局项目 (214C3167) 作者单位 :31621 舟山医院神经内科 ( 王斌达 周琳 刘春艳 唐维国 ), 细胞分子生物实验室 ( 续力云 ); 台州市立医院神经内科 ( 叶指南 ) 通信作者 : 续力云, xuliyuhappy@1.com 与对照组相 比, 脑梗死组经典型单核细胞百分比各时间点均无明显变化 ( 均 P ); 中间型单核细胞百分比及第 2 5 7~1 天均明显 升高 ( 均 P<.5); 非经典型单核细胞百分比入院第 2 5 天均明显下降 ( 均 P<.5) 脑梗死组单核细胞计数与 NIHSS 评分 呈正相关 (r=.58,p<.5);3 个亚型百分比与 NIHSS 评分均未见相关 ( 均 P ) 与未感染者比较, 脑梗死感染患者入院第 2 5 7~1 天单核细胞计数均明显升高 ( 均 P<.5), 非经典型单核细胞百分比均明显下降 ( 均 P<.5); 中间型单核细胞百分比入院当 天及第 2 5 天均明显升高 ( 均 P<.5); 经典型单核细胞百分比各时间点比较差异均无统计学意义 ( 均 P ) 与预后良好组比较, 脑梗死预后不良组入院第 2 5 天单核细胞计数 中间型单核细胞百分比均明显升高 ( 均 P<.5), 非经典型单核细胞百分比均明显下 降 ( 均 P<.5); 经典型单核细胞百分比各时间点比较差异均无统计学意义 ( 均 P<.5) 结论 CD14 + CD16 + 亚型变化有一定的规律, 中间型单核细胞 非经典型单核细胞可能与脑梗死相关感染及预后有关 关键词 单核细胞 CD14 CD16 脑梗死 Chages of moocyte CD14 + CD16 + subtypes i patiets with acute cerebral ifarctio ad its cliical sigificace Chia 急性脑梗死患者单核细胞 Abstract Objective To ivestigate the chagesof CD14+CD16+ moocytes i patiets with acute cerebral ifarctio ad cliical sigificace. Methods Thirty six patiets with acute cerebral ifarctio admitted withi 24 hof oset (study group) ad 32 patiets with dizziess hospitalizedat the same period (cotrol group) were erolled i the study. The peripheral moocyte cout ad the percetage of moocyte subtype i study groupwere determied at, 2, 5, 7-1d after admissio ad 9d i the followed up; those were measure at admissio i cotrol group. The correlatio betwee moocyte subtypes ad the progressio of acute cerebral ifarctio was aalyzed. Results Compared with the cotrol group, the percetage of typical moocytes (CD14 ++ CD16 - )showed o sigificat chages at all time poits i cerebral ifarctio group (P ). The percetage of itermediate moocytes (CD14 ++ CD16 + )was sigificatly icreased at d, d2, d5, d7 ad d1 after admissio(p<.5), the percetage of o-typical moocytes(cd14 + CD16 ++ )was sigificatly decreased at d2 ad d5 (P<.5). There was apositive correlatio betwee moocyte cout ad NIHSS score (r=.58, P<.5) at admissio, while o correlatio betwee the subtypes of moocytes ad NIHSS scores (P). Compared with o-ifected patiets, the moocyte cout i ifected cerebral ifarctio patiets was sigificatly icreased (P<.5), the percetage of o-typical moocytes was sigificatly decreased (P<.5), the itermediate moocytes were sigificatly icreased(p<.5) at d, d2 ad d5 of admissio, while the typical moocytes showed o sigificat differeces at all time poits (P<.5). Compared with the petiets with good progosis, the moocyte cout ad the percetage of itermediate moocytes were sigificatly icreased at d2 ad d5 i patiets with poor progosis(p<.5), ad the percetage of o-typical moocytes was sigificatly decreased (P<.5), but the percetage of typical moocytes showed 1548

2 o sigificat differece at all time poits (P ). Coclusio The CD14 + CD16 + moocytes chage with the progressio of the disease i patiets with acute cerebral ifarctio. The chages of itermediate moocytes ad o-typical moocytes may be related to the ifectio ad progosis of cerebral ifarctio. Key words Moocytes CD14 CD16 Cerebral ifarctio 炎症反应参与脑梗死的缺血损伤, 与脑梗死的发 生 发展及预后密切相关 [1-3] 单核细胞是重要的炎症反 应细胞, 在急性脑梗死人群中观察到单核细胞上高表达 的人类白细胞抗原 DR 位点抗原表达减少, 其分泌的 TNF- 琢减少, 这表明单核细胞活性下降, 可能与脑梗死 早期阶段免疫抑制有关 [4] 目前, 人类单核细胞亚型的划 分主要基于脂多糖受体 CD14 和 IgG Fc 段受体 CD16 的表达水平 [5-6] 在正常人群中, 循环血中 8%~9% 的单 核细胞表达 CD14 ++ CD16 - ( 经典型单核细胞 ), 约 1% 的 单核细胞表达 CD14 + CD16 ++ ( 非经典型单核细胞 ) 和 CD14 ++ CD16 + ( 中间型单核细胞 ) [5, 7] 单核细胞亚型在脑 梗死的病理 生理过程中也许具有特定的作用, 若其作 用机制能被准确阐明, 它们有可能成为有效的治疗靶 点 本文就急性脑梗死患者单核细胞 CD14 + CD16 + 亚型 的表达变化及临床意义作一探讨, 现报道如下 1 对象和方法 1.1 对象选择舟山医院 214 年 2 月至 215 年 4 月 脑梗死组 对照组 P 值 试剂和仪器 FITC 标记的单克隆抗体 CD14 (2 滋 l/ 支,Cat NO ) PEcy5 标记的单克隆抗体 CD16(2 滋 l/ 支,Cat NO ) 阴性对照 IgG(.1mg, Cat NO ;.1mg,Cat NO ) 和 FACS lysis solutio (1ml,Cat NO.34922) 均由美国 BD 公司提 供 ; 血液自动分析仪为日本希森美抗公司生产的 Sys 原 mex XE-21 型, 试剂为该公司供给的配套试剂盒 ; 流 式细胞仪为美国 BD FACSCalibur 1.3 方法 69.1± ±7.8 2(55.6) 23.5± ±2.9 表 1 2(55.5) 14(43.8) 血清检测脑梗死组患者 ( 用药前 ) 及 第 2 5 7~1 天的 6 颐 3~8 颐, 分别采集静 脉血, 并在 3mi 内分离血浆, 并保存在 -8 益冰箱内 对照组患者于采集静脉血 (1) 外周血单核细胞计数的测定 : 采集静脉血 3ml, 加入 EDTA 抗凝管中, 收治的 36 例急性脑梗死患者 ( 发病 <24h 入院 ) 为研究 对象, 其中男 2 例, 女 16 例 ; 年龄 42 耀 79(69.1 依 1.1) 岁 入组标准 : 年龄 <8 岁 ; 发病时间 <24h; 病前改良 Raki 量表 (mrs) 评分臆 2 分 ; 病后美国国立卫生研究 院卒中量表 (NIHSS) 评分逸 3 分 ; 符合 214 年中国急性 脑梗死诊治指南的诊断标准, 均经头颅 CT 或 MRI 诊 断 排除标准 : 入院时有发热 感染等症状 ( 体温 > 37.8 益,WBC>11 伊 1 9 个 /L 或 <4 伊 1 9 个 /L); 入院前 3 个月曾使用过抗生素 免疫抑制剂 类固醇激素 ; 入院前 3 个月有脑出血 脑脓肿 短暂性脑缺血发作 颅内手术 及外伤史 ; 既往有血液病 恶性肿瘤 自身免疫性疾病 肝炎 结核病史 ; 准备行溶栓者 选择同期在舟山医院神 经内科治疗的 32 例头晕患者进行对照, 其中男 17 例, 女 15 例 ; 年龄 49~74 (68.7 依 7.8) 岁 ; 均经头颅 CT 或 MRI 排除急性卒中 两组患者年龄 性别 吸烟 合并基 础疾病等情况比较, 差异均无统计学意义 ( 均 P >.5), 见表 1 两组患者一般资料比较 年龄 ( 岁 ) 男性 [(%)] BMI(kg/m 2 ) 吸烟 [(%)] 糖尿病 [(%)] 高脂血症 [(%)] 高尿酸血症 [(%)] 高同型半胱氨酸血症 [(%)] 9(25.) 4(12.5) (69.4) 19(52.8) 11(34.4) 21(58.3) 由舟山医院血常规室采用日本希森美抗公司 Sysmex XE-21 型血液自动分析仪作统一检测 (2) 单核细胞 CD14 CD16 的测定 : 淤取 2 支流式细胞仪管, 均加入已分离出血浆的抗凝血细胞 8 滋 l; 在试管 1 加入阴性对照 IgG, 在试管 2 中加入 FITC 标记的 CD14 PEcy5 标记的 CD16 各 4 滋 l; 震荡混匀, 保存在 4 益暗箱中 3mi 于加入 2ml 红细胞溶解液, 震荡混匀, 静置于 37 益温水浴中 1mi 中,2 5r/mi 离心 5mi, 弃上清液, 残留物中加 2 滋 lpbs, 立即上机检测 评价标准入院 7d 内, 每天记录 NIHSS 评分 ; 随访期间脑梗死后第 9 天, 记录 NIHSS 评分 mrs 评分 (1) 预后良好 : 脑梗死后第 9 天 NIHSS 评分 或 1 分, 且 mrs 评分臆 2 分 ( 2 ) 感染 : 依据国家卫生部关 [8] 于医院感染的诊断标准 淤下呼吸道感染 : 患者出现

3 咳嗽 痰黏稠 肺部出现啰音并伴随下列三项中一项 ( 发热 宰月悦或中性粒细胞比例增高 X 线示有肺部炎症浸润性病变 ) 于尿路感染 : 患者出现尿路刺激征, 或有下腹触痛 肾区叩痛伴或不伴发热并具有下列情况之一 ( 尿检白细胞 : 男性逸 5 个 / 高倍视野, 女性逸 1 个 / 高倍视野 ; 插导尿管患者结合尿培养 ); 临床已诊断为泌尿道感染, 或抗菌治疗有效而认定的泌尿道感染 1.4 统计学处理应用 SPSS 21. 统计软件 计量资料 符合正态分布, 用 表示, 比较采用独立样本 t 检 验 ; 组内各时点比较采用方差分析 脑梗死组 单核细胞计数及其亚型与 NIHSS 评分的关系采用 Pearso 相关分析 P<.5 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 脑梗死组基本情况住院 1 周内, 脑梗死组发生 脑梗死组 对照组 表 浙江医学 217 年第 39 卷第 18 期 感染 9 例, 占 25.%; 包括肺炎 8 例 泌尿系感染 1 例 住院期间病死猿例 ; 随访期间病死 3 例, 失访源例 2.2 脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化及与对照组比较脑梗死组及第 2 5 天单核细胞计数逐渐增高, 之后逐渐恢复 ; 及第 2 5 7~1 天与对照组比较, 差异均有统计学意义 ( 均 P<.5) 脑梗死组及第 2 5 7~1 天经 典型单核细胞百分比与对照组比较, 差异均无统计学意 义 ( 均 P ) 脑梗死组及第 2 5 天中间型 单核细胞百分比逐渐增高, 第 7~1 天逐渐恢复 ; 入院当 天及第 2 5 7~1 天与对照组比较, 差异均有统计学意 义 ( 均 P<.5) 脑梗死组及第 2 5 天非经典 型单核细胞百分比逐渐下降, 第 5 天达最低值, 之后逐 渐恢复 ; 入院第 2 5 天与对照组比较, 差异均有统计学 意义 ( 均 P<.5), 见表 2 脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化及与对照组比较 单核细胞计数 ( 1 9 个 /L) 经典型单核细胞百分比 (%) 中间型单核细胞百分比 (%) 非经典型单核细胞百分比 (%).49±.18.63±.17.67±.14.65±.16.45±.11.38± 脑梗死患者单核细胞计数及其亚型与 NIHSS 评分的关系 脑梗死组单核细胞计数 与 NIHSS 评分呈正相关 (r=.58,p=.2), 单核细胞 3 个亚型百分比与 NIHSS 评分均无明显相关性 ( 经典型 : r=.231,p=.174; 中间型 :r=.84,p=.627; 非经典型 : r=-.25,p=.2297), 见图 感染与未感染脑梗死患者入院后不同时点单核细胞 计数及其亚型的变化与比较 与未感染者比较, 脑梗死 感染患者入院第 2 5 7~1 天单核细胞计数均明显升高, 非经典型单核细胞百分比均明显下降, 差异均有统计学 意义 ( 均 P<.5); 中间型单核细胞百分比及第 2 5 天均明显升高 ( 均 P<.5); 经典型单核细胞百分比 各时点比较差异均无统计学意义 ( 均 P ), 见表 预后不良与良好脑梗死患者入院后不同时点单核 细胞计数及其亚型的变化与比较与预后良好组比较, 脑梗死预后不良组入院第 2 5 天单核细胞计数 中间型 单核细胞百分比均明显升高, 非经典型单核细胞百分比 均明显下降, 差异均有统计学意义 ( 均 P<.5); 经典型单核细胞百分比各时间点比较差异均无统计学意义 ( 均 P<.5), 见表 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 讨论本研究发现, 脑梗死早期单核细胞计数增高, 而后逐渐下降, 提示脑梗死后单核细胞处于激活状态, 可能与病后下丘脑 - 垂体 - 肾上腺皮质轴和交感神经系统激 [9] 活 刺激骨髓池中幼稚的单核细胞释放入外周血有关 有研究表明经典型单核细胞处于相对低分化的幼稚阶段, 占外周血单核细胞总数的 8%~9%; 当机体在炎症免疫反应的刺激下, 开始表达 CD16 并伴有 CD14 表达下调, 逐渐转化为中间型单核细胞, 最后成熟后呈现 CD16 高表达 CD14 低表达的状态, 即非经典型单核细 [1] 胞 本研究中脑梗死患者经典型单核细胞变化不大, 可能因为幼稚的经典型单核细胞储备大, 占全部单核细胞的大部分, 致使少量的经典型单核细胞成熟转化后在总体上观察经典型单核细胞仍无明显变化 此外, 中间型单核细胞总的趋势表现为先增高再逐渐恢复的动态变化过程, 提示机体在炎症免疫刺激下会使单核细胞逐渐分化成熟 而更为成熟的非经典型单核细胞在脑梗死急性期反而下降, 原因可能是与其他亚型相比, 非经典型单核细胞有更高的迁徙能力, 急性应激状态下能迅速

4 1. 1 感染 未感染 预后不良 NIHSS 评分 ( 分 ) NIHSS 评分 ( 分 ) 15 1 表 表 预后良好 图 1 NIHSS 评分 ( 分 ) NIHSS 评分 ( 分 ) 脑梗死患者单核细胞计数及其亚型与 NIHSS 评分的散点图 感染与未感染脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化与比较 单核细胞计数 ( 1 9 个 /L).51±.22.83±.14.84±.13.83±.14.46±.1.48±.16.57±.12.63±.11.61±.13.44±.12 经典型单核细胞百分比 (%) 中间型单核细胞百分比 (%) 非经典型单核细胞百分比 (%) 68.6± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.32 脑预后不良与良好脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化与比较 5.49± ± ± ± ± ± ± ± ± ±3.11 单核细胞计数 ( 1 9 个 /L) 经典型单核细胞百分比 (%) 中间型单核细胞百分比 (%) 非经典型单核细胞百分比 (%).49±.19.68±.18.75±.13.69±.17.47±.15.48±.14.55±.1.57±.7.6±.12.43± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±2.94 注 : 入院第 2 5 天分别病死 1 2 例 ; 第 9 天随访病死 3 例, 失访 4 例

5 从血管迁徙到损伤组织, 导致外周血中非经典型单核细 [11-12] 胞不升反而下降 研究表明中间型单核细胞具有强大的吞噬活性及 [13] 抗原提呈作用 在类风湿性关节炎 冠状动脉粥样硬化性心脏病等多种慢性炎性疾病进展期, 中间型单核细 [14-16] 胞明显升高, 且与疾病的进展 预后相关 本研究发现脑梗死急性期中间型单核细胞逐渐升高, 可能与急性应激状态下经典型单核细胞逐渐转化为中间型单核细胞有关 此外, 预后不良的脑梗死患者中间型单核细胞升高更为明显, 可能由于急性发病时本身病情重, 脑组织损伤范围广泛, 从而导致中间型单核细胞反应性升高 中间型单核细胞的升高, 进一步加重了机体的炎症免疫反应, 增强了单核细胞对损伤脑组织及细胞的清 [17] 除, 造成缺血脑组织的二次损伤 Deg 等研究发现中间型单核细胞可促进诱导型一氧化氮合酶的表达, 再次对神经组织造成毒性损害 因此, 寻求阻断经典型单核细胞向中间型单核细胞转化的有效方法, 可能为脑梗死 [5] 的治疗提供新方向 Kaito 等研究发现非经典型单核细胞较其他亚型具有更高的迁移能力, 在脑梗死早期就能 迅速迁移到损伤的炎性组织周围 本研究显示入院后出 现感染的脑梗死患者非经典型单核细胞明显减少, 可能 由于脑梗死后大量的非经典型单核细胞迅速从血管中 迁徙到损伤组织, 导致机体免疫防御功能下降, 从而使 脑梗死患者更容易发生感染 Auffray 等 [12] 利用感染的大 鼠作为模型, 发现与人类非经典型单核细胞同源的大鼠 Ly6Clow 非经典型单核细胞能在感染的数小时内迅速 从血管中迁移到感染组织中 本研究发现感染的脑梗死 患者非经典型单核细胞进一步下降, 可能由于非经典型 单核细胞大量迁移到感染组织所致 综上所述, 急性脑梗死患者单核细胞 CD14 + CD16 + 亚型变化有一定的规律, 中间型单核细胞 非经典型单 核细胞可能与脑梗死相关感染及预后有关 建议进一步 研究脑梗死后单核细胞及其亚型的分子机制, 可能为脑 梗死病情预测及治疗提供新策略 4 参考文献 [1] Petrovicdjergovic D, Gooewardea SN, Pisky DJ. Iflammatory disequilibrium i stroke[j]. Circulatio Research, 216, 119 (1): [2] Ito M, Kodo T, Shichita T, et al. Post-ischemic iate immuity ad its applicatio for ovel therapeutic strategy targetig brai iflammatio[j]. Niho risho Japaese joural of cliical medicie, 213, 71(7): stress coditios i sheep moocytes/macrophages[j]. Oxidativemediciead cellular logevity, 215(5):1-11. ( 收稿日期 : ) [3] Shim R, Wog CH, Ischemia. Immuosuppressio ad ifectio- ( 本文编辑 : 陈丹 ) 浙江医学 217 年第 39 卷第 18 期 tacklig the predicamets of post-stroke complicatios[j]. Iteratioal joural of molecular scieces, 216, 17(1): [4] Zhag DP, Ya FL, Xu HQ, et al. Adecrease of huma leucocyte atige-d Rexpressio o moocytes i peripheral blood predicts stroke-associated ifectio i critically-ill patiets with acute stroke[j]. Europea joural of eurology, 29, 16(4): [5] Kaito M, Araya S, Godo Y, et al. Relevace of distict moocyte subsets tocliicalcourseof ischemicstroke patiets[j]. PloS oe, 213, 8(8):e6949. [6] Ziegler-Heitbrock L, Acuta P, Crowe S, et al. Nomeclature of moocytes ad dedritic cells i blood[j]. Blood, 21, 116(16): e74-8. [7] UrraX, Cervera A, Obach V, et al. Moocytes are major players i the progosis ad risk of ifectio after acute stroke[j]. Stroke, 29, 4(4): [8] 中华人民共和国卫生部. 医院感染诊断标准 ( 试行 )[J]. 中华医学杂志, 21, 81(5): [9] Heidt T, Sager HB, Courties G, et al. Chroicvariablestress activates hematopoietic stem cells[j]. Nature medicie, 214, 2(7): [1] Auffray C, Sieweke MH, Geissma F. Blood moocytes: developmet, heterogeeity, ad relatioship with dedritic cells [J]. AualReview of Immuology, 29, 27(1): [11] Cros J, Cagard N, Woollard K, et al. Huma CD14dim moocytes patrol ad sese ucleic acids ad viruses via TLR7 ad TLR8receptors[J]. Immuity, 21, 33(3): [12] Auffray C, Fogg D, Garfa M, et al. Moitorig of blood vessels ad tissues by apopulatio of moocyteswith patrollig behavior[j]. Sciece, 27, 317(5838): [13] Rojas J, Salazar J, Martiez MS, et al. Macrophage heterogeeity ad plasticity: Impact of macrophage biomarkers o atherosclerosis[j]. Scietifica, 215, (3): [14] Korkosz M, Bukowska-Strakova K, Sadis S, et al. Moocloal atibodies agaist macrophage coloy-stimulatig factor dimiish the umber of circulatig itermediate ad oclassical [CD14(++)CD16(+)/CD14(+)CD16(++)] moocytes i rheumatoid arthritis patiet[j]. Blood, 212, 119(22): [15] Rog MY, Wag CH, Wu ZB, et al. Platelets iduce aproiflammatory pheotype i moocytes via the CD147 pathway i rheumatoid arthritis[j]. Arthritis research &therapy, 214, 16(6): 478. [16] Waschbisch A, Schroder S, Schrauder D, et al. Pivotal role for CD16 + moocytes i immue surveillace of the cetral ervous system[j]. JImmuol, 216, 196(4): [17] Deg S, Yu K, Zhag B, et al. Toll-like receptor 4promotes NO sythesis by upregulatig GCHI expressio uder oxidative 1552

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