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1 图书在版编目 (CIF) 数据 现代免疫学检验与临床车至香, 刘春主编. 济南 : 山东科学技术出版社, ISBN I. 现... II. 1 车...2 刘... 田.1 免疫学检验技术 2 免疫学临床应用 N.R392 中国版本图书馆 CIF 数据核宇 (2004) 第 号 现代免疫学检验与临床 主编车至香刘春 副主编王长印卢志明 出版者 : 山东科学技术出版社 地址济南市玉函路 16 号 邮编 电话 (0531) 网址 WNW.lkj. cor 孔 en 电子邮件 s 妇也 j@jn-publie. o0.eninfo.net 发行者 : 山东科学技术出版社 地址济南市玉函路 16 号 邮编 电话 ( 0531) 印刷者 : 山东新华印刷厂临沂厂 地址临沂市解放路 76 号 邮编 电话 (0539) 开本 787 m:n X 1092m:n 1 16 印张 字数 500 千 版次 2004 年 8 月第 1 版第 1 次印刷 ISBN R 1012 定价 :40.00 元

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3 目 IJ... E 司 免疫学是生命科学的前沿学科, 又是紧密联系实际的应用 学科, 是临床医学的重要基础, 它阐述了许多疾病的发病机理, 并且是许多疾病诊断和治疗的理论依据和重要的技术手段 该 学科发展迅速, 大量新的免疫学理论 新的免疫学实验技术不断 创立 临床免疫学检验朝着自动化 网络化发展 面对快速发 展新理论 新技术的挑战, 工作在第一线的检验人员必须不断地 学习新的临床免疫学知识, 了解新的检验项目 基本原理, 熟练 掌握各种新的检测手段, 提高对检测结果分析和判断的能力 我们根据自己的临床实践, 参阅了国内外部分新资料 新技术 过 II 岛叶飞 新方法, 编写了 现代免疫学检验与临床 >~ 书, 供检验工作者 检验系学生及临床医生参考之用 本书内容共分三部分 : 第一篇主要介绍免疫学基础知识, 包括免疫系统概论 抗原 抗体和抗原抗体反应 抗原提呈和免疫应答 主要组织相容性复合体 T 淋巴细胞的成熟 i 舌化和分化 B 淋巴细胞的产生 活化和分化以及细胞因子及其受体等内容 ; 第二篇主要介绍免疫学技术相关的内容, 包括免疫细胞的检测 免疫分子的检测 免疫浊度分析技术 酶免疫分析技术 免疫荧光标记技术 化学发光免疫测定技术 放射免疫技术和流式细胞术等内容 ; 第三篇主要介绍临床免疫相关的部分内容, 包括肝脏免疫病和免疫学检测 肾脏疾病与免疫学检测 自身免疫及自身免疫病与免疫学检测 AIDS 及免疫缺陷病与免疫学检测 免疫增殖性疾病与免疫学检测 感染免疫 移植免疫学 肿瘤免疫学等内容 本书是大家集思广益, 共同努力的结晶 参编人员中多数是中青年博士 硕士生等一批具有丰富临床经验的业务骨干, 大家在编写过程中, 表现出极大的热情, 认真反复修正, 力求在书中概括反映出近代免疫学进展的内容和新技术 由于水平有限, 在编写中难免存在重复 遗漏或错误不妥之处, 我们诚恳希望得到读者和同行的批评和指正 最后, 我们对山东科学技术出版社在各方面给予的支持和帮助表示由衷的谢意 编者

4 目录 第一篇 免疫学基础知识 第一章免疫系统概论 1 第一节免疫学发展史 1 第二节固有免疫与获得性免疫 4 第三节免疫系统的基本组成 7 第二章抗原 抗体与补体 口第一节抗原 口 过 II 岛叶飞 第二节抗体 四 第三节补体 21 第四节 抗原抗体反应 n 第三章 抗原提呈与免疫应答 M 第一节 抗原提呈细胞 M 第二节抗原提呈 29 第三节 免疫应答概述 33 第四节 T 细胞介导的细胞免疫应答 35 第五节 B 细胞介导的体液免疫应答 38 第四章 主要组织相容性复合体 4 第一节概述 4 第二节 小鼠 H-2 基因复合体 41 第三节 人类主要组织相容性复合体 c 第四节 目 A 分子的分布 结构和功能 46 第五节目 A 与临床 第五章 T 淋巴细胞的成熟 活化和分化 55 第六章 B 淋巴细胞的产生 活化和分化 第一节 B 细胞在骨髓的发育 " 第二节 B 细胞的活化 71 第三节 B 细胞的增殖和分化 75 第七章 细胞因子 80 第一节 细胞因子概述 80 第二节 细胞因子受体 85 第三节 细胞因子的生物学作用 88

5 2 现代免疫学检验与临床 曰录第五节 免疫浊度法的应用与展望 142 第四节 细胞因子与某些病理过程的关系 89 第五节 细胞因子各论 91 第六节 细胞因子及其受体在临床中的应用 101 第二篇 免疫学技术 第八章 免疫细胞的检测 103 第一节 免疫细胞的分离与纯化 103 第二节 淋巴细胞及其亚群的检测 108 第三节 免疫细胞功能的测定 110 第四节 自然杀伤细胞的检测 115 第五节 红细胞免疫功能的检测 116 第九章 免疫分子的检测 118 第一节 免疫球蛋白的检测 118 第二节补体测定 118 第三节 细胞因子及其受体的检测 124 第四节 粘附分子的检测 131 第十章 免疫浊度技术 133 第一节概述 133 第二节 免疫浊度测定法的基本原理 134 第三节 免疫浊度法的分类 137 第四节 免疫浊度法应用及测定中的注意事项 141 第十一章 酶免疫分析技术 146 第一节概述 146 第二节 酶免疫分析技术的分类 146 第三节 酶免疫分析相关仪器 150 第四节 酶免疫分析的应用 152 第十二章 免疫荧光标记技术 155 第一节概述 155 第二节荧光抗体 157 第三节 免疫荧光测定仪器 162 第四节 免疫荧光标记法的应用和展望 165 第十三章 化学发光免疫分析技术 168 第一节 化学发光免疫分析法 168 第二节 电化学发光免疫分析法 171 第十四章 放射免疫分析技术 173 第一节 放射免疫分析 173 第二节 免疫放射分析 178

6 代免疫学检验与临床 曰录第十五章 流式细胞技术 181 第一节 流式细胞术的发展史 181 第二节 流式细胞仪工作原理 182 第三节 流式细胞技术的临床应用 185 第三篇 临床免疫学检验 第十六章 肝脏疾病的免疫学检测 l 204 第一节 病毒性肝炎 204 第二节 肝纤维化与肝硬化 219 第三节 原发性胆汁性肝硬化 222 第四节 自身免疫性肝炎 224 第五节 原发性肝癌 225 第十七章 肾脏疾病与免疫 229 第一节 肾脏的生理结构和特点 229 第二节 引起肾脏疾病的免疫学因素 230 第三节 免疫性肾病的实验室检测 236 第十八童 自身免疫及自身免疫病与免疫学检测 241 第一节 自身免疫与自身免疫病 241 第二节 自身免疫病的发生机制 242 第三节 自身免疫病的免疫学检测 245 第十九章 免疫缺陷及 AIDS 病毒 m 第一节概述 250 第二节 原发性免疫缺陷病 250 第三节 继发性免疫缺陷病 257 第四节 获得性免疫缺陷综合征 258 第二十章 免疫增殖性疾病 265 第一节概述 265 第二节 常见的免疫增殖性疾病 265 第三节 免疫增殖性疾病的实验室检测 271 第二十一章 器官移植及其免疫学检验 278 第一节 器官移植及移植免疫概论 278 第二节 器官移植排斥反应的机制 281 第三节 移植免疫耐受 290 第四节 组织配型与器官移植 295 第五节 器官移植及移植排斥反应的实验室监测 302 第二十二章 肿瘤免疫 308 第一节概述 308 第二节 肿瘤发生的诱因及生成 现

7 4 现代免疫学检验与临床 曰第三节肿瘤抗原 310 第四节 抗肿瘤免疫效应 311 第五节 肿瘤的免疫逃逸机制 313 第六节 肿瘤的免疫治疗 314

8 阶男免疫系统概论且旱(immune)~ 词起源于拉丁语 " irnrnlll1is", 其原意是免除兵役或免除税收 在医学统概论免疫 第一篇 免疫学基础知识 上, 其意思是摆脱感染, 也就是机体抵抗病原微生物感染的能力, 并且认为都是对机体有 利的 免疫器官 免疫细胞和免疫分子共同构成免疫系统 (immune system), 免疫系统是保 护人或动物免受病原微生物和肿瘤侵袭的最有效的防御体系 它可以识别各种外来的抗 原, 并产生相应的细胞或分子来抵御外来物质的侵袭, 这些细胞和分子共同组成一个比神 经系统还要复杂的动态的网络系统 免疫系统识别外来抗原并产生相应反应的过程就是免疫应答 (immune response) 从 功能上来讲, 免疫应答可以分为相互关联的两部分 : 识别和应答 值得注意的是免疫识别 的特异性, 免疫系统可以通过识别化学结构的微小变化来区分两种外来病原体 进一步 讲, 免疫系统可以区分外来分子和机体自身的细胞和蛋白质分子 一旦外来生物体或非 感染性大分子被免疫系统识别免疫系统立即募集各式各样的细胞和分子产生适当的应 答, 也称作效应应答 (effector response), 从而消除或抑制外来物质的侵入 免疫系统可以 将初期的识别转化成各种不同的效应, 每一种效应针对一种特异的病原体 再次接触相 同的外来有机体时, 可以诱导一种记忆应答 (memory response), 特点是产生更快速和强烈 的免疫反应, 从而消除病原体并阻止疾病的发生 免疫性 (immun 町 ) 是指针对外来物质的 一种反应, 包括微生物和大分子物质 ( 如蛋白质和多聚糖 ), 而不管这种应答是生理性的还 是病理性的 免疫学 (irm 丑 unol 鸣 y) 作为一 n 相对的新兴学科, 仅有一百多年的历史 由于最初免疫 的含义是对传染性因子的抵抗力, 所以免疫学最初是作为细菌学的一部分, 随后作为微生 物学的一个分支, 逐渐发展成一门独立的学科 在现代免疫学中, 免疫是机体识别和排除 非己异物 ( 即抗原 ) 的能力 本质上讲就是机体识别 " 自己 " 和 " 非己 "( self - nonself), 从而 排除抗原性异物, 维持机体内环境的相对稳定性的一种反应 这种反应通常对机体是有 利的, 但是在有些条件下也可以对机体产生伤害, 不利于机体, 如器官移植排斥反应 自身 免疫病等 所菊口免疫学发展史早在公元前 5 世纪 Thucydides 描述了雅典的一次瘟疫, 他描述说康复的病人可以护理严重的病人而不会第二次感染这种疾病, 这是人们对免疫的最早的记载 有记录的最忏第一章免疫系

9 2 第一篇免疫学基础知识早的主动诱导免疫是公元 10 世纪由中国人进行的当时人们通过让儿童吸入康复后的天 花病人的皮屑或穿天花病人的衣服来预防天花的发生, 也就是通过接种人症预防天花, 这 是人类历史上最早的经验式免疫学应用的代表 直到 1798 年, 英国医生 Edward Jenner 发 明了牛症接种法, 他发现挤奶工人接触到患有牛症的奶牛后, 对当时致命的疾病天花产生 了免疫, 他解释是牛症的服液进入人体后可以保护人们免受天花的侵袭, 他这种技术在欧 洲得到了迅速的推广, 并逐渐取代了安全性较差的人症接种, 并由此引发了人们通过人工 免疫的方法预防传染病的开端经过将近两百年的努力终于在 1979 年 10 月 26 日由世 界卫生组织正式宣布在全球范围内消灭了天花取得了近代医学史上的一次巨大的胜利 Iρuis Pasteur 成功利用液体培养法培养了禽霍乱的致病菌并通过注射细菌培养液使 小鸡感染了霍乱 一个偶然的机会, 他用以前的培养液注射给了一些小鸡, 使小鸡出现了 症状, 但是, 令人吃惊的是这些小鸡又全部康复了 Pasteur 又把一些新鲜的细菌培养液注 射给这些小鸡, 他吃惊地发现, 这些小鸡全部没有发病 Paste 旧推测是由于在培养的过程 中细菌的毒力被削弱, 正是这种减毒的细菌使机体产生了抗病能力 为了纪念 Jenner 在 牛症接种方面做出的突出贡献, 他把这种减弱了毒力的菌株叫做疫苗 ( vaccine) 0 Pasteur 随后把这一发现应用到其他疾病, 并制备了炭瘟 鸡霍乱 狂犬病等病原微生物减毒活疫 苗, 建立了预防接种法 以后随着各种病原菌的发现, 进行了大量减毒疫苗的试验, 以免 疫的方法来预防和治疗疾病, 从而奠定了感染免疫的基础 1888 年德国学者 Von Behring 和日本学者北里在 Koch 研究所以白喉毒素免疫功物, 在血清中发现了抗白喉毒素的一种物质称之为抗毒素 并且发现可以通过抗毒素来对 抗白喉的感染, 开创了医学史上通过人工被动免疫治疗疾病的先河, 并由此引出了免疫学的一个重要分支血清学的发展 Behring 于 1891 年应用来自动物的免疫血清成功地治疗了一个白喉患者, 这是第一个被动免疫治疗的病例 为此他于 1901 年获得了诺贝尔医学奖 奥地利化学家 Karl Landsteiner 开创了免疫化学的先河 他用 { 国氨蛋白做抗原, 并且研究了抗原抗体反应的特异性从而带来了免疫学技术的飞速发展 Tiselius 和 Kabat (1 938) 建立了血清蛋白电泳技术, 从而证明了抗体活性存在于血清丙种球蛋白部分, 其后建立了分离纯化抗体球蛋白的方法, 为抗体理化性质的进一步研究奠定了基础 此后研 究的重点转向对抗体分子的结构与功能的研究 在 20 世纪 40 年代还建立了蛋白质抗原性分析的新方法, 如 Elek α~di 日及 α~chterlony 等人建立的凝胶扩散法 Grabar(1953 ) 等人建立的免疫电泳技术促进了对蛋白质抗原性的免疫化学分析, 从而发现了抗体分子的不均一性 由于抗体的纯化遇到了困难, 因而对抗体分子结构与功能的研究进展缓慢, 直到免疫生物学发展起来以后, 通过改进研究材料, 才使抗体分子结构与功能的研究取得了重大进展 在免疫学发展的过程中对抗感染免疫本质的认识从 19 世纪以来长期存在两种不同的学术观点 : 其一, 以俄国学者 E. Metchnikoff 为代表的细胞免疫学派 ; 其二, 以德国著名免疫学家 Ehrich 为代表的体液免疫学派 两派长期争论, 直到 1903 年 Wright 和 D:: mglas 发现了血清调理素并证实两种免疫因素相辅相成的关系以后才得到了统一 在现代细胞培养技术得到发展之前, 研究免疫细胞的活性是十分困难的, 而由于生物化学技术的发展, 体液免疫得到了充分的发展, 从而使细胞免疫受关注的程度落后于体液免疫 随着细

10 第一章胞培养技术的改进, 人们对淋巴细胞的认识更加深入 Bruce Glick 通过研究证实存在两种淋巴细胞 :T 淋巴细胞, 负责细胞免疫 ;B 淋巴细胞, 负责体液免疫 并且认识到这两个系统相互作用, 均是免疫应答所不可缺少的一部分, 至此关于细胞免疫和体液免疫的争论才真正得以解决 Ehrlich 在 Behring 工作的基础上创造性地提出了关于抗体产生的学说 1908 年他首先提出了抗体生成的侧链学说, 他认为抗毒素分子存在于细胞表面上, 当外毒素进入体内后与之特异性结合, 并剌激细胞产生更多的抗毒素分子, 自细胞表面脱落入血流即是抗毒素 在 20 世纪 30 年代 Haurowitz 等人认为抗体分子的结构是在抗原直接影响下形成的, 并提出了抗体生成的模板学说 ( template theory) 这一学说不承认产生抗体的细胞在其细胞膜上具有识别抗原的受体, 而是以抗原为主导, 决定了抗体的特异结构 这一学说在以后近 30 年的时间内限制了免疫学的发展, 直到细胞系选择学说提出后免疫学又有了新的进展 1957 年 Burnet 纠正了抗体形成的模板学说, 推出了克隆选择学说, 并很快得到公认 克隆选择学说为免疫生物学的发展奠定了理论基础 1974 年 Niels Jerne 又提出了抗体形成的免疫网络学说, 成为现代免疫学的又一重大发现 1945 年 附且发现异卵双生牛不同血型的两种细胞的嵌和现象, 并把这种现象称之为天然耐受 机体自我识别和免疫耐受学说的形成, 不仅对传统的免疫概念发出了挑战, 而且标志着现代免疫学的开端 免疫耐受理论的形成对器官移植 自身免疫病等的研究有重要的指导意义 1957 年后, 细胞免疫学重新兴起, 人类认识到特异性免疫是 T 淋巴细胞及 B 淋巴细胞对抗原剌激所进行的主动免疫应答过程的结果, 认识到细胞免疫和体液免疫的不同效应与协同功能 1977 年后, 由于分子免疫学的发展, 得以从基因活化的分子水平研究抗原剌激与淋巴细胞应答类型的内在联系与机制, 从而极大地促进了现代免疫学的发展 经过一百多年的发展, 免疫学己经从最初细菌学的一个分支, 发展成包括免疫生物学 分子免疫学 免疫遗传学 免疫病理学 免疫药理学 移植免疫学 老年免疫学 肿瘤免疫学和生殖免疫学等多个分支的一 n 综合性学科 但是不仅免疫学自身领域有待进一步 免疫系统概论3 发展, 而且, 学科之间的相互渗透又逐渐形成了许多边缘学科 随着自然科学的不断发展, 免疫学的研究领域也在不断扩展, 并且将更加深入 在免疫学发展的过程中, 众多免疫学家做出了重要的贡献, 现将部分获得诺贝尔奖的研究成果摘录如表 表 1-1 免疫学研究中诺贝尔奖获得者 年代 获得者 国家 研究成果 1901 &nil von Behring 德国 血清抗毒素, 血清疗法 1905 Robert Koch 德国 Koch 现象, 抗结核杆菌细胞免疫 1908 EI ie Metchnikoff 俄国 吞噬作用 细胞免疫理论 ( Metchnikoff) 和抗毒素 体液免疫 Paul Ehrlich 德国 理论 (Ehrlich) 在免疫中的作用 1913 αmrles Richet 法国 过敏性反应 1919 Jules Bordet 比利时 补体介导的溶菌作用 1930 Karl La 巳.d steiner 美国 发现了血型抗原 1951 肌 1axτbeiler 南非 研制了黄热病疫苗

11 第一篇信号转换免疫学基础知识( 续表 ) 年代 获得者 国家 研究成果 1957 Daniel Bavet 瑞士 抗组胶剂 1960 F.Macfarlane B 山 net 澳大利亚 发现了获得性免疫耐受 Peter Medawar 英国 1972 Rodney R. Porter 英国 抗体的化学结构 G 巳 aid 肌 1.Edelrnan 美国 1977 Rosalyn R. Yalow 美国 放射免疫测定技术 1980 George Snell 美国 主要组织相容性复合体的免疫调节作用 Jean Daussct 法国 Baruj Benacerraf 美国 1984 Cesar 肌咀 Istein 英国 单克隆抗体 Georges F. K hler 德国 Niels K.Jerne 丹麦 免疫调节理论 1987 Susurnu T,αlegawa 日本 抗体生成的基因重排 1990 E.D:mnallτbarnas 美国 移植免疫 Joseph Murray Peter C.Doherty 美国澳大利亚 主要组织相容性复合体在 T 细胞识别抗原中的作用 Rolf M.Zir 虫 ernagel 瑞士 1997 位 anley B Prusiner 美国 新的感染生物学理论 1999 Gunter Blobel 美国 第二币 国青免疫与获得性免疫 免疫系统作为机体抵抗微生物的屏障, 包括两部分 : 非特异性免疫 (non - specific im mun 町 ) 和特异性免疫 (specific immunity) 由于获得性免疫应答的形成需要一定的时间, 因此, 非特异性免疫, 也就是固有免疫 (innate immun 町 ) 为机体抵抗微生物的入侵提供第一道防御屏障 固有免疫是在种系发育进化过程中形成的经遗传获得的 由机体的解剖结构和生理功能所体现如机体的各种屏障结构 吞噬细胞及体液中抗微生物的物质 ( 如补体 细胞因子等 ), 在固有免疫中均起重要的作用 巨噬细胞通过吞噬并杀灭入侵的微生物, NK 细胞可以识别病毒感染的细胞并引起感染细胞的洛解, 巨噬细胞分泌的细胞因子通过炎症反应 巨噬细胞的活化等多种作用参与固有免疫, 补体系统通过洛解细菌 炎症反应 促进吞噬作用等发挥作用 与固有免疫相反, 特异性免疫, 即获得性免疫 (ada ptive immunity) 仅针对所感染的病原微生物, 只有受到抗原物质的侵袭以后, 获得性免疫才会形成 一般地讲, 初次接触某一抗原后 5~6 天就会形成特异的免疫应答 ; 将来再接触到相同的抗原就会导致记忆应答产生的应答较第一次接触时快速而强烈 固有免疫 与获得性免疫的区别见表 1-2 0

12 第一章表 1-2 固有免疫与获得性免疫 固有免疫 获得性免疫 特异性针对微生物的共同结构针对细菌抗原和其他抗原物质 特征 多样性有限多种多样 记忆性无有 自身无反应性是是 防御作用 皮肤 粘膜上皮及其表面的抗 菌物质等的屏障作用 上皮淋巴细胞及上皮表面产生 的抗体 组成血浆蛋白补体抗体 细胞 吞噬细胞 ( 巨噬细胞 嗜中性粒 细胞 ) NK 细胞 淋巴细胞 一. 固有免疫 固有免疫包含四种防御屏障 : 解剖屏障 生理屏障 吞噬细胞和炎症 固有免疫消灭病原微生物, 主要是通过巨噬细胞 NK 细胞 细胞因子及补体等发挥作用 (~) 解剖屏障解剖屏障主要包括皮肤和粘膜屏障, 另外还有血脑屏障和胎盘屏障 完整的皮肤和粘膜是阻止微生物入侵的第一道屏障, 主要通过机械阻挡和排除作用 局部 分泌液的抗菌作用和正常菌群的拮抗作用来阻挡病原微生物的侵入 各种原因引起的机体免疫功能下降时, 平时对机体无害的正常菌群或毒力甚弱的外源微生物就可能造成感染, 称为机会感染 血脑屏障主要是阻止细菌和一些生物大分子进入脑部, 保护中枢神经系统, 小儿由于血脑屏障发育不完善, 容易发生脑部感染 胎盘屏障主要是阻止母体内可能存在的微生物穿过, 从而保护胎儿免受感染 ( 二 ) 生理屏障生理屏障主要包括体温 低 ph 和化学调节剂 发热多是由细菌引起, 特别是革兰阴性细菌内毒素, 一般作为内源性致热源释放 另外, 单核细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子也可以引起发热反应 发热时可以抑制一些病原微生物的生长 由于大多数经食道进入胃的细菌难以在胃内低 ph 条件下存活, 因此, 低 ph 也是一种防御屏 免疫系统概论5 障 许多可洛性分子也起到屏障作用例如 : 洛菌酶 干扰素 补体和 C 反应蛋白等 洛菌酶可以洛解细菌的细胞壁, 干扰素可以作用于附近的免疫细胞, 诱导抗病毒作用, 补体的激活则可以洛解病原微生物和促进巨噬细胞的吞噬作用 ( 三 ) 吞噬作用 (phagocytosis) 吞噬作用是指侵入机体的异物颗粒 ( 如细菌 ) 被某些细胞摄取和破坏的过程, 这是一种低等生物就具有的防御功能 吞噬细胞主要包括中性粒细胞 单核细胞和巨噬细胞 在感染的急性期, 渗出的炎症细胞主要是中性粒细胞, 慢性炎症则以巨噬细胞为主 它们可以吞噬并杀灭和消化细菌, 另外, 巨噬细胞还可以吞噬炎症部位的中性粒细胞残骸, 有助于组织修复 ( 四 ) 炎症 ( inflammatio 川固有免疫的早期阶段表现为局部炎症反应 炎症是一种复杂的生理过程, 是机体的一种保护性反应, 参与炎症反应的成分包括神经 体液 细胞等 参与炎症反应的细胞主要是多形核白细胞, 一般在 30~60 mi 口内到达炎症部位, 吞噬病灶内的微生物, 同时释放洛酶体酶, 杀伤病原微生物或对组织造成损伤 如果炎症诱因持续存在, 5~6 h 后, 巨噬细胞和淋巴细胞也浸润到炎症部位, 加强该部位的防御自 E 力 淋巴细胞激活后释放的淋巴因子可以活化巨噬细胞加速对病原体的破坏和清除 炎症所导

13 6 第一篇免疫学基础知识致的全身性反应可以增强固有免疫系统清除感染的能力但严重感染所引起的炎症则有可能导致全身组织损伤, 甚至死亡 二. 获得性免疫获得性免疫是指机体经接触抗原物质后获得的免疫是针对某一特定抗原的特有的免疫, 所以又称为特异性免疫 这种免疫作用有明显的针对性, 即机体受到某一病原 ( 抗原 ) 的剌激后, 通过适应性应答获得免疫力, 这种免疫力只对这种特定的病原 ( 抗原 ) 有作用, 而对其他的病原 ( 抗原 ) 不起作用 特异性免疫主要是由 T B 淋巴细胞完成 通常所指的免疫, 均是特异性免疫 根据参与免疫反应的细胞及其产生的效应, 获得性免疫应答可以分为体液免疫和细胞免疫 (~) 体液免疫 (humoral immunity) 体液免疫是由 B 淋巴细胞介导的免疫应答, B 细胞受抗原剌激后, 通过活化 增殖和分化, 最后成为浆细胞并合成和分泌抗体 抗体与相应的抗原结合可以直接发挥效应也可以通过补体系统 K 细胞等的参与间接发挥效应 部分 B 细胞受抗原剌激后不向浆细胞分化, 而是转变成记忆性 B 细胞, 机体再次受同样的抗原剌激后, 可以迅速产生抗体, 并在校长的时间内维持较高的水平 由于抗体多在体液中发挥效应, 故称为体液免疫应答或抗体介导的免疫应答 (antibody mediated immune response) 体液免疫的作用主要是对抗细胞外微生物及其分泌的毒素 体液免疫发生效应的机制主要有中和作用 调理作用 抗体依赖细胞介导的细胞毒效应等 中和作用 ( 归且 eutralizatior 物表面的抗原或其毒素结合, 阻断了其与宿主细胞上的受体的结合, 从而发挥抗微生物及其毒素的作用 调理作用 ( opsonization) 是指抗体 补体促进吞噬细胞吞噬细胞 细菌等颗粒性抗原的作用 调理作用主要是 19G 型抗体 ( 特别是 19G 1 和 19G3) 的 Fc 段与中性粒细胞 巨噬细胞上的 Fc 受体结合, 从而向细胞内传递活化信号, 增强吞噬细胞的吞噬作用 抗体依赖细胞介导的细胞毒效应 (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 是指某些细胞通过其表面的 Fc 受体识别抗体的 Fc 段直接杀伤被抗体包被的靶细胞 这类细胞主要包括 NK 细胞 巨噬细胞和中性粒细胞 抗体与靶细胞表面的抗原结合是特异性的, 而效应细胞的杀伤作用是非特异性的 ( 二 ) 细胞免疫 (cellular immunity) 细胞免疫是由 T 淋巴细胞介导的免疫应答, T 淋巴细胞受特异性抗原剌激后活化 增殖 分化成效应性 T 淋巴细胞, 后者通过直接杀伤带有特异性抗原的靶细胞或产生多种具有生物活性的淋巴因子, 诱导炎症反应, 从而达到清除抗原的作用 因此, 细胞免疫是通过致敏淋巴细胞 淋巴因子和其他炎症细胞共同完成的 细胞介导的免疫是机体抗细胞内微生物和肿瘤的主要防御机制, 包括 :1 CD4 +T H1 细胞针对吞噬细胞吞噬体内的微生物产生细胞因子活化巨噬细胞来诱导炎症反应 2 CD4 +TH2 细胞释放细胞因子, 促进 B 细胞产生抗体, 参与体液免疫, 还可抑制巨噬细胞的活化, 可以局限炎症造成的组织损伤 另外, 通过激发以嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润为主的炎症反应, 是防御寄生虫感染的主要机制 3 's+t 细胞主要针对包括非吞噬细胞在内的各种细胞胞内感染和复制的微生物可以杀伤感染的细胞清除感染灶 其杀伤靶 细胞的机制包括两个方面 : 穿孔素 颗粒酶的作用是其介导靶细胞洛解的主要机制, 穿孔 素是细胞毒性 T 细胞中以单体形式存在的穿孔蛋白通过在靶细胞细胞膜上形成多聚体 而形成一个孔道, 如果形成的孔道足够多, 就可造成细胞内水的大量流失, 引起细胞渗透

14 第一章性洛解或由于高浓度 Ca 2 + 的内流引起细胞死亡 ; 另一方面是通过 Fas 和 FasL 的相互作 用, 导致细胞的调亡 所菊一一一口免疫系统的基本组成免疫系统由免疫器官 免疫细胞和免疫分子 ( 抗体 补体 淋巴因子等 ) 共同组成, 是免疫应答的物质基础 免疫器官是免疫细胞分化 增殖或定居的场所, 免疫器官又可以分为中枢免疫器官 (central immune organ) 和外周免疫器官 (peripheral immune organ) 通过血管和淋巴管把这些器官联系在一起, 并组成一个完整的功能单位 血管 淋巴管和淋巴器官中存在的大量的各种各样的细胞参与免疫应答过程, 在这些细胞中, 只有淋巴细胞具有获得性免疫应答的特点, 即 : 多样性 特异性 记忆作用以及自我非我的识别能力 其他细胞在获得性免疫应答过程中起辅助作用, 例如 : 辅助淋巴细胞的激活 增加巨噬细胞清除抗原的能力或分泌各种各样的免疫效应分子等 一些白细胞, 特别是淋巴细胞可以分泌多种叫做细胞因子的蛋白质分子, 这些分子可以调节内分泌系统, 并且在免疫应答的调节过程中起重要的作用 本节主要讨论免疫器官和免疫细胞, 关于免疫分子将在以后的章节中进行讨论 一. 中枢免疫器官中枢免疫器官是免疫细胞产生 发育 接受抗原 ( 主要是自身抗原 ) 剌激和分化 成熟的场所, 并对外周免疫器官的发育起主导作用, 对免疫应答的发生具有决定性的作用 中枢免疫器官包括胸腺 骨髓和腔上囊 ( 鸟类特有 ) 腔上囊位于总泄殖腔后, 是鸟类的中枢免疫器官, 为 B 细胞分化成熟的场所 (~) 胸腺 ( thymus) 胸腺是位于胸腔前纵阳的腺体组织, 在胚胎第 6 周由第三 四对咽囊的内胚层分化而来, 是胚胎期第一个出现的免疫器官 胸腺的重量和结构随年龄和机体状态而改变 : 出生时重 1O~15 g, 出生后迅速增大, 至青春期达到 30~40 g; 青春期过后开始缓慢退缩, 老年期胸腺组织大部分被脂肪组织所取代, 但仍残留一定的功能 胸腺由皮质和髓质组成 骨髓来源的前 T 细胞进入胸腺后在皮质内迅速大量增生, 另外, 皮质中还有上皮细胞 树突状细胞和巨噬细胞等 皮质由浅层至深层, 淋巴细胞由大变小, 显示淋巴细胞增生 分化 成熟的个体发育过程 髓质中主要含较多的上皮细胞, 较少的淋巴细胞 j 对突状细胞和巨噬细胞 髓质内散在分布的胸腺小体是胸腺正常发育的标志 胸腺是 T 细胞分化成熟的主要场所, 前 T 细胞必须在胸腺中经历阳性选择和阴性选择才能分化为具有岛任 -IC 限制性识别能力的 对自身抗原耐受的成熟 T 细胞 ; 胸腺还具有重要的免疫调节功能, 胸腺基质细胞分泌的胸腺激素和细胞因子是 T 细胞成熟的必要条件 ; 胸腺还是建立自身耐受及维持免疫自稳的重要器官 ( 二 ) 骨髓 (bone marrow) 指红骨髓, 是人和其他哺乳动物的造血器官, 也是各种免疫细胞的发源地 骨髓的干细胞具有强大的分化潜力, 可在某些因素作用下分化为不同的造血祖细胞, 进而分化为形态和功能都不相同的髓样干细胞和淋巴干细胞 ; 前者分化为红细胞系 粒细胞系 单核巨噬细胞系和巨核细胞系, 后者发育为淋巴细胞系 另外,B 细胞在骨髓微环境和激素样物质的作用下发育为成熟的 B 细胞, 还含有成熟 T 细胞和浆细胞, 也是再次免疫应答发生的主要部位 因此, 骨髓兼有中枢和外周免疫器官的作用 忏免疫系统概论7

15 8 第一篇免疫学基础知识二. 外周免疫器官外用免疫器官是成熟淋巴细胞定居的场所, 也是这些淋巴细胞对外来抗原产生免疫应答的部位之一 外周免疫器官包括淋巴结 脾脏 扁桃体和粘膜淋巴组织 外周免疫器官有两大功能 : 一是有效地捕捉和浓缩外来抗原二是产生抗原特异性 T 淋巴细胞和抗体 (~) 淋巴结人体共有 500~600 个淋巴结, 主要位于非粘膜部位 淋巴结广泛分布于全身淋巴回流的通路上, 处于机体防御的重要部位, 如颈 腋窝 肘 腹股沟 日 l 元系膜和肺 n 等部位, 是易受微生物或其他抗原异物侵入的部位 淋巴结实质分为皮质和髓质两部分 浅皮质区是 B 细胞定居的部位称为非胸腺依赖 区大量 B 细胞聚集形成滤泡 ; 无生发中心的滤泡称为原始滤泡其中多为未受抗原剌激的 成熟的 静息的 B 细胞 ; 在对抗原剌激的应答中发育起来的生发中心含有许多大淋巴细胞, 是增生分化的 B 淋巴母细胞, 这些细胞向髓质迁移并转化为浆细胞, 可产生与抗原有高亲和力的抗体 浅皮质区与髓质之间的部位称作副皮质区是 T 细胞居留的部位称为胸腺依赖 区 其中主要为 m4 +T H 细胞和少部分的 ω's+t 细胞 髓质内含有散在的淋巴细胞 大量的巨噬细胞和树 突状细胞 淋巴结的功能包括 :1 免疫细胞居留的场所, T 细胞主要位于副皮质区, B 细胞主要位于浅皮质区 ;2 发生初始免疫应答的场所 ;3 参与淋巴细胞的再循环 ;4 过滤作 用 ( 二 ) 脾脏脾脏是人体最大的免疫器官, 也是血液循环中的一个过滤器, 是免疫活性 细胞受抗原剌激后增殖分化的场所 脾脏可分为红髓和白髓 白髓内的中央小动脉周围 淋巴喃是 T 细胞聚集的部位 红髓量多, 分布在白髓的周围, 分为髓索和髓窦 ; 髓索主要是 B 细胞聚集区, 也有树突状细胞和巨噬细胞 ; 髓索围成髓窦, 窦内为循环的血液, 侵入血液中的病原体等异物可被分布在髓索内的巨噬细胞和树突状细胞捕捉 吞噬和杀灭 脾脏是各类免疫细胞居留的场所也是对抗原物质产生免疫应答及产生免疫效应物质的 重要基地 ; 另外, 脾脏还具有过滤血液中的外来抗原和发生突变及衰老的自身细胞的功能 二. 免疫细胞免疫系统的主要功能是识别并排除体内的非己物质执行此功能的细胞均属免疫细胞 换言之, 凡是参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞统称免疫细胞 但是, 从严格意义上讲, 免疫细胞是指造血细胞起源的一类细胞 免疫细胞主要作为循环细胞存在于血液和淋巴液中, 分布在除中枢神经系统以外的几乎所有组织中, 其中大部分分布在淋巴器官中 免疫细胞根据其分化发育状况分为两部分 : 髓系和淋巴系 髓系来源的细胞包括树突状细胞 单核细胞 各种粒细胞 组织嗜碱细胞 血小板和红细胞 淋巴系来源的细胞包括 NK 细胞 T 细胞和 B 细胞 在免疫应答过程中, 起核心作用的是淋巴细胞, 其中能接受抗原剌激而活化 增殖 分化, 产生免疫效应物质 ( 抗体或致敏淋巴细胞 ), 并能进行特异性免疫反应的淋巴细胞称为免疫活性细胞 (~) 淋巴细胞淋巴细胞是构成机体免疫系统的主要细胞群体, 淋巴细胞的显著特征是其异质性, 具有许多表型和功能不同的群体, 包括 T 淋巴细胞 B 淋巴细胞和 NK 细胞等, T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞还可以分为若干亚群 这些淋巴细胞群及其亚群在免疫应答过程中相互制约 互相协作, 共同完成对外来抗原物质的识别 应答和清除, 从而维持

16 一章机体内环境的稳定 淋巴细胞虽然在形态上相似, 但是其功能和细胞表面的标志有明显 的差异 ( 表 1-3) 表 1-3 淋巴细胞及其亚群的表面标志 T 细胞表面标志功能 B 细胞 NK 细胞 T H Tc CD, 粘附分子, 信号传导 CD:J T 细胞受体信号传导元件 + + CD4 结合 MHC II 类分子, 信号传导 + CDs 不详 CI 与结合 MHC I 类分子, 信号传导 + + C0 16 (FeγRill) IgG Fe 段低亲和力受体 + C0 21 (CR2) 补体 (C3d) 和 EB 病毒受体 + C 口叼抗原提呈细胞表面 B7 受体 + + CO, 2 (FeγRill) IgG Fe 段受体 + CR 补体 (C3b) 受体 + CD40 信号传导 + CD4s 信号传导 CD 到粘附分子 + T 淋巴细胞是胸腺依赖性淋巴细胞的简称, 这类细胞发生于骨髓, 然后迁移至胸腺, 第并在此经过一系列有序的分化过程才能发育成为成熟的 T 淋巴细胞, T 淋巴细胞还可以 进一步分化成各种不同的功能亚群, T 淋巴细胞发育分化的过程将在以后的章节中详细 描述 根据 T 淋巴细胞的功能特点可以分为调节性 T 细胞, 包括辅助性 T 细胞 (helper T lymphocyte, TH ) 和抑制性 T 细胞 (suppressor T lymphocyte, Ts ) ; 效应性 T 细胞, 包括细胞毒性 T 细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CIL 或 cytotoxic T cell, Tc ) 和迟发型超敏反应 T 细胞 (delayed type hypersensitivity T lyr 叩 hocyte, TDIH ) 它们对抗原的识别具有特异性, 并且只识别暴露 免疫系统概论9 于辅助细胞表面并与主要组织相容性复合体 ( 岛 1HC) 结合的蛋白质多肤抗原, 并产生免疫应答 辅助 T 细胞受抗原剌激后, 产生细胞因子 ( cytokine), 促进 T 细胞和其他细胞 ( 包括 B 细胞和巨噬细胞 ) 的增殖和分化 ; 细胞因子还可以吸引和活化炎症细胞, 使特异性 T 细胞免疫和非特异性的炎症性应答建立起重要的联系 细胞毒性 T 细胞接受抗原剌激以 后, 活化为抗原特异性 CIL 效应细胞, 发挥特异性杀伤靶细胞的功能 Ts 细胞的功能是 抑制免疫应答的活化过程, 其靶细胞主要是抗原特异性的 TH 细胞和 B 细胞 B 淋巴细胞是由哺乳动物的骨髓或鸟类的法氏囊中的淋巴样前体细胞发育分化形成的具有抗体生成能力的细胞, B 淋巴细胞的抗原受体是细胞表面的膜结合免疫球蛋白, 也是 B 淋巴细胞的特征性表面标志 抗原与 B 细胞表面的免疫球蛋白分子结合后引起 B 细胞的活化 增殖和分化, 最终分化成可以分泌抗体的浆细胞, 进而产生特异性的抗体, 发挥体液免疫的功能 B 淋巴细胞的活化 增殖和分化的过程将在以后的章节中详细地讨论 成熟 B 淋巴细胞主要定居在淋巴结皮质浅层的淋巴小节和脾脏的红髓及白髓的淋巴小节内 根据 B 淋巴细胞表面是否表达 m5, 可以将 B 淋巴细胞分为 Bl( 5+ ) 细胞和 B2( 5- ) 细胞两个亚群 ;B1 细胞在机体内出现较早, 产生后即成为具有自我更新能力的长寿细胞, 其产生的抗体多为低亲和力的抗体, 主要参与抗细菌感染的粘膜免疫应答, 另

17 一篇免疫学基础知识10 第外, 还与自身免疫病相关 B2 细胞亚群就是通常参与体液免疫应答的 B 淋巴细胞, 此外, B2 细胞还具有抗原提呈和免疫调节功能 除 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞外, 还有一类淋巴细胞, 它们不表达 T 或 B 淋巴细胞的表面标志, 这类细胞包括自然杀伤细胞 (natural killer, NK) 杀伤细胞 (killer, K) 等, 其中主要是 NK 细胞, 这类细胞由于胞浆内有许多嗜苯肢颗粒故被称作大颗粒淋巴细胞 ( large granular lymphocytes, IβL), 在没有明显的抗原剌激的情况下可以洛解肿瘤细胞和病毒感染的细胞, 具有抗肿瘤 抗病毒和免疫调节的功能 NK 细胞还参与移植排斥反应 自身免疫病和超敏反应的发生 ( 二 ) 抗原提呈细胞抗原提呈细胞 (antigen presenting cell, APC) 是指能捕捉 加工 处理抗原, 并将抗原提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞 根据抗原提呈细胞表面是否表达岛 1HC- II 类抗原及其他参与 T 细胞激活的共剌激分子, 可将抗原提呈细胞分为专职和兼职两大类 : 专职抗原提呈细胞包括树突状细胞 单核细胞 巨噬细胞和 B 细胞等, 这类细胞均能表达高水平的岛任 -[C- II 类抗原及共剌激分子 ; 兼职抗原提呈细胞包括血管内皮细胞 上皮细胞 间质细胞和活化的 T 细胞等, 这类细胞通常情况下不表达岛任 -[C H 类抗原, 亦无抗原提呈能力, 但在炎症过程中或受到某些活性分子 ( 如 IFN γ) 剌激后, 可以表达岛任 -[C- II 类抗原, 并能处理和提呈抗原 树突状细胞 (dendritic cell, 配 ) 是最重要的一类抗原提呈细胞, 广泛分布于机体的各种组织和器官中, 根据树突状细胞的生物学特征和部位的不同, 其命名也各不相同, 如 : 滤泡树突状细胞 并指状细胞 朗格汉斯细胞等 树突状细胞是体内提呈抗原能力最强的一 类抗原提呈细胞 ; 另外, 还参与 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞的发育 分化和激活, 并具有免疫调节和免疫监视的功能 树突 1 文细胞参与多种疾病的发病过程, 如肿瘤 自身免疫病 过敏性疾病 感染性疾病等 骨髓内的前单核细胞 外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞共同构成单核吞噬 细胞系统 (mononuclear phagocyte system, MPS) 单核细胞仅在血液中存留几个小时至几天的时间, 即移行至全身各组织器官内, 发育成熟为巨噬细胞 单核细胞和巨噬细胞不仅具有吞噬功能, 还具有抗感染 抗肿瘤及参与免疫应答和免疫调节等功能 巨噬细胞在机体特异性和非特异性免疫中均发挥重要作用 B 细胞也是一类重要的专职抗原提呈细胞, B 细胞主要通过表面的 B 细胞受体特异性摄取抗原, 然后进行加工并提呈给 CD4 +T 细胞, 同时还可诱导 B 细胞分泌细胞因子, 促使 B 细胞的增生分化, 使 B 细胞转化为浆细胞, 合成和分泌抗体 ( 三 ) 其他免疫相关细胞除淋巴细胞和抗原提呈细胞外, 造血干细胞 红细胞和各种粒细胞等均参与免疫应答过程, 也属于免疫细胞 造血干细胞是存在于组织中的一群原始造血细胞, 它们可以存在于造血组织及血液中, 是机体各种血细胞 ( 包括多数免疫细胞 ) 的共同来源 成年人的造血干细胞主要分布在红骨髓 脾脏及淋巴结中, 其中以红骨髓最为重要 造血干细胞包括三个不同分化水平的干细胞, 即多能干细胞 定向干细胞及其子代细胞的干细胞 定向干细胞包括髓系干细胞和淋巴系干细胞 ; 前者可以分化为红系干细胞 粒细胞单核细胞系干细胞 巨核系干细胞, 并进一步分化为相应的成熟血细胞, 后者可分化为前体 B 细胞和前体 T 细胞, 分别发育成成熟的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞

18 344 统概论中性粒细胞是外周血中数目最多的有核细胞 中性粒细胞胞浆中有大小较一致 分布均匀的颗粒, 其中含有多种洛酶体酶, 可参与中性粒细胞的生物学功能, 也与某些病理损伤有关 中性粒细胞具有多种生物学功能, 包括趋化性 吞噬作用 杀菌作用 抗病毒作用和免疫调节作用等 嗜酸性粒细胞具有对速发型超敏反应的拮抗和调节作用 吞噬作用 抗寄生虫感染以及产生炎症介质的作用 嗜碱性粒细胞和肥大细胞主要参与速发型超敏反应, 也参与机体抗肿瘤免疫应答, 或与其他一些疾病有关 红细胞在机体免疫应答中也有一定作用包括增强吞噬作用 清除循环免疫复合物 识别和携带抗原 增强 T 细胞依赖性应答还具有效应细胞的作用 参号文献 1 Vercelli D. Innate immunity: sensing the environment and regulating the regulators. Curr Orin Allergy Clin Immunol 2003 ;3(5) : 343~346 2 Carlyle JR, Michie AM, Furlonger C, et al. Identification of a novel developmental stage marking lineage commitment of pre 息时 litor thymocytes.j ExpMed 1997; 186(2) : 173~ Ruslan Medzhitov, Charles Janeway. Advances in Immunology: Innate ImmunitY. N Engl J Med 2000; 343 (5) :338 ~ 第4 von Andrian U. H., Mackay C. R.Advances in Immunology: T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.N Engl J Med 2000;343(14) :1020~ Peter J. Delver, Ivan M.Roitt.Advances in Immunology: The Immune System First of Two Parts.N Engl J Med 2000;343(1):37~49 6 Abul K. Abbas, Andrew H. Lightman, Jordan S. Pober. Cellular and Molecular Immunology, 4 吐 1 edition. W B Saunders ; (2000) 7 William E.Pau1. Fundamental Immunol 唱 T.5th edition. Philadephia: Lippincott Williams & Wilkins Publishers; (2003) 8 Charles A.Janeway, Paul Travers, Mark Walp 口口, et al. Immunobiology: The Immune System in Health & Dis ease.5th Edition. New York: Garland Science Publishing; (2001) 9 Aderm A, and LM Underhill.Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Imm und 西 ;y 17: 593~ 623, 邹雄, 张利宁分子免疫学与临床济南 : 山东科学技术出版社, Helen Chapel, Mansel Haeney, and Siraj Misbah et a!. Essentials of Clinical Immunol 唱 y.4 th Edition.IDN 以 JN: Blackwell Science LτD, (1999) 12 Gabriel Virella.Introduction to Medical Immunology.4th Edition.NEW YORK: MARCEL DEKKER, INC. (1997) 13 Richard A. Goldsby, τhα 口 as J.Kindt, Barbara A. Osborne and Janis Kuby. Immunol 唱 y.5th edition.new YORK: W.H.Freeman & Co. (2003) 14 沈霞主编. 临床免疫学与免疫学检验新技术. 北京. 人民军医出版社, 赵武述, 陈仁, 下志强. 现代临床免疫学北京. 人民军医出版社, 一章免疫系

19 口抗忏一篇免疫学基础知识第二章 抗原 抗体与补体 原 一. 概述 抗原 (antigen, Ag) 是一类能剌激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答 并能与相应 免疫应答产物 ( 抗体和或致敏淋巴细胞 ) 在体内或体外发生特异性结合 发生免疫反应的 物质, 亦称免疫原 ( immunogen) 抗原的前一种性能称为免疫原性 (immune 皂白 :licity), 即抗原 能剌激特异性免疫细胞, 使之活化 增生 分化, 最终产生免疫效应物质 ( 抗体和致敏淋巴 细胞 ) 的特性 ; 后一种性能称为抗原性 (antigenicity), 即抗原可在体内外与相应的免疫效应 物质发生特异性结合, 引起免疫反应的特性 根据上述特性, 可将抗原分为两类 :1 完全抗原 : 凡具有免疫原性和抗原性的物质称 为完全抗原 (complete antigen), 如大多数蛋白质 细菌 病毒等 2 半抗原 : 只有抗原性而 无免疫原性的物质称为半抗原 (hapten) 或不完全抗原 (i 日 cor 叩 lete antigen), 多为简单的小分 子物质, 它们单独作用时无免疫原性,{E! 与蛋白质载体 (carr 町 ) 结合后可具有免疫原性, 大 多数的多糖 类脂 某些药物等均属于半抗原 有些抗原能剌激机体发生病理性免疫应答即产生超敏反应此类抗原称为变应原 在某些特定条件下, 抗原可诱导机体对该抗原表现出特异性无应答状态, 即产生免疫耐受 性, 此类抗原称为耐受原 二. 抗原的性质 (~) 异物性异物性是作为抗原物质的首要条件 所谓异物, 是指化学结构与宿主 自身成分不同, 或机体的免疫活性细胞从未接触过的物质 在正常情况下, 自身组织或细胞对机体本身无免疫原性, 只有异种或异体物质, 以及 那些化学组成或结构发生改变的 由于某种因素而暴露的 在胚胎期与机体免疫系统隔绝 的自身物质, 才能诱导宿主的免疫应答, 即只有非己抗原才能引起免疫应答 具备异物性 的物质有以下 3 种 : 1. 异种物质绝大多数抗原都是异种物质如微生物及其代谢产物 其他种属动物 的血清蛋白及组织细胞等, 均可剌激机体产生免疫应答 一般种属关系越远, 免疫原性越 强 ; 反之, 种属关系越近, 则免疫原性越弱 2. 同种异体物质同一种属不同个体之间, 由于遗传基因不同, 其相同组织及细胞 表面的化学结构也有差异, 因此, 同种异体物质也是良好的抗原 如人类红细胞表面有 A B 不同的血型抗原可据此将血型分为 A B 0 和 AB 四种类型 人类的白细胞及其他 有核细胞表面, 存在组织相容性抗原 因此, 在不同血型个体之间输血或不同个体之间进 行器官移植时, 将会引起洛血性输血反应及移植排斥反应 所菊12 第3. 改变或隐蔽的自身物质自身物质通常对机体没有免疫原性, 但在外伤 感染 电

20 第一一章离辐射 药物等影响下, 自身组织结构发生改变或一些与免疫系统隔绝的自身物质 ( 即隐蔽的自身抗原 ) 被释放出来, 即可成为自身抗原, 剌激机体产生免疫应答, 引起免疫损伤, 严重者可造成自身免疫性疾病 ( 二 ) 理化性质 1. 大分子物质凡具有免疫原性的物质通常都是大分子物质, 分子量均在 以上 一般地说, 分子量越大, 抗原性也越强 异种蛋白质 多糖等天然抗原物质, 均为大分子物质, 纯化多糖 糖蛋白或糖脂蛋白复合物中的多糖分子均有较好的免疫原性 而小分子的多肤以及核酸分子则免疫原性较弱或无免疫原性, 分子量在 以下的肤类及其他物质大多无免疫原性, 分子量介于 5 000~ 1O 000 之间的肤类则为弱抗原 因此, 高分子物质如果水解为低分子物质后其抗原性减弱或者消失 2. 化学组成与结构大分子物质并不一定都具有良好的免疫原性, 如明胶分子量可达到 , 但因其组成为直链氨基酸, 易在体内降解为低分子量物质, 故其免疫原性很弱 ; 若在明胶分子上连接少量酷氨酸 谷氨酸等氨基酸, 则能显著增强其免疫原性 从组成上看, 大多数蛋白质都是良好的抗原, 凡含有大量芳香族氨基酸的蛋白质其免疫原性要明显高于以非芳香族氨基酸为主的蛋白质 从结构上看, 结构越复杂, 其抗原性就越强, 反之则越弱, 通常环状结构蛋白质分子较直链结构蛋白质免疫原性强 多糖分子的免疫 原性则主要取决于单糖的数目和类型大多数多糖是重要的天然抗原 核酸分子多无抗原性, 但如果与蛋白质结合成核蛋白则具有抗原性 以上情况表明, 物质的免疫原性除与其相对分子量有关外, 还与其化学组成和结构密切相关 3. 物理状态物质的物理状态也与其免疫原性有关, 一般地讲, 聚合状态的抗原性物质较单体的免疫原性强, 颗粒性物质较可溶性抗原的免疫原性强 因此, 对一些抗原性较弱的物质, 可使其聚合或吸附于某些大分子颗粒 ( 如明矶 氢氧化铝等 ) 的表面, 以增强其抗原性 二. 抗原特异性抗原具有与相应抗体或致敏淋巴细胞结合发生反应的性质称为抗原特异性 特异 抗辰 抗体与补体13 性是免疫应答和免疫反应中最重要的特点也是免疫学诊断 防治的理论依据 研究发现, 用化学方法降解抗原后获得的小分子降解产物 ( 分子量 200~ 1 000) 具有与相应抗体特异性结合的能力, 这表明抗原这一大分子物质中真正与抗体分子结合的化学基团仅仅是抗原分子表面的一小部分这种存在于抗原分子表面 决定抗原特异性的特殊化学基团即为抗原决定簇, 又称表位 抗原可通过表面的抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合而激发免疫应答, 也可通过表面抗原决定簇与相应抗体和或致敏淋巴细胞特异性结合, 而发生免疫反应 因此, 抗原决定簇是免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基础 抗原决定簇可由数个氨基酸或数个糖基组成其化学组成 排列及空间结构决定着抗原的特异性 (~) 功能型决定簇存在于抗原分子表面, 能被淋巴细胞识别, 启动免疫应答, 同时能与抗体和或致敏淋巴细胞特异性结合而发生免疫反应的抗原决定簇, 称为功能型决定簇 一般提到的抗原决定簇都是指这种存在于抗原分子表面的功能型决定簇 ( 二 ) 隐蔽的决定簇存在于抗原分子内部, 不能被淋巴细胞识别, 无法触发免疫应答的抗原决定簇, 称为隐蔽的决定簇 当抗原受到理化和生物因素影响时, 或经抗原提呈细

21 一篇免疫学基础知识胞加工后, 分子内部隐蔽的决定簇可能暴露, 从而作为新的功能型决定簇而发挥免疫作用 因此, 蛋白质变性后, 原有的抗原性降低或消失, 表现出新的抗原特性 有时体内的某些成分也可因感染 烧伤 电离辐射和药物等作用引起结构改变, 成为自身抗原, 导致自身免疫性疾病 ( 三 ) 抗原的结合价通常是指一个抗原分子能与相应抗体分子结合的抗原决定簇的总数 简单的半抗原一般只能与一个抗体分子结合称为单价 大多数天然抗原分子表面具有多个相同或不同的抗原决定簇, 为多价抗原 ( 四 ) 共同抗原天然抗原分子结构一般都很复杂, 其表面具有多种抗原决定簇, 可剌激机体产生多种特异性抗体每种抗体只能与相应的抗原决定簇结合 如果两种不同的抗原物质表面具有某种相同的抗原决定簇就可剌激机体产生相同的抗体 免疫学上将存在于两种不同抗原分子间的相同或相似的抗原决定簇称为共同决定簇或共同抗原, 亦可称为交叉反应性抗原 存在于亲缘关系很近的生物之间的共同抗原称为类属抗原, 存在于不同种属生物之间的共同抗原称为嗜异性抗原 四. 抗原的种类抗原物质的种类繁多, 目前常用的分类方法如下 : (~) 根据抗原的性能分类 14 第1. 完全抗原具有免疫原性同时又具有抗原性的物质 大多数蛋白质属于此类 2. 不完全抗原又称半抗原指本身只有抗原性而无免疫原性的物质 多糖 类脂 核酸 某些药物以及其他化学物质等低分子量的物质为不完全抗原, 不完全抗原与蛋白质 结合后即可成为完全抗原 ( 二 ) 根据抗原与机体的亲缘关系分类 1. 异种抗原来自另一物种的抗原如多种微生物及其代谢产物 异种动物血清等 2. 同种异型抗原来自同一种系而基因型不同的其他个体的抗原, 如人类红细胞抗原 主要组织相容性抗原等 3. 自身抗原能引起自身免疫应答的自身组织成分 ( 三 ) 根据抗原的来源分类 1. 外源性抗原 (exogenous ant 也 en) 指非抗原提呈细胞 (antigen presentir 鸣 cell, APe) 自身所产生的抗原, 必须被 APC 摄取, 并与岛 1HC - II 类分子结合成复合物的形式提呈给 T 细胞, 包括各种天然抗原 ( 微生物 异种动植物蛋白 同种异体抗原等 ) 人工抗原( 与化学物质结合的天然抗原, 如腆化抗原 { 目氨蛋白等由简单化学基团或有机分子与蛋白载体结合形成的半抗原载体复合物 ) 合成抗原( 如共聚多肤 合成多肤以及用化学方法合成的高分子氨基酸聚合物 ) 和基因工程抗原 ( 如用于免疫的基因工程疫苗 ) 等 2. 内源性抗原 (endogenous antigen) 指免疫效应细胞的靶细胞自身所产生的抗原, 与岛 1HC- I 类分子结合成复合物, 表达于细胞表面并被提呈给细胞毒性 T 细胞, 包括自身隐蔽抗原 变性的自身成分 TCR 和 BCR 的独特型决定簇 肿瘤抗原 病毒感染细胞合成的抗原等 ( 四 ) 根据抗原剌激 B 细胞产生抗体是否需要 T 细胞辅助分类 1. 胸腺依赖性抗原 (thynlus dependent 削 igen, 1D - Ag) 此类抗原需要在 T 细胞辅助及巨噬细胞参与下才能激活 B 细胞产生抗体 大多数天然抗原属于此类, 如细菌 病毒

22 第一一章人血清球蛋白 牛血清球蛋白 卵白蛋白 外毒素及羊红细胞等 这类抗原分子量大, 结构复杂, 决定簇种类繁多且分布不规则 引起免疫反应的特点如下 :1 既能引起体液免疫应答, 也能引起细胞免疫应答 ;2 产生的抗体以 19( 王为主, 同时也可产生其他类别的抗体 ; 3 可产生免疫记忆 2. 胸腺非依赖性抗原 (thymus independent antigen, TI - Ag) 此类抗原不需要 T 细胞辅助就能直接剌激 B 细胞增生 分化 产生抗体 天然 TI- Ag 种类较少, 主要有细菌脂多糖 肺炎球菌芙膜多糖和聚合鞭毛素等 这类抗原结构比较简单, 决定簇种类单纯, 数目较多, 排列密集且有规律, 能与 B 细胞表面相应抗原受体牢固结合, 并引起受体交联和位移, 从而直接激活 B 细胞 引起免疫反应的特点如下 :1 只能引起体液免疫应答, 不能引起细胞免疫应答 ;2 只剌激 B 细胞产生胁 f 类抗体 ;3 无免疫记忆 ( 五 ) 超抗原为一类由细菌外毒素和逆转录病毒蛋白构成的不同于促有丝分裂原的抗原物质 此类抗原作用不受岛 1HC 的限制, 无严格的抗原特异性, 只需要极低浓度即可激活多克隆 T 细胞, 引起很强的免疫应答, 故称超抗原 主要包括 : 金黄色葡萄球菌肠毒素 链球菌致热外毒素 毒素休克综合征毒素 次要淋巴细胞剌激抗原等 五. 医学上重要的抗原 (~) 病原微生物各种病原微生物, 如细菌 病毒 立克次体 螺旋体等, 均是良好的 抗原 病原微生物虽然结构较简单, 但是其化学组成却相当复杂, 含有多种性质不同的蛋白质以及与蛋白质结合的多糖和类脂是多种不同抗原成分的复合体 以细菌为例, 其主要抗原有以下几类 :1 表面抗原 : 是包裹在细胞壁外面的抗原物质, 随菌种和结构的不同可有不同的名称 ;2 菌体抗原 : 又称 抗原, 细菌菌体抗原的总称, 是主要存在于细菌细胞壁中的抗原物质 ;3 鞭毛抗原 : 又称 H 抗原是存在于细菌的鞭毛中的抗原 ;4 菌毛抗原 : 是存在于细菌的菌毛中的抗原物质, 有别于鞭毛抗原 利用病原微生物是良好的抗原物质这一特点, 可以用来制备疫苗, 进行预防接种 由于不同种类的细菌所含的抗原成分有所不同, 可采用免疫学方法来进行鉴定与分 抗辰 抗体与补体15 型, 或测定患者血清中的特异性抗体, 进行疾病的诊断 ( 二 ) 细菌外毒素 类毒素和抗毒素 1. 外毒素外毒素是某些细菌在生长代谢过程中分泌到菌体外的毒性物质 外毒素的毒性极强, 对组织的细胞毒性作用具有高度的选择性, 可引起各自不同的特殊病变及临床表现 外毒素为蛋白质有很强的抗原性能剌激机体产生相应的抗体 2. 类毒素外毒素经 0.3% ~0.4% 甲醒洛液处理后, 失去毒性, 但仍然保留其抗原性, 即成为类毒素 类毒素可剌激机体产生相应的抗毒素, 以中和外毒素的毒性, 因此可作为人工自动免疫制剂在预防由外毒素引起的疾病中起重要作用 常见的类毒素有白喉类毒素和破伤风类毒素等 3. 抗毒素外毒素和类毒素剌激机体产生的抗体能消除外毒素的毒性, 称为抗毒素 临床上用来防治破伤风 肉毒 白喉 蛇毒等的抗毒素, 都是用类毒素免疫功物 ( 一般是马 ) 制备的 此种抗毒素的作用具有两重性, 一方面它提供了特异性抗毒素抗体, 可以中和体内相应的外毒素, 具有防治疾病的作用 ; 另一方面, 它作为具有抗原性的异种蛋白, 能剌激机体产生抗体, 并有可能引发超敏反应, 因此在使用此类生物制剂之前, 必须做皮肤过敏试验

23 一篇免疫学基础知识16 第( 三 ) 嗜异性抗原嗜异性抗原是指某些不同种属动物 植物或微生物之间存在的共同抗原, 又称 Forssman 抗原 现己发现多种在医学上有重要意义的嗜异性抗原, 例如 : 1 与 ABO 天然血型抗体有关的嗜异性抗原 : 大肠杆菌 描含人血型 B 物质 ; 肺炎球菌 14 型含人血型 A 物质 2 与临床某些免疫性疾病发生有关的嗜异性抗原 : 乙型洛血性链球菌 (A 族 ) 细胞壁与人肾小球基底膜 心瓣膜和心肌组织有共同抗原, 可导致急性肾小球肾炎或风湿病 ; 大肠杆菌 14 的脂多糖与人结肠粘膜之间也存在共同抗原, 可导致溃殇性结肠炎的发生 ( 四 ) 白细胞分化抗原白细胞分化抗原是指白细胞 血小板和血管内皮细胞等在分化成熟为不同语系和分化不同阶段以及活化过程中出现或消失的细胞表面的抗原性标志 它们是细胞膜上的一类蛋白质或糖蛋白, 种类繁多, 分布恨广, 除了表达在白细胞表面, 还可分布在胸腺细胞 髓样细胞 骨髓干细胞 上皮细胞等细胞膜上 白细胞分化抗原具有重要的生物学意义, 不仅可以作为表面标志用于细胞的鉴定和分离, 还广泛参与细胞的生长 成熟 分化 发育 迁移和激活 此外, 分化抗原的改变与某些病理状态的发生与发展有关 深入研究白细胞分化抗原, 有助于从分子水平上认识免疫应答的本质, 并对疾病的诊断 预防 治疗以及发病机制的研究具有重要意义 目前应用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法, 将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群 (cluster of differentiation, CD), 并以此代替分化抗原以往的命名 简言之, m 是位于细胞膜上一类分化抗原的总称, m 后的序号代表一个或一类分化抗原分子 在习惯上, 鉴定所用的单克隆抗体及其所识别的相应抗原都用同一个 m 序列号, 为便于区分起见, 将单克隆抗体检测鉴定的白细胞分化抗原称为 CD 抗原或 m 分子 ( 五 ) 血型抗原血型抗原属于同种异型抗原, 到现在己在人类红细胞表面鉴定出 20 余种血型抗原系统, 其中以 ABO 血型系统最重要, 其次是因 1 血型系统 l. ABO 血型系统根据人类红细胞表面所含 A B 抗原种类的不同, 可将人类血型分为 A B 0 和 AB 四种类型 ABO 血型抗原是糖蛋白 不同血型者相互输血, 可因红细胞膜表面血型抗原与相应抗体结合而发生洛血, 引起严重的输血反应, 因此不同血型者严禁相互输血 ABO 血型物质不仅存在于人红细胞膜上, 也可存在于体液中, 其中唾液中含量最高, 其次是血洁 精液 胃液 羊水 汗液 尿液和泪液, 胆汁和乳汁中也可有少量存在 2. Rh 血型抗原研究发现, 用恒河猴红细胞免疫家兔后所获得的免疫血清, 可凝集多数人的红细胞, 这表明在人类红细胞和恒河猴红细胞表面存在相同的抗原成分, 称为目 1 抗原 人类红细胞表面具有四 1 抗原者称为目 1 阳性, 缺乏因 1 抗原者称为目 1 阴性 正常情况下, 人体血清中不存在抗因 1 抗原的天然抗体, 抗因 1 抗体只有在接受免疫的情况下才产生 当通过输血使团 1 阳性红细胞进入团 1 阴性者体内, 或因 1 阴性妇女娃振而 胎儿为 Rh 阳性, 由于娃振期胎盘损伤或分娩时胎盘剥离造成胎儿团 1 阳性红细胞进入母 体时, 方可剌激机体产生因 1 抗体, 这种抗体主要为 IgG 类抗体, 可通过胎盘, 因此, 当此妇女再次娃振且胎儿红细胞为目 1 阳性时, 抗因 1 抗体即可通过胎盘与胎儿红细胞表面的目 1 抗原特异性结合, 在补体参与下可能引起胎儿流产或发生新生儿洛血症 ( 六 ) 主要组织相容性抗原主要组织相容性抗原是主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC) 基因编码的产物, 广泛分布于哺乳动物的有核细胞表面, 其

24 第一一章化学组成主要为糖蛋白或脂蛋白, 简称岛 1H C 抗原 不同动物的岛但 C 抗原有不同的命名, 小鼠的孔 1H C 抗原称为 H-2 抗原, 人类的岛 1H C 抗原因首先在外周血白细胞表面被发现, 故称为人类白细胞抗原 (human leucocyte antigen, 因 A)o 岛任 -IC 抗原属于同种异型抗原, 根据其结构 分布和功能可分为 I 和 H 类抗原 岛任 -IC I 类抗原广泛存在于几乎所有类型有核细胞的表面, 岛但 c- II 类抗原主要存在于 B 细胞 活化 T 细胞 巨噬细胞及其他 APe 表面 岛 1HC- I 类抗原能引起强烈的同种异体移植排斥反应, 是经典的移植抗原, 此外它还具有介导细胞毒 T 细胞 (Tc) 对病毒感染细胞的特异性杀伤作用山任 -IC- II 类抗原与免疫应答和免疫调节有关, 在抗原提呈 细胞间协作 混合淋巴细胞反应 移植物抗宿主反应和迟发型变态反应中具有重要作用 岛任 -IC 抗原的主要生物学功能 :1 引起移植排斥反应 ;2 参与抗原的加工处理和提呈 ;3 制约免疫细胞间的相互作用 ;4 在胸腺内诱导胸腺细胞分化成熟 ( 七 ) 自身抗原自身物质对机体一般来说不显示免疫原性, 但在某些情况下可以成为自身抗原 1. 隐蔽的自身抗原某些自身物质在正常情况下与血流和免疫系统相对隔绝, 免疫细胞在胚胎期未能对其建立免疫耐受, 这些物质称为隐蔽的自身抗原 当外伤 感染或手术不慎等原因使这些物质进入血流时, 可引起自身免疫应答, 严重者发生自身免疫性疾 病 如 : 甲状腺球蛋白释放入血可引起变态反应性甲状腺炎 ( 即桥本甲状腺炎 ), 眼晶状体蛋白和眼葡萄膜色素抗原释放可引起晶状体过敏性 ~ 炎和交感性 ~ 炎, 桔子抗原释放可引起男性不育, 脑脊髓和神经髓革自蛋白抗原释放可引起脱髓喃脑脊髓炎和外周神经炎等 2. 改变或修饰的自身抗原通常自身组织对机体自身不具有免疫原性, 但在病原微生物感染 电离辐射及药物等因素作用下, 或自身组织的分子结构发生改变, 形成新的抗原决定簇或暴露出内部隐蔽的决定簇时, 即可剌激机体产生免疫应答, 严重者可引起自身免疫病 ( 八 ) 肿瘤抗原肿瘤抗原是细胞在癌变过程中出现的具有免疫原性的大分子物质的 抗辰 抗体与补体17 总称 根据其特异性, 一般可分为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原两大类 1. 肿瘤特异性抗原 (t 轧 umo 创,r s 叩 pe 凹 C 凶 can 山二 存在于相应正常细胞和其他肿瘤细胞表面的抗原 O 宿主免疫系统可将 1SA 识别为非己 抗原, 对它产生体液和或细胞免疫应答 1SA 最初是通过动物肿瘤移植实验所证实的, 故曾经被称为肿瘤特异性移植抗原 (tumor specific transplantation antigen,1sfa) 或肿瘤排斥抗原 ( tumor rej ection antige 儿 1RA )o 此类抗原可存在于不同个体的同一组织学类型肿瘤中, 如黑色素瘤相关排斥抗原 (melanoma - associated rejection antigen,.mara) 可见于不同个体的黑色素瘤细胞, 但正常黑色素细胞却不表达此类抗原 1SA 也可为不同组织学类型的肿瘤所共有, 如突变的 ras 癌基因产物可见于消化道癌 肺癌等, 但其氨基酸顺序与正常原癌基因 ras 表达产物存在差异, 并能被机体免疫系统所识别 2. 肿瘤相关抗原 (tumor associated antigen, TAA) 是指无严格的肿瘤特异性, 即非肿瘤细胞所特有, 正常细胞也可表达的抗原, 只是在细胞发生癌变时含量明显增加或出现异位表达, 如某些糖蛋白 胚胎性抗原等

25 一篇免疫学基础知识第二币 抗 体 免疫球蛋白 ( immunoglobuli 儿 Ig) 是指具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白, 主要存在于血液及某些分泌液中, 也可作为抗原识别受体存在于 B 细胞表面 抗体 (antibody, Ab) 是机体免疫细胞被抗原激活后, 由增殖分化成熟的终末 B 细胞浆细胞合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白 抗体是免疫球蛋白, 但并非所有的免疫球蛋白都是抗体 免疫球蛋白是一个结构及化学的概念, 而抗体则是功能及生物学的概念, 二者并不等同 抗体具有免疫功能, 是重要的免疫分子, 主要存在于血液 体液和粘膜分泌液中 一. 免疫球蛋白的结构 (~) 四月太链结构各类免疫球蛋白的基本 单位都是四条肤链的对称结构, 包括两条相同 可变区 ( 抗原结合部位 ) 18 第的重链 (heavy chain, H 链 ) 及两条相同的轻链 (light chain, L 链 ) 两条重链和两条轻链间以及 重链和轻链间, 分别以二硫键连接 ( 图 2-1) 免疫球蛋白的基本结构 (basic s 甘 uct 旧 e) 又称为 免疫球蛋白的单体 免疫球蛋白为糖蛋白, 糖 基存在于重链上 重链由 440 个氨基酸组成, 相 对分子量较大, 约 Da, 结合有不同量的糖 基 根据重链恒定区抗原性的不同可将其分为 重链 5 类, 即 v,'y, 队队 E 链, 由它们组成的免疫球蛋 白分别称为 I 圳 I 剧 19A 盼 19E o 轻链含 214 个氨基酸, 相对分子量约为 Da, 根据其结构和恒定区抗原性的差异分为 κ 和入二型 一 图 2-1 免疫球蛋白结构示意图 个免疫球蛋白分子的两条轻链型别相同, 绝无可能 κ 型和入型共同存在于同一个免疫球 蛋白分子中 整个免疫球蛋白分子单体呈 Y 型 ( 二 ) 恒定区和可变区 1. 恒定区 在多肤链的 C 端, 占轻链的 12 和重链的 3 4, 其氨基酸数量 种类 排列 顺序以及含糖量都比较稳定, 故称恒定区 (constant region, C 区 ) 前者称轻链恒定区 (CL 区 ), 后者称重链恒定区 (CH 区 ) 在同一种属动物中同一类别的免疫球蛋白, 其恒定区氨 基酸仅可有少数被取代 增加或缺失, 但对不同类别的免疫球蛋白, 其恒定区的上述参数 则差别很大 该区不仅作为免疫球蛋白的骨架, 而且参与免疫应答效应, 具有很多重要的 生物学活性 2. 可变区 在多肤链的 N 端, 占轻链的 12 与重链的 1 4, 因这个区的氨基酸组成及 排列顺序多变, 故称为可变区 (variable regio 儿 V 区 ) 前者称轻链可变区( 叽 J 区 ), 后者称 重链可变区 (VH 区 ) 在可变区中, 某些特定位置的氨基酸残基具有更大的变异性, 称为 高变区 (hypervariable region, HVR) 0 高变区实际上是特异性抗原与免疫球蛋白的结合部 位, 己经证实可变区的大部分序列并不直接与抗原接触, 而是形成稳定的抗原接触面, 称

26 第一一章为免疫球蛋白的裂隙 ( cleft) 这些裂隙由轻链和重链各 3 个高变区构成的 3 个环状结构组成 由于这些高变区序列与抗原表位互补, 故又称为互补决定区 ( eomplementar 町 deter rru 日 ing region, CDR) 从免疫球蛋白的抗原性考虑, 其独特型决定簇 (i diotypie deter minant) 主要也在该区域 可变区中非 HVR 部位的氨基酸组成和排列顺序相对比较恒定保守, 通过这些氨基酸残基, 可变区的空间构象可形成比较稳定的主体结构, 支持着 CDR, 故称为骨架区 (frame work region, FR) 骨架区不与抗原分子直接结合, 但对维持 CDR 区的空间构象起重要作用 可变区共有 4 个 FR, 3 个 ωr 分别被 FRI,FR2 FR3 和 FR4 隔开 3. 功能区免疫球蛋白的多肤链分子可折叠成几个由链内二硫键连接的球形结构 IgG 19A,1gD 的重链有 4 个球形结构, 分别为 VH CHI 0 丑 CH3; 胁 1, 19E 有 5 个球形结构, 多出了 1 个 CH 斗 轻链则有 VL 和 CL 2 个球形结构 每个球形结构由约 110 个氨基酸残基组成, 并代表一个功能区 (domain) 0 4. 免疫球蛋白的水解片断用蛋白酶将免疫球蛋白水解成小的片断是研究免疫球蛋白的结构和功能的重要方法, 常用的蛋白酶有胃蛋白酶和木瓜蛋白酶两种 木瓜蛋白酶可以在 IgG 饺链区重链间二硫键近氨基端, 将 IgG 水解成 3 个片段, 包括 2 个结构相同的单价抗原结合片段简称 Fab 段, 和 1 个可以结晶片段简称 Fe 段 ; 每个 Fab 段由一条完整 的轻链和重链的 VH 和 CHI 功能区组成, 具有与抗原特异结合的功能, Fe 段相当于 I 剧的 丑和 CH3 功能区, 无抗原结合活性, 但具有重链的抗原性和相应功能区的生物活性 胃蛋白酶可以在 IgG 饺链区重链间二硫键近 C 端将 IgG 断开, 形成一个双价的 Fab 段, 而 Fe 段则被胃蛋白酶裂解为多个小分子片段, 失去生物学活性 5. 饺链区在 CHI 0 丑之间, 即重链的链间二硫键连接处附近有一个可转动的绞链区 (hinge region), 由 2~5 个链间二硫键 CHI 尾部和 0 丑头部的小段肤链构成, 约有 30 个氨基酸残基 饺链是浆细胞分泌的一种糖蛋白 当 k 与抗原结合时, 该区可转动, 以便可变区的抗原结合部位尽量与不同距离的 2 个抗原表位 (epitope) 配合, 起弹性和调节作用, 另一方面有利于 k 分子变构, 暴露 k 的补体结合点 6. 分泌片又称分泌成分, 是上皮细胞产生的一种多肤, 以非共价键的形式连接 19A 分子, 与饺链区共同构成分泌型 19A( SIgA) 0 SIgA 存在于分泌液中, 其中的分泌片能抵御蛋白酶的消化作用, 有稳定 19A 的作用 二. 免疫球蛋白的分类及性质 抗辰 抗体与补体19 (~) 免疫球蛋白的类别 1. 类 (class) 同一种属所有个体的免疫球蛋白, 根据其重链恒定区抗原特异性的差异, 可分为 μ γ α 8 和 E: 5 类, 相应的免疫球蛋白分别称为胁 1, IgG, 19A IgD 和 19E o 不同类别的免疫球蛋白, 其抗原性的差异在于免疫球蛋白分子内重链恒定区的氨基酸组成 排列顺序 构型以及二硫键的不同, 而其余各条重链的类别都相同 2. 亚类 ( subclass) 同一类免疫球蛋白, 根据其重链恒定区 ( 主要是饺链区 ) 氨基酸组成的微小差异, 以及二硫键位置和数目的不同, 又可分为亚类 3. 型 ( type) 根据各类免疫球蛋白轻链恒定区的化学结构与抗原性的差异, 可分为 κ 和入两个型 人类血清免疫球蛋白中 κ 链占 23, 不同人种这两个型的比例有所差异, 不同种属问差异更大 κ 链和入链抗原性的不同是由其恒定区氨基酸的组成及排列顺序所

27 一篇免疫学基础知识20 第决定的 0 4. 亚型 (subtype) 所有 κ 链恒定区的结构基本相同,{E! A 链恒定区的氨基酸排列存在差异, 据此可分为亚型 如入链 190 位氨基酸为亮氨酸时称 OZ( + ), 为精氨酸时称 'Z( - ) ; 入链 154 位为甘氨酸时称 Kem( +), 为丝氨酸时称 Kem( -) ( 二 ) 免疫球蛋白的抗原性免疫球蛋白一般均是具有抗体活性的蛋白分子 由于其为大分子蛋白质, 所以对另一种屑的动物或同一种屑的不同个体也是一种抗原物质 在免疫球蛋白分子上主要有 3 种抗原决定簇, 即同种型 同种异型和独特型抗原决定簇, 分别位于免疫球蛋白分子的 C 区和 V 区 1. 同种型 ( isotype) 指同一种属所有个体免疫球蛋白分子所共有的抗原特异性 同种型抗原决定簇主要存在于免疫球蛋白的 C 区表现在全部免疫球蛋白的类 亚类 型和亚型的分子上, 可以应用抗 C 区 H 链及 L 链的抗体进行血清学鉴定 同种型抗原决定簇不能作为一种遗传标志 2. 同种异型 (allotype) 指同一种属不同个体间的免疫球蛋白分子所具有的不同抗原特异性 编码同种异型抗原决定簇的基因是同一基因座位的不同等位基因, 它们均为共显性, 类似人类的血型抗原 目前己鉴定的人类免疫球蛋白分子上的同种异型抗原决定簇存在于 IgG!gA,lgE 的 H 链 C 区和 κ 轻链的 C 区 同种异型抗原决定簇可以作为一种遗传标志 3. 独特型 (idiotype, Id) 代表免疫球蛋白独特型的决定簇是位于免疫球蛋白 V 区高变区的遗传标志 免疫球蛋白独特型的差异是由于叽 J 和 VH 高变区氨基酸序列的不同 所致, 这种氨基酸序列的差异也是抗体特异性的分子基础, 不同特异性的抗体分子其独特型也不同 独特型由若干表位组成, 被称为独特位 (idiotope ), 可剌激异种 同种异体甚至同一个体产生相应的抗体, 即独特型抗体 (Aid) 现己证明, Id 决定簇不仅存在于抗体分子中, 也存在于 B 细胞和 T 细胞的抗原受体上 二. 免疫球蛋白的生物学功能 (~) 与抗原特异性结合这是免疫球蛋白最重要的功能 免疫球蛋白与相应抗原结 合, 在体内介导多种生理和病理效应, 在体外引起各种抗原抗体反应 免疫球蛋白的 Fab 段可变区与相应抗原决定簇的立体构型必须相吻合, 二者所带电荷也必须互相对应 Fab 段与抗原结合的能力大小, 重链大于轻链 ( 约为 2: 1), 并与 Fab 段的完整性有关 抗原与抗体结合后, 免疫球蛋白的 Fe 段变构, 从而产生其他生物学活性, 如中和作用 调理作用 激活补体等 ( 二 ) 激活补体抗体与相应抗原结合后, 发生变构, 其重链恒定区上的补体结合点暴露, ~q 与之结合, 从而使补体各成分激活, 此为补体激活的经典途径 I 刷 勘乱 I 圳通过经典途径激活补体的能力最强, lgg2 虽可激活补体, 但作用较弱 19G4,!gA 及其他类别免疫球蛋白不能通过经典途径激活补体但其免疫球蛋白凝聚物可通过旁路途径激活补体 完整的 19E 分子不能通过旁路途径激活补体, 而从 19E 分离出的 Fe 段却能激活补体 19D 是否能激活补体尚未得到证实 ( 三 ) 与细胞表面 Fe 受体结合免疫球蛋白能通过其 Fe 段与多种细胞表面的 Fe 受体结合 巨噬细胞 淋巴细胞 嗜碱粒细胞 肥大细胞 中性粒细胞和血小板等都能表达 Fe 受体 免疫球蛋白与这些细胞 Fe 受体的结合部位因免疫球蛋白的种类不同而各异,

28 所菊补忏口第一一章IgG 的 GI3 功能区与巨噬细胞 Fe 受体结合, 19E 的 GI4 功能区与嗜碱粒细胞的 Fe 受体结合 不同类别的免疫球蛋白可与不同的细胞结合, 产生不同的生物学效应 ( 四 ) 参与免疫调节抗体对体液免疫有正 负调节作用 此外, 抗独特型抗体可识别自身的体内其他抗体或细胞克隆上的独特型决定簇, 这种自我识别是抗体分子参与免疫调节的重要机制之一, 即独特型网络调节 一一一体 补休 ( complement) 是新鲜血清中存在的一种不耐热的成分, 可辅助特异性抗体消除病原体作用 包括 30 余种可洛性蛋白和膜结合蛋白, 故称为补体系统 在自然条件下, 补体成分以无活性的酶原形式存在, 多种特异性和非特异性免疫学机制可使这些无活性的酶原分解, 产生一个有活性的大单位和一个小单位, 这一过程称为激活 补体系统按其生物学功能可以分为 3 类 :1 补体的固有成分 : 指存在于体液中 参与补体激活级联反应的补体成分,C1 q Clr CIs c4 α 参与经典激活途径 ; 结合甘露糖的 MEL; 旁路撒活途径的 B 因子 D 因子 ; 攻膜蛋白的巳元 c6 C7 c8 和 ω 2 补体调节蛋白 : 膜结合性调理素 (C 屿, C3b) ;CI 抑制物 I 因子 H 因子 S 蛋白 Sp4040; 促衰因子 同种限制因子 膜反应 洛解抑制因子等 3 补体受体 (CR) : 包括 CRI~CR5 C3 ar α ar C4aR 等 一. 补体激活途径参与激活途径的固有成分包括 Cl( CIq Clr CIs) α C3 C 斗, 整个激活过程可分为两个阶段 这两个阶段分别称为 : 先期事件和后期事件, 其分界线是 C3 转化酶的形成和活化 先期事件涉及三条途径对口转化酶的激活 (~) 经典途径参与此途径的固有成分包括 Cl( CIq Clr CIs) α c4 口, 整个激活过程可分为识别和活化两个阶段 抗辰 抗体与补体21 1. 识别阶段抗原和抗体结合后, 抗体发生构想改变, 使 Fe 段的补体结合部位暴 露, 补体 CI 与之结合并被激活, 这一过程被称为补体激活的启动或识别 CI 是由 CIq Clr 和 CIs 分子组成的多聚体复合物 CIq 为六聚体, 呈球形, 其每一亚单位的头部是 CIq 与免疫球蛋白结合的部位 Clr 和 CIs 与 CIq 相连 当两个以上的 CIq 头部被 IC 中剧或 IgG Fe 段结合固定后, CIq 6 个亚单位的构象即发生改变, 导致 Clr 被裂解, 所形成的小片段即为激活的 Clr, 它可裂解 CIs 成为两个片段, 其中小分子片段 ( CIs) 也具有蛋白酶活性, 它依次裂解 c4 与 α 2. 活化阶段 CIs 被活化后, 专 - 性地使下列两个补体成分分解和活化,C4 分解成 C 屯和 C4 b;α 分解成 αa 和 αb 被激活的两个大的分解单位 C4 b 和 αb 迅速沉积到 细胞表面, 共同构成经典途径中显示酶解活性的 转化酶, 即 C4 b2b( 旧称 C4 b2a) ( 二 )~ 但 L 途径 MEL 是一种钙依赖性糖结合蛋白, 属于凝集素家族, 可与甘露糖结合 MEL 与 CIq 并不具有氨基酸序列上的同源性, 但两者的分子结构类似 MEL 首先与细菌的甘露糖残基结合, 然后与丝氨酸蛋白结合, 形成 MEL 相关的丝氨酸蛋白酶 (~ 但 L associated serine pro - tease, lv1asp - 1,lV1ASP - 2) ( 图 2-2) 0 lv1asp 具有与活化的 CIq 相似 的结构和生物学活性, 可水解 C 斗和 α 分子, 继而形成 转化酶, 其后的反应过程与经典 途径相同 这种补体激活途径被称为 MEL 途径仙也 L pathway)

29 第一篇免疫学基础知识~:.:.:>.:::.':.~:..:-:. 可 '~-5: 户 ' 古 i;'"~~.!:.';' 7 ~1 图 2-2 MBL 相关的丝氨酸 蛋白酶结构示意图 ( 三 ) 旁路途径岛但 L 途径中产生的 转化酶水解 而成为 C3a 和 C 元 沉积于细胞表面的 b 可与 B 因子结合, 成为易于被血清中 D 因子分解的易感状态, B 因子遂分解成为 Ba 和 Bb, 然后由 b 和 Bb 构成复合物, 成为旁路途径中的 转化酶的 bbb o 由此可见, 经典途径和旁路途径的 转化酶都可使底物 分子酶解, 但两者结构不同, 分别为 C4 b2b 和 C3bBb 这里, C3b 既是 C3 转化酶分解 之后出现的产物, 又是 C3 转化酶的组成部分, 由此形成了经典途径和旁路途径的相互影响的一种反馈性放大机制 二. 补体的效应功能 (~)MAC 的组装经 C3 转化酶分解产生的 C3, 还有一个重要作用, 是与 C 斗和 α 的分解产物即 c4 日 b 共同构成 转化酶 转化酶的功能是将 C5 分解戚 a 和 C 元 前者释放入液相, 后者仍结合在细胞表面, 并可依次与 c6 C7 结合 所形成的 b67 复合物, 插入浆膜脂质双层中, 进而与 c8 呈高亲和力结合, 形成 b678, 加上 1O ~16 个 C9 分子联结戚 b~9, 在病原体或靶细胞表面形成攻膜复合物 ( 图 2-3) 这是一个插入靶细 22 胞双层脂质膜的中空圆桶状结构, 内径为 11 nino C5b vg7 与 C6 C7 结合 C 血 ~ 6, 7 通过 C7 与胞膜结合 也 c8 与复合物结合并插入细胞膜 四与复合物结合 并聚集 & 到子 C 世啻舍 在踉上形成 ;J 吼 脂质层 病原体 图 2-3 攻膜复合体形成过程示意图 ( 二 )MAC 的效应机制 MAC 在细胞膜上形成的小孔可让水和电解质通过却不能让大分子穿行 因而靶细胞表面大量攻膜复合物出现, 最终导致细胞内渗透压降低, 胞膜破裂 这一效应称为细胞裂解 此外, 末端补体成分插入胞膜, 可能使致死量钙离子被动的向胞内弥散, 由此引起细胞死亡, 称为补体依赖的细胞毒性, 即 α)c o 二. 补体的生物学作用 (~) 调理作用 是血浆中浓度最高的补体蛋白, 含量为 1. 2 rug ml 一个口转化 酶可以分解 1000 个 0 分子, 由此产生大量 C 弛 吞噬细胞带有识别病原体表面 b 的 受体, 有利于吞噬细胞借助配体 受体的结合, 增强对覆盖有 C3b 分子病原体的吞噬和消 除 补体的这一功能称为调理作用 (opsonization) 血清内含有的调理素与细菌及其他颗粒物质结合, 可促进吞噬细胞的吞噬作用 补体激 ii5 过程中产生的 C3b C4 b 和 ic3b 均是重要的调理素

30 23 第与补体抗原抗体反应 ( 二 ) 免疫调节作用非淋巴细胞语系的细胞可参与抗体介导的效应作用 如巨噬细胞和 NK 细胞凭借各自的 Fc 受体, 参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 (antibody - depen dent cell - mediated cytotocixity, A 四 ::C) 0 又如非专职抗原提呈细胞在细胞因子的作用下, 可通过不同类型淋巴细胞的活性, 诱导局部免疫耐受 ( 三 ) 引起炎症反应 C4, C3 C5 分解产生的小片段 C 虹 C3a 和 C5a 作为一种肤介导物 (peptide med 四 or) 参与诱导局部炎症反应, 起着招募吞噬细胞的作用 C 虹 C3a 和 C5a 又被称为过敏毒素, 它们作为配体与细胞表面相应受体结合后, 激发细胞脱颗粒, 释放组肢之类的血管活性介质, 从而增强血管通透性并剌激内脏平滑肌收 缩 过敏毒素也可与平滑肌结合并剌激其收缩 三种过敏毒素中, 以 C5a 的作用最强 C5a 是一种有效的中性粒细胞趋化因子 第四币 抗原抗体反应 (antigen - antibody reactio 川是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应 抗原抗体反应既可发生在体内也可发生在体外 抗原与相应抗体在体内结合, 激活体液免疫, 可发生吞噬 洛菌 杀菌 中和毒素等作用 在体外结合时, 由于抗原的物理性状以及参与反应的物质的差异可出现凝集 沉淀及补体参与的反应等 由于抗体主要存在于血清中, 临床上一般多采用血清做试验, 故体外的抗原抗体反应又称作血清学反应 (serologic reactio 川 一. 抗原抗体反应的原理抗原抗体反应可人为地分为两个阶段. 第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段, 此阶段反应快, 仅需要几秒至几分钟, 不出现可见反应 ; 第二阶段为可见反应阶段, 抗原抗体复合物在环境因素的影响下, 表现为凝集 沉淀 溶解 补体结合等肉眼可见的反应, 此阶段反应慢, 常需要几分钟 几小时或几天 在血清学反应中, 这两个阶段往往不能严格区分 抗原抗体的特异结合是由于抗原决定簇和抗体的 Fab 段内高变区之间具有互补性 抗原抗体结合的理化特性主要有以下几种 : (~) 亲水肢体转化为琉水肢体抗体是球蛋白, 而且绝大多数的抗原也是蛋白质, 它们洛解在水中时均为胶体溶液, 不会发生自然沉淀 其原因是由于蛋白质含有大量的氨基和竣基残基, 这些残基在洛液中带有电荷, 在静电作用影响下, 在蛋白质分子周围就出现了带相反电荷的电子云形成了水化层再加上电荷的相斥作用使得蛋白质洛液不会自行聚合而发生沉淀 当抗原与抗体结合后, 电荷因结合而减少或消失, 电子云也消失, 蛋白质由亲水肢体转化为琉水肢体, 如果此时再加入电解质, 可使各琉水肢体进一步靠拢, 形成肉眼可见的抗原抗体复合物 ( 二 ) 抗原与抗体结合力有四种分子间引力参与并促进抗原抗体之间的特异性结合, 分别为 :1 电荷引力 : 又称库仑引力或静电引力, 是抗原和抗体分子上带有相反电荷的氨基和竣基基团之间相互吸引的力, 其大小与两个电荷间距离的平方成反比 2 范德华力 : 是原子与原子 分子与分子互相接近时发生的一种吸引力 由于抗原与抗体两个不同的大分子外层轨道上电子之间相互作用, 使得两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力, 促使抗原与抗体相互结合 其大小比静电引力弱 3 氢键结合力 : 当具有亲水基团 ( 如 一一章抗辰 抗体

31 一篇免疫学基础知识24 第OH NH2 α::dh) 的抗体与相应的抗原彼此接近时, 可形成氢键, 使抗原与抗体相互 结合 氢键结合力比范德华引力强, 且更具特异性 4 琉水作用 : 抗原抗体分子侧链上的 非极性氨基酸在水洛液中与水分子间不形成氢键, 当抗原决定簇与抗体结合点靠近时, 相 互之间正 负极性消失, 由于静电引力形成的亲水层也消失, 排斥了两者之间的水分子, 从 而促进抗原抗体间的相互吸引而发生结合 这种正在水作用对于抗原抗体的结合非常重 要, 提供的作用力也最大 二. 抗原抗体反应的特点 (~) 特异性抗原抗体结合的特异性表现在抗原决定簇与抗体 Fab 段高变区之间化 学结构和空间构型上的互补性 抗体 N 端可变区可形成一个平凹槽, 大小约 150 nm X 6 m 丑 X6 nm, 抗原如棋形嵌入, 呈现高度的特异性结合 ( 二 ) 最适比例在一定浓度范围内, 无论是稀释抗原或稀释抗体, 而其相应的抗体或 抗原浓度保持不变, 只有在两者比例合适时才出现最强的抗原抗体反应 抗原与抗体分 子比例合适的范围, 称为抗原抗体反应的等价带 (zone of equivalence) 在此范围内, 抗原 与抗体可充分结合, 沉淀物形成快且多, 当反应速度最快 沉淀物形成最多 上清液中几乎 无游离抗原或抗体存在时, 此为抗原抗体分子的最适比例, 称为最适比 (optimal ratio) 在等价带前后, 分别为抗体过剩带和抗原过剩带, 由于抗原抗体比例不合适, 使沉淀 物体积小 量少 上清液中可测出游离的抗原或抗体 如果抗原或抗体极度过剩, 则无沉 淀物形成, 此现象在做血清学试验时被称为带现象 (zone phenomeno 日 ) 0 出现在抗体过剩 时, 称为前带 (prezone) ; 出现在抗原过剩时, 称为后带 (postzone) ( 三 ) 可逆性抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡, 在一定条 件下是可逆的 抗原抗体复合物解离的程度与二者之间的亲和力有关, 高亲和性抗体的 抗原结合点与抗原决定簇在空间构型上非常匹配, 二者结合牢固, 不容易解离 反之, 低 亲和性抗体与抗原形成的复合物较易解离 解离后的抗原或抗体均能保持未结合前的结 构 活性及特异性, 因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体 ( 四 ) 亲和性与亲和力抗体的亲和性 ( affin 町 ) 是指抗体与抗原之间的一致性, 这是抗原与抗体之间的固有亲和力 亲和性可用平衡常数 K 表示, K 二 [Ab' Ag] [Ab][ Ag], K 值越大, 则亲和性越高 亲合力 ( avidity) 是指功能结合力, 与抗体结合价直接相关, 即所谓 多价优势 亲和力越大, 抗原抗体结合的稳定性越高 二. 影响抗原抗体反应的因素 (~) 电解质抗原与抗体发生特异性结合反应后, 由亲水肢体转化为琉水胶体, 溶液 中如果不存在电解质, 则仍然不出现可见反应 因此, 在血清学试验中, 为了促使沉淀物 或凝集物的形成, 常用.85% 盐水作为抗原抗体的稀释液 ( 二 )ph 值抗原抗体反应必须在合适的 ph 环境中进行 由于蛋白质具有两性电离 性, 每种蛋白质都有其固定的等电点, 如 ph 达到或接近抗原的等电点时, 即使无相应抗 体存在, 也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集, 造成假阳性反应 因此, 血清学反应一般 要求 ph 在 6~8 左右, 否则将影响抗原及抗体的理化性质 ( 三 ) 温度在一定的范围内, 温度的升高可促进分子运动, 抗原与抗体碰撞机会增 多, 可以使反应加速 {E! 当温度高于 56'C 时, 可导致结合的抗原抗体发生解离, 甚至变性 或破坏 常用的抗原抗体反应温度一般为 3 7'C, {E! 某些血清学反应有其独特的最适反应

32 25 第一一章温度 ( 如某些反应要求温度在 4'C) ( 四 ) 振荡适当振荡可以促进抗原抗体分子的接触, 可加速反应, 但若振荡力过大, 也可造成抗原与抗体分子不易结合而影响反应的进行 参号文献 1 苏娜. 抗体工程. 北京 : 科学出版社, 龚非力. 基础免疫学. 武汉 : 湖北科学技术出版社, 龚非力. 医学免疫学 北京 : 科学出版社, ]aneway C, et al. lmrnunobiol 咱 '.5 th ed.1999.current Biology Ltd 5 Roitt 1M, et a l. lmrnunol 咱 '. 俨 ed Ma ndarinαfset (HK)Ltd 6 Zinkemagel RM, Hengartner H. Regulation of the immune rest 口 nse by antigen. Science, 2001; 293: 251 ~253 7 Cresswell P. Cell biology. Cutting and pasting antigenic peprides.science, 2004;304: 525 ~ Wachholz PA, Durham SR. Induction of blocking' IgG antibodies during immunotherapy. Clin Exp Allergy, 2003 ;33 (9): 1171 ~ Zhao Y, Kacskovicsl, Rabbani H.Physical mapping of the bovine immunoglobulin heavy chain constant region gene locus.] BioI Chem, 2003; 278 (37): 35024~ Crawley A, Wilkie BN.Porcine 19 isotypes: function and molecular characteristics. Vaccine, 2003; 21 (21 ~ 22) : 2911 抗辰 抗体与补体

33 一篇免疫学基础知识第三章 抗原提呈与免疫应答 所菊26 第口抗原 ; 是呈细胞抗原提呈细胞 (antigen - presenting cells, APC) 是指能加工 处理抗原并将抗原提呈给特异性 T 淋巴细胞的一类免疫细胞 通常所说的抗原提呈细胞是指能表达岛任 -[C II 类分子的树突状细胞 巨噬细胞 B 细胞等, 即专职性抗原提呈细胞 (professional APe) 0 某些抗原提呈细胞如内皮细胞 纤维母细胞 上皮细胞和激活的 T 细胞等, 通常情况下没有抗原提呈的能力, 但在某种剌激下, 可表达岛 1HCII 类分子并提呈抗原, 称为兼职抗原提呈细胞 (non - professional APC) 从广义上讲, 提呈内源性抗原 表达岛任 -[CI 类分子的细胞均为兼职抗原提呈细胞 一. 树突状细胞 (dendritic cell, DC) E 汇是目前所知机体内功能最强的专职性 A 配, 因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名 配广泛地分布于脑以外的全身各脏器, 虽然数量较少, 但抗原提呈能力远强于其他 APC 它能高水平表达岛 1H CII 类分子, 并能有效摄取和处理抗原, 然后移行至淋巴器官, 有效激活未致敏 T 细胞, 它的抗原提呈效率高, 少量抗原和少数配足以激活 T 细胞 (~) 树突状细胞的标志目前尚无非常理想的用于鉴定配的特异性分子标志, 往往通过形态学 组合性细胞表面标志 混合淋巴细胞反应中剌激初始型 T 细胞增殖三个方面加以综合判断, 即具有典型的树突状形态, 膜表面高表达岛任 -[C II 类分子, 能移行至淋巴器官剌激初始 T 细胞进行增殖, 并具有一些相对特异性表面标志的一类细胞 现有数种 E 汇相对特异性标志得到公认, 如人配的主要特征性标志为 CD 1a mll0 和 ms30 最近有研究发现鼠抗人庄的 α 但 F-44 单抗可识别处于分化中期和成熟期的人配, α 但 F-56 单抗识别人的 α 但 F-56 配还表达特异性识别病原微生物的受体以及 FeR, 主要参与抗原的摄取 配也表达 MHC 分子 共剌激分子 mso 及 CDs6 Iα1}\ -3ω 如 CD 咄 CD44 及自 1 比整合素家族成员( 町 λ 5 除外 ), 参与抗原提呈 另外, 配还分泌 ILl IL6 IL8 IL12 1NF α IFN α 等细胞因子, 参与机体免疫调节 ( 二 ) 树突状细胞的来源及分布 1. 来源根据配的来源, 可将配分为髓系来源的配和淋巴系来源的配, 虽然这两类配均起源于体内的多能造血干细胞, 但它们各自来源于各自的前体细胞并且有不同的功能特点, 其差别之一在于前者与单核细胞 粒细胞有共同的前体细胞, 而后者与 T 细胞, NK 细胞有共同的前体细胞 大多数 E 汇来源于骨髓, 前体配由骨髓进入外周血, 再分布到全身各组织, 其分化发育经历了从前体配到非成熟配到成熟配的过程 滤泡 E 汇则不同于一般的配, 它并非来源于骨髓, 其前体细胞主要存在于初级淋巴组织 2. 分布配广泛分布于除脑之外的全身各组织器官, 根据分布部位的不同, 可将其忏

34 第三章大致分为三类 : 淋巴样组织中的配, 包括滤泡配 (follicular dendritic cell, 曰 :::) 并指状细 胞 (i nterdigitating cell, IDe) 边缘区 E 汇 ; 非淋巴样组织中的庄, 包括间质性 E 汇 朗格汉斯 细胞 (Langerhans cell, LC) ; 循环配, 包括淋巴配 (lymphatic dendritic cell, LI 汇 ) 亦称隐蔽细 胞 (veiled cell, VC) 和血液配 滤 ; 包 E 汇存在于几乎所有的次级淋巴组织, 位于淋巴结注皮质区淋巴滤泡内, 表达免疫球蛋白受体 FcR C3bR 及免疫球蛋白 IgG 等, 使免疫复合物结合在细胞膜上, 并能使复合物中的抗原长期保留在细胞表面, 保持其免疫原性, 通过长时间剌激记忆 B 细胞, 使其保持免疫记忆 FDC 可将免疫复合物提交给 B 细胞, 经 B 细胞加工处理后提呈给 T 细胞, 启动再次免疫应答 并指状细胞位于淋巴组织 T 细胞区, 是由 LC 移行至淋巴结衍生而来的一种细胞 其表面缺乏 FcR 和 C3bR, 但富含 MHCI 类分子和 H 类分子 II 汇通过其突起与 T 细胞密切接触, 可有效将抗原提呈给 T 细胞, 并发挥免疫激活作用, 启动免疫应答 少数 IDe 为长寿 APC, 可能与维持 T 细胞的免疫记忆有关 朗格汉斯细胞是位于表皮和胃肠道上皮的未成熟的配, 在人体的防御系统中起着极为重要的作用 其表面高表达 FcR C3bR 岛 1HCI H 类分子, CDt 的 LC 胞浆内有特征性 " 网球拍 " 状细胞器, 称为 Birbeck 颗粒, 这是 LC 的标志性特征 目前认为, LC 来源于骨髓的多能造血干细胞, 在摄取 加工和处理抗原后向 T 淋巴细胞区迁移时逐渐分化为成熟配 LC 具有较强的吞噬能力和抗原提呈能力, 但其免疫剌激能力较弱 间质性 E 汇主要分布在心脏 肝脏 肾脏 肺脏等实质器官问质的毛细血管附近, 高表达 MHCII 类分子, 具有不规则的膜突起 间质 E 汇也分布在骨酷肌和大血管的内皮下, 有人认为问质配与动脉粥样硬化有关 分布于消化道 呼吸道 泌尿生殖道粘膜的问质配即粘膜配, 是一群特殊的配, 也称为哨兵细胞 其形态和表面标志随环境不同而各异 血液 E 汇主要是配的前体细胞和 I 工 )c 进入血液后的形式 淋巴 E 汇主要是配的淋巴循环形式, 分布在全身的淋巴管中, 在机体受到感染损伤等剌激后, 全身各器官的配均迁至淋巴管中成为 I 工汇, 所以 I 工汇的标志和形态各异, 但一般均高表达岛任 -IC II 类分子, 具有较强的摄取提呈抗原能力, 激活未致敏 T 细胞, 启动初次免疫应答 ( 三 ) 树突状细胞的主要生物学功能 1. 配的抗原提呈功能配可通过三条途径摄取抗原, 即吞饮作用 受体介导的内吞作用 吞噬作用 ( 详见下述 )0 I 汇对抗原的处理加工和提呈过程与其他 APC 相似 ( 详见下述 ), 但其提呈外源性及内源性抗原的能力均大于其他 APe 2. 参与 T 细胞的发育 活化和分化配作为重要的胸腺间质细胞, 在胸腺细胞的阳性选择和阴性选择中起着重要的作用 I 汇表面高表达多种共剌激分子, 可通过与 T 细胞表面的相应配体结合, 提供 T 细胞活化的共剌激信号 I 汇还分泌多种细胞因子, 参与 T 细胞的增殖 分化, 如促进 TH 细胞的分化 ( 详见第五章 ) 0 3. 参与 B 细胞的发育 活化和分化处于外周淋巴器官 B 细胞依赖区的配在 B 细胞的发育 活化 分化以及记忆 B 细胞的形成和维持中起重要作用 4. 免疫调节作用配可分泌多种细胞因子参与免疫调节, 如 IL-l IL- 8 IFN α N α 和 GM-CSF 等 配还可分泌多种趋化因子, 介导其他免疫细胞的趋化作用 27 抗Em提口王与免疫应答

35 一篇免疫学基础知识二. 巨噬细胞 (ma cropr 昭 e, Mφ 巨噬细胞起源于血液中的单核细胞 (monocyte, 比川, 单核细胞来源于骨髓中的前体单核细胞 (pre - monocyte), 它们共同构成了单核巨噬细胞系统 (mononuclear phagocyte systern, 岛 1PS)o Mφ 可主动吞噬 杀伤和消化病原微生物等抗原性物质, 是机体非特异性免疫的重要组成部分, 同时在特异性免疫应答的各个阶段也起重要作用 (~) 巨噬细胞的来源及组织分布骨髓中的髓样干细胞在骨髓微环境中在某些细胞因子, 如单核细胞集落剌激因子及单核细胞生长因子的作用下, 发育成前单核细胞 前单核细胞在单核细胞诱生因子的剌激下, 发育成单核细胞, 进入外周血 单核细胞在血液中 仅存留数小时至数日, 即移行到全身各组织器官内, 发育成为 Mφ Mφ 的寿命长达数月 以上, 其形态较大, 表面皱榴多, 内含洛酶体, 具有粘附能力和强大的吞噬能力 定居在组 织中的 Mφ, 一般不再返回血流, 它们可在组织间隙中自由移动成为游动的 Mφ, 或在组织 中成为固定的 Mφ 在无明显的炎症剌激因素时, 许多器官仅存在少量的 Mφ M'φ 在不 28 第同器官有不同的名称, 行使功能亦不同 其在不同组织中的名称分别为组织细胞 ( 结缔组织 ) 库晋弗细胞 (Kupffer' s cell) ( 肝 ) 肺泡巨噬细胞( 肺 ) 游走及固定巨噬细胞( 淋巴结 ) 游走及固定巨噬细胞 ( 脾 ) 固定巨噬细胞( 骨髓 ) 腹腔巨噬细胞( 腹膜腔 ) 胸腔巨噬细胞 ( 胸膜腔 ) 破骨细胞( 骨 ) 小胶质细胞( 神经组织 ) 组织细胞( 皮肤 ) 滑膜 A 型细胞 ( 关节 ) ( 二 ) 巨噬细胞的表面标志近年来己制成多种用以鉴定 MPS 的 McAb, 如 OKM-1, 鸟也 c -120 M01-4 等 Mφ 上表达丰富的岛任 -[CI H 类分子, 其中岛任 -[crr 类分子的表达受许多因素的影响, 且与 Mφ 的功能状况有关 MIl 表面有多种受体, 如 FcR 和 C3bR 可与免疫复合物结合, 进而发挥免疫功能 ; 细胞因子受体如 M-CSFR 等可介导 Mφ 的分化发育 ; 趋化性细胞因子受体, 使 MIl 在趋化因子的剌激下进入炎症反应部位 ( 三 ) 巨噬细胞产生的酶及分泌产物单核巨噬细胞能产生多种胞内及胞外酶, 如洛酶体酶 洛菌酶 髓过氧化物酶等 MIl 还可产生和分泌多种生物活性物质如细胞因子 补体成分 激素样物质 凝血因子等 此外 Mφ 还分泌反应性氧代谢中间产物和 NO 等 这些酶类和分泌产物, 与 Mφ 的生物功能密切相关 ( 四 ) 巨噬细胞的主要生物学功能 Mφ 的生物学功能主要表现在下面三个方面 : 1 抗原提呈作用, Mφ 作为体内重要的抗原提呈细胞, 参与抗原的摄取 加工 处理 提呈并激发免疫应答 ( 详见下述 ) ;2 吞噬杀伤作用, M'φ 可作为效应细胞直接消除各种异物, 杀伤肿瘤细胞和胞内寄生的病原体, 行使非特异性免疫功能 ;3 免疫调节功能, Mφ 通过提呈抗原和分泌各种细胞因子而激活或增强免疫应答 抑制性 Mφ 能分泌有免疫抑制作用的活性物质如 PGE, 从而抑制免疫应答 二.B 细胞 B 细胞能持续表达 MHcrr 类分子, 能有效提呈抗原给 CD4 +T 细胞 它通过两种方式摄取抗原, 即通过 BCR 特异性摄取抗原以及通过非特异性的胞饮作用 前者为其主要的摄取抗原方式, BCR 与抗原的特异性决定簇结合, 发生受体介导的内吞作用, 经加工处理后的抗原多肤与 MHcrr 类分子结合后表达于细胞表面, 提呈给 ω'4+ T 细胞, 并激活之 同时也诱导 B 细胞分泌细胞因子, 激活 B 细胞使之转化为浆细胞, 发挥免疫效应 四. 兼职抗原提呈细胞

36 Em29 第; 是呈疫应答抗原 兼职抗原提呈细胞包括血管内皮细胞 各种上皮细胞和间质细胞 皮肤的成纤维细胞 及活化的 T 细胞等, 兼职抗原提呈细胞可能参与炎症反应或某些自身免疫病的产生 第二币 抗原提呈细胞 (APe) 摄取抗原并将其处理成免疫原性多肤, 以岛 1H C 分子 抗原肤复 合物的形式表达于 APe 表面, 供 T 细胞的 TCR 识别 同时, APC 表达协同剌激分子与 T 细胞表面相应配体结合, 进而激活抗原特异性 T 细胞, 产生免疫应答 以上复杂过程称为 抗原提呈 T 细胞不能直接识别游离的抗原, 只能通过 T 细胞表面的特异性受体 (TCR) 识 别经 APC 提呈的抗原, 因此抗原提呈在免疫应答中有着重要的意义 根据被提呈抗原的来源不同, 可将其分为两大类 : 来源于细胞外的抗原称为外源性抗 原 (exogenous antigen), 如被吞噬或吞饮的细胞 细菌 微生物蛋白质分子或某些自身成分 等 ; 细胞内合成的抗原称为内源性抗原 (endogenous antigen), 如病毒感染细胞所合成的病 毒蛋白 肿瘤细胞合成的蛋白以及胞内某些自身成分等 前者被 APC 摄取 加工 处理, 形成抗原肤 MHCII 复合体表达于 APC 表面, 被 ω'4+ T 细胞识别, 此途径称为洛酶体途径 ( 亦称岛证 -[CII 类途径 ) ; 后者在胞内加工 处理形成抗原肤 岛任 -[CI 复合体, 供 CDs+T 细胞 识别, 称为胞质洛胶途径 ( 亦称岛 1H CI 类途径 ) 此外, 体内还存在一种鸟 1H C 非依赖性的 抗原提旦机制 一. 溶酶体提呈途径 外源性抗原的提呈遵循洛酶体提呈途径, 受 MHCII 类分子限制 抗原由 APe 摄取 后, 经内质体洛酶体加工处理, 形成免疫原性多肤 ; 在内质网中, 岛任 -[C II 类分子的 a 自链 与恒定链形成九聚体, 转运至内质体洛酶体中, 其中的抗原肤与岛 1H CII 类分子形成复合 物 抗原肤岛 1H CII 类分子复合物被转运并表达 APe 表面, 被 m4 +T 细胞识别 具体过 程如下 : (~) 外源性抗原的摄取 外源性抗原进入机体后, 首先与抗原提呈细胞结合, 不同的 APe 与蛋白抗原结合的途径 效率及特异性均不同 1. 巨噬细胞可通过多种方式摄取抗原 Mφ 可非特异性的吞噬固体或大分子复合物 等颗粒抗原, 即吞噬作用 ;M'φ 可非特异性的吞入可溶性抗原或极微小的颗粒, 即吞饮作 用 ;Mφ 可借助表面免疫球蛋白 Fe 受体及补体 b 受体等, 有效介导抗原识别与摄取, 即 表面分子介导的胞吞作用 2. 树突状细胞对抗原的摄取 早期研究认为配只具有吞饮能力, 而无吞噬颗粒抗 原的能力, 现阶段研究表明配也具有一些功能性受体介导的颗粒性抗原的吞噬能力 配可通过多种途径摄取抗原 :1 通过吞饮作用 : 即细胞骨架依赖型的 由膜皱泪和形成大 囊泡的液相内吞作用 I 汇具有强大的液相吞饮功能, 未成熟的配吞饮速度快 吞饮量 大 2 通过受体介导的内吞作用 : 配借助表面的受体有效捕获低浓度相应抗原, 如经 FeR 捕获抗原抗体复合物或经甘露糖受体捕获甘露醇糖化及岩藻糖化抗原, 后者可在内 吞体的 ph 环境中释放出其配体使其再循环, 从而通过少量受体可捕捉较多的抗原物质 在 E 汇成熟过程中, 其 Fe 受体及甘露糖受体表达下调, 使其摄取抗原能力下降 3 通过 吞噬作用摄取抗原 : 某些部位的配或仅在发育的某些特定阶段的配具有一定的吞噬能 三章抗提口王与免

37 一篇免疫学基础知识力 3. B 细胞对抗原的摄取 B 细胞通过两种方式摄取抗原, 一是通过非特异性的胞饮作用, 二是通过其表面的抗原特异性受体 (BCR) 介导, 由于 BCR 与抗原具有高亲和力, 使抗原浓集于 B 细胞表面后摄入胞内, 所以在抗原浓度非常低的情况下也能有效提呈抗原 ( 二 ) 外源性抗原的加工处理外源性抗原经以上过程进入 APC 后, 在胞内被质膜包裹, 运送到胞浆内的一种膜性细胞器内质体中 在酸性环境中被附着于其膜上的蛋白酶水解为抗原片段, 并随内质体转运至洛酶体, 洛酶体 (ph4. 5 ~ 5. 0 ) 内含有多种水解酶, 最终抗原被降解为大概含有 13~18 个氨基酸残基的短肤, 可与岛任 -[C rr 类分子相结合 内质体及洛酶体是 APC 加工处理抗原的主要场所 ( 三 ) 岛任 -[C rr 类分子对外源性抗原的提呈作用岛任 -[C rr 类分子主要表达于抗原提呈细 胞, 如配 巨噬细胞 B 细胞 激活的 T 细胞等, 其主要作用是以抗剧太 阳 crr 类分子复 合物的形式将抗原肤提呈给 CD4 +T 细胞 岛 1Hcrr 类分子对抗原的提呈与其本身结构及另一特殊分子恒定链 (invariant chain, Ii) 有密切关系 Ii 是一条分子量为 31 kda 的非多肤性糖蛋白 岛 1Hcrr 类分子 α 链和自链在粗面内质网中合戚, 并在钙联蛋白参与下折叠成异二聚体, 各含有两个胞外区 (α1 α2 及自 1 民) 一个跨膜区和一胞内片段 α1 链及自 1 链通过 一个自片层和两个 α 螺旋形成一个抗原结合槽, 此槽的两端为开放结构, 使它结合的多月太 30 第在 N 端及 C 端可有适当的延长 粗面内质网膜上存在 Ii, 其 N 末端与岛 1Hcrr 类分子结合 成 (α ~ - Ii)3 九聚体 Ii 的主要作用有参与 α 链和自链的折叠, 促进岛 1Hcrr 类分子二聚 体的形成 ; 促使岛 1Hcrr 类分子在细胞内的转运, 尤其是从内质网向高尔基体的转运 ; 封闭 岛任 -[crr 类分子的肤结合槽, 有效阻止岛 1Hcrr 类分子在离开内质网后与胞浆中未成熟的内 源性多肤结合, 使其与即将提呈的外源性抗原多月太相结合 1. Ii 依赖性的岛 1H crr 类分子合成途径 (α ~ - Ii) 3 九聚体由内质网转运至胞浆内 的腔室结构 ( 内质体洛酶体 ) 内, 在酸性环境及某些蛋白水解酶的作用下 Ii, 与岛 1HCa~ 异 二聚体尚不能完全解离, 肤结合槽里仍保留一小段含 80~104 个残基的 Ii 链, 称为 H 类分 子相关的恒定链多肤 (class rr - associated invariant chain peptide, CLIP), 此时的岛任 -[C rr 类分 子不能与抗原肤结合 o HIA-DM 分子 ( 一种非经典岛任 -[crr 类分子 ) 可使 CLIP 与抗原肤结 合槽解离, 这样, 岛任 -[C rr 类分子才可以与腔内的抗原肤结合形成稳定的复合物, 转运至胞 膜, 供 ωjt 识别 2. Ii 非依赖性途径部分外源性抗原直接与胞膜表面的空载岛 1Hcrr 类分子结合后, 被吞噬入细胞内, 在内质体中抗原被阵解为多肤, 随后与再循环至胞内的空载的成熟 岛 1Hcrr 类分子结合, 形成稳定的抗原肤岛 1Hcrr 类分子复合物, 转运至细胞膜, 供 m4 +T 细胞识别 在此过程中, 岛 1Hcrr 类分子 α 或自链尾部具有极其重要的作用, 若去除 α 或自 链尾部, 将使 APC 表面岛任 -[crr 类分子内化受阻 二. 胞质溶胶途径 岛任 -[C I 类分子提呈的抗原是细胞内源性多肤, 他们大多来自于胞浆或核蛋白, 如细胞 自身蛋白 病毒胞膜蛋白 肿瘤抗原等 细胞内形成的内源性抗原在胞质内首先被蛋白酶体 (proteasone ) 降解成大小不等的肤

38 第三章段, 继之借助抗原多纠月肤太转运蛋白阳 ( transpo 阳 of an 山 1 与新合成的岛怔但 -r CI 类分子结合, 形成抗原月肤太岛怔但 -rci 类分子复合物, 最后经高尔基体等细胞外扫排 F 系统 (intracellular exocytic compartment, IEC) 转运至细胞表面, 供 CDs+T 细胞识别 具体过程如下 : (~) 抗原的降解目前发现细胞内蛋白酶体又称低分子量多肤或巨大多功能蛋白酶 (low molecular weight polypeptide or large multifunctional protease, 山 1P), 在内源性抗原的降解中发挥重要作用 蛋白酶体有两个亚单位山 1P 2, 山 1P7, 是岛任 -rc 蛋白酶相关基因山 1P 2 山 1P7 基因编码产物 1979 年, Goldberg 等首先报道了在大鼠肝脏和阿织红细胞中存在一种分子质量为 700 kda 的受 A1P 激活的中性蛋白酶 此后, 一些在形态 功能及免疫学特性上与之相同的颗粒通过不同途径被分离出来, 它们被命名为蛋白酶体 蛋白酶体广泛存在于真核细胞中, 在古细菌和真菌中也有表达 蛋白酶体包括两种形式 :20 s 复合物 (700 kda) 和 26 s 复合物 (l 500 kda) 26 s 复合物由 20 s 复合物与 19 s 复合物 ( 又称 PA700) 组成, 主要负责依赖泛素的蛋白质降解途径 在电镜下, 不同种族 不同组织来源的 20 s 蛋白酶体具有相当一致的结构 : 其为一个由 4 个圆环叠成的圆筒状颗粒, 每个圆环包含 7 个亚基, 依次为 α7 日 7 日 7α7 蛋白酶体是一种多催化活性蛋白酶, 活性位点是自亚基 N 段的保守残基 1hr, 当日亚基的 N 段前导序列被切除后, 这个 1hr 就被暴露出来 一般认为, 19 s 复合体与 20 s 复合体结合后可显著提高 20 s 复合体蛋白酶活性 如无 19 s 复合体, 则 20 s 复合体不能阵解泛素化蛋白 20 s 复合体一般只能降解小肤, 有时也能阵解蛋白, 但必须先被激活 26 s 蛋白酶体一般只降解泛素化蛋白, 只有极少数未泛素化蛋白被 26 s 蛋白酶体降解 泛素为一种高度保守 分子量约为 8.5 kda 的蛋白质, 胞内蛋白需与泛素共价相联后才能被 26 s 蛋白酶体迅速降解 泛素依赖性的蛋白水解途径是岛任 -rc I 类分子提呈过程的先决条件 内源性抗原常在胞浆内多种酶和 A1P 的作用下与泛素 ( ubiquitin) 结合, 泛素化的内源性抗原被解除折叠, 以线性形式进入蛋白酶体, 泛素的参与有助于保证其他功能性蛋白不被水解 蛋白酶体对蛋白质的阵解具有高选择性, 受到精细的调节, 以免水解扩大化引起的细胞损伤 降解后所产生的肤段, 部分被进一步降解为单个氨基酸后重新用于蛋白质合戚, 部分则被转移到内质网腔内, 与岛任 -rci 类分子结合 ( 二 ) 抗原多肤的转运抗原多月太在被转运至内质网腔之前, 首先与胞浆中的热休克蛋白 70(hot shock protein, hsp) 结合, 然后将抗原多月太转移到另一个 hsp90 分子上, 并由 hsp90 转运至内质网膜处, 通过内质网膜的抗原加工相关转运体 (transporter associated with antigen processu 毯, or transporter of antigenic peptides, TAP), 将多月太递交给腔内的 gp96 分子, gp96 分子具有蛋白酶活性和 A1P 酶活性, 其结构上有 A1P 结合位点, 也是 ABC 家族成员 gp96 结合 A1P 后, 在地 ν 存在条件下发挥 A1P 酶活性, gp96 ~ 旦与 MHCI 类分子结合, 就可激活 gp96a1p 酶活性, 释放能量供 gp96 发生构型的改变, 从而将多肤交给岛任 -rci 类分子, 有助于抗原多肤与岛任 -rci 类分子的结合 TAP 也是一个与岛 1HC 相关的基因产物, 编码 TAP 的基因与 11v 但 山 1P7 的基因相邻, 都位于 MHCI 类基因群 TAP 为二分子的异二聚体 (TAP1 2), TAP1 和 TAP2 各跨越内质网膜 6 次, 形成一 " 孔 " 样结构, 依赖 A1P 对多肤进行主动转运 目前认为 TAP 对多肤的转运过程为 : 多肤与孔样结构的胞浆区结合, A1P 结合在 TAP1, TA 凹的竣基端, 经水解后导致 TAP 异二聚体的构型改变, 从而暴露膜内区的结合位点, 使多月太进入内质网膜腔 31 抗Em提口王与免疫应答

39 一篇免疫学基础知识32 第一个细胞每分钟大约能转运 个多肤 TAP 分子对 8~12 个氨基酸的肤段具有较高的亲和力, 该长度与岛任 -rci 类分子结合的多肤长度相近, 因此适于与岛任 -rci 类分子结合的肤段优先转运至内质网 TAP 也能转运较长或较短的多肤, 只是亲和力较低, 最多能转运几个氨基酸尚未确定 某些胞膜蛋白或内源性合成抗原, 部分进入胞浆的外源性蛋白以及部分在内质网合成的蛋白可不依赖 TAP 被处理 此处理过程发生在内质网或其他相关小室中, 主要借助于内质网内的原位阵解, 参加 TAP 非依赖加工反应的蛋白酶尚不清楚 经加工修饰的抗原肤, 在内质网中与岛 1HCI 类分子的结合和转运过程与通过 TAP 处理机制相似 ( 三 ) 岛任 -rci 类分子对内源性抗原的提呈作用岛 1HCI 类分子广泛分布于有核细胞的细胞膜上 它是由重链 α 和轻链 ~2m 以非共价键结合组成的二聚体 重链的胞外部分有 α1 α2 电三个功能区, α1 和归功能区形成了岛 1HCI 类分子结合多肤的槽状结构 槽的两个侧面是相反走向的 α 螺旋, 底面为一组 8 个折叠拌组成的自片层, 形成大小约 1 nm X 2.5 nm X 1. 1 nm 的区域, 槽状结构纵向的两端是封闭的, 一般只能接纳 8~ 1O 个氨基酸残基的抗原肤, 这样, 岛 1HCI 类分子与抗原多月太可以有效结合, 保证了有效抗原提呈的功能 在内质网内, 岛 1HCI 类分子的重链 α 链与免疫球蛋白的结合蛋白 (Bip) 或钙连接蛋白 ( cainexi 日 ) 结合, 钙连接蛋白或 Bip 的功能是与 α 链结合, 限制其移动, 防止其降解, 促进其与民微球蛋白的组装, α 链民微球蛋白结合后, 释放钙连接蛋白, 在此时另外一个分子伴侣钙网蛋白 ( caireti culi 口 ) 与日 2 微球蛋白复合物结合 在细胞缺乏自 2 微球蛋白时, I 类分子重链仍然与钙连接蛋白结合, 这可能是这些缺乏自 2 微球蛋白的细胞不能在膜上表达相当数量 I 类分子的原因 然而, I 类分子的运输对比微球蛋白的要求不是绝对的 缺乏自 2 微球蛋白的细胞表面仍可检测到低水平的 I 类重链分子 除与钙网蛋白结合外, α 链 ~2 微球蛋白复合物也与一个被称为 TAP 相关蛋白 ( tapasi 日 ) 的 MHC 编码分子相结合 TAP 相关蛋白将内质网膜上提供抗原肤的分子 TAP 聚集和不含肤的 I 类分子比复合物联系起来, 之后, 钙网蛋白和 TAP 相关蛋白解离, 抗原肤与 α 链 民微球蛋白形成结构稳定的三聚休, 随后, 此三聚体与 TAP 分离, 移行至高尔基体, 通过分泌囊泡移行至细胞表面, 供 CDs+T 细胞识别 游离的抗原多月太在内质网内半衰期 1~ 短, 故与岛 1HCI 类分子高亲和力结合的多肤才得以保护, 从而一定程度上保证了岛 1HCI 类分子对肤分子的选择性 从以上过程可以看出, 被提呈的抗原经历了蛋白酶体对抗原蛋白的选择性水解,TAP 对抗原多肤的选择性转运, 岛 1HCI 类分子对多肤结构的限制这三个关键环节, 保证了抗原提呈的准确性和特异性 ( 四川任 -rc 分子对抗原的交叉提呈现象 1. 岛 1HCII 类分子对内源性抗原的提呈现阶段研究表明岛任 -rc II 类分子对内源性抗原的提呈可能通过三种方式 : 第一种是类似于岛 1HCI 类分子与内源性抗原结合的方式, 在内质网中新合成的岛 1HC 类分子即与多肤结合 ; 第二种可能的途径是新合成的岛任 -rc II 类分子与尚未完全降解的内源性蛋白在内质网中形成复合体, 这些复合体在被转运至内质体经加工处理后再呈递 ; 第三种是内源性蛋白进入洛酶体, 像外源性抗原一样, 被加工处理呈递 尽管岛 1H CII 类分子中的 Ii 能抑制岛任 -r C II 类分子通过前两种途径与内源性抗原结合, 但是否能完全抑制目前还有不同看法

40 33 第2 疫应答口Em岛任 -rci 类分子对外源性抗原的提呈最近研究发现, 岛任 -rci 类分子也能呈递外源 性抗原, 主要由巨噬细胞 配等抗原提呈细胞完成 某些外源性抗原可从内质体洛酶体 中逸出至胞质中, 进入岛 1HCI 类分子介导的抗原加工途径 ; 外源性抗原也可直接与胞膜 表面的空载岛但 CI 类分子结合, 然后被吞噬入胞内, 与吞噬小体和洛酶体融合, 降解成多 月太后, 再与经胞膜再循环进入胞内的空载岛任 -rci 类分子结合, 也可以外排至胞外再与膜 上空载的岛 1HCI 类分子结合而被提呈 ; 感染的细胞或肿瘤细胞洛解后 Hsp 肤分子复合 物被释放, 由吞噬细胞摄取, 进入吞噬细胞的胞质洛胶途径 这种交叉提呈并不是抗原提 呈的主要方式 二. 非经典岛任 -rc 分子提呈途径 对蛋白质抗原的提呈, 主要通过上述两条途径 近些年研究发现, 某些非岛 1H C 分子 ( 如 m] 和分子伴娘 ) 可在脂类抗原的提呈中发挥作用 ω1 基因位于 MHC 之外, 在人类 ω1 基因位于第 1 染色体 (lq22-23), 分为五组 : ω]a ω1b ω]c ω'j D ω], 前四组分别编码 CDla ω1 协 b CD 至今还未发现 Oω1 分子的细胞外蛋白是由 α1 耐和 α3 结构域组成, 其大小与岛但 CI 类 分子的相应部分相似 ω1 分子近膜侧的问结构域与阳 CI 类分子的问结构域在序列 上有明显的同源性, 但 α1 归结构域与岛任-rC 分子的相应部分仅有很低的同源性, 并含有较 多的疏水性氨基酸残基 根据 α1 归结构域的序列同源性, 可将 ω1 分为两类 :CD] I 包 括 CD]a CD] 们 ωh 主要表达于专职 APC 如朗格汉斯细胞 皮肤和淋巴结 E 汇 淋巴结皮质 区的 B 细胞和激活的单核细胞等 ;m]ii 包括 m]d' 表达于肠上皮细胞表面 与孔 1HCI 类分子不同, ω1 分子的抗原结合槽深而且狭窄, 其非极性或琉水性氨基酸 侧链几乎全呈线性排列, 故适于提呈糖脂类或脂类抗原 现己证明, m]b 和 ω]c 分子能够 呈递分枝杆菌胞壁糖脂成分 ω1 分子与脂质抗原中的疏水端直接结合, 抗原亲水端则 被 1CR 识别 CD] 分子介导的抗原提呈依赖于 APC 的抗原摄取和处理, 内源性脂类和外 源性脂类均能被 ω1 分子呈递, 但脂类的提呈无需 MHC 基因编码的抗原加工分子 ( 如 DMADMB 或 TAP) 参与, 而可能是其他分子参与对 CD] 的运输和脂类抗原的加工 处理 小鼠的 ω1 特异性 T 细胞主要是 CD4 + 细胞, 也包括 m4 -CD s - 细胞, 但没有 ωj 细 胞 人类 ω1 特异性 T 细胞主要是携带 1CR, 峭的 m4 -CD s - 细胞 但最近的研究表明 's+t 细胞和 1CRγ 盯细胞也可识别 CD] 分子 通过在胸腺的分化过程, 这些 CD] 特异性 细胞获得了某些独特的性质 : 首先, 它们表达 NK 细胞受体 ; 其次它们具有特殊的细胞分 泌功能, 特别是 ωj 细胞亚群, 当初次剌激后, 1 h 内便可分泌大量 IL- 4, 从而可能促进 TH2 细胞应答 现有研究发现, 表达 1CRα 自或 1CR 扮的 T 细胞可使表达 CDla 或 ω]c 的肿瘤细胞洛解, 三章抗提口王与免说明 ω1 分子可介导 T 细胞的杀伤作用 ;CD] 特异性 T 细胞可表现出细胞毒性, 杀伤经 ω1 提呈分枝杆菌的感染细胞 这说明 ω1 分子和 ω1 特异性 T 细胞有重要意义 一一一免疫应答 (immune response, Ir) 是指机体免疫系统受抗原剌激后淋巴细胞特异性识别忏所菊免疫应答概述

41 一篇免疫学基础知识抗原分子, 发生活化 增生 分化或无能 调亡, 进而表现出一定生物学效应的全过程 机体通过免疫应答识别 " 自己 " 与 " 非己 ", 以排除 " 非己 " 的抗原性异物, 保持内环境的稳定 在正常情况下, 机体对 " 非己 " 抗原产生正应答, 执行免疫防卫功能 ; 对自身抗原产生负应答, 即免疫耐受, 以保护自身组织器官不受免疫系统的攻击 但在异常情况下, 机体对 " 非己 " 抗原应答过高, 导致超敏反应的发生, 应答过低, 导致免疫功能低下或缺失, 易致严重感染或肿瘤的发生 ; 对自身抗原发生应答, 则导致自身免疫病 免疫应答是一个十分复杂的过程, 由多种免疫细胞和免疫因子参与, 并受遗传因素的调控, 目前有许多环节尚未完全清楚, 有待进一步的研究 一. 免疫应答的类型在体内有两种免疫应答类型, 一种是非特异性免疫应答, 亦称固有性免疫应答 ( innate nni 丑 une response) ; 一种是特异性免疫应答, 亦称获得性免疫应答 (adaptive imr 丑 une response) 机体遇病原体后, 首先并迅速起防御作用的是非特异性免疫应答, 它是生物体在长期种系发育和进化过程中逐渐形成的一系列防御功能 在机体抗感染过程中, 它发挥作用快, 范围广, 是抗感染的第一道防线 执行非特异免疫功能的细胞主要有皮肤粘膜上皮细胞 吞噬细胞 NK 细胞 NK1. 1 +T 细胞 γ 盯细胞和 B-1 细胞 当病原体如细菌 真菌及 34 第胞内寄生的寄生虫等穿越皮肤 粘膜屏障, 入侵体内, 可及时地被正常分布于该处的巨噬 细胞和来自周围毛细血管的中性粒细胞吞噬清除, 大多数病原体感染终止于此 对病原 体感染的细胞或肿瘤细胞, 尚有 NK 细胞识别加以杀伤 吞噬细胞及 NK 细胞的免疫特点 是 : 能识别多种病原体的共有成分, 对病原体无严格选择性, 对多种病原体均有吞噬 杀伤 作用 巨噬细胞及 NK 细胞的这种功能, 在遇到病原体以前己经存在, 但在执行功能后, 不产生免疫记忆, 再次遇到病原体后, 吞噬杀伤功能并不增强 对于部分入侵病原体, 产 生非特异性免疫的炎症反应, 吞噬细胞活化产生并释放细胞因子, 而致血管扩张, 通透性 增加, 血管内容物渗出, 引起局部红 肿 热 痛, 即炎症 细胞因子还致血管内皮话化, 血 管内巨噬细胞及中性粒细胞等炎症细胞渗出 另外, 活化的巨噬细胞等作为 APe 提呈抗 原, 诱导特异性免疫应答 特异性免疫应答是在非特异性免疫应答的基础上建立起来的, 又称获得性免疫应答, 即狭义上的免疫应答, 下面所阐述的免疫应答即特异性免疫应答 参与特异性免疫应答的细胞主要有 T 细胞 B 细胞和抗原提呈细胞 特异性免疫应 答根据机体清除抗原的效应机制及其所参与的主要免疫细胞不同, 可分为 T 细胞介导的 细胞免疫应答, 即 T 细胞活化而介导的杀伤细胞或免疫炎症效应的特异性细胞免疫应答 ; B 细胞介导的体液免疫应答, 以特异性抗体发挥免疫作用 二. 免疫应答的基本过程 免疫应答过程被人为地划分为三个阶段 : 感应 ( 或识别启动 ) 阶段 增殖和分化阶段 效应阶段 实际上这三个阶段是紧密相关和不可分割的连续过程 1 感应阶段 :APC 摄 取 加工 处理抗原,T 细胞 B 细胞通过 TCR BCR 特异性识别抗原 2 增生和分化阶段 : 在此阶段, 接受抗原剌激的淋巴细胞活化 增殖和分化, 又称活化阶段 T B 细胞特异性 识别抗原后, 在多种细胞因子 粘附因子的作用下, 活化 增殖 分化为效应性 T 细胞或浆 细胞, 并分泌免疫效应分子 ( 各种细胞因子和抗体 ) 3 效应阶段 : 在此阶段, 免疫效应细

42 Em35 第T 细胞介导的细胞免疫应答疫应答胞和效应分子共同发挥作用, 与抗原结合清除抗原或与靶细胞结合发挥免疫效应, 及诱导 机体产生免疫耐受 第四币细胞免疫应答 (cellular imnunoresponse) 亦称细胞介导的免疫 ( cell - mediated imnunity, α11), 参与细胞免疫应答的细胞既包括非特异性细胞如巨噬细胞 中性粒细胞 嗜酸性粒细胞及 NK 细胞等, 又包括抗原特异性免疫细胞 T 细胞 前者介导吞噬作用及细胞毒作用, 后者介导特异性的免疫应答即狭义上的细胞免疫, 也是本节讨论的范围 细胞免疫应答是特异性及非特异性细胞相互作用的结果, 而且常依赖于各种体液分子的参与 一.T 细胞对抗原的识别 T 细胞抗原受体 (T cell recepter, TCR) 在识别 APe 所提呈抗原时, 必须同时识别与抗原肤形成复合物的岛任 -IC 分子, 即 T 细胞的双识别 经小鼠实验证明, 从 H-2 k 小鼠体内分离的巨细胞病毒特异性 CIL, 只能杀伤被病毒感染的同品系来源的靶细胞, 而不能杀伤仅表达 H-2 b 的靶细胞, 提示抗原复合物中的岛任 -IC 分子须与自身岛 1HC 分子属于同种或同型, 才能介导 T 细胞免疫应答, 即 T 细胞的岛 1HC 限制性 T 细胞识别抗原的主要单位是 TCR 与一组 CD3 分子以非共价键结合而形成的复合物 :TCR ω3 复合物 ( 图 3-1) 大多数成熟 T 细胞的 TCR 分子是由 α 和自链组成的异二聚体 TCR,α 自分子, 在 CD4 - i 的未成熟 T 细胞及少数成熟 T 细胞表面的 TCR 分子是由 γ 和 8 链组成的异二聚体 TCRγ i) o 这两种 TCR 分子各由两条异源二聚体肤链经二硫键连接组成跨膜分子, 膜外区包括可变区 (V 区 ) 和稳定区 (C 区 ), 类似 19 结构 跨膜区带正电荷, 有利于跨膜区带负电荷的 CD3 分子以及协同剌激分子与之聚集 TCRα 自识别抗原复合物时, 其 α 自链可变区的 CDR1 和 CDR2 区结合岛任 -IC 分子顶部的 α 螺旋和抗原肤的两端, ω 阳区结合抗原肤中央的 T 细胞表位处, 即同时识别抗原肤及岛 1HC, 发挥 T 细胞的双识别作用 ω3 是 T 细胞表面的主要分化抗原之一, 由 γ 心 5 和可五种肤链组成, 孜以及 i)e; 两 三章抗提口王与免条肤链以非共价键形式组合, 也或切两条肤链以二硫键结合, CD3 分子通过盐桥与 TCR 形成稳定的复合物结构, 以 γ12, i)e; ~~ 或 γe 浅 切的形式形成复合物 ω3 分子的胞内区 含有免疫受体酷氨酸活化基序 (imr 丑 une receptor tyrosine - based active motif, ITAM), 参与 T 细胞的活化 所以 TCR 是识别异种抗原和自身 MHC 分子的受体, 而 ω3 分子并不参与 抗原识别, 它具有稳定 TCR 结构和传递活化信号的作用 另外, T 细胞的辅助受体 ω'4 CDs 可发挥细胞间粘附作用, 加强 TCR 抗原肤 MHC 的结合, 并且其胞内与蛋白酶氨酸激酶 ( 凹 K) 相连, 协同活化 T 细胞 CD4 分子以单链形 式存在, 与 MHC- II 类分子的非多态部位 ( 民 ) 结合, ω8 分子以双链形式存在, 与岛 1HC I 类分子的非多态部 (α3 ) 结合 TCRyi) 识别抗原机制尚不完全明确, 大部分 γ 盯细胞表 面缺乏 CD4 ω8 分子, 一般认为, 其对抗原的识别是岛 1HC 非限制性的, 但一部分 γ 盯细 胞, 特别是成熟的 γ 盯细胞, 其对抗原的识别可能是岛 1HC 限制性的 二.T 细胞的活化. 增殖及分化

43 一篇免疫学基础知识初始 T 细胞接受抗原剌激后活化, 进而增殖 分化为效应 T, 具体内容见第五章, α F 36 第COOH 图 3-1 二.T 细胞介导的免疫效应机制 T 细胞介导的免疫应答的免疫效应主要有 :1 抗感染 : 主要针对胞内感染的病原体, 如细菌 病毒 真菌 寄生虫等 2 抗肿瘤 : 主要有 Tc 细胞的特异性杀伤作用 ; 巨噬细胞 NK 细胞的 AI 汇 C 效应 ; 各种细胞因子直接或间接的杀瘤效应等 3 免疫损伤作用 :T 细 胞效应可能参与 E 型超敏反应, 移植排斥反应, 某些自身免疫病等 由 T 细胞介导的免疫效应有两种基本形式 : 一种是细胞毒性 T 细胞 (Tc 或 1CL) 介导 的特异性细胞毒作用 ; 一种是 CD4 +T H1 细胞介导的细胞免疫效应 (~ )THl 细胞介导的细胞免疫效应 TH1 细胞主要分泌 IL-2 INF- /,,1NF- ~ 及 GM CSF 等, 主要介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答, 参与细胞免疫以及 j 旦发型超敏性 炎症的形成, 故亦称为炎症性 T 细胞 TCR - CD:J 复合物示意图 1. TH1 可产生多种细胞因子 通过多种途径作用于巨噬细胞引起炎症某些胞内寄生 的病原休, 可在 Mφ 的吞噬小体内生长, 并逃避特异性抗体和 生病原休, TH1 细胞可通过活化 Mφ 及释放各种活性因子而攻击之 CIL 攻击 针对此类胞内寄 活化的 TH1 细胞分泌的 IFNγ 是单核巨噬细胞强有力的活化因子, 此外, TH1 细胞 表面表达 CD40L 与 Mφ 表面的 CD40 结合, 也可向其发出活化信号, 促进其激活 活化的 Mφ 内吞噬小体可与洛酶体结合, 在低 ph 值条件下, 杀菌酶活性大大增加 ; 活化的 Mφ 还产生 超氧离子和 NO, 并合成释放各种抗菌肤和蛋白酶等, 可强有力的杀伤病原微生物 的 Mφ 表面岛任 -[crr 分子和 1NF α 受体数量增加, 具有更强的提呈抗原和激活 T 细胞的 能力, 从而增强放大了免疫应答 TH1 细胞可通过两种途径募集巨噬细胞, 一种是 TH1 细胞 产生 IL-3, GM-CSF, 剌激骨髓产生新的巨噬细胞, 一种是 TH1 细胞分泌 1NF α 1NF- ~ 活化

44 37 第Em疫应答和 MCP-l 等, 使血管内皮高表达粘附分子, 介导吞噬细胞粘附和游出血管至感染部位 2. TH1 细胞通过分泌细胞因子作用于多种免疫细胞 TH1 细胞产生 IL-2 等细胞因子, 促进 Tl 细胞,Te 细胞等增殖, 增强放大免疫效应 ; 产生 00 γ, 对 B 细胞合成 IgE 起负调节作用, 但对其他几种 Ig 的合成起辅助作用, 影响速发型超敏反应的发生 产生 OO-/" IL- 2, IL-12 等细胞因子, 激活 NK 细胞并增强其杀伤功能 ; 产生 1NF α 1NF 日, 活化中性粒细胞, 促进其杀伤病原体的作用 总之, TH1 细胞所产生的多种细胞因子均属于炎症介质, 可直接或间接介导炎症, 主要 通过活化 Mφ 而诱导炎症性迟发型超敏反应, 在宿主的抗胞内病原感染中起重要作用 ( 二 )Te 细胞介导的细胞毒效应 Te 细胞多为 C 口 J T 细胞, 主要杀伤被病毒或其他胞内寄生微生物感染的宿主细胞及肿瘤细胞等 Te 细胞可高效 特异性地杀伤靶细胞而不损害正常组织 Te 细胞介导的免疫效应在抗病毒感染及抗肿瘤中起着重要的作用 Te 细胞杀伤靶细胞的过程分为两个阶段 : 效靶细胞结合阶段和致死性打击阶段 1. 效靶细胞结合 Te 细胞必须与靶细胞直接接触才能发挥杀伤效应 Te 细胞表面的 1CR 识别靶细胞表面的抗原肤岛 1HCI 类分子复合物并与其结合,CDs 分子加固其结合, 然后 Te 细胞上的淋巴细胞功能相关抗原 l(lfa -1) CD2 等粘附分子, 有效结合靶细胞表面的细胞间粘附分子 (Ie 丛 1) LFA-3 等, Te 细胞与靶细胞结合更加紧密, 且胞浆内颗粒集中向靶细胞结合部位移动, 从而使效应 Te 细胞释放的效应分子集中作用于靶细胞, 以保证特异性杀伤所接触的靶细胞, 而邻近的正常细胞不受损害 在 3 7'C 并有地 2+ 存在的条件下, 此过程历时数分钟 2. 致死性打击 Te 细胞主要通过两种途径杀伤靶细胞 : 穿孔素 颗粒酶介导的分泌性杀伤和受体介导的细胞凋亡途径 具体途径主要依赖于 T 细胞类型, 其次为靶细胞上 Fas 的表达及敏感程度等 (1) 分泌型杀伤 Te 细胞分泌穿孔素 (perforin) 颗粒酶(granzyme ) 等, 直接杀伤靶细胞 1 穿孔素穿孔素由 Te 细胞和 NK 细胞产生, 生物学效应类似于补体激活所形成的膜攻击复合体 (MAC) 通过 edna 克隆得知穿孔素的 DNA 序列与补体 G 存在部分同源 在钙离子存在的情况下, 细胞毒颗粒降解并释放穿孔素单体进入细胞间隙, 并插入靶细胞膜, 聚合形成营状的多聚穿孔素 多聚穿孔素约含 12~16 个穿孔素分子, 在靶细胞膜上形成跨膜孔道, 使水 电解质迅速进入细胞, 导致靶细胞洛解 另外, 其他细胞毒性介质, 如颗粒酶 1NF 等也可通过穿孔素形成的跨膜孔道进入靶细胞 Te 细胞保护自身不受穿孔素攻击的机制, 目前认为, 是由于 Te 细胞可表达或释放硫酸软骨素 A 蛋白聚糖, 同源抑制因子, 与其免受穿孔素攻击有关 2 颗粒酶颗粒酶是存在于 NK 和 Te 细胞胞浆颗粒中的一类丝氨酸蛋白酶, 目前己发现 7 种颗粒酶 颗粒酶随 Te 脱颗粒而释放出胞外, 通过穿孔素形成的孔道进入靶细胞, 主要通过激活凋亡相关酶系统, 引起靶细胞 DNA 断裂, 诱导靶细胞凋亡 通过这种方 三章抗提口王与免式, 既可以杀伤靶细胞, 又可以降解靶细胞内感染病毒的 DNA 以阻止病毒的复制, 防止病 毒释放后再感染邻近正常细胞 另外, Te 细胞颗粒中含有 leukalexin, 又称 1NF 相关蛋白, 其作用为穿孔素依赖性, 可

45 一篇免疫学基础知识介导靶细胞凋亡 (2) 受体介导的杀伤 1 效应 Tc 细胞分泌的 1NF α 可通过与靶细胞表面相应受体 1NFR -1 结合而发挥细胞毒作用 其中, 分泌型 1NF α 主要介导靶细胞坏死, 膜型 1NF α 主要介导靶细胞凋亡, 且以参与 Tc 的慢时相细胞毒作用为主 此外, Tc 还可以产生不依赖钙离子的 1NF 样的可恪性毒素, 又称淋巴毒素 (lyl 刊 photoxi 日, LT) 或 1NF 日, LT 与靶细胞表面受体结合后, 进入细胞内, 被洛酶体摄取, 通过降低溶酶体稳定性, 使溶酶体酶外逸, 导致细胞洛解 ; LT 也可与靶细胞表面 Fas 结合, 引起细胞凋亡 2 活化后的 Tc 细胞表面高表达 FasL, 其与靶细胞表面的 Fas 结合, 通过激 ii5 胞内 Caspase 系统, 引导死亡信号的逐级传导, 致靶细胞核 DNA 降解, 最终导致靶细胞凋亡 此过程不依赖于钙离子 Caspase 是一组半肮天冬蛋白酶, 无活性酶原内部两个保守性 Asp 残基被特异酶切后形成双链, 以类似酶原激活方式成级联放大反应, 导致细胞凋亡 另外, T 细胞表面也表达有 Fas, 活化的 Tc 表达 FasL, 也可杀死自身或相邻表达 Fas 的 T 细胞, 即活化诱导细胞死亡, 这一过程对免疫应答的负调节或维持自身耐受是重要的 经过以上两个阶段, 靶细胞进入渗透性洛解及程序性死亡阶段 而对靶细胞进行攻击后的 Tc 细胞仍然保持完整性, 一旦靶细胞凋亡结束, Tc 就在缺乏地 2+ 的状态下与靶细 38 第细胞数多于 Tc 时, Tc 的再循环发挥关键作用 Tc 细胞杀伤靶细胞的高效性 特异性以及 连续性在机体的细胞免疫中有重要意义 胞脱离, 参加再循环 ; 再循环 Tc 可对靶细胞重复杀伤 5~7 次, 此后失去杀伤活性 当靶 此外, 少数 1CL 为 ω'4+ 1CL, 属于 Tl 细胞 ω'4+ 1CL 可识别阳 CI 类分子提呈的抗原, 但在效应阶段不受岛任 -rci 类分子的限制, 亦无抗原特异性, 主要发挥旁观者杀伤效应 它不含穿孔素和颗粒酶, 但表面表达大量的 FasL, 推测主要通过 Fas FasL 途径导致靶细胞凋亡 B 细胞介导的体液免疫应答 机体的特异性体液免疫应答主要由 B 细胞介导, B 细胞通过其表面受体 BCR 识别特 异性抗原, 进而活化 增殖, 并分化成抗体分泌细胞或记忆细胞, 从而产生免疫效应 一.B 细胞对抗原的识别 (~)B 细胞对胸腺依赖性抗原 (1D- Ag) 的识别 B 细胞通过 B 细胞抗原受体 (B cell antigen recepter BCR) 复合体识别抗原 BCR 复合体由膜免疫球蛋白 (Sr 址 g) 和信号传导结 构 Ig α Ig~ 以非共价键结合而成 Sr 址 g 与血清 Ig 在结构上有高度的同源性, 但其重链 (SmlgH) 末端另有一跨膜区和膜内区, SmlgH 的胞内部分都很短, 其中剧和 I 挡的胞内区 仅含三个氨基酸, 因此, 需其他辅助分子才能把信号传导入胞内 不同发育和分化阶段的 B 细胞, 其 Sr 世 g 类别各异 : 不成熟 B 细胞为 Sm 胁 1, 成熟 B 细胞为 SmI 圳 SmIgD, 记忆 B 细 胞可为 SmlgG SmlgA 或 SmIgE o 抗原与 Smlg 的可变区结合, 产生 B 细胞活化的第一信号, 由 Ig α 自将第一活化信号转导入胞内 BCR 不仅能识别蛋白质抗原, 还能识别肤 核酸 多聚糖 脂类和小分子化学物质 ; BCR 可特异性识别完整蛋白质抗原的天然空间构象, 或识别蛋白质阵解而暴露出来的决忏所菊五口

46 第三章定簇的空间构象, 而无需 APC 对抗原进行加工处理, 亦无岛 1H C 限制性 ( 二 )B 细胞对胸腺非依赖性抗原 (TI - Ag) 的识别细菌多糖 多聚蛋白质 脂多糖等 TI 抗原, 能直接激活初始 B 细胞, 而无需 TH 细胞的辅助 根据激活 B 细胞的方式不同, 可将 TI 抗原分为两类 :TI -1 抗原和 TI-2 抗原 TI -1 抗原常被称为 B 细胞丝裂原 除了与 BCR 结合之外, 在高浓度时, 还能与丝裂 原受体结合 TI-2 抗原为细菌胞壁与英膜多糖, 是具有高度重复表位的聚合分子, 它的 重复表位可使 B 细胞表面受体发生广泛的交联 二.B 细胞的活化. 增殖和分化 高浓度的 TI -1 抗原可非特异性多克隆的诱导 BCR 能结合 TI -1 抗原的 B 细胞才能被激活 联而造成受体结构的重排与膜结构的改变, 产生触发信号, 引起 B 细胞增生 分化 ; 低浓度时, 只有其 TI-2 抗原的重复性表位可使 BCR 发生交 B 细胞的活化 一般情 况下, 由于无 T 细胞辅助, TI 抗原不能诱导抗体类型转换 抗体亲和力成熟和记忆性 胞形成, 即无记忆性 而 1D 抗原对 B 细胞的活化需要 T 细胞的协助 B 细胞与 T 细胞表 达的多种粘附分子及其相应配体相互作用, 构成 B 细 B 细胞激活的第二信号 通过第一信号 和第二信号的共同作用以及多种细胞因子的参与 B 细胞活化进而增殖分化为浆细胞或 记忆细胞 ( 其过程详见第六章 ) 二.B 细胞的效应机制 (~) 初次免疫应答与再次免疫应答 1. 初次免疫应答 抗原初次进入机体后需经一定的潜伏期才能在血液中出现抗 体, 其时间长短与机体状况 抗原的性质及其进入机体的途径等因素有关 此后抗体水平 逐渐上升至峰值, 即延迟相, 约需 6~ 1O 天, 抗体的倍增时间取决于抗体的性质以及抗原 剂量等因素 起初血清中的抗体主要为胁 f 类抗体, 后期产生 19( 王为主, 其总量及与抗原 的亲和力均较低 血清中抗体浓度维持在峰值一段时间后, 由于被阵解或与抗原结合被 清除, 抗体水平逐渐下降 初次应答的主要特点是需要抗原浓度大, 潜伏期及延迟相时间 长, 血清抗体滴度低, 且早期以 I 剧为主 初期免疫应答除了产生特异性浆细胞分泌抗体 之外, 还有一些受到剌激的幼 B 细胞发育到一定程度不再分化而保持休止状态, 即记忆 B 细胞, 不分泌抗体, 只有在接受特异性抗原剌激后才激活为抗体分泌细胞 2. 再次免疫应答 相同抗原再次侵入机体机体可发生再次免疫应答 由于记忆性 B 细胞表面高水平表达高亲和力 BCR 仅需少量相同抗原即可有效启动再次免疫应答 再次应答的潜伏期短, 约为初次应答的一半, 延迟相短, 仅为 4~5 天, 其高峰浓度高且维 持时间长, 血清抗体以 19( 王为主 与初次免疫应答相比, 再次免疫应答产生抗体的亲和力 明显增高, 即亲和力成熟现象 因 TI 抗原不能诱导记忆细胞的产生, 所以只能引起初次 应答, 而不能诱导产生再次免疫应答 ( 二 ) 抗体的免疫效应 1. 中和作用 抗体的中和作用主要表现在两个方面 : 一种是针对细菌毒素的抗体, 可以与体内和体外的细菌毒素特异性结合, 阻断细菌毒素与宿主细胞表面的受体结合, 或 封闭毒素的活性部位, 使其不能发挥毒性作用 ; 另一种是抗病毒抗体, 可与相应的病毒蛋 白衣壳抗原结合, 可阻碍病毒与易感宿主细胞的结合, 同时也使蛋白质外壳失去了对病毒 核酸的保护作用 39 抗Em提口王与免疫应答

47 一篇免疫学基础知识2. 免疫调理作用 对于细菌等病原体, 抗体一般不能将其直接杀灭, 但可发挥免疫 调理作用, 促进吞噬反应, 最终消灭入侵病原体 抗体以其 Fab 段与病原体结合, 以 Fe 段 与吞噬细胞表面的 FeR 结合, 从而促进吞噬细胞对病原体的吞噬, 即抗体介导的调理作 用 ; 另外, 吞噬细胞表面表达 C:J b 受体, 可与抗原 抗体 补体复合物结合, 也可促进其吞 噬作用, 即补体介导的调理作用 3. 激活补体 IgG 或胁 f 类抗体与抗原结合成免疫复合物, 激活补体经典途径, 通过 膜攻击复合物发挥洛菌或洛细胞效应 4. 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 (A 四 ::C) 抗体 Ig( 王的 Fab 段与靶细胞的抗原 结合, Fe 段发生构型改变, 可与 NK 细胞 巨噬细胞 中性粒细胞和嗜酸粒细胞的 FeγR 田 结合, 从而介导对靶细胞的杀伤, 这就是 AI 汇 C 作用 5. 通过胎盘和粘膜分泌型 19A 的局部抗感染作用 母体的 IgG 可通过胎盘滋养层细 胞, 进入胎儿的血液循环, 构成胎儿的天然被动免疫 这种传递是通过 I 剧的 Fe 性与胎盘微血管壁发生可逆结合而进行的 段选择 40 第粘膜免疫是免疫系统中一个特殊的组成部分, 产生粘膜免疫 19A 的 B 细胞主要来自 粘膜伴随淋巴组织 (M 且 T), 包括扁桃体 肠集合淋巴结 淋巴滤泡等 M 且 T 没有输入淋 巴管道, 抗原是从粘膜上皮表面进入的 在粘膜上皮下, 分布有巨噬细胞 配 B 细胞, 大 部分 T 细胞为 ms+t 细胞, m4 +T 细胞主要为 CD4s RO+ 记忆 T 细胞 在它们的共同作用 下, B 细胞产生的特异性 19A 分泌型 19A 与病原微生物结合, 阻挡其与粘膜上皮的粘附作 用, 从而阻止病原微生物的入侵 分泌型 19A 在粘膜以及乳腺 唾液腺和宫颈腺的上皮共 同构成粘膜免疫网 6. 免疫损伤作用由抗体引起的免疫损伤可见于 I H 田型超敏反应和自身免疫 病 I 性超敏反应由 IgE 介导, II 田型超敏反应由 IgG, 刷介导 某些自身免疫病损伤 与 H 田型超敏反应有关 此外, 针对移植物抗原的预存抗体, 可导致超急性排斥反应 : 受者体内预 存的抗供者 组织的抗体, 与移植物的 HlA-Ag 或血型 Ag 相结合, 激活补体, 释放多种活性物质, 最终 引起移植物的不可逆的缺血 变性和坏死 另一方面, 抗体与移植物释放的可洛性抗原形 成免疫复合物, 可封闭移植物抗原, 阻断受者免疫细胞对其识别 攻击, 从而防止或减弱排 斥反应 肿瘤患者的某些 I 届亚类可作为封闭因子, 阻碍特异性 Te 识别和杀伤肿瘤细 胞, 因此有促进肿瘤生长的作用 参号文献 1. 陈慰峰. 医学免疫学. 第 3 版. 北京 : 人民卫生出版社, 龚非力. 基础免疫学武汉 : 湖北科学技术出版社, ScottH.Podolsky,Alfred I.Tauber.The generation of diversity: clonal selection theory and the rise of molecular immunology. 1st pbk ed. Cambridge, Mass. : Harvard University Press, Goldsby R. A, Kindt T. J. C 胁 me E.A.lmmunology 5th ed.new York: Garland Publishing, Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS. Cellular and Molecular lmmuology.4th ed.philadelphia: W.E. Saunders Cαn pany, 2000.

48 第四章第四章 主要组织相容性复合体 所菊M4Aql 忏口述组织相容性 (histocom 阳 tibil 问 r) 是指器官或组织移植时供者与受者相互接受的程度 早在上世纪初人们就发现, 在不同种属或同种不同系的动物个体间进行正常组织或肿瘤移植时会发生排斥, 排斥反应即为供受双方不相容的反映 后经证实, 排斥反应是由细胞表面代表个体特异性的抗原所诱导的, 称之为移植抗原 ( 田口 splantation antigen), 即组织相容性抗原 ( histocompatibil 问 r antigen) 这是一套非常复杂的抗原系统, 其中起决定性作用 能引起强而迅速的排斥反应者谓之主要组织相容性抗原 (major histocompatibility antige 口, 岛任 {A), 其他在移植排斥反应中发挥次要作用的的称为次要组织相容性抗原 编码岛任 {A 的基因是位于某一条染色体上, 由一组高度多态性基因组成的染色体区域, 这就是主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, 阳 -IC) ;MHC 基因产物即 MBA 可在不同细胞表面表达, 我们习惯上叫它岛任 -IC 分子 现代通过对人和哺乳动物以及其他脊椎动物的研究发现, 他们都存在结构和功能相似但又各自独特的岛任 -IC 遗传区域 人们对岛 1HC 及其编码的抗原系统做了不同的命名, 人的主要组织相容性抗原系统称为人白细胞抗原 (hurna 口 leucocj 耻 antigen, HlA), 小鼠的主要组织相容性抗原系统称为 H-2 系统, 其他如狗的为 RiA, 猪的为 SLA, 家兔的为 RiA 由于小鼠繁殖快 易于饲养而成为岛 1HC 研究中最重要的实验动物 岛任 -IC 是己生口的多态性最丰富的一个基因系统, 拥有极大数量的等位基因, 赋予机体巨大潜力以适应多变的内外环境 近年来, 随着对岛但 C 研究的进一步加深, 人们发现岛 1HC 不仅控制着同种移植排斥反应, 而且在 T 细胞的分化发育中发挥作用, 更与机体免疫应答和免疫调节密切相关 可见岛 1HC 己成为免疫学及免疫遗传学研究最活跃的领域 旺主要组织相容性复合体41 第二币 小旨主 H-2 基因复合体 对近交系小鼠 (i 日 bred mice) 和同类系小鼠 ( co 日 genic mice) 的研究在岛 1H C 的发现中起 着至关重要的作用 近交系小鼠又称纯系小鼠, 是通过兄妹交配繁殖 20 代以上获得的, 同一系内各个体遗传背景完全相同, 同源染色体都是纯合型的, 具有长期遗传的稳定性 同类系小鼠是指应用两纯系小鼠不断杂交和回交筛选而育戚, 同一系内各个体的岛 1H C 结 构有所不同, 其他遗传背景完全一致, 同类系小鼠因其在岛 1H C 上的差异而在岛 1H C 的研究 中非常重要 而用不同的同类系小鼠杂交则进一步产生重组体小鼠 1936 年 Go rer 在鉴定近交系小鼠的红细胞血型抗原时发现 4 组血细胞抗原, 并分别命名为抗原 I H 田和 No 20 世纪 40 年代, George D. 出 ell 等使用近交系小鼠分析肿瘤和其他组织移植后排斥反应, 结果发现用抗原 H 阳性品系小鼠内生长的肿瘤分别移植于

49 一篇免疫学基础知识其杂交子代, 肿瘤只能在抗原 H 阳性小鼠内生长, 在抗原 H 阴性小鼠的体内则被排斥, 这种排斥不仅针对肿瘤, 也针对供者正常的组织 细胞 这就证实了小鼠抗原 H 是一种组织相容性抗原, 故称为小鼠的组织相容性抗原 2, 即 H-2 0 随着研究的深入, 人们将小鼠岛 1HC 定位于第 17 号染色体上, 称为小鼠 H-2 复合体 这是一组紧密连锁的基因群, 长约 1500 恼, 由 K 区 I 区 S 区和 D 区 4 个遗传区域组成 其中 I 区又分为 I-A 和 1- E 两个亚区 H-2 基因复合体由经典的 H-2 和位于 D 座右侧的 l1 a( thymus leukemia antigen) 组成, 按 H-2 复合体内基因所编码的分子结构与功能不同, 将其分为三类 一. I 类基因 I 类基因编码岛 1H CI 类分子的重链, 其轻链是位于第 2 号染色体的基因所编码的比 微球蛋白 (~2 - m), 二者以共价键结合形成异二聚体在细胞膜表面表达 42 第I 类基因由小鼠的 H-2K H-2D 和 H-2L 区组成, 其编码的 I 类分子分别为 K D 和 L 分子, 组成小鼠的 H-2 抗原系, 具有高度多态性, 与移植物排斥反应密切相关 二. II 类基因 经典 H 类基因是指编码 H 类分子的 I 区基因, 并分为 I-A 和 1- E 两个亚区 1963 年 Baruj Benacerraf 通过动物实验证实小鼠对某抗原的应答能力受常染色体显性基因控 制, 将此基因称为免疫应答基因 (imr 丑 une response 段时,Ir 基因 )0 McDevitt 证实了 Ir 基因与 H-2 复合体呈连锁关系, 定位于 H-2K 和 H-2D 区之间, 因此命名为 I 区 其表达产物 为 I 区相关抗原即 Ia 抗原, 与多肤抗原的提呈有关 近来研究发现, II 类基因还包括编码 I-M 和 1-0 分子的非经典 H 类基因, 编码低分子量多肤 (l ow molecular weight polypeptide, 山 1P) 的低分子量多肤基因山 1P l 和山 1P7, 以及编码抗原加工相关转运蛋白的抗原加工相 关转运休 ( transporter associated with antigen processir 毯, TAP) 基因, TAPl 和 TA 白 二. 田类基因 田类基因是指小鼠 H-2 的 S 区 此区主要有 α C4A C4B Bf 等补体相关基因以及 编码吁吁的基因 另外, 与 21 所菊丑化酶有关的 CYP2 1A CYP2 1B 基因也在此区内 一一口人类主要组织相奋斗哇复合体一人类主要组织相容性复合体由法国学者 Jean Dausset 在 1958 年首先发现 由于该基因群编码的抗原首先在白细胞表面被发现, 且含量高, 所以又称人类白细胞抗原 (human leukocyte antigen, 因 λ) 0 在人类岛怔宜, 即编码 HIA 的基因群又称为 HIA 复合体 鉴于 Dausset 的贡献, 他和 George D. Snell 及 b 基因的发现者 Baruj Benacerraf 共同获得 1980 年度诺贝尔医学奖 这无疑是对他们为人类认识岛任 -IC 所做出的巨大贡献的最大肯定和褒奖 一.HIA 复合体的结构和特点人类主要组织相容性复合体 ( 岛 1HC) 即 HIA, 己于 1999 年完成全部基因的测序工作, 基因图发表在同年 10 月底的 Nature 杂志上 目 A 复合体是迄今人类己知的具有最丰富多态性的遗传系统, 定位于第 6 号染色体短臂 6p 区, 长 3600 恼, 占据了一个较大的 DNA 片断, 约占人体整个基因组的 ; 从遗传学角度来讲, 其伸展长度约为 2~3 分摩 ( centimorgans ) 此区域结构有以下特点:1 为迄今己知基因中多态性最高的基因复合忏

50 体 ;2 在 3600 kb 区域内共确认有 224 个基因座位, 其中的 128 个为功能性基因有产物的表达 ;3 存在大量假基因 不表达基因或非经典基因, 224 个基因座位中就有 96 个为假基因, 占到基因座位总数的 42.9% ;4 是基因密度最高的一个区域, 平均每 16kb 就有一个基因 ;5 是免疫功能相关基因最集中 最多的一个区域, 128 个基因中 39.8% 的基因产物具有免疫功能, 特别是 H 类区域中几乎所有的基因均显示免疫相关功能 ;6 是与疾病关联最为密切的一个区域 表 4-1 列出了 HlA 区域内主要基因及己正式命名的等位基因数 可以看出 HlA 等位基因数己多达 1748 个 (HlA 区域内其他等位基因也多达 66 个 ), 并且随着研究的不断深入, 新的等位基因被不断发现, 这个数字还在不断扩大 与小鼠的 H-2 相类似,HlA 基因复合体根据其编码分子 ( 即 HlA 抗原 ) 的结构 分布及功能的不同也分为 3 个区, I 类基因区 H 类基因区和田类基因区 ( 图 4-1) 第六号染色体 基困区 L;: 二二二 :J-----[ 二二二 ::J--C 二二 ::::rj 人 MHe 基困结构 HLA OP ON OM ~. r" 品.r"ι"I, TAPBP j3 '" CY. '" ~ 自由 F B C A 主l'!lI M"t"T r class ' I 43 第四章00 00 要组织相容性复合体图 4-1 人 L 怔 {C 基因结构示意图 (~) I 类基因区目 AI 类基因区位于复合体的最远端 ( 端粒侧 ) 最早发现的 HlA A, f 丑 A-B 和团 A-C 为经典的 HlA I 类基因 o HlA -A, f 丑 A-B 和团 A-C 基因座的等位基因数分别为 和 167 个, 均具有高度多态性 ; 其编码的产物为 HlA I 类分子的重链 (α 链 ), 轻链 链 ) 是由第 15 号染色体编码的比微球蛋白 (~2 - m) 0 非经典 HlA I 类基因包括 HlA -E F G H K X 等 在生理条件下,HlA G 的产物高表达在胎盘的绒毛外滋养层细胞上, 作为配体分子与 KIR 结合而抑制 NK 细胞的杀伤活性, 从而起到保护胎儿的作用 ; 而且 A-E 所编码的分子是所有非经典 I 类分子中迄今所知的唯一能提呈肤段的 ( 二 ) II 类基因区 HlA II 类基因位于 HlA 复合体的着丝粒端, 长约 恼, 其中且 A-DR 四 l, DP 基因座为经典的目 A Il 类基因 ; 每个基因座含两类基因 A 和 B, 其中 A 基因编码 α 链, B 基因编码自链, 两者以非共价键连接构成 α 自二聚体跨膜糖蛋白 H 类基因区还包括 DM A OOB 等基因, 统称为非经典的目 A Il 类基因 其中, 因 A-DM 的产物与外源性抗原的加工与提呈有关 另外, II 类基因区还有 TAPl TA 巴和

51 第一免疫学基础知山 1P2 山 1P7 基因, 编码的分子分别为 TAP 和山 1P, 而后者是组成蛋白酶体 ( proteasome ) 的 核心 ; 蛋白酶体可把内源性抗原分解成 7~ 1O 个氨基酸的短肤 抗原加工相关转运体表 达于内质网膜, 负责内源性抗原肤向内质网腔的转运 表 4-1 H1A 区域内主要基因及正式命名的等位基因数 (2004 年 6 月 ) HLA- I 类基因 且 λ E 类基因 其 {hu 名称 等位基因数 名称 等位基因数 名称 等位基因数 T 丑 λa 309 T 丑 λdra 3 TAPl 6 J-llλB 563 用 λdrbl 368 TAP2 4 J-llλC 167 用 λdrb2 1 岛怔气 2 T 丑 λe 6 用 λdrb3 41 山 1p7 T 丑 λf 2 用 λdr B4 12 肌 1ICA 56 J-llλG 15 用 λdrb5 18 MICB T 丑 λh 用 λdrb6 3 MICC 用 λj 用 λdrb7 2 肌 1ICD T 丑 λk 用 λdr B8 MICE 44 T 丑 λl 用 λdrb9 J-llλIX 主 IAl 27 用 λix 主 Bl 56 篇T 丑 λdma 4 6 用 λ I1VIB 用 λixja 用 λixjb 8 识T 丑 λdpal 20 8 用 λdpbl 107 总数 ( 三 ) 田类基因区此区位于 HlA- I 和 H 类基因区之间 主要基因有编码补体 B 因子 口 C4 (C 屯和 C4 b) 的基因 ; 编码 21 丑化酶的 CYP2 1A CYF21B 基因 ; 热休克蛋白 70(heat shock protein70, HSP70) 基因 ; 肿瘤坏死因子基因以及编码淋巴毒素 α 和淋巴毒素目的淋巴毒素基因 LTA( lymphotoxi 日, LT) 和 L1B o 二.HlA 分型技术与 HlA 抗原和等位基因命名 (~) 血清学分型技术法国学者 Dausset 最先采用白细胞凝集反应检出 HlA 抗原 随后, 建立了血清学分型技术, 即补体依赖的微量淋巴细胞毒试验 (complement dependent cytotoxity test) 其通用的标准方法是 NIH 二步法 经典且 A-I 类抗原因 A-A B C 和四 λ H 抗原因 A-DR 00 可用血清学方法检出抗原的宽特异性 目前, 血清学分型技术 { 乃是因 λ 分型的基础 ( 二 ) 细胞学分型技术团 A-DR 与 HlA -DPw 特异性可分别通过纯合子分型细胞 (homozygote typi 鸣 cell, HIe) 及预致敏淋巴细胞试验 (primed lymphocyte test, PLT) 检测 由于所需分型细胞来源困难及操作手续繁琐, 加上分子生物学技术的迅猛发展, 细胞学分型

52 第四章技术正逐渐被淘汰 由经典细胞学分型技术鉴定的 D 和 DP 特异性加 W o 需要指出的是 C 位点抗原后加上 W, 是为了与补体相区别 ( 三 )HlA 的 DNA 分型技术 20 世纪 80 年代后期, 随着分子生物学引入团 A 领域, 在配 R 基础上进一步发展了各种 DNA 分型技术, 常用的有配 R 扩增产物的限制性片段长度多态性分析 (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism, PCR RFLP) 配 R 产物的序列特异寡核昔酸探针杂交 (PCR - sequence specific oligonucleotide, PCR sg)) 序列特异性引物的 PCR 扩增 (PCR - sequence specific primer, PeR - SSP) 配 R 单链构像多态性分析 ( 配 R - sir 鸣 Ie strand conformational polymorphism, PeR - SSCP) PCR 指纹图 (PCR fingerprinting) 和序列直接分型 ( 配 R - SBr)o 根据对 HlA 等位基因检出的精细程度,DNA 分型方法可分为三类 : 检出宽特异性的低程度 DNA 分型 ; 检出部分等位基因的中等程度 DNA 分型以及可基本检出全部等位基因的高程度 DNA 分型 宽特异性的低程度 DNA 分型相当于血清学方法检出的目 A 抗原特异性 进行等位基因分型后, 发现属于同一个血清学特异性的抗原往往可被数个甚至数十个不同的等位基因所编码 如编码 HlA-DRB1 抗原的等位基因至少有 368 个, 编码 且 A-B55 的等位基因也至少有 16 个 为此, 世界卫生组织命名委员会制定了 HlA 的命名原则, 要点如下 :1 对某一个基因, 先写出座位名, 下接兴号, 再用 4 个数字代表这个等位基因的名字, 如 B 兴 2706 DRB1 祷 405 等池 DRB1 均指 HlA 基因座位, 兴号后面的 4 位数中前 2 位是指这个等位基因相应的血清学特异性, 后 2 位数则代表该等位基因序号 如 B 兴 2706 的血清学特异性是 B27, 6 为序号 2 如果一个等位基因在不同个体问仅有极微小差异并属于无义突变, 则在等位基因后再加第 5 个数字以示区别, 如 B 兴 和 B 兴 如果由于技术所限不能对等位基因作精细分型时, 则可用其宽度特异性或低中度分辨特异性来表示 如不能区别 B 兴 及 B 兴 则可写成 B 兴 二.HlA 复合体的遗传特征 (~) 单 f 音型 (haplotype) 遗传前己述及团 A 复合体是一组紧密连锁的基因群, 在同一条染色体上的等位基因 (alleles) 的特定组合称为单倍型, 其表达的抗原产物为表型 主要组织相容性复合体45 (phenotype) 两个同源单 f 音型构成 HlA 的基因型 (genotype) 在亲代与子代的遗传过程中,HlA 单倍型作为一个单位传递给下一代 因此, 子代的第 6 号同源染色体分别来自其父母的单倍型, 子代总是得到一条父亲的单倍型和一条母亲的单倍型 所以, 子代与亲代之间总有且只有一个单倍型相同 ; 同胞之间, 两个单 f 音型完全相同和完全不同的几率各占 25%, 一个单倍型相同的几率占 50% 这一遗传特点, 决定了在器官移植中供受者配型合适的机率, 在亲属中要高的多 这在亲子鉴定中也得到了充分的应用 ( 图 4-2) ( 二 ) 多态性 ( polymorphisr 丑 ) 多态性是指在一随机婚配的群体中, 染色体同一基因位点有两种或两种以上等位基因, 可编码两种以上基因产物的现象 HlA 复合体是迄今己知的人体最复杂的基因复合体, 具有最丰富的基因多态性 HlA 复合体多态性最主要的原因是因 A 复合体的每一基因座都存在大量的等位基因, 如且 A-I 类基因目 A-A B C 三个座位的等位基因数分别为 309, 563 和 167 个 对每一个体来讲, 任何一个座位均有两个等位基因, 分别来自父亲和母亲 HlA 复合体中每一个等位基因均得到充分表达, 这称为共显性 ( codo minance), 这一特性更增加了 HlA 表型的多样性 ( 三 ) 连锁不平衡 (Ii 出 age diseqilibriur 丑 ) 连锁不平衡是指在某一群体中, 不同座位上

53 --A凶2 E E -EEK一篇免疫学基础知识母 且 I law -- 'cωb -- AU EUOO Tft ::11 二 ;; : 二 II 二 叫UMMm 田-EEE.,-EEAU-图 4-2 I-llλ 单倍型遗传示意图 46 第注 :a b c, d 均代表单倍型 ;Al B6 A2,B50 等代表基因座等位基因 某两个等位基因出现在同一条单元型上的频率与预期值之间有明显的差异 目 A 复合 体各等位基因均有各自的基因频率 基因频率指群体中每个等位基因出现的几率与该群 体全部等位基因之比 从理论上讲, 在任一随机婚配的群体中, 每一单倍型出现的频率应 等于各个基因频率的乘积 { 旦实测结果常与理论推算不一致, 提示连锁的基因并非完全 随机组合, 而是某些基因经常在一起出现, 而另一些又较少在一起出现 例如, 在北欧白 人中四 λal 和 HlA-B8 的基因频率分别为 0.17 和 0.11, 若随机组合, 则单体型 Al B8 的预期频率应为 0.17XO.11 二 但实际所测得的 A1-B8 单体型频率是 0.088, 故 A1-B8 处于连锁不平衡 其二者的差值 (6 二 二 0.069) 即为连锁不平衡 参数 四 λ 复合体的高度多态性, 赋予机体适应内外环境多变的巨大潜力, {E! 同时也给器 官移植合适供体的选择带来了极大的困难 连锁不平衡现象恰恰在一定程度上限制了群 体中四 λ 单元型的多样性, 这又为无血缘关系器官移植寻求配型合适的供体提供了可 能 目 λ 复合体的多态性和连锁不平衡是以非常微妙的矛盾形式出现的, 对于物种的生 存和繁衍以及维持群体的稳定性具有极其重要的生物学意义 第四币 因 A 分予的分布 结何和功能 一.HlA 分子的分布 且 λ 复合体的表达产物称为人类主要组织相容性抗原, 又称人类白细胞抗原 各类 HlA 抗原的组织分布不同 (~)HlA- I 类分子 经典 HlA- I 类抗原广泛分布于体内各种有核细胞表面, 包 括血小板和阿织红细胞, 但成熟的红细胞一般不表达 I 类抗原 经典 HlA- I 类抗原在 不同组织和不同细胞类型的表达水平也不同 I 类分子表达最高的是淋巴细胞, 中性粒 细胞 巨噬细胞及树突细胞也高水平表达 HlA- I 类分子 相反, 肝 肾 肺细胞 纤维母 细胞和肌细胞低水平表达 I 类分子 ; 而神经元细胞 母 胎表面滋养层细胞均不表达经典 HlA- I 类抗原 (HlA- C 分子除外 ) 另外, 某些分化阶段的精细胞也不表达 HlA- I 类 分子 ( 二 )HlA - II 类分子 经典 HlA - II 类分子, 即 HlA -DR 00 DP 的表达比较 局限, 主要是在某些免疫细胞表面, 特别是抗原提呈细胞如巨噬细胞 树突细胞 成熟 B 细胞以及胸腺上皮细胞 血管内皮细胞 此外, 激活的 T 细胞及精细胞也有经典 HlA - II

54 第四章类分子的表达 ; 某些组织细胞在异常情况下也可异常表达 H 类分子, 如 Graves 病患者的甲 状腺上皮细胞 I 型糖尿病患者的 1 夷岛日细胞 在中性粒细胞 未致敏的 T 细胞 脑 肝 肾及胎儿滋养层细胞等均不表达经典 HlA - II 类分子 ( 三 ) 可洛性 HlA 抗原 (soluble HlA antigens, shla) 在 HlA 的三类抗原中, 田类抗原 (α 四 C 阳 C4b) 主要以可洛性形式存在于血清 ( 血浆 ) 中 ; 因 A-I H 类抗原除了以膜 抗原形式存在于细胞膜表面外,1970 年 VanR, d 在正常人血清中检测到可洛性人类白细 胞 I 类抗原, 后又从人类淋巴液 尿液 汗液及乳汁等体液中相继检出, 称为可洛性 HlA 抗原 (sf 丑 A)o 血清 shla - I 类抗原与细胞膜表面目 A-I 类抗原的分子结构基本相 似, 由重链 α 链和 121 王 Da 的民微球蛋白 (~2 - m) 以非共价键结合形成异源二聚体 整个 shla- I 分子与血清低密度脂蛋白 (LDL) 结合 α 链有 王 Da 四型 441 王 Da 分 子可能是完整的 HlA 分子, 以脂联形式循环 ;39 1 王 Da 分子不含跨膜片段, 是经卧 ~A 替代 拼接后分泌进入体液的可洛性形式 ;36 kda 及 34 kda 分子则既不含跨膜片段, 又没有胞 浆尾部, 可能是膜表面 HlA 或 shla- I 类分子 441 王 Da 分子的蛋白降解产物 可恪性人类白细胞抗原与细胞膜表面目 λ 分子一样, 在体内参与免疫应答, 具有免 疫调节功能, 可诱导产生免疫耐受, 抑制细胞毒性 T 淋巴细胞 (OL) 的洛细胞作用 健康 个体血清中 shla- I 含量很低, 并保持相对恒定, 变动范围为 0.5μg mi ~ 25 flg mi, 而在器官移植 感染性疾病及某些自身免疫性疾病等病人血清中, shla - I 有明显的变化 另外, shla- I 的血清含量与个体的 HlA 表型及基因背景密切相关 1999 年兰炯采等采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 双抗夹心法测出中国人 s 且 A-I 正常值为 ( 土 )ng mi o 在临床上血清 s 且 λ 水平己作为预测移植物排斥反应 评估移植预后 反 映感染性疾病和某些自身免疫性疾病活动状态 观察肿瘤分化程度及预后的指标 二.HlA 分子的结构 1987 年四 orkman 首先借助 X 线晶体衍射技术弄清了 HlA- A2 分子的立体结构, 使人们对 HlA 分子结构有了明确认识 因 A-I 和 H 类分子的共同特征是 :1 都是由重链 主要组织相容性复合体47 (α 链 ) 和轻链 ( 自链 ) 经非共价键连接而成的异二聚体 ;2 都分为胞膜外区 跨膜区和胞浆 区三部分 ;3 胞膜外区又分为氨基端抗原肤结合区和免疫球蛋白样区, 据此特点,HlA 分 子都属于免疫球蛋白超家族 ;4 跨膜区均穿过细胞膜并将 HlA 分子锚定在细胞膜表面 ; 5HlA 分子的胞浆区与细胞内外信息的传递密切相关 详见表 (~)HlA- I 分子结构经典的 HlA- I 类分子的 α 链 ( 重链 ) 由 HlA -A B C 基因编码, 相对分子量约为 45 kda; 自链 (~2 - m) 编码的基因位于第 15 号染色体, 分子量约为 12 kda, ~2-m 为可洛性分子, 不穿过细胞膜 四 λ I 类分子的 α 链胞膜外区有三个结构域, 即 α1 α2 α3, 分别包含约 90 个氨基酸 α1 和归结构域构成胞外抗原肤结合区, 又称抗原结合槽 α3 结构域与民 m 二者相互结合, 构成免疫球蛋白样区, T 细胞 ω8 分子亦结合在此区 胞膜外区 ~2 -m 与 α 链相互作用, 对于 I 类分子天然构型稳定性的维持以及在细胞表面的有效表达有重要作用 目 A-I 分子抗原结合槽的两端封闭, 因此接纳的抗原肤长度有限, 约为 8~ 1O 个氨基酸, 以九月太与 I 类分子的结合亲和力最大 研究中发现, 九月太抗原往往带有两个或两个以上和抗原结合槽相结合的特定部位, 称锚定位, 位于该部位的氨基酸残基则称为锚定残

55 欣结合槽大小第一篇编码基因免疫学基础知识基 (anchor res 血 Ie) 而能与同一类 HlA 分子相结合的多个抗原肤, 其锚定位和锚定残基 往往相同或相似, 从而构成了共同基序 (consensus motif) ( 二 )HlA - II 分子结构且 A-II 类分子 α 链的相对分子质量约为 32~34 kda, ~ 链 的相对分子质量约为 29~32 kda oα 链和自链以非共价键连接, 共同穿过细胞膜 H 类分子 α 链和自链的胞膜外区分别由 α1 α2 和自 1 自 2 结构域组成 与 HlA- I 分子 不同, 由 α1 和自 1 结构域组成的 H 类分子的抗原分子槽两端开放, 可容纳 1O ~30 个氨基酸 残基组成的抗原肤, 该抗原肤通常含有一个含 9 个氨基酸的特殊序列, 即九月太核心结合序 列 (core bindi 山 u 鸣 :Jg s 优 eq 牛阳 u 眨 ler 旧 e 吵 ) 0α 吨 2 和自比 2 结构域相结合构成与团 λ I 分子 α 问 3 自结构域相类似 的免疫球蛋白样区, 是 CD 口 4 分子的结合位点 O 表 4-2 HlA I 类和 H 类分子的比较 特 征 且 λi 类分子 HLAII 类分子 分子结构 表达特点 多肤性位点 α(44~471 二 Da) 自 2 微球蛋白 (12 kda) 共显性 α1 和 α2 α(32~34 I 二 Da) 自 (29~32 kda) 共显性 α1 和自 1 区 48 T 细胞共受体结合位点参与作用的抗体来源 α3 区结合 CD, 内源性 自 2 区结合 CD4 外源性 容纳 7~10 氨基酸残基的欣 容纳 10~30 个或更多氨基酸残基的欣 组织分布 几乎所有有核细胞 抗原递呈细胞 HLA-A B C 用 λdr DF DQ 三山任 -I C 分子的功能 (~) 限制约束免疫细胞间相互作用 1974 年 Nature 杂志发表了美国学者 Peter Doherty 和瑞士免疫学家 Roy Zinkemagel 的最新研究发现 : 在感染了淋巴细胞脉络膜脑膜 炎病毒 (lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV) 的小鼠中, 特异性细胞毒性 T 细胞 (OL) 对 病毒感染靶细胞的杀伤作用受岛 1HC 分子的限制 后来的研究进一步证明这种限制同样 存在于免疫细胞之间的相互作用中, 如 TH 与 B 细胞以及 TH 与 Tc 细胞之间 这种现象, 即具有同一岛 1HC 表型的免疫细胞才能有效的相互作用称为岛任 -IC 限制性 ( 岛任 -IC restric tion) 由于他们的这一杰出贡献, 他们被共同授予 1996 年度诺贝尔医学和生理学奖 可 以说, 对岛 1HC 限制性的认识开创了免疫学的新纪元 Tc 与病毒感染的靶细胞间相互作用受 MHC- I 类抗原的约束 Tc 的 1CR 联合识别 靶细胞表面的病毒抗原以及岛任 -IC- I 类分子 α1 和归结构域的多态性决定簇 ; 同时,Tc 表 面的 ω8 分子识别 I 类分子 α3 区的非多态性决定簇 巨噬细胞与 TH 细胞间的相互作用受 MHC- II 类抗原的约束 TH 的 1CR 联合识别 抗原肤以及附 -IC- II 类分子 α1 和自 1 结构域的多态性决定簇 ; 同时,TH 细胞表面的 ω4 分 子识别 MHC- II 类分子 α2 比结构域的非多态性决定簇, 由此启动免疫应答 只有岛 1HC H 类分子阳性的免疫细胞才具有抗原提呈能力, 并且细胞表面岛 1HC - II 类分子密度与 其抗原提呈能力呈正相关 因此, 岛 1HC- II 类分子是抗原提呈能力的标志

56 第四章( 二 ) 参与对抗原的处理在试验中, 将纯抗原和 T 细胞放在一起, 并不能使 T 细胞激活, 只有岛 1HC 抗原肤复合体才能激活 T 细胞 这表明, 岛任 -I C 是 T 细胞识别抗原的基础 T 细胞对抗原的识别, 实质上是 T 细胞受体 (TCR) 对 MHC 和抗原的双重识别 内源性抗原与细胞质中的蛋白酶体 ( proteasome ) 结合并进一步分解成 7~ 1O 个氨基酸的小分子量蛋白 ( 山酌, 经抗原相关转运物质 (TAP) 转运到内质网腔, 与 MHC- I 类分子结合, 再经高尔基体提呈至细胞表面为 T 细胞受体识别 外源性抗原被吞噬到细胞内后, 在 APe 内降解成短的抗原肤 ( 约 1O ~20 个氨基酸 ), 然后和内质网合成的岛 1HC- II 类分子结合, 再被运送到细胞表面 由此可见, 岛任 -IC 分子在多个环节参与对抗原的处理 ( 三 ) 参与 T 细胞分化在正常发育环境中, 早期 T 细胞在胸腺中发育为成熟 T 细胞, 其间伴随着一系列表面标志的变化, 要经历三次克隆清除 第一, 不能表达 TCR 者被克隆清除 ; 第二, 不能识别岛 1HC 者被克隆清除 ; 第三, 以 TCR 识别胸腺基质细胞表面岛任 -IC 分子或岛 1HC 自身抗原肤并显示高亲和力的 T 细胞克隆发生细胞凋亡, 即自身反应性 T 细胞被克隆清除 通过以上过程, 只有具有 TCR 并能与自身岛 1HC 结合的外来肤作用的 T 细胞才能留存并发育成熟 ( 四 ) 参与免疫调节非 T 细胞 ( 巨噬细胞 B 细胞等 ) 在体外能诱导自身 T 细胞发生增殖反应, 此即自身混合淋巴细胞反应 (autologous mixed lymphocyte reactio 日, A 岛仕.R) 在 AMLR 中非 T 细胞表面的剌激决定簇是 HlA 团主分子 自身反应性 T 细胞增殖后可表达 HlA -DR 抗原, 后者又作为剌激分子激活某些 T 细胞, 此即 T-T AMLR o AMLR 代表体内免疫细胞间的一种调节机制, 有助于维持免疫自稳, 故岛 1HC - II 类分子通过诱发 AMLR 而参与免疫调节 ( 五 ) 其他非免疫学功能回 E 基因 ( 旧称且 A-H) 位于 HlA -A 基因端粒端约 4000 恼, 为非典型性 I 类基因 它的产物与 HlA- I 类分子相似 遗传性血红蛋白沉着症 (hered 阳 y hemochromatosis, HH) 是一种常染色体隐性遗传性疾病, 在白人中较常见, 尤其在具有欧洲血统的北美群体, 发病率可达 3%0 ~4%oo 此病的特点是铁在人体许多器官, 如心脏 肝等的细胞中病理性聚积, 过度的沉积可导致肝癌 肝衰竭 严重的 DM 和心脏 主要组织相容性复合体49 病 现己清楚, 因 E 基因的突变与遗传性血红蛋白沉着症相关 ; 越来越多的证据表明, 位于第 6 号染色体短臂上的目 E 基因所表达的 HFE 分子在调控铁的摄取及代谢中发挥重要作用 研究发现, 携带回 A-A3 和 HlA - B, 4 二等位基因纯合体的个体其患有可 1 的 RR( 相对危险性 ) 为 90 进一步研究发现, 可 1 病人往往在回 E 基因第 283 位出现特征性突变, 由半肮氨酸突变成酷氨酸 (α83y), 这个突变与 70% ~90% 的目 1 病相关联, 因为此 突变阻碍了半肮氨酸在 α3 区二硫键的形成, 影响了 HFE 分子在胃 小肠 肝等细胞表面的 正常表达 四.HlA 分子表达的调控四 λ 分子在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用, 是维持免疫系统和机体内外环境稳定的重要保证 HlA 分子在细胞表面的表达受多种因素在多个水平的调控 (~) 转录水平的调控一般认为, 转录水平的调控对目 A 分子的表达最为重要 在 IFN - "Ia 目的作用下, CIITA 是一种非 DNA 结合蛋白, 它可以同 HlA- I 和或 H 类转录复合体结合, 并以复合体形式结合在启动子上而启动有效转录, 从而引起 HlA 分子合成及

57 一篇免疫学基础知识在细胞表面的表达 ( 二 ) 细胞因子可使岛任 -IC 分子表达增加 IFN 和 1NF 均可增强不同类型细胞且 A I 类抗原的表达, 并且 IFN γ 是最强的 ; 而 IFN - ~ γ 和 1NF α 以及 IL- 6 等均可以 增强不同类型细胞 HlA - II 类抗原的表达 ( 三 ) 某些疾病可引起特定细胞表面目 A 分子的表达某些自身免疫性疾病 传染性 疾病以及肿瘤等均可影响 HlA 抗原的表达 如某些肿瘤细胞表面目 A-I 类抗原表达 减少 ; 再如 I 型糖尿病患者的膜岛日细胞, 原先不表达 HlA - II 类分子, 被诱导而异常表 达 H 类抗原, 而 AIDS 病患者单核细胞 HlA - II 抗原表达明显减少 所菊50 第五口因 A 与 II 备床一.HlA 与器官移植人们通过排斥反应发现了岛 1HC, 对岛 1HC 的研究又促使人们发现移植成功最大的障碍是组织不相容引起的排斥反应 这个发现在一定程度上极大地促进了现代器官移植的发展 在人体器官移植中, 供者和受者之间团 A 型别相吻合的程度直接影响到移植物的存活率 研究发现 HlA - II 类抗原的配合比目 A-I 类抗原的配合更为重要 近年来特别重视 HlA -DP 对移植器官长期存活的意义 在肾移植中, 因 λ 座位配合的重要性依次为 HlA -DR HlA -B HlA -A; 而在骨髓移植中, 一般在供受者 HlA 单倍型相同的情况下才易成功, 即要求从同胞中选择与病人目 A 基因型相符合的个体作为供者 总之, 在器官移植中, 避免或减少急性和慢性排斥反应, 延长移植物存活的时间, 应该做到 :1 在移植前进行准确的 HlA 配型并尽量选择遗传学上相容的供受对 ; 供受者间的 HlA 相似性越高, 移植成功的可能性越大 2 在移植后对受者进行积极恰当的免疫抑制 二.HlA 与输血反应输血后的同种免疫反应是由于同种异体供受者问免疫遗传背景不同所致, 以反复输血后发生非洛血性输血反应和血小板输注无效两个表现为特征, 这种反应 70% 以上由白细胞抗体引起, 其中主要是因 A 抗体, 并且女性 HlA 抗体检出率显著高于男性 在临床上, 近年来非洛血性发热性输血反应 (febrilenon haemolytictransfusion reaction, FNl 丑 R) 呈上升趋势 引起 FNl 丑 R 的机理很多, 其主要原因是白细胞的同种抗原不配合所致 由于 HlA 系统的高度多态性, 使供血者与受血者间多为不合, 引起受血者产生相应的抗体, 当再次输入具有相应抗原的血细胞成份时就会发生淋巴细胞毒性反应, 造成白细胞凝集并在单核巨噬细胞系统内被破坏, 释放出内源性致热源, 从而引起以发热与寒战等为主要临床表现的 R 吐丑 R o 患者 HlA 抗体的产生与输血次数大致呈线性关系, 受血次数越多, 产生 HlA 抗体的机会和特异性就越多, 出现输血反应的可能性越大 O 反复有规律的受血者产生且 A 抗体的频率可达 50% 以上, 多次娃振的妇女即使过去从未输血, 血清中也会出现这类抗体 开展成分输血或和减少输入的白细胞数量以及在临床中推广 HlA 抗体筛选, 可降低此类输血反应的发生率 二.HlA 与亲子鉴定和法医学目 λ 是人体内最复杂的多态性系统, 两个无血缘关系的个体很难具有完全相同的忏

58 第四章HlA 基于 HlA 的高度多态型和单 f 音型遗传的特点, 借助于 HlA 基因型和或表现型的 检测, 可进行亲子鉴定 因为服从共显性的遗传规律, 一个个体的 HlA 抗原能完整的表达在细胞表面并终身不变 对个体而言, 因 A 复合体被看作是个体特异性的终生遗传标记, 这在法医学上可用于个体识别 尤其是近年来采用 PCR 技术, 可以从死亡者极少量的组织标本中进行且 ADNA 分型 四.HlA 表达异常与疾病的关系 (~)HlA- I 类抗原表达异常 HlA- I 类分子在许多肿瘤中有失表达和低表达现象, 造成 HlA 特异性改变, 从而逃避了 CIL 对肿瘤细胞的识别及杀伤, 导致肿瘤免疫逃逸 (sneaking through) 0 HlA - I 类抗原表达异常发生的频率在不同肿瘤中差异较大, 其发生的机制主要包括重链及 ~2 -m 的基因突变 表达调控异常和抗原加工分子 TAP imp 异常等 因 A-I 类分子和 TAP 的低表达常预示着肿瘤的临床进程加快和预后不良, 在体内外研究中能导致肿瘤细胞对 CIL 的敏感性丧失或降低, 能明显影响病人进行 T 细胞免疫治疗的效果 00 γ 能很大程度地使肿瘤细胞的 HlA 低表达升高或恢复正常表达, 因此有人认为, 对目 A-I 类分子低表达或阴性的肿瘤患者, 应辅以 00 γ 的免疫治疗, 可提高肿瘤的治疗效果 ( 二 )HlA - II 类抗原表达异常在某些器官特异性自身免疫疾病中, 原先不表达 目 A-II 类分子的上皮细胞可被诱导而异常表达 H 类抗原 如 Graves 病患者的甲状腺上皮细胞 I 型糖尿病患者的 1 夷岛日细胞 原发性胆管肝硬化患者的胆管上皮细胞等均可发现 HlA - II 类抗原异常表达 其机理可能是局部感染诱生 γ 干扰素 (00 γ), 后者诱导 H 类抗原, 就可能以组织特异性方式将自身抗原提呈给自身反应性 T 细胞, 从而启动自身免疫应答 激活的自身反应性 T 细胞又自巨大量产生 00 γ, 诱导更多的靶细胞表达 H 类抗原, 加重和延续自身免疫应答, 导致迁延不愈的自身组织损伤 裸淋巴细胞综合征 (bare lymphocyte sy 且也 Dme, BLS) 是一种染色体隐性遗传的疾病, 这类病人 HlA- I 类分子表达良好, CDs+T 细胞发育正常 del. HlA - II 类分子表达缺陷, 仅少量 m4 +T 细胞发育还不能被抗原激活 由于 BLS 病人胸腺内抗原提呈细胞不表达 主要组织相容性复合体51 岛 1HCII 类分子, 影响 m4 +T 细胞的阳性选择, 致使外围血中成熟 CD4 +T 细胞数量显著减少 ; 而且因为外周血 APC 缺乏 H 类分子, 不能向这些少量的 CD4 +T 细胞提呈抗原, 从而造成细胞免疫和体液免疫联合缺陷 患者对各类病原体易感, 常于婴儿期死亡 五.HlA 与疾病的相关性目 λ 与疾病相关性的研究始于 20 世纪 60 年代 越来越多的研究表明, 某些疾病的发生与特定的 HlA 型别呈非随机分布 最典型的例子是 91 % 以上的北美白人强直性脊柱炎患者带有 HlA- B27 抗原, 而正常人群中只有约 9% 携带有目 A-B27 抗原 因 A 与疾病的相关性通常运用关联 ( assoc 川 ion) 进行研究 关联在遗传学上是指两个遗传学性状在群体中同时出现呈非随机分布, 它表明了特定 HlA 抗原和疾病在表现型上的联系 因 A 是第一个被发现与疾病有明确联系的遗传系统, 迄今己发现上百种疾病与 HlA 有关联, 详见表 4-3 特定疾病与某种 HlA 型别的关联程度通常运用相对危险性 ( relative risk, RR) 来评估, 其计算公式为 : RR= p+ X C P XC

59 一类风湿性关节炎第疫学I 型糖尿病免基础知式中 p+ 为具有某种抗原的病人数 ;C 为不带此抗原的对照组人数 ;p 为不带此抗原 的病人数 ;C+ 为具有此抗原的对照组人数 RR 表示带某种 HlA 抗原的人与无此种抗原 的人在患某种疾病的危险性上的比值 RR 二 1 时, 两者无关联 ; 若 RR> 斗, 则认为此病与 某种田 λ 肯定有关联, 为阳性关联 ;RR 值越大, 表示带此抗原的人患某种病的危险性越 大 反之, 若 RR<l, 为阴性关联, 表示带此抗原者对某病有抵抗性 籍此, 疾病关联基因 相应的被分为易感 (susceptibility) 和抵抗 ( resistant) 两类 表 4-3 HlA 与疾病的相关性 疾 病 用 λ 抗原 相对危险性 RR 强直性脊柱炎 Reiter 病牛皮癖性关节炎 Be hcets 综合征亚急性甲状腺炎多发性硬化症发作性睡眠 B27 B27 C" 治 B51 B35 DR2 DR2 100~200 30~ ~ 痛痊样皮肤病 DR 干燥综合征 DR3 10 全身性红斑狼疮 DR3 6 篇DR 寻常天痛疮 DR4 DR3 DR4 20 全身性硬化症 c4 团总 11 识C4 AI 已 KJ 9 (~)HlA- I 类抗原关联的疾病 HlA- I 类抗原关联的疾病主要有与 HlA-B27 抗原关联的血清阴性脊柱关节病 团 A-B35 关联的亚急性甲状腺炎 团 A-B51 关联的白塞病 (Behc ets disease) 及与 HlA -Cw6 关联的寻常性牛皮畴 岛任 -IC I 类基因 HlA- B27 所表达的产物即 HlA- B27 抗原分子是第一个被发现的人类某一疾病与一种鸟任 -I C 分子相关的抗原 1973 年 Brewerton 首先报道了且 A-B27 与强直性脊柱炎 (ankylosing spondylitis, AS) 的密切相关性 超过 90% 的 AS 患者携带回 A-B27 基因, 这种与疾病的强关联在对许多种族人群的研究中被证实 随后, 其他几种疾病, 包括 Reiter 综合征 反应性关节炎 银屑病关节炎 炎性肠病等也相继被发现与 HlA- B27 相关, 并具有不同的相对危险性 这一组与 HlA- B27 相关的疾病被称为血清阴性脊柱关节病 (seronegative spondyloarthropathies, SpA), 是一类以慨髓关节 脊柱和周围关节的炎症及类风湿因子阴性为特征的慢性关节病 因 A-B27 至少包括 22 个不同的同种异型基因型 ( 亚型 ), 分别命名为 HlA -B 兴 2701 到目 A-B 兴 2722 近年来大量家系调查发现同卵双生子 AS 的共唐 率约为 50% ~60% 研究发现,HlA- B27 阳性者患 AS 的几率是 HlA B27 阴性者的 200~300 倍 以上信息强烈提示 AS 是一个基因病, 不排除 HlA I 类分子 ( 如 B60) 与 H 类分子同时参与发病 应当承认环境因素 ( 非遗传 ) 可能是普遍存在的

60 第四章HlA- B27 与 AS 的强关联, 使 HlA-B27 的检查成为 AS 的辅助诊断方法之一 临床上 HlA- B27 的检测方法主要有 :1 微量淋巴细胞毒法 (microlymphocytoxicitytest) 检测 HlA; 2 流式细胞技术检测 HlA-B27 需要特别指出的是, 不能根据是否存在目 A-B27 而确定或排除 AS 的诊断, 因为在 AS 的 HlA- B27 检查中, 既不存在 100% 的特异性, 也不存在 100% 的敏感性 不同种族和人种中,HlA-B27 的流行情况 (HlA- B27 检查的特异性 ) 和与疾病的相关强度 (HlA- B27 检查的敏感性 ) 也各不相同 ( 二 ) 且 A-II 类抗原关联的疾病因 A-II 类抗原关联的疾病主要有与四显相关联的发作性睡眠 (narcolepsy) 与目 A-DR3 关联的突眼性甲状腺肿 ( Grave's disease) 重症肌无力和艾迪生病 (Addisons disease) 与 HlA -DR4 关联的类风湿性关节炎 (RA) 与目主 2 关联的乳靡泻以及与 HlA -DR3 DR4 关联的 I 型糖尿病 近年来 HlA - II 类基因与人类疾病的相关性研究表明 :1 不同国家 不同地区的同一种疾病与不同的 HlA - II 类易感基因 保护基因有关 如 1 夷岛素依赖型糖尿病 (IDDM) 与 HlA -DR4 有关, 但 DR 斗的不同亚型易感基因在不同国家 不同地区人群中控制着 IDDM 的易感性 ; 如 DRB1 祷 405 具有较强的易感性, 而 DRB1 祷 403 具有较强的保护作用 2 且 A-II 类基因的多态性可以改变 HlA 分子 抗原 T 细胞之间相互作用的特性, 并因此控制对外来抗原 ( 也可能对自身抗原 ) 的免疫应答 3HlA - II 类基因编码的某一氨基酸 序列控制着疾病的易感性和临床性状 如类风湿关节炎时,HlA - DR~ 链的 70~74 位氨基酸序列 (Q)RKRAA 的亮酸酸 (K) 被取代, 与 RA 易感密切相关 ; 且类风湿因子 ( 盯 ) 的产生亦与该氨基酸序列关联 4 构成 HlA 基因群的各个基因是高度连锁的, 因而与某一特定疾病关联的易感基因有可能不是单一的, 而是一些连锁基因的组合, 即单体型 ( haplotype) 如娃振糖尿病 (GDM) 与 DRB1 祷 701- DRA1 祷 201 ~02 单体型相关 四 λ 与疾病易感性的机制学说包括 :1 分子模拟 (molecular mimicry) 学说 :HlA 抗原本身与某些病原物质相似, 机体或者不能对该病原物质产生有效的免疫应答 或者在对病原物质的反应中发生交叉反应而损伤了自身组织 2 受体 (receptor ) 学说 : 目 A 抗原可能作为外来抗原的受体, 两者结合后引起细胞和组织抗原性改变, 致使机体将它们作为外来异物发生免疫反应, 产生组织损伤 3 自身抗原提呈 (autoantigen presentatio 川学说 :HlA- II 类分子在结合并提呈抗原到反应性 T 细胞的过程中, II 类抗原表达过少或过多, 不同亚区的 α 链和自链发生错配, 形成新的抗原性物质, 产生了自身组织的损伤 4 非典型的岛任 -I C 基因 ( nonclassical 岛任 -IC elements) 学说 : 非典型的 ( 或称非编码的 )HlA - II 类基因与 HlA 疾病易感基因之间存在着连锁不平衡 5 免疫耐受学说 : 人体内存在某物质的耐受性片断, 此片断被阻 A 分子提呈以后, 机体免疫系统便对该物质建立免疫耐受, 与某些疾病相关 主要组织相容性复合体53 的保护性目 A 基因产物与该耐受性片断的亲和力高, 而易感 HlA 基因产物与该片断的亲和力较低 四 λ 和疾病的关联是一个越来越受到关注的问题, 这不仅因为它涉及诸多临床疾病发病的病因 ( 几乎所有的自身免疫病和 HlA 关联 ), 还因为这是一个揭示岛任 -IC 功能及其免疫调节机制的极佳切入口 人类主要组织相容性复合体 ( 岛 1HC) 即且 λ, 己被完成全部基因的测序工作, 基因图发表于 1999 年 10 月底的 Nature 杂志 HlA 全基因图的确立, 为全面评估 HlA 和疾病的关联及阐明相应疾病产生的免疫遗传学和分子生物学机制, 准备了条件, 它使在时也水平上探讨 HlA 与疾病的相关性成为可能 通过深入的连锁分析,

61 免疫学基础知16 黄烽, 杨春花. 强直性脊柱炎临床及免疫发病机制的研究进展. 中国免疫学杂志, 2001, 17 (6) :281 ~ 可找到一些入选基因并逐一作功能测定, 并最终确定这些基因的核昔酸序列 HlA 全基 因图的确立, 必将为疾病关联分子生物学的研究作出无可估量的贡献 参号文献 1 Goldsby RA. Immunol 唱 y.5th ed.new York:Freeman WH and Cαnpany, 周光炎. 免疫学原理 上海 : 上海科学技术文献出版社, 陈慰峰. 医学免疫学 第 3 版. 北京 : 人民卫生出版社, τbe M-IC Sequencing Consortium: Complete sequence and the gene map of a human major histocompatibility complex.nature, 1999 ;401: in 鸣 t hla 6 Bjorkman BJ, Saper MA, Sa=aoui B, et al.τbe foreign antigen binding sites and T cell recognition re 且 ions of class I histocompatibility. Nature, 1987, 329: Grumet FG, Buelow R, Grosse Wilde H, et a!. Rep 口,rt of the second international soluble Hlλ(sHlλ) workshop. H uman Immunol, 1994, 40 (3) : Municucci A, Noci I, Fuzzi B, et a1. Human Immunol, 1994, 60 (11) : 兰炯采, 石宁, 郑世荣, 等. 可溶性同 λ I 的检测及中国人正常值. 中国免疫学杂志, 1999, 15(5) : 第一篇~ 胡正强. 可溶性 HlA 免疫生物学研究进展. 国外医学免疫学分册, 2002, 25 (1) : 39~41 11 徐文峙, 李志强. 非溶血性发热性输血反应. 中国输血杂志, 2002, 15(5) :368~ 张志梅, 兰炯采, 曹琼.114 例输血后 HlA 抗体的初筛分析中国输血杂志,2000, 13(2) : 100~ 范丽安. 医学遗传学理论与实践 (4) 人类主要组织相容性复合体 外科理论与实践, 2000, 5(2) : 附 24~26 识 范丽安, 周光炎. 人类基因组 L 怔 {C 测序及其免疫学意义. 上海免疫学杂志, 1999, 19(6) :321 ~ 张江林, 黄烽.HlA- B27 检测的进展及其临床意义. 中国实用内科杂志, 2002, 22(5) :313~ 苏枭.HlA- II 类基因与人类疾病相关性研究进展. 国外医学免疫学分册, 2000, 24(4):233~ J.Klein and A. Sato Advances in Imm unolc 町 : The I-llλSystem - First of Two Parts. N Engl J Med 2000; 343 (10) :702~ J.Klein and A. Sato Advances in Imm unol 咱 ':ηle HlλSystem - Second of Two Parts N Engl J Med 2000; 343 (11) :782~786

62 第五章第五章 T 淋巴细胞的成熟 活化和分化 T 淋巴细胞是胸腺依赖性淋巴细胞 ( thynlus - dependent lymphocyte) 的简称 T 淋巴细胞成熟过程中必须首先进入胸腺, 经历一系列有序的分化过程, 才能发育成为成熟的 T 细胞 成熟的 T 细胞被释放入外周血, 成为外周 T 淋巴细胞库的主要组成部分 此时, 成熟的 T 细胞库具有两个基本特征 : 一是 T 细胞识别抗原受自身岛任 -IC 限制 ; 二是成熟 T 细胞库具有白身耐受性, 即不对自身岛 1HC 分子或与之结合的自身抗原产生应答 刚刚由胸腺进入外用的成熟 T 细胞称为初始 T 细胞, 初始 T 细胞需经过抗原剌激以及协同剌激信号和细胞因子等的共同作用, 才能被活化, 进而增殖 分化为效应 T 细胞和记忆性 T 细胞, 执行相应的免疫功能 一.T 细胞的个体发育 T 淋巴细胞是由多能造血干细胞 (pluripotent hematopoietic stem cell, PHSC) 发育分化而来 PHSC 具有两个特征, 即能分化成所有类型的血细胞和自我更新的能力 PHSC 进一步分化为髓系干细胞和淋巴系干细胞 前者最终发育成为红细胞 巨噬细胞和粒细胞 ; 后者分化为前体 T 细胞 (pro - T) 和前体 B 细胞 (pro- B), 最终分别在胸腺和骨髓发育为成熟的 T 细胞和 B 细胞 (~)T 细胞在胸腺中的成熟胸腺是 T 细胞分化成熟的主要场所 由于在一些无胸腺的个体中也发现存在少量成熟的 T 细胞, 因此可能存在除胸腺外的其他组织, 但至今还未找到其确切位置 前休 T 细胞由骨髓迁移至胸腺的过程尚未完全清楚, 其最早在胸腺中被检出的时间, 在小鼠是在鼠胎发育的第 11 天, 人类是在娃振的第 7~8 周 前体 T 细胞通过胸腺上皮细胞进入皮质区, 在胸腺基质细胞及其分泌的因子和胸腺激素的作用下, 不断分化发育, 继而向髓质迁移, 继续进行分化直至成熟 在胸腺中的未成熟 T 细胞统称为胸腺细胞 T淋巴细胞的成熟 活化和分化55 成熟的 T 细胞大部分通过毛细血管后静脉进入血液, 少数通过淋巴管进入血流, 经血液循环转移到次级淋巴器官如脾脏 淋巴结中的胸腺依赖 区定居 以上过程为 αlit 细胞的发育过程 T 细胞在胸腺内的分化成熟可分为三个时期 : 1. 第一时期即双阴性期 在前体 T 细胞进入胸腺之初, 尚未表达 T 细胞表面标志, 但表达末端脱氧核昔转移酶 (TcIT), 主要位于胸腺被膜下区域, 称为前胸腺细胞 前胸腺细胞进入皮质区, 进一步发育为 ω4- C 口 i 双阴性细胞 (double negative cell, DN) '4- CDg- 双阴性细胞只表达 T 细胞系的早期特征标志 ω2 和 CDs, 但不表达 CD4 和 ω'8, 也不表达 1CR 和 CD3 分子 在此阶段, 开始 1CRG 基因重排, 如果 1CRG 重排成功, 将启 动 1CRD 基因的重排, 分别表达 1CR γ, i) 链, 如果 1CR 的 γ 和 8 均得以成功表达, 细胞则作为 γ 盯细胞离开胸腺, 并在第三类淋巴组织中进一步分化成熟, 目前对其分化成熟的过程知之甚少 绝大多数胸腺细胞并不能成功重排并表达 1CRG 和 1CRD 基因, 在此情况下, 编码 1CR-~ 链的立即基因开始重排 不发生日链基因重排的细胞发生凋亡

63 一篇免疫学基础知识56 第2. 第二时期即双阳性期 此阶段, 随着胸腺细胞向胸腺皮质深层迁移, 双阴性细胞发育为 CD4+ωJ 双阳性细胞 (double positive cell, DP) 0 CD4+ J 双阳性细胞首先表达 TCR 的自链, 之后表达 TCR 的 α 链前体 (pt(α), 两者结合成异二聚体, 即 pre - TCR o pre TCR 的表达可诱导 ω4 和 ω8 分子基因的活化, 胸腺细胞首先表达 ms 分子, ms 分子促 进 CD4 分子的表达, m4 与 CDs 分子表达于胸腺细胞表面, 形成双阳性细胞 胸腺细胞大多数为 CD4+ J 双阳性细胞, 它们在表达 ω4 和 CDs 后即进入快速增殖期 然后,TCRA 基因开始重排与表达, 新表达的 TCR α 链取代 pt<α 与 TCR- ~ 链结合为异二聚体, 后者与 CD3 分子共同组成立 :R-m3 复合体 3. 单阳性期 CD 4 + ms + 双阳性细胞在胸腺经历阳性选择及阴性选择两个过程, 分化为 CD4+T 细胞和 ms+t 细胞, 即单阳性细胞 (si 鸣 Ie positi 时 cell, SP) (1) 阳性选择 m4 +CD s + 双阳性细胞首先经历由 TCRa~ 介导的阳性选择过程 在胸腺皮质与髓质交界处, CD4 + m s + 双阳性细胞的 TCR 咱与胸腺基质细胞表面的岛 1HC I, II 类分子相互作用, 若其 TCR 能与阳 CI H 类分子以适当亲和力结合, 则可被选择, 进一步发育为单阳性细胞, 反之, 则发生细胞凋亡而被克隆清除 仅有约 5% 的 ω'4+ CDs + 双阳性细胞经历阳性选择而存活 在此过程中, 与基质细胞表面岛 1H CI 类分子结合的 m 4 + CDs + 双阳性细胞 ms 分子表达水平上调, CD4 分子表达水平下调直至完全抑制, 最终 分化为 CDs+T 细胞 ; 与岛 1HCII 类分子结合的 CD4 + m s + 双阳性细胞 CD4 分子表达水平上调 而 ms 分子水平下调直至完全抑制, 最终分化为 CD4 +T 细胞 通过阳性选择, 单阳性细胞 获得岛 1HC 限制性的识别能力, 即 CDs+T 细胞具有识别自身岛但 CI 类分子复合物的能力, 而 CD4 +T 细胞则具有识别自身岛 1HCII 类分子复合物的能力 (2) 阴性选择经过阳性选择的单阳性细胞, 既包括识别异己抗原的特异性克隆, 也包括自身反应性克隆 前者是机体所需要的, 后者是对机体有害的, 必须通过阴性选择, 才能发育为成熟的能识别外来抗原的 T 细胞 位于胸腺皮质与髓质交界处的巨噬细胞 树突状细胞高水平表达岛 1HCI 和岛 1HCII 类抗原, 后二者与自身抗原结合成复合物 通过阳性选择的单阳性细胞若能识别此自身抗原岛但 C 分子复合物, 即被诱导细胞凋亡或无能, 而不能识别该复合物的胸腺细胞则能继续发育 由此, 胸腺细胞通过阴性选择而获得对自身抗原的耐受性 在所有的胸腺细胞中约有 98% 的细胞发生程序性死亡, 这说明在 T 细胞发育过程中受到自身岛任 -IC 限制和自身耐受方面的严格选择 ( 二 )T 细胞受体的发育 TCR 基因的重排和表达, 是 T 细胞在胸腺中分化成熟的重要步骤, 并伴有 CD3 CD4 ω8 等分化抗原的表达 在 T 细胞发育过程中, 围绕着 TCR 的成熟, 发生了一系列基因的有序表达和关闭 编码 TCRαJ γ 和 8 链的基因座位分别被命名为 TCRA 立即 TCRG 和 TCRD o 每个基因座位上含有川 C 基因片段, 立即和 TCRD 基因座位上还含有 D 基因片段 人的 TCRA 和 TCRD 位于 14 号染色体上, 两组基因片段交叉分布, 其中包括 46 个 TCRAV 50~70 个 AT, 1 个 AC 以及 4 个 TCRDV 3 个 DD 3 个 DJ 和 1 个田丁基因片段 立即和 TCRG 分别位于 7 号染色体的长臂和短臂上, 分别包括 64 个 TC 阻 V 2 个 BD 13 个 BJ, 2 个 BC 以及 8 个 TCRGV(6 个假基因除外 ) 2 个 GJ 和 2 个 GC 基因片段 γ 和 8 链基因座位上 V 基因片段较 α 和自链基因座位上的 V 基因片段少, 但 γ 盯 'CR 具有更丰富的连接多样性 在人的

64 第五章胚胎胸腺中, γ 盯 CR 的表 j 主要早于 α 阿 CR, 前者出现在第 9 周, 后者出现在第 10 周 优先 表达 γ 盯 CR 可能在 T 细胞分化中有重要作用 例如删除 γ" 静息基因 " 的小鼠的 α 阳 CRT 细胞不能正常分化, 而剔除自基因并不影响 γ 盯 CR 的分化, 表明 T 细胞分化的早期, γ" 静 息基因 " 的转录可能是咱基因表达所必需的 CD3 i) 是最早开始表达的 T 细胞系特异性基因, 随即出现 pre- 1CR 的替代轻链 pt(α(gp33) 的 m 阳 A 以及 1CR 目的胚系转录本 其后是重组活化基因 RAG-l 和 RAG - 2(recombination activation gene - 1 2) 的表达 与此同时, 在 RAG 作用下, 立即基因进行 V D, J 基因片段重排与表达 此时, 细胞表面出现由 pta 与 1c 邸组装成的 pre- 1CR, 与 CD3 (γ h 链 ) 共同开始行使信号传导功能 ; 可诱导 T 细胞克隆扩增, 暂时性下调 RAG-l 和 RAG-2 表达, 通过等位基因排斥作用抑制另一条染色体上 1CRE 基因的重排, 确保只有一个立即等位基因重排 同时 1CRA 基因也开始重排, 但该基因 V, J 片段正常水平的重排发生在细胞己恢复至静止状态后, 因此时 RAG 活性尚处于抑制状态 最后, 表达成熟的 1CR,α 日, 而 pta 以及 RAG-l 和 RAG-2 的表达则被关闭 二.T 细胞的活化 T 细胞活化是指抗原肤 岛但 C 复合物与 1CR 复合物结合以后, 或经致分裂原剌激 后, 诱导产生的一系列细胞内反应, 最终结果是细胞内某些蛋白分子活化并具有转录因子的功能, 然后作用于相应的靶基因, 促使基因转录或关闭, 使细胞功能发生变化 T 细胞活化的主要过程是 :T 细胞对抗原进行识别, 活化信号经过跨膜传递及胞内传递, 多种相关酶活化, 转录因子 ii5 化 转位入胞核, 激活基因转录, 进而分泌效应细胞因子, 诱导细胞活化 广义的淋巴细胞活化还包括细胞活化 增殖和分化, 最后形成免疫效应细胞或分子的全过程 二.T 细胞对抗原的识别 (~)T 细胞识别抗原的部位病原微生物侵入引起感染的部位并不是免疫应答开始的部位 病原微生物及其产物经淋巴液转运至淋巴结, 在该处被吞噬细胞捕获, 如果感染的病原微生物在血液中, 则在脾脏被捕获 经上述淋巴组织中的 APC 吞噬并处理和加工后, 将其携带至淋巴结的副皮质区及脾的小动脉周围淋巴喃, 与 T 细胞结合, 提呈抗原, 进 而 ii5 化 T 细胞 通常只有 ~ 个淋巴细胞表达对某一抗原特异性识别的受体, 数量很少, 只有经过克隆扩增以后才能产生大量的效应细胞 T淋巴细胞的成熟 活化和分化57 ( 二 )T 细胞对抗原的双识别及岛但 C 限制性详见第三章 四.T 细胞的活化 T 细胞接受抗原剌激后, 需要双信号 ( 图 5-1) 和细胞因子的作用才能够完全活化 (~)T 细胞活化的信号要求 l. T 细胞活化的第一信号 1CR 与抗原肤 MHC 分子复合物的特异性结合, 启动抗原识别信号, 即第一信号 CD4 或 CDs 分子作为共受体, 可分别与岛任 -[C- II 及岛任 -[C- I 类分子结合, 除可增强 T 细胞与 APC 间的粘附作用外, 其胞浆段尾部与 ω3 相聚, 可激活与胞浆段尾部相连的酷氨酸激酶, 促使含酷氨酸的蛋白磷酸化, 启动激酶活化的级联反应, 最终通过激活转录因子而导致编码细胞因子及其受体等的基因转录和产物合成 2. T 细胞活化的第二信号在抗原特异性的 T 细胞活化过程中, 仅有 1CR - CD3 复

65 一篇免疫学基础知识合物的介导, 还不足以使 T 细胞完全活化, 必须借助另外的抗原非特异性协同剌激信号, 又称第二信号, 即 APe 上的协同剌激分子与 T 细胞表面的相应受体的结合, 如 B7 ω28 CIlA4, CD2(LFA2) - CDS8 (LFA 川 LFAl- rcam 4 - lbb lbbl 等 ( 见图 5 l) ;T 细胞只有在识别协同剌激信号后, 才能得到有效的激活和增殖, 进而发挥其细胞免疫功能 若缺乏协同剌激信号, 则发生 T 细胞无能, 甚至凋亡 对大量动物和人肿瘤的体内外研究表明, 肿瘤细胞往往由于缺乏或低表达这些共剌激分子而不能有 APe 图 5-1 : 过 ZB T 细胞的双识别及双信号 效活化 T 细胞介导的抗肿瘤免疫应答, 因而使 T 细胞获得有效的共剌激信号己成为肿瘤免疫治疗的关键环节 在这些协同信号中, B7 - m 28 CIlA4 的协同作用为 T 细胞活化提供重要的协同剌激信号 B7 - CD28 CIlA4 同属 19 超家族成员 B7 包括 B7 -l( ω) 和 B7-2( 186 ), 是分子量为 50~70 kda 的跨膜糖蛋白, 细胞膜外区有一 19V 样区和 19GI2 样 功能区,B7 通过其胞膜外 V 样功能区结合 J 口 CIlA -4; B7 -l 主要表达于 B 细胞 激 58 第活的单核细胞巨噬细胞 1 对突状细胞, 激活的 T 细胞以及 NK 细胞等的表面 人类 B7 -l 基因约为 32 峙, 位于 3 号染色体, 编码信号肤, 转录起始点, 胞外 k 可变区样功能区, 胞外恒定区样功能区, 跨膜区段 B7-2 在静止 B 细胞上表达水平极低, 当 B 细胞被 ip S 剌激后,B7-2 表达迅速增加, 24 小时后可达高峰 B7-2 胞浆区有 3 个 PKC 磷酸化位点, 提示其具有信号传递功能 未致敏 T 细胞的 CD28 是 B7 -l B7-2 的唯一受体, 其为 44 凶 a 的糖蛋白, 由两条相同的链组成, 也可表达于浆细胞以及极少量的 CD3 + 胸腺细胞表面, 其胞内区存在免疫受体酷氨酸 i 舌化基序 (immune recept,αtyrosine - based active motif, n: 丛心, 传递 T 细胞活化信号 ω'28 分子与 B7 分子结合, 可促进 1L- 2 基因转录和稳定 1L -2m RNA, 从而促进 1L -2 合成以促使 T 细胞增殖 ; 还可增强 bcl- xl 的表达, 保护 T 细胞免于 调亡 CIlA -4 主要表达于活化的 T 细胞表面, 也可表达于 CIL 细胞, 位于 2 号染色体, 其与 m28 的同源性达 31 % 0 CIlA - 4 胞内区存在免疫受体酷氨酸抑制基序 (immune receptor tyrosine - based inhibitory motif, rtim), 传送抑制信号 在 T 细胞激活至峰值后 CIlA4 表达增加, 因其与 B7 的亲和力显著高于 ω28, 故其与 B7 结合启动的抑制性信号, 使活化的 T 细胞子代细胞对抗原剌激的敏感性降低, 从而有效制约特异性 T 细胞克隆的过度增生 近年来, 大量的体外实验证实, 4 -IEB(ω137) 与 4 -lbbl(cd137 L) 也是较重要的共剌 激分子 4-lBB 是 N 受体超家族成员, 表达于活化的 ω'4+ T 细胞和 CD8 +T 细胞表面 4-lBBL 属肿瘤坏死因子超家族, 主要表达于活化的抗原提呈细胞 ( 巨噬细胞 树突状细胞 B 细胞 ) 它们可提供独立于 ω'28 以外的共剌激信号, 诱导 T 细胞的活化 增殖及分泌细胞因子, 如可促使 ω'8+ T 细胞产生 1L -2 和 m γ 以及促使 CD4 +T 细胞产生 1L- 2 及 1L -4, 还可增强 CIL 的功能, 维持 T 细胞的长期存活 另外, 4 - lbb 4 - lbbl 介导的反向共剌激信号可诱导单核细胞的增殖, 还能增强树突状细胞的功能 3. 除上述双信号外, T 细胞的充分活化还有赖于细胞因子的参与, 如活化的 APe 和 T

66 第五章细胞可分泌 IL-l IL-2 IL- 6 IL-12 等多种细胞因子, 它们在 T 细胞激活中也发挥重 要作用 4. T 细胞除了经上述抗原特异性途径诱导活化外, 还可以经过非抗原途径诱导活化, 如丝裂原 (mit, 鸣 e 川作为非特异性的多克隆激活剂, 能使大量处于休止期的 T 细胞克隆被 激活 大多数丝裂原来源于植物或细菌, 常见的丝裂原有植物血凝素 (phytohemaggluti 日 1 日, PHA) 伴刀豆蛋白 A( concanavalin A, 口 A) 及美洲商陆丝裂原 (pokeweed mitogen, PWM) 等 T 细胞表面表达多种识别丝裂原的膜分子, 丝裂原与 T 细胞表面相应膜分子上特定的糖 基交联后 ( 因丝裂原是多价的 ), 可直接使静止状态的 T 细胞活化 增殖 转化为淋巴母细 胞 ( 二 )T 细胞活化信号的转导过程 T 细胞表面的 TCR 特异性结合抗原, 通过 CD3 将 胞外信号剌激传递至胞内, 使控制细胞应答的有关基因转录激活和表达 另外, 共剌激信 号 CD2s 以及细胞因子受体也参与了信号转导过程 1. 信号的跨膜传递 TCR 与抗原结合后, 其位置与构象发生变化, 本来分散存在的 受体 ( 如 C 鸟, CD4 或 CDs, CD45 ) 发生聚集, 即受体交联, 使得细胞表面的离子通道开放, 改 变细胞内某些重要离子浓度, 作为胞内信号转导分子, 引起胞内变化 另外, 聚集在一起 的受体胞内部分相互接触, 活化胞内信号蛋白和酶 活化信号由胞外传至胞内, 需经历一个由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白磷酸化与脱磷酸化反应的环节 磷酸化的底物主要是丝氨酸 苏氨酸和酷氨酸 催化反应的酶主要有蛋白激酶 C(protein 1 王 inase, PKC) 和蛋白酶氨酸激酶 (protein tyrosine kinase, PIK), 以及参与脱磷酸化的蛋白酶氨酸磷酸酶 (protein tyrosine phosphatase, 凹 P) 0 PIK 是一类专 - 性的使蛋白质上的酷氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶, 参与 T 细胞活化早期信号转导, 可分为受体型和非受体型两类 前者大多属于与细胞生长分化有关的生长因子受体, 生长因子与相应受体结合后, 使受体发生二聚化, 进而激活受体胞内段具有 PIKl 舌性的结构域, 进而使受体自身的酷氨酸磷酸化后, 触发下一步反应 TCR 活化信号的传递一般涉及非受体型 PIK, 主要包括 Src 家族成员 p56 1 飞 p59!yn 以及市 k 家族成员 ZAP-70 等 p56 1 企主要与 ω4 或 ωs 分子的胞浆尾部相连, p59!yn 与 CD3 的 : 链相连 ; T淋巴细胞的成熟 活化和分化59 ZAP-70 位于胞浆中, 当受体交联时, ω3 CD4 或 CDs 及 ω45 的胞浆尾部同时聚在一起, 促使带有酷氨酸的蛋白发生磷酸化而 )15 化, 产生激酶活化的级联反应, 传递活化信号 其中, CD45 分子胞浆区具有内在的酷氨酸磷酸酶活性, 当受体交联时, 与 CD4 CDs 分子以及 ω3 靠近, 与其携带的 p56 ld 和 p59!yn 作用, 使 p56 凶手口 p59 阳的 C 末端负调节区的酷氨酸去磷酸化, 解除其 C 末端对激酶活性的抑制作用, 从而恢复其活性 被激活的 lck 和 fyn 可使许多蛋白酶氨酸残基磷酸化 p59!yn 可使 CD3 分子胞浆区 ITAM 的酷氨酸残基磷酸化, n: 丛 f 为含有酷氨酸的易于被 PIK 作用而发生磷酸化的序列, ω3 共含有 10 个 IT, 丛 1, IT, 丛 f 还存在于其他免疫细胞活化相关受体如 BCR 复合物的 19α 国链, 某些 Fc 受体的胞浆区 p56 峙的参与可使 IT, 剧的磷酸化更完全 IT, 剧中的酷氨酸磷酸化后形成一结合区, 借助与 src 同源区 2(src homol 叩 2, S 四 ) 结合, 和胞浆内带有 SH2 功能区的 ZAP-70 分子结合 继而, p56 1 企促使 ZAP-70 磷酸化而活化 激活的 ZAP-70 使接头蛋白 (rat SiP 76) 磷酸化, 激活的接头蛋白与各种带有 Sf 丑结构域的信号蛋白结合, 包括磷酸脂酶 C

67 一篇免疫学基础知识60 第(phospholipase C, PLC) 和连接蛋白 Grb- 2, 使之活化, 分别启动两条不同的信号转导途径 2. 1CR 活化信号胞内传导的主要途径 (1) 磷酸肌醇代谢途径激活的 ZAP-70 使 PLC 分子 γ 链的酷氨酸磷酸化, 从而激活 PH 士, 激活的 PLC 即可水解细胞膜上的磷脂酷斗, 5 二磷酸肌醇 (PIP2), 产生 1, 斗, 5 三磷酸肌醇 (IP3 ) 和 1, 2 酷基甘油 (diacylglycerol, DAG), IP3 和 DAG 相伴产生, 分别作为第二信使, 启动两个独立的信号传导途径, 但它们必须协同作用, 才能完成跨膜信号传递任务 由于一个 PLCγ 分子能诱导产生多个 IP3, DAG 分子, 使胞内信号在传递过程中得以放大 IP3 可与内质网膜上的与 Ca 2 + 通道相联的 IP3 受体结合, 使钙通道打开, 诱导内质网释放 CJ+, 同时可传递信号至胞膜上的钙储存控制通道, 使 Ca 2 + 通道开放, 诱导细胞外 Ca 2 + 内流, 结果是使胞浆游离 Ca 2 + 浓度升高, 使胞浆内钙 i 周磷酸酶 ( calcine 旧 in) 活化, 后者使胞内活化的 T 细胞核转录因子 (nuclear factor of activated T cell, NFAT) 去磷酸化而被活化, 并由胞浆转至核内 ;Ca 2 + 还可与胞浆中的钙调蛋白 ( calmodulin) 结合, 后者与 Ca 2 + 结合后, 可与一些蛋白激酶结合, 使酶类得以活化, 进而启动转录 活化 如 PKC 的活化, 促使一系列底物活化, 进而促使 T 细胞活化 如果 Ca 2 + 浓度过高, 又成为 IP3 与受体结合的抑制剂, 可反馈性抑制内质网中 Ca 2 + 的进一步释放 DAG 是蛋白激酶 C 的激活剂, 它可在胞膜内面结合 PKC, 并使其对 Ca 2 + 敏感性增高, 成为有活性的 PKC 一般认为, IP3 Ca 2 + 和 DAGPKC 两个反应系统共同参与 PKC 的活化和失活 活化的 PKC 能使许多蛋白磷酸化 : 可诱导抑制因子 lk B (inhibitor of NF - KB) 磷酸化和降解, 使其与转录因子 NF-KB 解离, 进而活化 NF- KB, 后者转位至胞核, 从而将信号传至细胞核 ; 可使 Na+ H+ 交换体蛋白质磷酸化, 导致 Na + 入胞, H+ 出胞, 导致细胞内 ph 升高, 胞浆碱性化, 进一步引起对 ph 敏感的蛋白质磷酸化, 有助于活化细胞核内的基因系统, 促进 T 细胞的活化和增殖 (2) MA. 皿 i 途径 MA.P 激酶 (mitogen activated protein kinase) 途径是由三组激酶 (MKKK 岛佳运 MA. 目 组成的级联反应 ZAP -70 活化后可经 Ras 蛋白激活 MA.PK 途径 : 激活的 ZAP-70 使接头蛋白 LA1 飞和 SLP-76 磷酸化, 后者募集连接蛋白 Grb-2 和鸟昔酸交换蛋白 Sas( 吐 le son of sevenless), 使 Ras 与 G1P 结合而活化, 而 G1P 水解酶的激活蛋白 GAP, 使 Ras- G1P 转变为 Ras-GDP 而失活 活化的 Ras 可结合并激活 Raf 和其他 MA. 皿 i 途径中的分子, 进而启动 MA.PK 途径 Raf 是一组丝氨酸苏氨酸激酶, 属 MKKK(~ kinases), 是 MA.PK 信号传递途径的重要启动分子, 它激活 ~(MA.PK kinases) 进而激活 MA. 皿 (, 后者不仅能在胞浆中或转入核内磷酸化转录因子, 而且能磷酸化并激活其他信号分子, 调节多种信号传递途径 目前己知 MA.PK 的底物有 Raf P90 Rsk 激酶 AP-1 核转录因子及 c lun c - Fos, c - Myc 的编码蛋白, 由此可见, 也 f 既是 MA.PK 的底物, 又是阳阻的激活剂 (3) '28 活化途径 CD28 7J\. 子在 T 细胞活化中起着重要的协同剌激作用 一般认为, ω'28 - B7 的第二活化信号传导途径主要是 MA.P 及 P I3 - K 途径 磷脂酷肌醇 3 激酶 (phospharidylinosito13 kinase, PI3 - K) 由调节单位 p85 和催化单位 p li O 组成, p85 含有 Sf 丑结构域, 与磷酸化的 ω'28 的 YMl' 制 (Tyr - Met - Asn - Met) 序列以及 YXJ 创 (Tyr - Xaa - Xaa Met) 序列结合, 产生活化的第二信号, 引起活化的系列级联反应, 直接导致细胞核内转录因子活化, 特别是激活癌基因 fos 和 lun 的表达, 由两基因编码的分子组成 AP-1 转录

68 第五章因子, 在 IL-2 基因的转录过程中起重要的启动作用 (4 )J 且 (SfAT 途径 JAK(Janus kinas Just another kinase) 是一类酷氨酸激酶, 目前发现 的 JAK 家族成员有 J 且让 ~3 TYK2 0 J 且豆的 C 末端为激酶功能区, 具有活化所必需的 KEYY 序列 中间是激酶样功能区, 是与 SfAT 结合的部位 N 末端为 JAKs 的同源区, 是与细胞因子受体胞浆区结合的功能区 SfAT( singal transducer and activator of transcription) 是一族 DNA 结合蛋白, 它既是信号 传递分子, 又是转录调控因子, 从而介导多种生物学效应 当其分子内的酷氨酸 Tyr 残基 磷酸化后, 分子即转变成活性形式 触发 Sf AT 成员激活的因素有 : 细胞因子 受体 JAK 通路中, 激活的 JAK 可使 SfAT 分子中的酷氨酸残基磷酸化 ; 生长因子的跨膜受体自 身磷酸化激活后, 亦可使 Sf AT 磷酸化 ; 血管紧张素 H 受体与 G 蛋白相联, 可通过 G 蛋白 使 SfAT 磷酸化, 但具体机制不详 Sf AT 的结构可分为四个功能区, 从 N 末端到 C 末 端分别为 :JAK 磷酸化激活 Sf AT 所必需的区域, 是含有 PIP 的功自能 E 区 ;DNA 结合功自能 E 区 (ωdna bin 且叫 1 吐由山 di u 鸣 1 毯 gd 也 ornalll 叽 l 且儿 :I, DB), 含有 DNA 结合序列 ;S 趾 r 比 C 的同源 SH3 S 田结构域 ; 基因转录活 化功自能 E 区 ( tra 缸 an 且 nsa 缸削 ctl 口 m 飞 点 O 位于 SH2 结构域的竣基端的某一 Tyr 残基的磷酸化对 Sf AT 与 DNA 结合至关重要, 该 Tyr 残基被磷酸化后, 可与其他 Sf AT 分子中的 Sf 丑功能区相结合, 形成 Sf AT 的同二聚 体或异二聚体, 二聚化作用是与时也结合所必需的 当细胞因子与其受体结合后, 引起受体的二聚化, 在胞浆内形成高亲和力的 JAKs 结 合位点, J 且也与受体的结合位点结合后, 发生自身或受体交叉磷酸化而被 ii5 化, 磷酸化的 J 且 i 分子可催化受体分子中的 Tyr 残基磷酸化, 后者吸引含有 SH2 结构域的 Sf AT 结合于 受体上, 使 JAK 与 SfAT 靠近 JAK 迅速使 SfAT 磷酸化, 活化的 Sf AT 通过 Sf 丑彼此作用 形成二聚体, 同时与受体的亲和力降低并与之解离, 以二聚体的形式转至胞核, 作为转录 因子结合 DNA, 调控相关基因的表达 Sf AT 结合 DNA 可有两种方式 : 一种是以二聚体结 合 p48 蛋白的形式结合于干扰素剌激的反应元件 (IFN - stimulated response element, ISRE), 含此类元件的基因有 OAS, I 出 15, I 创 54, GBP 等 ; 另一种是以二聚体的形式结合于 DNA 上 的 m γ 活化序列 (IFNγ activated sequence, GAS) 或相关元件, 具有细微的序列特异性 和结合位点的差异 不同的细胞表达不同的细胞因子受体及特定的 J 且豆和 SfAT, 不同受 体吸引特定的 J 且 i 及 SfAT, 使得特定的 SfAT 复合物在核内与相应 DNA 结合, 保证了转 录 ii5 化的多样性和对 DNA 的特异性 ( 三 ) 转录因子活化及基因表达 1. 转录因子活化 T 细胞活化信号经上述途径, 产生激酶磷酸化的级联反应, 放大了 开始时的活化信号, 使 T 细胞内转录因子活化, 结合到有关基因的调控区, 调控细胞基因 及增殖分化 T淋巴细胞的成熟 活化和分化61 IL-2 基因的激活和表达在 T 细胞活化中发挥关键作用, IL- 2 基因的转录调节, 取决于转录因子与 IL-2 基因调控区 ( 增强子和启动子 ) 的结合 该处有多个转录因子结合点, 包括 NFAT NF-KB AP-l, Oct-l 等, 它们是经不同途径而来的信号活化时也结合蛋白, 即转录因子 这类分子由 DNA 结合区 二聚化区和转录化区组成, 与核内基因调控区上的相应时也序列结合, 通过卧也聚合酶启动 IL-2 基因转录 NFAT 不仅存在于 T 细胞中, 在活化的 B 细胞等多种免疫细胞中也可表达 目前

69 一篇免疫学基础知识62 第NFAT 家族己发现四个成员, 分别为 NFAll~ 斗 未经活化的细胞, 其 NFAT 以磷酸化的形 式存在于胞浆中, 在细胞 ii5 化时, 经钙调磷酸酶的作用脱磷酸化而活化, 从胞浆进入细胞 核 NFAT 作为一种转录调节蛋白与 AP-l 转录因子结合, 并作用于 IL- 2 增强子上, 调 节 IL-2 基因转录 免疫抑制剂环抱菌素 A 和 FK506 通过阻止 NFA1 飞与 IL- 2 基因的结 合而阻止 IL-2 基因的转录, 从而发挥免疫抑制作用 NF-KB 是最初在 B 细胞中发现的一种与 IgK 轻链转录有关的核转录因子, 后来发现 它也存在于 T 细胞和其他真核细胞中 NF-KB 在胞浆中与抑制因子 IKB 结合, 处于无活 性状态, Ca 2\ PKC 和 H2 C)z 等诱导 IKB 磷酸化, 使其与 NF-KB 解离, 从而 NF-KB 活化并 转位至胞核 NF-KB 可与特异性结合位点结合启动多种基因转录, 特别是 IL- 2 和 1 2R 基因的表达 八聚体结合蛋白 (octamer binding protei 日, Oct- I) 结合于 IL-2 增强子的 A 位点处 ( 序 列 63 ~ 93 ), Oct - 1 可特异性地与增强子中靠近转录启动区的 8 个恒定核昔酸序列相结合 (A1GCAAAT) 即 :A-B 是 Oct-l 的共活化因子, 与 Oct-l 一起结合于 IL-2 基因促进其 转录 激活蛋白 1 (activator protein 1, AP - 1) 由两个原癌基因产物 lun 和 Fos 或两个 lun 组 成 AP-l 必须是二聚体才能结合 DNA o lun 蛋白可组成 lun - lun 二聚体, 而且 s 蛋白必 须与 lun 蛋白结合才形成稳定的异源二聚体, 与 DNA 结合并发挥反式激活能力 2. T 细胞基因表达 TCR 识别抗原肤后产生的活化信号内传, 使多种细胞因子基因 转录活化, 产生细胞因子, 这些细胞因子与其受体作用之后, 活化与细胞增殖及分化相关 基因, 推动细胞进入分裂周期, 出现克隆扩增及向效应细胞分化 涉及 T 细胞活化的基因 有近百种, 根据其活化的时间顺序, 将其划分为瞬时基因 早期基因及晚期基因 ( 5表 1) 这些基因根据其功能又可分为三类 : 细胞原癌基因转录因子基因 细胞因子基因和 细胞因子受体基因 表 5-1 活化 T 细胞表达的代表性基因 活化日寸相 名 称 功能分类 时 间 所处位置 瞬时 c-f, 出 原癌基因 ; 核结合蛋白 15 min 胞核 c - ]un 细胞癌基因, 转录因子 15~20 min 胞核 NFAT 转录因子 20 min 胞核 NF- KB 转录因子 30 min 胞核 c-myc 细胞癌基因 30 min 胞核 早期 IFNγ 细胞因子 30 min 分泌的 IL-2 INSR 细胞因子激素受体 45 min l 'h 分泌的质膜 IL-3 细胞因子 1~2h 分泌的 τgf 自 细胞因子 <2h 分泌的 IL-2R 细胞因子受体 2h 质膜 1NF 自 细胞因子 1~3 h 分泌的 cyclin 细胞周期蛋白 4~6h 胞浆

70 第五章( 续表 ) 活化日寸相 名 称 功能分类 时 同 所处位置 IL-4 细胞因子 <6h 分泌的 IL-5 细胞因子 <6h 分泌的 IL-6 细胞因子 <6h 分泌的 c-myb 原癌基因 16 h 胞核 G 岛 1- CSF 细胞因子 20 h 分泌的 晚期 T 丑 λdr MHC- II 类分子 3~5d 质膜 VLA-4 粘附分子 4 d 质膜 VLA-1, 粘附分子 7~14 d 质膜 (1) 细胞原癌基因和转录因子基因细胞原癌基因是细胞的正常基因, 它的产物可分 布于细胞的不同部位, 调节细胞的生长和分化 许多是作为转录因子来调控其他基因的 表达 之所以这样命名, 是因为如果这些基因过量表达或基因发生突变或是病毒中同源 基因的表达, 将会导致细胞的恶性转化 TCR 复合物与配体结合后, T 细胞中的许多原癌基因的转录子明显增多 其中研究较多的两个原癌基因 : c - Fos 和 c - Myc, 它们都属于瞬时基因, T 细胞受到剌激后 15 mi 口和 30 mi 且可测到 c - Fos 和 c-myc 的转录因子 它们的细胞癌基因产物在细胞核内起反式转录调控蛋白的作用 Fos 蛋白为调控 IL- 2 转录的 AP-l 和 NFA1 飞复合物的一部分 Myc 蛋白可能能够起始时性的合戚, 这可能是通过对其他基因的转录调控来实现的 其他在 T 细胞活化的晚期被激活转录的细胞原癌基因可能为另一些基因的表达所必需, 如 c -Myb 只有在 T 细胞白分泌 IL- 2 后才开始转录, Myb 蛋白存在于胞核中, 其功能尚不清楚 (2) 细胞因子基因 TCR 复合物受抗原剌激后数小时内, 各种细胞因子基因的转录水平明显升高 其中, IL-2 基因的转录被视为细胞因子基因转录调控的代表性基因, 对大多数正常 T 细胞, IL-2 是一种自分泌生长因子, 所以其基因调控对 T 细胞功能活化中的细胞分裂是至关重要的 IL- 2 基因转录起始部位的 5' 端有一个增强子, 它以组织特异性的作用方式, 使 IL-2 基因仅限在 T 细胞内转录 IL-2 基因的激活需要多个信号整合 T淋巴细胞的成熟 活化和分化63 在一起作用于其增强子, 即多个蛋白结合位点都被占据且各个结合蛋白之间相互协作, 才能使 IL-2 增强子有活性 另外, 如前所述, 细胞原癌基因在 IL- 2 基因激活过程中也起重要作用 (3) 细胞因子受体基因 IL-2 受体基因的转录是 T 细胞活化过程中的又一重要组成部分 IL-2R 是由 α 日 γ3 个亚基组成, α 和自亚基单独可与 IL- 2 分子结合, 但亲和力低且不能转导 IL- 2 增殖信号 同时具备 α 和自亚基的 IL-2R 与 IL- 2 的结合力可增高, 但不能转导 IL-2 信号 只有同时具备自 γ 或 α 日 γ 亚基的 IL-2R 才能与 IL- 2 有高亲和力并可转导 IL-2 增殖信号 IL- 2 受体的 α 链的编码基因具有一个 5'ft 市增强子区域, 据报道, IL-l IL-2,1NF 及 TCR-m3 介导的信号均能参与转录的调节 IL- 2 受体队 γ 链的编码基因最近己被克隆,{E! 尚未进行转录调控的分析 五.T 细胞的增殖与分化细胞增殖是指细胞通过分裂使细胞数目增加, 使子细胞获得和母细胞相同的遗传性

71 一篇免疫学基础知识的过程 细胞分化是指由受精卵产生的同源细胞在形态 功能和蛋白质合成方面发生稳定性差异表达的过程 T 细胞通过增殖与分化, 使具有相同抗原特异性的细胞克隆得以扩增, 并且分化为具有不同功能的 T 细胞 (~)T 细胞的增殖刚刚由胸腺进入外周的成熟的 CD4 + 和 ω's+t 细胞处于细胞周期的 Go 期, 即静息状态 (resting state), 称为初始 T 细胞 (na ve T cells) 初始 T 细胞未经抗原剌激, 其特点是染色体紧凑, 胞浆极少, 几乎没有转录表达活动 初始 T 细胞在机体内循环流动, 由胸腺经血液循环进入二级淋巴组织如淋巴结中, 停留在二级淋巴组织, 如果未接触抗原, 它将通过输出淋巴营经胸导管再次进入血液, 此循环大约需要 12~24 h 这种 循环使初始 T 细胞有更多的机会接触外来性抗原物质 如果初始 T 细胞的 1CR- CD3 复 合物识别 APe 上的抗原肤 MHC 复合物, 在 CD2s - B7 产生的协同剌激信号以及 APe 产 生的 IL-l 等的共同作用下, T 细胞将会被激活, 由 Go 期进入 DNA 合成前期 G] 期 Go 期 的 T 细胞代谢活性很低, 仅表现出基础水平的卧业和蛋白合戚, 当细胞被活化从 Go 期进 入 G] 期后, 细胞代谢加速, 时也 RNA 和蛋白质合成明显增加 64 第激活的 T 细胞迅速进入细胞周期, 通过有丝分裂而大量增殖 多种细胞因子参与诱导 T 细胞分裂, 其中最重要者为 IL- 2 在 T 细胞激活后的 45 mi 口和 2 h, IL- 2 和 IL- 2 受体的 α 链即开始转录并表达, 而且协同剌激信号增加了 IL-2m 卧忱的半衰期, IL-2 转录的加强以及 IL-2 mrna 的稳定, 使其转录水平提高 IL- 2 受体 α 链与己存在的队 γ 链形成高亲和力的异源三聚体, IL-2 和此受体结合后, 启动受体介导的 Jak Stat 途径, 激活 Stat5, 作用于 IL-2 基因启动子, 直接使其发生转录激活 IL-2 还通过多种 PIK 参与的途径, 活化其他一些激酶, 最终使用期素依赖性激酶 (cyelin - dependent kinase, CDK) 家族中的 CDK2 活化, 并激活周期素 E, 周期素是使细胞进入分裂周期并从 G] 期转向 DNA 合成期 S 期的重要调节蛋白 T 细胞进入 S 期后复制每条 DNA 链的拷贝, 使细胞的增殖成为必然, T 细胞经过一个短暂的 DNA 合成后期 G2 期后, 进入有丝分裂期 M 期 T 细胞既分泌 IL-2, 又分泌 IL- 2R, 形成了自分泌活化扩增信号的正反馈放大, 使被活化的 T 细胞克隆得到快速的扩增 激活的 T 细胞每天分裂 2~3 次, 持续 4~5 d, 产生大量的具 有相同抗原特异性的 T 细胞克隆, 因此, 极大地增强了对特定抗原的免疫应答 研究表明 TH l 细胞与 TH 2 细胞亚群增殖的条件是有差别的 初始 T 细胞和 TH l 的增 殖绝对依赖 IL-2, 而 TH 2 细胞在 IL- 4 存在时, 没有 IL- 2 也能增殖 因此, 当 IL- 2 分泌减少时, 只有 TH 2 细胞对抗原剌激有反应 ( 二 )T 细胞的分化激活的 T 细胞经过有丝分裂大量增殖, 产生大量的子系细胞, 分化为记忆细胞和效应细胞 不同的效应细胞执行不同的功能, 如分泌细胞因子, 辅助 B 细胞 ( 激活的 ω'4+ T 细胞 ) 和细胞毒作用等 (CDs+T 细胞 ) 1. ωjt 细胞的分化 TH 细胞在未接触抗原之前, 为 THO 状态 当接受抗原剌激后, 在不同因素的影响下, 可分化为不同的细胞亚群 :TH l 细胞亚群和 TH 2 细胞亚群 THO 细胞的分化方向是决定机体免疫应答类型的重要因素, TH l 细胞倾向于分泌 IL- 2 IFN γ 和 1NF-~ 等, 与 DIH 反应 Tc 细胞的增殖 分化及 NK 激活 抗病毒 抗胞内病原体感染等有关, 主要介导细胞免疫应答 ;TH 2 细胞则倾向于分泌 IL-4 IL-5, IL-6 和 IL- lo 等, 与 B 细胞增殖 分化和促进抗体生成有关, 主要介导体液免疫应答 局部微环境中存在

72 第五章的细胞因子种类是调控 THO 细胞分化的关键因素, 另外, 抗原的类型和剂量 抗原提呈细 胞 激素等都可影响 TH 细胞的分化 ( 表 5-2) 表 5-2 促进 TH l 和 TH 2 细胞分化的因素 影响因素 THl 细胞 TH2 细胞 细胞因子抗原与 MHC 结合提呈抗原的 APC IL- 12, IFN γ, IL-18, IL-2 低剂量高密度, 高亲和力巨噬细胞, DCl IL-4, IL-lO, τgf 自, IL-2 高剂量低密度, 低亲和力 E 口 共刺激分子 激素 4-1BB, CD 40 雄激素 QX40, ICC 也 糖皮质激素, 雌 孕激素 (1) 细胞因子的作用通过对 IL-12 和 IL-4 及其受体缺陷鼠的研究表明 : IL-12 和 IL-4 分别为诱导 THl 和 TH 2 细胞分化的主要因子 许多胞内感染的病原体能直接诱导 APe 产生 IL-12, THl 细胞优先分化引起 THl 反应 ; 而一些引起 TH2 反应的病原体则直接 诱导产生 IL-12 抑制因子 研究表明, TH 2 细胞通过释放 IL- lo 和 1GF- ~ 可下调 THl 细胞的活性, 而 THl 细胞则通过释放 IFN γ, 抑制 THO 细胞向 TH 2 细胞转化 IFN - y, 1GF-~ 和 IL- lo 等主要是通过调节 APC 合成 IL-12 或调节靶细胞对 IL-12 的敏感性而起作用, IL-12 还可通过诱导 NK 细胞和 T 细胞产生 IFN γ 间接诱导 THl 亚群形成 0 IL-18 缺陷的小鼠 THl 反应缺陷, 但 IL-18 的主要作用是维持 THl 反应持续存在, 而不是直接诱导 THl 细胞的分化, 主要是通过促进 IFN γ, IL-2 和 GM-CSF 等 THl 细胞因子的产生, 增强 THl 介导的细胞免疫应答 (2) 抗原的影响目前认为, 低剂量抗原有利于 THO 细胞向 THl 分化, 高剂量抗原则促使 THO 细胞向 TH 2 分化, 并且抗原的结构亦影响 TH 细胞的分化 对岛 1HC 抗原肤 TCR 亲和力与 TH 细胞亚群分化的影响的研究表明, 抗原肤与 MHC 亲和力越大, 越有利于向 THl 分化, 亲和力越低, 则有利于诱导 TH 2 反应, 与抗原肤岛 1HC 亲和力作用相类似, T淋巴细胞的成熟 活化和分化65 抗原肤与 TCR 亲和力越大, 越有利于诱导 THl 反应, 反之则有利于诱导 TH 2 型反应 (3)APC 的作用各种 APe 向 T 细胞提呈抗原时, 产生 IL-12 的能力不同, 因而诱导 TH 分化的方向也不同 髓样树突状细胞是诱导 TH 细胞分化的重要的 APe 目前对配 亚群的认识还不是很清楚, 有学者提出可将其分为 I 型配和 H 型配, I 型 E 汇 (DCl) 的主要作用是通过分泌 IL-12 促使 THO 向 THl 分化, 通过 IFN-y, IL-2 的分泌介导 THl 型反应 ;II 型配 ( 目 :2) 其主要作用是促使 THO 向 TH 2 分化, 通过 IL-4 IL- lo 的分泌介导 TH 2 型免疫反应 巨噬细胞提呈抗原时, 在其产生的 IL-12 作用下, THO 细胞趋于向 THl 细胞分化 APC 表面的共剌激分子也可调节 TH 细胞的分化 目前认为, CD28 - B7 以及另外一些共剌激分子如 4 - lbb lbbl, OX40 - OX40L, CD 40 - CD 40 L, Iα)s - B7h 等都可能参与 TH 细胞的分化及反应 最近一些实验表明 :CD28 信号协同 4-lBB 可导致 TH 产生 IFN γ, 并证明这些 m γ 分泌细胞不表达 ω 到分子而呈现 THl 型反应 ;OX40 与 ω28 协同

73 一篇免疫学基础知识作用促使 TH 细胞分泌 IL-4, 促使 TH 2 细胞活化 ; 活化 T 细胞的 CD40 L 与 APC 表面的 ω 咄分子结合后, 可直接诱导 APe 产生 IL-12, IL-12 促进 TH 1 细胞的分化 ; 另外, m2s 的同源共剌激分子 Iα)s 可诱导 T 细胞分泌 IL- lo 1GF 日, 有利于向 TH 2 细胞分化 ( 的激素的影响糖皮质激素可增强 TH 2 细胞的增殖分化, 主要是靠直接诱导淋巴细 胞和 APC 产生 IL-4 和 IL- lo, 而抑制产生 IFN γ 和 IL-12 然而在高浓度糖皮质激素 的条件下, 能使淋巴细胞洛解, 抑制所有的细胞因子, 包括 TH 2 类细胞因子的产生 雌激 素和孕激素均能抑制 TH 1 细胞反应, 促进 TH 2 细胞反应, 相反, 雄激素则有利于 TH 1 细胞反应 另外, 儿茶酷肢, 以及前列腺素 甲状腺激素均能抑制 TH 1 细胞反应, 促进 TH 2 细胞 反应 TH 细胞分化为 TH 1 细胞亚群还是 TH 2 细胞亚群, 取决于 T 细胞在致敏初期接受何种剌激信号, 而不是因为这些细胞群具有特异性的细胞系 对于 TH 1 细胞与 TH 2 细胞可否相互转化, 一般认为, 在 TH 1 或 TH 2 分化早期可以相互转化, 随着外界剌激的不断重复, 这一过程将不可逆转 近年来, 又报道了 TH 3 亚型, 主要分泌 1GF 日, 可下调 TH 1 及 APe 等 免疫细胞的活性, 在诱导免疫耐受中起重要作用 2.CDs +T 细胞的分化 目前研究发现, 根据分泌细胞因子不同, ω's+t 细胞也可分为 66 第TeO Tel Te2 三种亚型 Tel 主要分泌 IFN γ 和 IL-2, 而 Te2 主要分泌 IL-4 IL-5 和 1 10, TeO 既分泌 IFN - /"IL- 2, 又分泌 IL- 4 近期实验表明, 鼠的 ms+t 细胞在体外能被 IL-4 诱导分化为 Te2 细胞, 并且, IL- 4 的存在促进了分泌 IL- 4 IL- 5 的细胞的生长, 并抑制 IFNγ 的产生 而且 12 的存在, 有助于 CDs+T 细胞向 Te2 细胞转化 初始 's+t 细胞的活化主要有两种方式 :TH 细胞依赖型和 TH 细胞非依赖型 (l)th 细胞依赖型与 ω's+t 细胞结合的靶细胞一般仅少量表达或不表达共剌激分子, 不能激活初始 C 口 R+T 细胞, 而需要 APe 及 m4 +T 细胞的辅助 Stuhl 町等提出由 J CE ω'4+ TH 细胞和单个 APC 组成的细胞丛的概念 J CHJ 的表位及 TH 细胞的表位由同一 APe 提呈 初始 TH 细胞受 APe 提呈的抗原信号剌激后, 膜表面大量表达 ω 咄分子的配体, 与 APe 表面的 ω 咄分子结合, 可引起 APe 活化并分泌大量的 IL IL 12 又可作用于 TH 细胞及 OL, IL-12 诱导 TH 细胞向 TH 1 细胞分化, 促使 TH 1 细胞分泌 IFNγ 和 IL-20 IFNγ 和 IL-2 可通过上调阳 -IC 分子及共剌激分子在 APe 上的表达, 促进 OL 的活化 活化的 OL 产生大量的 IFN γ, 可诱导 APC 分泌 IL CDs+OL '4+ TH 细胞和 APe 之间的交叉激活实现了由初始 OL 向效应 OL 的分化 (2 )TH 细胞非依赖型如某些病毒感染或剌激物诱导配活化, 上调岛 1HC 分子及共剌激分子的表达, 可直接剌激初始 CDs+T 细胞合成 IL- 2, 促使 ωjt 细胞自身增殖并分 化为细胞毒 T 细胞, 而不需要 TH 细胞的辅助 3. 记忆性 T 细胞被抗原活化的 T 细胞进一步分化, 成为效应 T 细胞和记忆性 T 细胞 记忆性 T 细胞是在抗原剌激下寡克隆扩增的具有特异性识别抗原的长寿群 T 细胞, 参与增强性的再次免疫应答 一般认为, 初次应答中部分细胞分化为记忆细胞, 这与 1CR 亲和力的成熟有关, 而亲和力的成熟涉及细胞分裂 在初次应答过程中, 增殖状态的高亲和力前体记忆细胞在分

74 第五章化为静止状态的记忆细胞之前, 必须经历一个效应阶段 大多数表达低亲和力 1CR 的效应细胞发生快速的细胞凋亡, 只有高亲和力 1CR 的 T 细胞才能转化为长寿的静止的记忆细胞 在初次应答的终末阶段, 抗原浓度己降到低水平, 只有高亲和力 1CR 的 T 细胞才能接受低浓度的抗原信息, 并优先存活而扩增 高亲和力 1CR 的 T 细胞与低浓度抗原接 触可上调凋亡分子 bcl- 2 的表达, 从而避免了调亡的发生, 存活为特异的记忆性 T 细胞 滤泡树突状细胞对于记忆 T 细胞的形成具有重要意义, 它可保留抗原剌激, 并使 T 细胞有 可能持续的与低水平抗原接触, 从而有利于 T 细胞的存活 长期记忆性的维持还需要细 胞因子的参与, 或使 T 细胞与某些基质细胞接触, 以间歇性剌激 T 细胞 虽然记忆性 T 细胞与未活化的初始 T 细胞一样处于生长周期的 Go 期, 但它的粘附分 子及某些细胞因子受体表达水平较高, 由 Go 期再次活化而进入 G] 期的条件远没有未活 化细胞那样严格 区分初始 T 细胞与记忆性 T 细胞, 主要靠细胞表面分子 ω'45, 初始 T 细 胞表达高分子量的 ω'4s RA, 而记忆性 T 细胞表达低分子量的 CD4S RO o 参号文献 1 龚非力. 医学免疫学. 北京 : 科学出版社, fV 同京, 章廉.TH 类细胞极化群体的基础与临床. 北京 : 军事医学科学出版社, Goldsby R.A,KindtT.J., Osbome B.A. Immunol 唱 T 5th Edition. New York: Garland Publishing, Richard A. Goldsby, τbomas J.Kindt, Barbara A. Osborne, et a!' Immunology. 5th Edition. W H Freeman & 仇, Ro 叽 Brostoff, M 仕.Immunolc 町. 6th Edition. [ s.lj: Harcourt Asia Pte Ltd, Abbas A.K, Lichtman A. H, PoberJ. S. Cellular and Molecular Immuology.4th Edition.Philadelphia: W. B.Saunders mpany, 2000 T淋巴细胞的成熟 活化和分化67

75 阶一篇免疫学基础知识男B 淋巴细胞 (B lymphocyte) 简称 B 细胞, 由哺乳动物骨髓或鸟类法氏囊中淋巴样前体 旱B 淋巴细胞的产生 活化和分化且细胞分化成熟而来 从前体 B(pro - B) 细胞到最终的效应细胞浆细胞和记忆细胞, 经历 了三个阶段, 即成熟 B 细胞 (mature B cell) 的生成阶段 抗原性激活 B 细胞阶段以及活化 的 B 细胞分化为效应细胞阶段 B 细胞在骨髓中发育成熟后, 进入外周血, 在未接触抗原 时, 称为初始 B 细胞 (na ve B cell) B 细胞在骨髓的发育 哺乳类动物的 B 细胞在胚胎早期于肝脏中发育成熟, 人类的前体 B 细胞最早出现于 娃振第 8 周的胚肝中, 正值造血干细胞由卵黄囊向肝脏迁移之时 B 细胞在胚胎中晚期 直至终生于骨髓中发育成熟 B 细胞在骨髓中的发育是抗原非依赖性的, 从多能造血干 细胞开始分化, 经历淋巴系干细胞 祖 B 细胞 (pro- B) 前 B 细胞 (pre - B) 未成熟 B 细胞 (imnature B cell) 和成熟 B 细胞几个阶段 在此过程中经历了 k 基因的重排以及胞内和 细胞表面结合标志物的表达等, 可区分 B 细胞在骨髓内发育各个阶段, 最终产生对抗原 有应答能力的成熟 B 细胞 随着 B 细胞的发育成熟, 与 k 基因重排相关的一些蛋白的基 因及其产物也发生变化, 这些变化也可用于区分处于不同发育阶段的 B 细胞 如同 T 细胞在胸腺的发育过程, 祖 B 细胞在骨髓中必须经历阳性选择与阴性选择过 程, 才能发育为成熟 B 细胞 通过阳性选择, 使经历 B 细胞表面功能性 k 基因重排 ( 特别 是重链 μ 链的重排 ) 的细胞存活 通过阴性选择, 骨髓内凡是能与自身 Ag 反应的 B 细 胞, 其成熟均被阻滞, 该细胞的 BCR 需重新编辑, 如编辑成功, 则继续发育成熟, 如编辑不 成功, 则发生克隆清除或诱导形成无能状态 另外针对隐蔽自身 Ag 反应的 B 细胞克隆 得以存活, 此为克隆忽视 ( clonal 唱 1orance) 在外周免疫器官中, B 细胞的分化发育同样发 生阳性选择 ( 通过体细胞超突变, 形成高亲和力抗体的细胞 ) 和阴性选择 一. 免疫球蛋白的基因重排与 B 细胞的发育 19 基因重排发生于胚肝及骨髓中静止的 (Go ~Gl 过渡区 ) 未成熟 B 细胞内 随着 B 细胞的发育成熟, lg 的基因进行有序地重排, B 细胞系的发育是由于 k 重链及轻链基因 进行连续有序重排的结果 19 基因含有多个相互分离的可变区 (variable, V) 连接区 (joi 日 1 鸣,J) 和一个或数个恒定区 (constant, C) 片段 在面 1 基因, V 区和 J 区之间还存在着多变 区 (diversity, D), 在重组酶 (recombinase) 的参与下, lg 基因发生单个 V- J 或 V-(D)-J 片 段的体细胞重排 (somatic rearrangement) 此过程是位于重排片段之间的 DNA 顺序发生缺 失, 并非所有发生重排的 19 基因均能编码抗体分子, 只有当 V 区和 C 区的读码框在重排 后仍得以维持, 才可称为生产性重排 由此而形成的功能区基因可编码一个独特的 k 分 子的 V 区 重组后的基因转录成 m 卧址, 通过剪接去除 V-D-J 片段和 C 区之间的非编 码顺序, 产生成熟的 m 卧恤, 后者翻译形成蛋白质 忏所菊68 第口

76 第六章机体通过 k 中 V-D-J 片断之间的不同组合, 产生大量的变异性, 这种变异性通常称为组合变异性 此外, V- J 片段间还可通过剪辑的插入或缺失产生非胚系编码的核昔酸序列 重组的 19 基因, 其 V 区还可发生体细胞基因突变, 这些均可导致抗体分子的多样性 在 B 细胞分化发育过程中, 其 k 基因节段互相靠近, 重新排列, 形成功能性 k 基因单位 其中, 先进行重链基因重排, 后进行轻链重排 其重链中先进行 D- J 基因重排, 然后进行 V-D-J 基因重排 ; 轻链中先重排 κ 后重排入 B 细胞在骨髓内发育各阶段的变化主要表现在膜表面标志的改变及 19 基因的顺序性重排过程 (~) 祖 B 细胞祖 B 细胞首先发生 k 重链 DH JH 的重排, 轻链仍处于胚系 (germ line) 状态, 但在重链己重排而轻链尚未重排的祖 B 细胞与前 B 细胞内出现两种特殊的基因归和 Vpre - B 基因, 它们相互间并不发生重排, 分别编码口和 Vpre- B 蛋白, 两种蛋白以非共价键连接, 形成假轻链或称替代轻链 (surrogate light chain, SLC) ( 二 ) 前 B 细胞早期阶段的前 B 细胞体积较大, 即大前 B 细胞, 并处于活跃分裂状态, 发生重链 VH DHJH 基因重排 当一条染色体上的重链基因 VH DH 山进行重排后, 将关闭另一条染色体上的重链基因重排, 导致这两个发生重排的重链基因出现等位排斥现象 如果第一条染色体上的重链基因重排失败, 则另一条染色体上的重链基因开始重 排 VH DHJ H 基因发生重排后, 产生的 fl 重链与替代轻链形成的 19 样复合物表达于细胞表面, 称为前受体 (prereceptor), 即 pre- BCR, 与其他信号传递分子如 B29 和 mb-1 相相联而介导信号分子的传递 Pre- BCR 与配体分子相结合, 可传递促进细胞继续发育的信号, 以保证前 B 细胞的增殖, 该信号可一过性地抑制重组活化基因 RAG - 1 RAG - 2 (recombination activating genes 1 and 2) 的表达, 抑制重链 μ 基因的继续重排, 但促进轻链 (κ 或川的重排与表达 晚期前 B 细胞轻链 VJ 基因发生重排, 先对编码 19K 链的基因进行重排, 如果重排不成功,lgA 基因将被重排 在小鼠, 表达 κ 轻链的 B 细胞与表达 k 轻链的 B 细胞数量之比大约为 10: 1, 且入链与 μ 链配对的效率较低 如果两轻链的基因重排均不成功, 则该细胞不能继续发育成熟而被淘汰 随着 B 细胞的发育进展, 归和 Vpre - B 基因的表达被关闭, pre- BCR 亦被 B 细胞所表达的 k 所代替, 从而发育为未成熟 B 细胞 只有重链和轻链基因两者的有效重排才能导致 B 细胞的继续分化, 其中任何一方重排失败都会导致这些细胞的调亡, 即被阳性选择 同时, 由于 k 基因 V D, J 片断的重排具有随机性和独立性的特点, 故所表达的 BCR 具有独特的抗原特异性 ( 三 ) 未成熟 B 细胞骨髓中的未成熟 B 细胞表面表达 slβf 和 19α 国分子, 共同组成 BCR 复合体并具有抗原识别能力 若此时受到骨髓基质细胞表面抗原或骨髓中的可洛性抗原的剌激, 会导致 s 剧和 ω'4s R 分子表达下调, 使 B 细胞处于受抑制状态, 不能进一步分化成熟 这可能是自身反应性 B 细胞克隆发生流产, 形成 B 细胞耐受的机制之一 而对自身抗原无反应的 B 细胞克隆将继续发育成熟, 即被阴性选择 在小鼠, 骨髓每天大约有 5 X 10 7 个新的细胞产生, 但只有 5 X 10 6 个 B 细胞进入外周成熟 B 细胞库, 这就说明有 90% 的 B 细胞在离开骨髓之前就被清除死亡, 一般认为, 未成熟的 B 尚须经过上述阴性选择过程, 才能最终发育成为成熟细胞, 由骨髓进入脾脏和外周淋巴结 ( 四 ) 成熟 B 细胞 B 细胞的最终成熟有待于 slgd 的表达 此为成熟 B 细胞发育阶段, 此阶段的发育特点为膜开始表达 19D Fc 受体和补体受体, 膜表面同时表达胁 1,lgD 的 B淋巴细胞的产生 活化和分化69

77 一篇免疫学基础知识70 第细胞才认为是完全成熟的 B 细胞, 这种 B 细胞可以对特异性抗原的剌激起反应 所有发育至此阶段的 B 淋巴细胞都是在无特异性抗原的剌激下进行的, 故称为抗原非依赖性发育期 成熟的 B 细胞进入血液及外周淋巴组织后, 在外来抗原的剌激及 T 细胞的辅助下进一步分化发育 二.B 细胞发育的骨髓造血微环境 B 细胞在骨髓中的发育与骨髓造血微环境 (hemopoietic inductive microenvironent, HIM) 密切相关, 骨髓的基质细胞以及细胞因子和粘附因子与 B 细胞发育密切相关 基质细胞包括巨噬细胞 血管内皮细胞 纤维母细胞 前脂肪细胞和脂肪细胞等 正常小鼠的前体 B 细胞在体外的增殖需要与基质细胞接触, 该基质细胞将会分化成前脂肪性纤维母细胞, 当这些前脂肪细胞发育成熟到脂肪细胞时, 便失去了支持前 B 细胞生长的能力 不同类型的基质细胞特异的与不同类型的前体细胞相互作用 基质细胞可分泌多种细胞因子和细胞外基质, 前者包括 IL-4 IL-6 IL-7, M- GSF G-CSF sσ 1GF-~ 等, 后者包括纤维粘连蛋白 胶原蛋白基层粘连蛋白成分 其中, IL 7 对 B 细胞的分化发育最为重要 在分化早期, B 细胞的发育需与基质细胞直接接触, 在后期阶段, 则仅依赖于基质细胞所分泌的细胞因子 祖 B 细胞通过细胞表面粘附分子 ( 如祖 B 细胞表面 \!LA 斗和基质细胞表面的 VC 剧 1) 与基质细胞紧密接触, 之后, 基质细胞表面的膜型干细胞因子 (stem cell factor, Sσ) 与 B 细胞表面的酷氨酸激酶 c - Kit 结合, 激活 c - Kit, 传导活化信号, 祖 B 细胞进一步分化为前 B 细胞, 并表达 IL-7 受体 在基质细胞分泌的 IL-7 的作用下, B 细胞继续增殖分化, 并诱导前 B 细胞膜表面粘附分子表达下调, 使其与基质细胞分离, 在此阶段, 前 B 细胞勿需与基质细胞直接接触, 但仍需 IL-7 等细胞因子促进其生长发育 二.B 细胞分化发育的转录调节 B 细胞在骨髓中的分化发育除了受骨髓基质细胞 细胞因子及 pre - BCR 的调节之外, 还受转录因子的调节, 如 E2A 早期 B 细胞特异性活化蛋白 (early B cell factor, EBF) B 细胞特异性活化蛋白 (B cell specific activator protei 日, B 创刊和 Sox-4 等 E2A 缺陷小鼠不能表达 RAG-I, 不能进行 DJ 基因重排和表达口基因, E2A 不仅在 B 细胞分化的早期起重要作用, 而且在 B 细胞分化晚期也起调节作用 EBF 和 E2A 缺陷鼠表现相似的 B 细胞发育缺陷, 是 B 细胞早期发育的重要调控分子 敲除 Pax- 5 基因 ( 编码 BSAP) 的小鼠, 可引起 B 细胞分化停止 BASP 参与调节归 VpreB, Iblk, lg - J 链基因的转录, 除了调节早期 B 细胞发育外还可调节晚期 B 细胞发育 另外, NFKB 也可调节 B 细胞初期分化的 19 轻链基因 它在 pre - B 阶段才出现 NFKB 还可通过调节生长因子产生的信号抑制 B 细胞前体 B 细胞 k 的基因重排还受 RAG-I, RAG- 2 以及末端脱氧核糖核酸转移酶 (ter minal deoxyribonucleotide transferase, TdT) 的表达调控 19 重链基因 VDJ 的重排依赖于重组活化基因 RAG - 1, RAG - 20 RAG - 1 和 RAG-2 任何一方发生紊乱都会导致 B 细胞的分化障碍 RAG-I 基因缺陷的小鼠, 其 T B 细胞分化停止于早期阶段, lg 基因均处于胚系状态 RAG-I, RAG- 2 基因在祖 B 细胞和前 B 细胞阶段时即被激活, 当 B 细胞成熟并完成 k 基因重排后失去活性

78 第六章TcIT 是祖 B 细胞内的一种核蛋白, 尽管 TdT 对 B 细胞发育是不必要的,{E! 可通过模板 非依赖方式将核昔酸转移到 19H 链而增加 k 的多样性 当分化至前 B 细胞阶段, TcIT 不 再表达 四.B 细胞亚群 B 细胞可分为 B-1B 细胞和 B-2B 细胞两个亚群 他们出现于胚胎中, 表达胁 f 但 很少表达 19D o 进入外周的 B 细胞具有异质性, 根据 CDs 的表达与否, 可把 B 细胞分成 B-1 细胞和 B-2 细胞两个亚群 但 CDs 并不是 B-1 细胞不可缺少的部分, CDs 基因缺陷的小鼠仍 可产生 B-1 细胞 B-1 细胞属于非特异性免疫细胞, B-2 细胞即通常参与体液免疫应 答的 B 细胞 B-1 细胞在来源 分布 表面标志和免疫功能等方面具有不同于 B2 细胞的 特点 B-1 细胞表面表达 CDs m 胁 1, 即使成熟时也不表达 migd o B-1 细胞在个体发育过 程中出现早于 B-2B 细胞, 仅占 B 细胞的 5%0 B-1 细胞产生于个体发育早期, 在胚胎 时期, B-1 细胞起源于骨髓中的干细胞, 在出生后, B-1 细胞由骨髓外的前体细胞分化而来, 其发生不依赖于骨髓细胞 B-1 细胞的分布在个体发育的不同时期稍有差别, 胚 胎期主要分布于大网膜和肝脏内, 新生儿期分布于脾脏 腹腔, 成年后 B-1 细胞在次级淋巴组织如脾 淋巴结中少见, 但它是腹膜和胸膜中的主要 B 细胞 B-1 细胞产生后, 成为具有自我更新能力的长寿细胞 B-1 细胞极少发生体细胞超突变和 19 类别转换, 所以产生的抗体亲和力较低, 亦无记忆性, 产生的抗体多为胁 1 0 {E! B-1 细胞原受体和所产生的抗体能以相对低的亲和力与多种不同的抗原表位结合, 这个现象称为多反应性 B-1 细胞的抗原识别谱较窄, 主要针对属于 TI -2 抗原的多糖类物质, 尤其是某些菌体表面共有的多糖抗原 肠道固有层与腹膜腔中的 B 细胞大部分为 B-1 细胞 由于 B-1 细胞倾向于产生抗细菌多糖抗原的抗体及倾向于定位在肠道和腹膜腔, 所以其在抗细菌感染的粘膜免疫应答, 尤其是对防止肠道细菌感染的粘膜免疫应答有重要作用 然而 B-1 细胞在机体对蛋白质抗原的免疫应答中无重要性 B-1 细胞还可产生多种针对自身抗原的抗体, 如类风湿因子和抗 ssdna 的胁 f 类, 从而参与某些自身免疫病的发生 B淋巴细胞的产生 活化和分化71 第二币 B 细胞的 )rj 化 B 细胞在骨髓发育成熟后进入血循环, 迁移至周围免疫器官中定居, 构成外周 B 细胞库 这些细胞大多是处于休止状态 未接触抗原的初始 B 细胞 当它们接触抗原剌激后 被活化, 进而增殖分化为效应 B 细胞, 其中大部分为可分泌特异性抗体的浆细胞, 小部分 停止分化而成为记忆性 B 细胞 如果初始 B 细胞在外周没有接受抗原剌激, 将会在几周内凋亡 一.B 细胞对抗原的识别 B 细胞在骨髓中产生并转移到外周后, 要经历一个简短的非成熟期, 此时它们极易因接触抗原而失活 在外周经过一段较短时间后如果接受来自抗原或其他类型细胞的剌激信号, B 细胞就会获得一种长期的再循环表型, 并且有能力产生免疫应答 根据所接触

79 一篇免疫学基础知识的抗原不同, B 细胞的活化有两种途径 : 一种需要 TH 细胞的辅助, 所接触的抗原为 E 抗 原, 一种可不依赖于 TH 细胞, 所接触的抗原为 TI 抗原 ( 一 )B 细胞对 1D 抗原的识别 B 细胞通过 B 细胞抗原受体 BCR 复合体识别抗原 O BCR 复合体由膜免疫球蛋白 ( 趾 llg or mlg) 和信号传导结构 19a 19~ 藉非共价键结合而成 Smlg 的重链 (SmlgH) 末端有一跨膜区和胞内区, 其胞内部分都较短, 从只有 3 个氨基酸残 基 ( 如 Sm 胁 f 和 SmlgD 的胞内区都是赖氨酸蝴氨酸赖氨酸 ) 到有 28 个氨基酸残基 ( 趾 d 届亚类 ), 因此, 需其他辅助分子才能把信号传导入胞内 不同发育和分化阶段的 B 细胞, 其 S 址 g 类别各异 : 不成熟 B 细胞表达 S 址 β1, 成熟 B 细胞表达 S 址 β4 趾 llgd, 接受抗 原剌激后, B 细胞表面的 S 世 gd 很快消失, 记忆 B 细胞可表达 SmlgG S 址 ga 或 SmlgE, 但不 表达 S 址 gd o 抗原与 Sr 址 g 的可变区结合, 产生 B 细胞活化的第一信号, 由 19α19~ 将第一 活化信号转导入胞内 ( 二 )B 细胞对 TI 抗原的识别根据激活 B 细胞的方式不同, 可将 TI 抗原分为两类 : TI -1 抗原和 TI-2 抗原 TI -1 抗原常被称为 B 细胞丝裂原 除了与 BCR 结合之外, 在 高浓度时, 还能与丝裂原受体结合, 非特异性多克隆地激活 B 细胞 TI -2 抗原多为细菌 胞壁与英膜多糖, 是具有高度重复表位的聚合分子, 它的重复表位可使 BCR 发生广泛的 交联, 可特异性的激发 BCR 有效持续的信号传导功能而引起 B 细胞活化 TI - 2 抗原不 同于 TI -1 抗原, 它可活化成熟 B 细胞, 但使未成熟 B 细胞失活 ; 而 TI -1 既可活化成熟 B 72 第细胞, 又可活化未成熟 B 细胞 一般情况下, 由于无 T 细胞辅助, TI 抗原不能诱导抗体类型转换 抗体亲和力成熟和记忆性 B 细胞形成, 即无记忆性, 这些均需 TH 细胞的辅助 对于所有类别的 TI 抗原来说, B 细胞产生抗体应答都需要细胞因子参与, 尽管其来源可能是非淋巴细胞, 如巨噬细胞等 而且活化的 B 细胞可分泌 1L -1 1L- 2 1L -4~ 1L -7,1L 10 1L -12 1NF α 1NF-~ IFN - /"GM - CSF 等一系列因子, 这些因子作为自分泌推动 B 细胞增生和分化 二.B 细胞活化信号的转导 E 抗原对 B 细胞的活化需要 T 细胞的协助 B 细胞与 T 细胞表达的多种粘附分子及其相应配体相互作用, 构成 B 细胞激活的第二信号 通过第一信号和第二信号的共同作用以及多种细胞因子的参与, B 细胞活化进而增殖分化为浆细胞或记忆细胞 抗原与 BCR 特异性结合后, 激活 BCR 复合物的跨膜信号传导, 即第一信号, 诱导 B 细胞活化的早期事件, 包括岛任 -[crr 类分子表达增高, 细胞周期自 Go 期进入 G] 期, 而且如有抗原的强烈剌激存在, 还会发生细胞增殖 BCR 与抗原的交联除启动信号传导外, 还可使 BCR 抗原复合物内化, 来参与 B 细胞的抗原提呈作用 内化后的 BCR 抗原肤复合物经胞内的酶解加工处理, 以岛 1H C 多肤复合物形式表达于细胞膜上, 供 TH 细胞识别, 活化的 TH 细胞表达多种细胞表面分子, 后者与 B 细胞受体相结合, 提供 B 细胞的活化信 号, 即第二信号 该途径活化的 B 细胞进一步增殖并最终在淋巴器官的 T 细胞区中分化 成为浆细胞, 或者是在初期活化后迁移到滤泡区并开始形成生发中心 在生发中心, B 细胞激活 k 基因的体细胞突变, 然后再经过与抗原结合有高亲和力的严格选择过程, 最终产生可分泌高亲和力抗体的记忆 B 细胞和寿命较长的浆细胞 (~ )BCR 复合物介导的跨膜信号传导 BCR 复合物对信号的传导主要依赖于组成

80 六章BCR 复合物的 Igα( 叩 α) 和 19~(m79 日 ) 0 Igα 和 Ig 自由 mb-1 和 B29 依次编码, 以二硫键相连成异源二聚体, 再与 BCR 以非共价键结合 Igα 和 Ig~ 与 m 具有结构相似性, 都含有胞外区 跨膜区和胞浆区 Igα 的胞内区含有 61 个氨基酸残基, Ig~ 含有 48 个氨基酸残基, 它们足以介导与信号传导元件的相互作用, 并且都含有与 TCR 复合体中 ω3 的胞内结构域序列同源的 ITAM 序列, 即 YXXL ~-8 YXXL I 保守序列, 序列中的 X 为任意氨基酸 抗原诱导 BCR 交联后,Igα 和国的两个 n: 丛 f 的酷氨酸磷酸化, 双磷酸化的 IT, 丛 f 可被市 l 王家族 ( 胞浆内的一组蛋白酶氨酸激酶 ) 的 Sf 丑结构域以高亲和力识别, 从而使勘 k 结合到 BCR 复合体上, 并使岛 rk 结构域中的 Y518 和 Y519 磷酸化而使之激活 市 k 的结合是 BCR 介导信号传导的关键事件, 可激活下游信号传导通路 另外,Sre 家族激酶 (T 细胞主要为 Lek, B 细胞主要为 Lyn, Blk, and Fyn) 也能够结合到磷酸化的 ITAM 上, 与鸟 rk 家族酷氨酸激酶之间, 存在着明显的协同作用, 例如 Sre 基因缺陷的 Df40B 细胞,Syk 的活化明显降低, 但还残存一部分信号传导功能, 而敲除鸟 rk 基因会导致该类细胞中信号传导功能的极度缺陷, 这说明市 k 的激活并非严格依赖 Sre 激酶 ( 二 )B 细胞活化的共受体 B 细胞表面的 CD19 CD21ω 剖 Leu13 形成 B 细胞活 化的共受体 ( 图 6-1) 其中, ω19 可直接 与 BCR 发生联系, 也可与其他三种分子构 成信号传导复合体 ω19 是特异性地表达于 B 细胞表面的糖蛋白, 其胞浆区长, 其中丝氨酸 苏氨酸和 9 个酷氨酸残基上含有可磷酸化位点 ω19 分子中的酷氨酸残基在抗原与 BCR 结合后迅速磷酸化, 与 IgαIg~ 相关的 Fyn Lyn 等酷氨酸激酶和 PI- 3K 相结合, 从而加强膜信号传导 ω 丑 (CR2) 的胞浆区恨短, 其胞外区能与 町 nll yn 补体结合 人 CD21 的胞外区能结合 Ie3d 图 6-1 B 细胞共受体示意图 C3d 及 C3dg ω81 属 4 次穿膜超家族成 员, 这个家族成员蛋白质的 N 端与 C 端均在胞内 在高剂量抗原存在时, 足够数量的 ω19 分子与 BCR 结合可直接激活 B 细胞, 在抗原 剂量较低时,CD19 与 BCR 连接的数量有限, 需借助 ω19 CD 21 CD 81 Leu13 复合物的参与 : 抗 原除与 BCR 结合外, 还可被补体包被后与 CD21 结合, 藉此使 ω 19 21ω81 Leu13 复合物 与 BCR 相连, 即将 ω19 与 BCR 靠近, 以加强抗原诱导下的信号传导, 促进 B 细胞的活化 另外, CD32 X 才第一活化信号转导起负调节作用, CD32 是 IgGFe 段的低亲和力受体 B 细胞表达的 m32 分子即 FeγR II B1, 后者胞内区有酷氨酸相关的免疫受体抑制序列 (immunoreeeptor tyrosine - based inhibitory motif, ITIM) 含 I 剧的免疫复合物经由 FeγR II B1 与 B 细胞结合, 导致 BCR 和 FeγRII B1 的共聚集 ITIM 中磷酸化了的酷氨酸募集蛋白质酷氨 酸磷酸酣酶 SHP -l( PIP1e), 使 Ig α Ig~ 胞内区的酷氨酸残基去磷酸化, 或使参与 Ig α Ig~ 相 B淋巴细胞的产生 活化和分化73

81 一篇免疫学基础知识效应是抑制 BCR 介导的细胞增生 母细胞化和抗体产生 ( 三 )TH 细胞对 B 细胞活化的辅助作用 B 细胞的激活有赖于 T 细胞辅助 TH 细胞 提供 B 细胞活化的第二信号 TH 细胞至少以两种方式辅助 B 细胞 : 一是经由 B 细胞与 TH 细胞直接接触, 二是 T 细胞产生的细胞因子的作用 74 第初始 TH 细胞特异性识别 APe 所提呈的抗原肤 MHCII 类分子复合物而被激活, 在 外周淋巴组织的 T 细胞区增殖, 并分化为效应 TH 细胞 B 细胞作为重要的 APe, 通过双 信号活化 T 细胞 效应性 TH 细胞经诱导表达多种膜分子, 其中, 最重要的是 CD40 L o 活化 的 TH 细胞表面的 CD40 L 与 B 细胞表面表达的 CD40 相互作用, 向 B 细胞传递重要的活化信 号 另外, CD40 在 B 细胞的 k 重链转换中起十分重要的作用, CD40 缺陷会引起高胁 f 综合 征 CD40 L 在与 ω 咄结合, 提供活化信号的同时, 可使 B 细胞上调 B7-1 B7-2 的表达, 反过来增强 B 细胞的共剌激活性 在对 B 细胞的辅助作用中, 其他胞膜分子间的相互作用如 B7 - CD28 LFA-1- ICAM 1, CD 2 - CDS8 等也很重要 活化的 TH 细胞 ( 主要是 TH 2 细胞 ) 能分泌多种细胞因子, 如 1L- 4 1L -5,1L 等, 作用于 B 细胞, 另外, 巨噬细胞分泌的 1L -1 也参与 B 细胞的活化 如 1L- 4 可促 进 B 细胞的活化与分化, 诱导 B 细胞产生 IgG 1 与 19E ;IL-5 可促进小鼠 B 细胞生长与分 化 ;IL- 6 则是 B 细胞促分化因子 细胞因子的参与是 B 细胞充分活化和增殖的必要条 件 B 细胞与辅助其活化的 T 细胞所识别的为同一抗原, 但在体外实验发现, TH 细胞也 能藉细胞 细胞直接接触及分泌的细胞因子辅助其他抗原致敏的旁邻 B 细胞 (bystander B cell), 这种辅助成为 " 旁邻辅助 " ( 四 )BCRl 舌化信号胞内传导的主要途径 BCR 交联引起的酷氨酸激酶活化, 可触发 一系列信号事件 其中主要的信号传导途径有磷酸肌醇途径 Ras 途径 PI3 -K 途径等 1. 磷脂肌醇途径活化的协等激活 PLCγ1 和 PLCγ2, 这两种 PLCγ 的异构体均可裂 解 PIP3 成 IP3 和 DAG, 分别启动两个信号传导途径, 其传导过程同 T 细胞活化 2. Ras 途径目前认为,BCR 主要通过激活时 k 激酶, 活化适配蛋白 She, She 结合到 Grb-2 上, 后者又与核昔交换因子 rrffis1 和 rrffis2 结合, 形成蛋白复合物, 通过 Grb - 2 的 Sf 丑结构域而结合到 Ras 上 sos 通过核昔转移作用诱导 Ras 与 GIP 结合, 使之活化, 并激活 Raf 从而触发激酶的级联反应, 导致 MAPK 成员 ERK1 和 ERK2 的激活 MAPK 的 下游靶分子包括转录因子 ( 如 Elk -1) 和丝苏氨酸蛋白激酶 RSK 另外, 因 <C 依赖的途径 也可诱导 Raf 激活 使 Ras 失活 BCR 信号也能够导致 GIP 酶活化蛋白和 RasGAP 的磷酸化, 它们又能 3. PI3 - K 途径 BCR 激活可使 P I3 -K 的酷氨酸快速磷酸化, 磷酸化斗, 5 二磷酸肌 醇 (PIP2 ) 产生 3, 斗, 5 三磷酸肌醇 (PIP3 ), BCR 诱导的酷氨酸磷酸化的另一个靶标是 5 磷酸肌醇酶 SHIP( 含 S 凹的肌醇磷酸酶 ), 它可将 PIP3 转化为 PI(3, 4 )P 2 0 PI3 - K 和 SHIP 产生的磷酸肌醇作为第二信使, 启动信号传导 二. 基因表达的 BCR 调控 BCRl 舌化信号经上述途径传导, 产生一系列激酶磷酸化级联反应, 使 B 细胞内转录

82 第六章口因子活化, 诱导对 B 细胞存活 增殖及与 TH 细胞相互作用等功能重要的基因转录 (~)NF-AT 是最早发现于 T 细胞的核转录因子家族, 后来发现也表达于 B 细胞等 多种免疫细胞 BCR 激活的 B 细胞能使 NF-AT 快速脱磷酸化, 可能是 Ca 2 + 钙调蛋白话 化的丝苏氨酸蛋白磷酸酶钙神经碱的直接反应, NF-AT 磷酸化后被转运至胞核并结合 DNA o NF-AT 的活化有赖于 BCR 激活导致的细胞内游离钙离子升高 目前对 NF-AT 在 B 细胞内调控的基因还不是很清楚, 但免疫抑制剂环抱菌素 A 和 FK 通过抑制钙神经碱而发挥作用, NF-AT 是这些物质的主要靶目标 由于这些免疫抑制剂阻断 BCR 诱导的 B 细胞增殖, 所以认为 NF-AT 在调控对 B 细胞的增殖极为关键的一种或多种基因中发挥重要作用 ( 二 )BCR 激活也会使转录因子 NF- KB) 舌化 NF-KB 最初是因其结合 19K 基因座内基因内区增强子的 KB 位点而被发现的, 后来发现, 它在许多免疫反应和应激反应中发挥关键作用 在非激活状态, NF- KB 以二聚体形式存在于细胞之内, 大多以一个 p50 亚基和一个 c- Rel 或 RelA 所形成的异二聚体形式存在, 并与抑制性亚基 IKB 结合 B 细胞的 激活导致 IKB 蛋白激酶的活化, 从而磷酸化 IKB, 触发蛋白酶体介导的该抑制物的降解 这样 NF-KB 活化并转位至胞核, 结合 DNA, 通过 c - Rel RelA 亚基提供的相互活化功能 而活化转录 ( 三 )BCR 激活也活化转录因子 CREB CREB 最初是因为其在介导第二信使 camp 诱 导的转录事件中发挥作用而被发现的 CREB 持续性表达和存在, 并结合到其 DNA 同源 位点 camp 结合反应元件 (camp response element, C 旺 ) 上 在许多细胞中, camp 水平升 高可使 CREB 活化并与转录共活化蛋白 CPB 相互作用 在 B 细胞中, CREB 似乎对 camp 水平升高无应答, 但却会因 BCR 激活而活化 该活化状态也涉及到 Ser133 的磷酸化, 而 该磷酸化是依赖 PKC 的 在 JunE 基因启动子区发现了一个 C 旺位点, 该基因是 BCR 激 活 B 细胞内的一个早期反应基因 CREB 的显性 隐性形式阻断, 是基于 J 山 ill 启动子的报 告基因的诱导, 所以 CREB 有可能参与了该早期反应基因的活化 ( 四 )B 细胞通过 RasMAPK 途径激活 SRFTCF 血清反应因子 S 盯 ( serur 丑 response factor) 和功能依赖 S 盯的三重复合物因子 TCF( ternary complex factor) 由 MA. 匹激 j 舌, 并结合于 血清反应元件 (serum response element, SRE) 0 SRE 元件是在 BCR 活化的早期反应基因鸣 1 和 c - fos 上发现的 鸣 1 基因在其启动子区有 6 个 S 旺样元件, 它们是 BCR 诱导 转录所必需的 另外, Fos Jun 家族成员也是应答 BCR 诱导的早期反应基因 Fos 和 Jun 家族成员如 J 山 ill, J 山 Jl) c - Fos, FosB 和 Fra -1 通过二聚化才有活性, 并参与到 1PAPMA. 反应元件的 DNA 位点 BCR 诱导的早期反应基因还有 c - myc, 该基因产物与固有表达蛋白 Max 形成 一个非共价异二聚体, 此复合物是一个转录活化物, 在诱导细胞增殖反应中起作用 BCR 的激活也能诱导岛 1HCII 类基因的转录 岛任 -IC II 类基因表达升高可促进与 TH 细 B淋巴细胞的产生 活化和分化75 胞的相互作用, 从而加强 B 细胞的活化增殖信号 进入外周组织的 B 细胞在外来抗原剌激或 T 细胞辅助下分化为效应细胞 为了方忏所菊一一一B 细胞的增殖和分化

83 一篇免疫学基础知识76 第便了解, 可把这个过程分为活化 增殖及分化三个阶段 此过程是一个连续的过程, 在不少情况下, B 细胞在增殖的同时也发生分化, 即增殖和分化不能截然分为两个不同的时相 B 细胞通过有丝分裂而大量增殖 未接受抗原剌激的静息 B 细胞处于细胞周期的 Go 期, 抗原剌激的 B 细胞活化诱导静息细胞进入细胞周期, 并从 G] 期进入 S 期, 在 S 期进行 DNA 复制 之后经过一短暂的 G2 期, 进入有丝分裂 M 期 B 细胞主要在生发中心进行增殖分化, 产生抗体的浆细胞和能对再次剌激产生反应的记忆性 B 细胞 一.B 细胞增殖分化的部位 B 细胞对 TI -1 抗原的应答反应主要发生在外周免疫器官的胸腺依赖区, 而对 TI - 2 抗原的应答主要发生在边缘区 B 细胞对 TI 抗原应答后产生的抗体主要为 I 剧类 机体对 TD 抗原的初次应答主要在胸腺依赖 区中进行 在 T 细胞的辅助下, B 细胞发生活化 增殖和分化, 成为寿命较短的浆细胞, 这些细胞停止分裂, 可高效合戚 分泌抗体, 主要为胁 f 类 少数活化 B 细胞迁移到非胸腺依赖区, 在初级淋巴滤泡内大量增殖, 形成生发中心 (ger minal center, GC), 并在生发中心经历体细胞突变 抗原受体亲和力成熟 19 类别转换等过程, 最终分化为记忆 B 细胞或抗体分泌细胞 记忆 B 细胞一旦形成, 即离开生发中心, 进入淋巴结和血液循环中进行再循环 记忆细胞并不分泌抗体, 只在受到相同抗原再次剌激后, 能很快地分化成为浆细胞 二. 生发中心 的组织结构生发中心是对 TD 抗原应答的重要场所 生发中心主要由增殖的 B 细胞组成, 约 10% 为抗原特异性 T 细胞 生发中心的组织学结构可分为明区 (light zone) 和暗区 (dark zone), 在生发中心的顶部及周围有密集的小淋巴细胞构成的新月形帽, 又称顶帽区 B 音区位于生发中心的内侧部分, 分裂增殖的生发中心母细胞 ( centroblast) 在此紧密聚集, FDC 1~ 少 明区是生发中心的外侧部分, 含有较多的网状细胞, 巨噬细胞及 FDC, 但中心细胞 ( centrocyte) 在此聚集不甚紧密 淋巴小结间的弥散组织为小结间区, 含有较多的初始 B 细胞 二. 生发中心 的形成生发中心在抗原剌激下于一周左右形成, 其形成被人为分成 3 个阶段 : (~) 中心母细胞阶段在外周免疫器官的胸腺依赖 区, 活化的 TH 细胞能识别由 B 细 胞所提旦的抗原肤岛 1HC 复合物, 并促进其活化 某些 B 细胞在原位活化 增殖 形成中心, 然后分化为浆细胞状态 另一些活化的 B 细胞则迁移到初级淋巴滤泡内转化为 B 淋巴母细胞 B 淋巴母细胞的增殖极快, 约 6~7h 增殖一代, 仅 3~4d 即可增殖到大约 104 个细胞, 充满整个滤泡 第 4 天, B 淋巴母细胞迁移到滤泡内侧, 失去 slg, 转变成为中心母细胞, 形成生发的暗区 中心母细胞体积较大, 胞浆丰富, 含有松散的染色质, 有很强的增殖能力 ( 二 ) 中心细胞阶段中心母细胞继续增殖, 再度表达 slg( 通常为己经历 19 类别转换的 19A 19G), 转化为中心细胞 这些细胞体积小并不再分裂, 并向日芷丰富的外侧区移动形成亮区 在亮区中的绝大多数中心细胞发生凋亡, 被该区的巨噬细胞所吞噬 中心母细胞发育为中心细胞, 常经历体细胞突变和抗原选择 亲和力成熟的过程, 一般认为, 前者发生在暗区的中心母细胞增殖阶段, 后者发生在亮区的中心细胞阶段 中心细胞至少需要接受两类重要的信号才能免于调亡 最重要的是抗原信号,F1 充表面固定的抗原与

84 第六章B 细胞表面 BCR 特异性结合, 保证了选择的特异性 FDC 在 B 细胞形成过程中起着重要 作用, 虽然没有 F1 芷网络结构, 生发中心也能形成, {E:! 消退很快, 并伴随 B 细胞亲和力成 熟的降低 FDC 通过特异分子, 比如 8 凶抗原, 为中心母细胞提供了潜在的增殖信号 FDC 表面的补体受体除了捕获免疫复合物外, 还用于检验中心细胞对自身抗原的亲和力 这个选择过程中,F1 充表面的低亲和力 FeRγ li B 通过协调生发中心 TH 与中心细胞相互作 用而发挥作用 最近发现, 生发中心 B 细胞内有一种调节蛋白 Bam3 2, 它能够调节目 3K 引起的信号转导 B 细胞在 FDC 辅助下合成抗凋亡分子 bcl- 2, 有利于使 B 细胞免于调 亡 第二个信号为 B 细胞的 ω'4 0 与 T 细胞的 ω'40 L 间的相互作用 ( 三 ) 记忆性 B 细胞阶段少数经体细胞突变和抗原选择后免于调亡的中心母细胞 进入顶亮层, 在 FI 汇 s 和 Th 的协同作用下分化为次级母细胞, 再分化为记忆性 B 细胞或寿 命较长的浆细胞离开生发中心进入血循环 ( 四 ) 生发中心的三个重要事件 B 细胞分化的三个重要事件在生发中心发生 : 体细 胞超突变 (somatic hypennutation) 和亲和力成熟 ( affin 町 maturation) k 类别转换以及浆细胞 和记忆细胞的产生 一般说来, 亲和力成熟和记忆细胞的产生必须在生发中心进行, 而 k 类别转化和浆细胞的生成也可在生发中心之外进行 1. 体细胞超突变和亲和力成熟体细胞超突变极大的局限于生发中心并定向于 k 基因的 V 区 在生发中心暗区的中央母细胞在抗原剌激下大量增殖时可发生体细胞超突变, 即重排后的 VD 和 VDJ 外显子发生高频率的点突变 这一过程常伴随抗体亲和力成熟, 即抗体与抗原的结合能力增强 突变后产生新的抗体, 有利于抗原选择有高亲和力受体的 B 细胞克隆 经历体细胞超突变和亲和力成熟后的 B 细胞才能最终分化为记忆型 B 细胞或长寿命浆细胞 它们分泌产生的抗体可更有效的保护机体免受外来抗原的侵袭 体细胞突变只发生在 B 细胞被激活以后, 浆细胞及记忆 B 细胞发生之前 当 B 细胞在生发中心克隆扩增之后, 重链基因 VDJ 的超突变以点突变的形式发生 体细胞超突变只在特定的解剖部位次级淋巴滤泡的生发中心才能发生, 且需 T 细胞的参与 突变多发生在免疫球蛋白重链基因转录调节起始点的下游 1~2 kb 区域内 体细胞超突变在每代细胞的发生率约为 到 1 100, 虽然体细胞超突变可促进亲和力的成熟, 而亲和 B淋巴细胞的产生 活化和分化77 力的成熟常伴随 19 类别转换, 但突变与 k 类别转换无关 19 基因超突变导致抗体分子 V 区的变化, 可加强或减弱抗体与抗原之间的亲和力 如果 19 基因突变使 BCR 对抗原的亲和力增加, B 细胞在抗原浓度较低的情况下仍能获得足够的剌激信号, 维持其进一步扩增 这些 B 细胞逐渐取代体内对抗原较不敏感的其他 B 细胞, 使血清中高亲和力抗体比例越来越高, 即实现抗体的亲和力成熟 在亲和力成熟过程中, 抗体产生的平均亲和力得以提高 中心母细胞转化为中心细胞后移到亮区, 由 F1 充上抗原对其进行选择 低亲和力的 B 细胞可因抗原浓度下降而迅速失去与抗原的接触, 并发生凋亡, 只有中亲和力及高亲和力的 B 细胞仍维持与抗原接触而被选择出来 2. 抗体分子的类别转换在 B 细胞扩增的过程中, 其所合成的抗体分子重链发生类别改变, 从胁 f 转换成 19G,1gA 19E 等其他类别或亚类的 19, 但其抗原特异性不变, 这种现象称为类别转换 (class switchir 剧 初次免疫应答早期的血清抗体以胁 f 为主, 而晚期以

85 一篇免疫学基础知识IgG 为主, 就是抗原特异性 B 细胞合成的抗体分子发生类别转换的缘故 对每一克隆 B 细胞来说,IgH 链的 V 区和 L 链不变化, 因此转换后的 Ig 分子尽管类别可以转换, 但 V 区 和基本的抗原结合特异性没有改变, 这是 B 细胞分化的一个特点 类别转换与重链 C 区有关, 它涉及部位特异的重组过程 在 cc 才 I 基因的 5' 端的内含 子中, 除了 Ci) 基因外, 都有一段重复性 DNA 序列称为转换区 (switch region, S region) 不同类别 CH 基因的 S 区序列各不相同, 主要的差异表现在他们的长度 (2~ lokb) 和组成, 但都含有 GAGσ 和 GGGGf 的重复序列, 提示这些序列在类别转换过程中扮演关键性角色 一般来说, 在欲表达的 CH 基因 5' 端缺失其他 CH 基因未完成类别转换, 可通过两种方式实现 : 一是同源重组, 即相同或大致相同的基因片段进行重组 ; 二是非同源重组, 即包含不同核昔酸序列的基因片段进行重组 转换可通过以下方式实现 : 一是同一 DNA 片段的 2 个位点进行重组, 使欲被切除的 DNA 片段成环 ; 二是姐妹染色单体的 2 个位点进行重组, 使其中一个染色单体以及该染色单体进入的细胞获得另一条姐妹染色单体上丢失的 CH 基因 ; 三是同源染色体的 2 个位点进行重组, 一条染色体获得另一条同源染色体上缺失的 G 基因 其中, 同一 DNA 片段上, 2 个位点发生非同源重组进而导致的时也成环或缺失, 是最常见的缺失性类别转换 B 细胞合成的抗体分子的类别转换离不开 TH 细胞的辅助, TH 细胞的 m40 L 为 B 细胞 实现类别转换提供必需信号之一 微环境中不同细胞因子的组合对类别转换的结果有重 78 第要影响 1GF-~ 与 IL-5 的共同作用可诱导 B 细胞合成 IgA ;IL-2 IL- 4 和 IL- 5 的协同作用倾向于维持酬的合成 ;00 γ 主要诱导向 IgG2a 和 I 剧的转换, 而且 4 则促进向 19E 和 IgGl 的转换 3. 浆细胞和记忆细胞的产生经过亲和力成熟和 Ig 类别转化, 中心细胞以其能够以足够的亲和力结合抗原的能力而在亮区内存活, 这些细胞最终成为抗体分泌细胞或记忆细胞 B 细胞一旦分化成浆细胞则失去了分裂能力, 但其粗面内质网丰富, 高尔基体发达, 代谢活跃, 表明其合成和分泌 k 的能力增强 每个浆细胞只分泌一种结合特异性的抗体分子, 据估计, 一个浆细胞每秒钟能分泌 5000 个抗体分子 一般认为, 浆细胞是终末细胞, 它们的平均寿命只有几天 记忆性 B 细胞为长寿命 低增殖细胞, 其一旦形成, 就能持续以非增殖状态长期存在 该生存需要抗原持续存在, 或者通过微生物持续低水平复制, 或者通过 FDC 细胞表面的抗原储留 记忆性 B 细胞可表达膜 Ig, 但不能大量产生抗体 它们离开生发中心后参与淋巴细胞再循环, 一旦再次遭遇同一特异性抗原, 即迅速活化 增殖 分化, 产生大量高亲和力特异性抗体 参号文献 1 何球藻, 吴厚生, 曹雪涛. 细胞与分子免疫学. 上海 : 上海科学技术文献出版社, 陈慰峰. 医学免疫学第 3 版. 北京 : 人民卫生出版社, Paul W. E. Fundamentallmrnunology.4th ed. Philadelphia: Lippincott - Raven Publishers Abbas A.K, Lichtman A.H, Pober l.s.cellular and Molecular lmrnuol 唱 y.5th ed. Philadelphia: W. B. Saunders

86 79 第六章B淋巴细胞的产生 活化和分化Company, Goldsby R.A, KindtT.J., Osbome B.A. Immunol 唱 T 5th ed.new York: Garland Publishing, Gupta, Sudhir. Butcher, Eugene.Paul, W.E. I; 归口 phocyre activation and immune regulation IX.New York Kluwer Academic Plenum Publishersc, 2002

87 一篇免疫学基础知识第七章 细胞因子 80 第细胞因子 ( cytokine, 口 是指由免疫细胞 ( 单核巨噬细胞 T 细胞 B 细胞 NK 细胞等 ) 和某些非免疫细胞 ( 血管内皮细胞 表皮细胞 纤维母细胞等 ) 受剌激后合戚 分泌的一类 生物活性物质 细胞因子多属分子量为 6~60 kda 的多肤或糖蛋白, 作为细胞间信号传 递分子, 主要介导和调节免疫应答及炎症反应, 剌激造血功能, 并参与组织修复等 本章 重点讨论细胞因子的分子结构 产生及其生物学功能 所菊口细胞因芸概述一. 细胞因子的命名 20 世纪 50 年代初即己发现, 体内存在一类具有广泛生物学效应的肤类生物活性分子 早期由于对其本质尚不清楚, 多以其生物学活性命名, 致使名称相当混乱, 同一分子往往由于具有不同的生物学效应而被给予不同名称 至 70 年代末, 人们认识到这些活性分子主要由白细胞合戚, 且主要介导白细胞间相互作用, 遂将这些因子统一命名为白细胞介素 (in - terleukin, IL), 并按发现顺序以阿拉伯数字排列, 如 IL-l IL- 2 IL 世纪 80 年代至今, 由于基因工程和细胞工程的迅猛发展, 可对各种多肤活性分子进行分子克隆, 从而有可能深入研究它们的分子结构和功能 在此期间, 不仅相继发现了许多新的多肤活性分子, 而且也揭示了它们的许多新功能 目前, 将所有的 1 干扰素( interferon, 00) 肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor, 1NF) 造血因子 各种细胞生长因子 趋化因子等统称为细胞因子 二. 细胞因子的分类细胞因子至今尚无统一的分类法 现将己有的分类法归纳如下 : (~) 按产生细胞因子的细胞类型分类 1. 淋巴因子 (lymphokine) 主要由淋巴细胞产生, 包括 IL- 2 IL-3, IL-4 IL-5, IL 6 IL-9 IL- lo IL-12 IL-13 IL-14 IL-16 IL-17 OO- 'Y,1NF-~ ω1-csf 等 ; 2. 单核因子 (monokine) 主要由单核巨噬细胞产生, 包括 IL-l IL- 6 IL NF α G-CSF 和 M-CSF 等 ; 3. 其他细胞产生的细胞因子主要由上皮细胞 血管内皮细胞 成纤维细胞 骨髓及胸腺基质细胞等产生, 如 EPO IL-ll IL-8 SCF 和 00- ~ 等 ( 二 ) 按细胞因子作用的靶细胞种类分类 1. 作用于巨噬细胞的细胞因子如巨噬细胞趋化因子 (Mσ) 巨噬细胞移动抑制因子 (MlF) 巨噬细胞活化因子 (MAF) 等 2. 作用于白细胞的细胞因子如白细胞移动抑制因子 (LeF) 白细胞趋化因子 (LCF) 集落剌激因子 (CSF) 等 3. 作用于淋巴细胞的细胞因子忏如致分裂因子 (MF) 转移因子(1F) 多种白细胞介

88 创一第七章细胞因子素 ( IL) 等 4. 作用于其他类型细胞的细胞因子 如淋巴毒素 (LT) 破骨细胞活化因子 (OSF) 表 皮生长因子 ( 囚 F) 等 ( 三 ) 按细胞因子在免疫应答中的主要作用分类 1. 效应性细胞因子 这类细胞因子包括 :1 具有趋化作用的细胞因子, 如 Mσ LCF IL-8 等 ;2 具有移动抑制作用的细胞因子, 如 MIF LIF 等 ;3 激活免疫效应细胞的细胞因 子, 如 lv1af, IFN γ 等 ;4 具有细胞毒作用的细胞因子, 如 1NF α LT 等 2. 调节性细胞因子 这类细胞因子包括 : 发挥正调节作用的细胞因子, 如 IL , IL- 4 IL- 5, CSF 等 ; 发挥负调节作用的细胞因子, 如 1GF- ~ IL-IRa 可洛性免疫 应答抑制物 时也合成抑制物 免疫球蛋白结合因子等 ( 四 ) 按细胞因子的主要功能分类 1. 介导天然免疫的细胞因子多为单核巨噬细胞激活产生的单核因子, 如 1NFα IL-l 且 6 IL-8 趋化因子 IFN α IFN- ~ 等, 它们参与抗病毒感染和激发抗菌性炎症 反应 2. 介导特异性免疫的细胞因子主要由抗原激活的 ω'4+ T 细胞产生, 如 IL IL-5 1GF- ~ 等, 它们介导淋巴细胞激活 增殖并分化成抗原特异性效应细胞 3. 激活炎症细胞的细胞因子如 IFN - 'Y, lv1af IL- 8 IL- lo IL-12 LT MIF 等, 其主要功能是激活非特异性效应细胞, 介导细胞免疫的效应过程 4. 刺激造血的细胞因子如 IL - 3, CSF(GM G M- CSF) E 町 IL-7 c - kit 配 体 (Sσ) 等, 它们能强烈剌激造血干细胞增殖, 并分化成各种成熟血细胞, 形成细胞集落, 统称集落剌激因子 ( 五 ) 按细胞因子存在形式分类 1. 分泌型细胞因子一般细胞因子均属此型 当细胞因子产生细胞受到剌激后, 细胞因子基因转录激活, 产生 m 卧屿, 大部分细胞因子的信号肤在粗面内质网蛋白翻译过程中被切除, 经修饰成为成熟蛋白, 继而被迅速分泌到细胞外, 主要以自分泌或旁分泌的形式发挥作用, 部分分泌型细胞因子也可进入血液循环, 在全身发挥作用 2. 跨膜型细胞因子部分细胞因子除有分泌型外, 还存在跨膜型 后者常是前者的前体, 即该类细胞因子信号肤在粗面内质网蛋白翻译过程中被保留下来, 经修饰成为成熟蛋白, 借助信号肤镶嵌在细胞膜上, 成为跨膜型细胞因子 跨膜型细胞因子经某些水解酶的作用, 可转换为分泌型细胞因子 1NF α 1GF α CSF - 1, c- kit 的配体与 KL-IKL 2( 干细胞因子 ) 及某些生长因子如因 F 肝素结合生长因子(f 证记 F) 神经喃瘤生长因子 (schwannoma - derived growth factor) c - erbb:z HER2 配体等均属此类细胞因子 跨膜型细 胞因子主要在局部通过细胞 细胞之间的接触发挥作用, 介导细胞之间的粘附 邻近细胞 的剌激 细胞毒作用 杀毒作用等 跨膜型细胞因子与其相应分泌型细胞因子的生物学功能基本相同, 但不尽一致 如跨膜型 1NF α 能杀伤对分泌型 1NF α 耐受的肿瘤细胞, 而且其信号传导与杀瘤机制也与分泌型有差异 此外, 有的跨膜型细胞因子是由于分泌型细胞因子通过与一个跨膜型亚单位结合, 而存在于细胞膜上, 如膜型 LT( 详见 1NF 家族 ) 二. 细胞因子的共同特点各种细胞因子有其独特的分子结构 理化特性及生物学功能, 但也具有下列共同特

89 一篇免疫学基础知识占 82 第(~) 理化特性细胞因子一般是分子量为 6~60 kda 的多肤或糖蛋白, 其成熟分泌 型分子所含氨基酸多在 200 个以内 不同细胞因子的氨基酸序列无明显同源性 ( 少数例 外 ) 0 多数细胞因子以单体形式存在, 少数细胞因子以二聚体 ( 如 IL- 5, IL-12 M-CSF 1GF- ~) 或三聚体形式 ( 如 1NF) 存在 ( 二 ) 分泌特点 1. 细胞因子一般均为多细胞来源如 IL-l 可由单核巨噬细胞 内皮细胞 B 细胞 成纤维细胞 表皮细胞等产生 ; 而一种细胞也可产生多种细胞因子, 如活化的淋巴细胞可 产生 IL-2 IL-6 IL-9 IL- lo IL-13 IFN - 'Y,1GF - ~ GM-CSF 等 2. 细胞因子的分泌是短暂的, 并有自限性细胞因子一般无前体状态储存, 当细胞 因子产生细胞受剌激后, 细胞因子基因转录被激活, 从而启动该因子的合戚, 所合成的细 胞因子通常迅速分泌到胞外 细胞因子转录的激活过程十分短暂, 加之编码细胞因子的 mrl' 也不稳定, 极易降解, 故细胞因子的合成十分短暂 此外, 细胞因子在转录后水平也 受到控制, 如将无活性前体蛋白水解成有活性的产物 3. 细胞因子与内分泌激素不同多数细胞因子通常不出现在血清中, 而是以自分泌 ( autocrine) 和或旁分泌 (paracrine) 形式发挥效应, 即细胞因子主要作用于产生细胞本身和 或邻近细胞, 多在局部发挥效应 但在一定的条件下, 某些细胞因子 (IL-l IL- 6 1NF α) 也可以内分泌形式作用于远端靶细胞, 介导全身性反应 ( 三 ) 细胞因子受体特点如同其他多肤激素, 细胞因子必须与靶细胞表面特异性受 体结合才能发挥其生物学效应 细胞因子受体一般对细胞因子具有高亲和力, 其解离常数为 ~ 10-10, 比抗原与抗体的亲和力大 100~1 000 倍, 比岛任 -I e 与抗原多肤的亲和力大 倍以上, 故极微量的细胞因子 ( 通常在 pmol L 水平 ) 即能激发明显的生物学效应 分泌的细胞因子是否被靶细胞接受, 取决于靶细胞上相应受体的数量与功能, 而细胞因子受体的表达则受特异性信号的调节 这些信号可以是其他细胞因子, 也可以是与该受体特异结合的细胞因子本身 ( 四 ) 生物学作用特点 1. 生物学作用的多样性 细胞因子可介导和调节免疫应答 炎症反应 ; 或作为生长 因子, 促进靶细胞增殖 分化, 并剌激造血 促进组织修复等 2. 生物学效应的复杂性 (1) 一种细胞因子可作用于多种不同类型的靶细胞 如 IL-l 可作用于胸腺细胞 中 性粒细胞 肝细胞 表皮细胞 内皮细胞 巨噬细胞 T B 细胞 NK 细胞 成纤维细胞等 (2) 多种细胞因子可作用于同一种靶细胞 如 IL-l IL- 2 IL- 4 IL- 8 IL- lo 等 均可作用于 T 细胞 (3) 同一细胞因子对不同靶细胞显示不同效应 如 1NF α 对 L929, 124 岛伍 180 等细 胞株显示细胞毒效应, 而对某些纤维母细胞系则可促进分裂及增殖 (4) 不同细胞因子可具有某些相同的生物学效应 如 IL-2 IL-4 IL-9 均可维持和 促进 T 细胞的增殖, 故将小鼠 IL-2 基因去除, 其 T 细胞功能基本正常, 并未严重影响免 疫应答过程

90 一第七章细胞因子(5) 生物学作用的时相性 一种细胞因子的某些效应可同时出现, 而另一些效应则在 不同的时相出现 3. 生物学作用的双向性 适量细胞因子有生理性调节作用, 过量细胞因子则可能对 机体造成损害 ( 五 ) 细胞因子的网络性 细胞因子的产生 生物学作用 受体表达 相互调节等均具 有网络特点 : 1. 细胞因子间可相互诱生 如 1NF α 能诱生 IL-l, 而且 1 又可诱生 IL- 6 等, 如 此形成 " 瀑布 " 样作用 2. 细胞因子受体表达的调节 如 IL-l IL-5, IL-6 IL-7,1NF 等均能促进 IL- 2 受体表达 ;IL-l 能降低 1NF 受体密度 ; 多数细胞因子对自身受体的表达呈负调节, 对它 种细胞因子受体表达成正调节 3. 细胞因子间生物学活性的相互影响某些细胞因子对特定生物学效应显示协同作用, 如 IL-l IL-2 IL- 4 IL- 6 1NF 等协同促进活化的 B 细胞增殖 ; 而且 2, IL-4, 1NF IFN γ 协同促进活化 T 细胞增殖 ; 低浓度 IFN γ 或 1NF 单独应用均不能激活巨噬细胞, 联合使用则有显著的激活作用 四. 细胞因子表达与功能的调节多种因素可在不同水平上调节细胞因子的表达与功能 囚(~) 细胞因子表达的调节机制 1. 转录水平的调节多数调节因素在转录水平调节细胞因子的表达 如内毒素可激活单核巨噬细胞的 NF-KB, 启动 IL-6 及 1NF 等基因的转录 IL-6 基因功能调节区存在几种转录控制元件, 如糖皮质激素反应元件 (G 阻 ) AP-l 结合位点 c - fos 血清反应元件同源性 (c - fos S 阻 ) camp 反应元件 (C 阻 ) 和 NF-KB 结合位点等 多反应元件 (MRE) 位于 c - fossre 同源区内, 此外, 该区还有核因子 IL-6(NF IL-6) 的识别位点 ( 图 7-1) 己证实, 炎症反应中 NF-KB 和 1NF IL- 6 的共同表达, 是调节 IL-l 1NF 和 1 6 产生水平的重要机制 2. 翻译水平的调节内毒素 (LPS) 可使靶细胞内转录活性提高 3 倍,{ 3. 1NF m 卧也却增加 100 倍, 合成的蛋白量则增长 倍, 提示内毒素可能在翻译水平调节表达 除影响翻译效率外, m 卧性的稳定性也起重要作用, 如放线菌酣可促进 LPS 诱导的 1NF α 高表达, 其作用机制就是使 1NF α 的 m 卧也半衰期延长 3. 翻译后水平的调节许多细胞因子是糖蛋白, 若糖基化过程异常, 可影响细胞因子的表达与活性 4. 分泌水平的调节尤其对于某些跨膜型细胞因子, 他们通过酶解作用而转化为分泌型细胞因子, 该过程可受体内外多种因素 ( 如强抗原剌激 PRe 等 ) 的调节 ( 二 ) 细胞因子生物活性的调节机制 1. 细胞因子受体的调节细胞因子与相应受体结合后才能发挥活性, 故受体表达的数量 构型和亲和力直接影响细胞因子的活性 细胞因子可通过影响细胞因子受体表达, 进而调节自身或其他细胞因子的生物学活性 : (1) 调节自身受体的表达如 IL-2 可通过自身分泌和旁分泌, 促进靶细胞表达 1 2R, 而大多数细胞因子对自身受体的表达呈负调节

91 Mmm 百血清 一篇免疫学基础知 结合点 -«MGGGAITITCC ORE ORE AP-l 结合点 ORE c-fos SRE 同源区 NF-KB 结合点 TATA 图 7-1 IL- 6 基因功能调节区 84 第(2) 诱导或抑制其他细胞因子受体的表达如 IL-l IL- 6 1NF IFNγ 等可促进 1 2R 的表达, 而 1GF-~ 则可降低 IL-2R 的表达 2. 可洛性细胞因子受体的调节作用大多数可洛性细胞因子受体可与膜受体竞争 细胞因子, 从而抑制细胞因子的生物学活性 3. 天然细胞因子抑制物的调节作用体内存在某些天然的细胞因子抑制物, 如 1 lr 抑制物可占据 IL - lr, 但却不引起信号传导, 从而抑制 IL-IR 发挥其生物学活性 ; 1NF α 抑制物可与 1NF α 结合而特异性阻断其活性 4. 抗自身抗体的调节作用正常人或某些自身免疫病 感染性疾病患者血清中, 可 识检出抗多种细胞因子的自身抗体, 主要为 IgG 类 这类抗体对机体具有双重作用 : 在生理状态下, { 民浓度的抗细胞因子抗体并不干扰细胞因子活性, 而可作为细胞因子的载体, 使之免受蛋白水解酶的降解, 延长其半衰期和活性 ; 在病理情况下, 抗细胞因子抗体可中和细胞因子的活性, 从而缓解细胞因子造成的病理损害, 但也可能因此干扰细胞因子的防御作用, 如抗 IFN 抗体可减弱 IFN 的抗病毒和抗肿瘤活性 此外, 细胞因子的生物学活性还受体内多种因素的影响, 如激素的调节 ; 细胞因子之间的协同与拮抗 ; 体外各种剌激物和药物的作用等 ( 三 ) 调节细胞因子表达与活性的因素 1. 神经内分泌的调节详见第三节 2. 细胞因子之间的调节细胞因子之间可相互促进或彼此约束, 形成细胞因子网络 : (1) 细胞因子的相互诱生如 IL-l 可诱导 IL- 2 IL-3, IL-4 IL- 6 IL- 8 和 CSF 的合成和释放等 (2) 细胞因子对其他细胞因子的负调节 如 IL- 4 IL- lo 和 1G F- ~ 对 IL-l 1NF IL-6 且 8 等多种细胞因子的活性有负调节作用

92 一第七章细胞因子(3) 细胞因子的自身调节作用 如 IL-2 1NF α 等通过自身分泌对自身发挥正调节 作用 3. 外源性或内源性调节因子的作用 各种抗原 ( 包括病原微生物 ) 和丝裂原是诱导 细胞因子产生并显示活性的主要剌激物 ; 体内某些介质 ( 如 PGE:z ) 可下调 1NF IL G-CSF 等的表达与活性 ; 某些药物 ( 如地塞米松 环胞霉素等 ) 可抑制 IFN-Y, IL-1, IL 2 IL-3, IL-4 IL-6 1NF 等的合成 第二币 细胞因予受体 细胞因子必须与靶细胞表面相应受体结合, 才能触发细胞内的一系列信号传导并显示生物学效应 因此, 细胞因子受体是细胞因子研究领域中的一个重要方面 一. 细胞因子受体的分类 (~) 细胞因子受体超家族根据细胞因子受体的结构与功能, 可将其分为 5 个不同的超家族 不同学者提出的每个超家族中所包括的细胞因子受体稍有不同 1. 造血因子受体超家族这是细胞因子受体中最大的一个超家族, 可分为红细胞生成素受体超家族和干扰素受体家族 (1) 红细胞生成素受体超家族其成员胞外区与 E 问 R 胞外区在氨基酸序列上有较囚高的同源性, 分子结构上也有较大相似性, 故得名 它包括绝大多数细胞因子受体, 如 1 2 邸和 γ 链 IL-3R IL- 4R IL- 5R IL- 6R IL-7R IL- 9R IL -l1 R EFDR TIDR G GSFR GM-GSFR LIFR CNIFR 0 且恒 gp130 KH97 等 该类受体的共同特征是 : 功能上与造血细胞的增殖和分化有关 ; 分子结构上, 其胞外区均包括由 200 个氨基酸构成的同源区, N 端有 4 个保守的半肮氨酸, 其 C 端存在由 Trp - Ser - X - Trp - Ser 组成的 WSXWS 构型 此外, 该类受体的胞内区段酶有 1PK 活性区域等传递第二信号的基本结构, 其受体后信号传导需要另外的受体相关分子参与 该受体家族亦称 I 型细胞因子受体家族 (2) 干扰素受体家族属于这一家族的成员有 I 型 IFN(IFNα 自 ) 和 H 型 IFN(IFN γ) 受体, 还可能有组织因子 它们属于 H 型细胞因子受体家族, 其结构与红细胞生成素受体家族相似,{E! N 端只含 2 个保守的半肮氨酸, 而且近膜处也有 2 个保守半肮氨酸 2. 免疫球蛋白超家族其成员包括 I 型和 H 型的 IL-1R IL-6R 某些生长因子( 如 P 口 E FGF) 和某些集落剌激因子 ( 如 M-CSF 及 c - kit 配体 ) 受体 该类受体结构特点是其胞外区富含半肮氨酸, 并含 k 样功能区 有趣的是, IL - 6R 既含 k 样功能区, 也含 WSXWS 构型 3. 1NF 受体超家族或称神经生长因子受体家族其成员包括 I 型与 H 型 1NFR NG FR Fas 蛋白及 ω'40 ( 表达于 B 细胞表面 ) 等 其结构特征是胞外区有约 160 个氨基酸构成的同源区, 由 4 个含有 4~6 个 Cys 的结构域组成的重复结构, 该类受体家族亦称田型细胞因子受体家族 4. 1PK 受体超家族包括四 FR P 口 :;FR M-CSFR 配 FR 等 结构特点是其细胞内区段具有 1PK l 舌性区域, 当受体与细胞因子结合后, 受体内在的 1PK 可被激活, 即受体本身介导信号传递 5. G 蛋白相联受体超家族主要包括 IL-8R 及其他趋化因子受体 该类受体含有

93 一篇免疫学基础知识86 第7 个硫水性跨膜 α 螺旋结构, 该结构最初在日肾上腺素能受体及视网膜视紫红质上被发 现, 现认为与 GIP 结合蛋白相联的受体普遍存在该结构, 其发挥作用依赖于 G 蛋白 ( 二 ) 细胞因子受体的肤链组成 1. 单链模式此类受体只含一条多肤链, 如 E 四 R 生长激素受体 G- CSFR 等 当 细胞因子与单链受体胞外区结合后, 可诱导受体形成同源二聚体或寡聚体, 以激活胞内信 号系统 2. 双链模式此类受体由两条异源多月机在组成 : 一条是特异的配体结合链, 又称私 有链 ; 另一条链不与配体结合, 但参与受体的信号传递, 由于此链是若干细胞因子受体共 同的信号传导组分, 又称 " 公有链 " 如 IL- 3, IL- 5, GM - CSF 除了各自具有与配体特异 结合的 α 链外, 均共用一条相同的自链 (KH97) ; IL - 6R LIFR OSV1R 及 CNIFR 也是由配体 特异的私有链和信号传导的公有链 (gp130) 组成 3. 多链模式此类受体由多条肤链组成, 其中有两条链参与信号传导 如 IL- 2R 由 α 日 γ 链组成, α 链是配体特异结合链, 自与 γ 链含 wsxws 结构并共同参与信号传导 IL-2R 的 γ 链也是 IL-4R IL-7R IL-9R IL-15R 信号传导的公有链 根据细胞因子受体存在的形式, 还可将其分为膜结合细胞因子受体 (membrane bound cytokine receptor, mckr) 和存在于体液中的可洛性细胞因子受体 (soluble cytokine receptor, 但 ) 0 细胞因子复杂的生物学活性是通过与其相应的 mαr 结合而介导的 ; s 口也则具有独特的生物学意义, 且其水平变化与某些疾病有密切关系 二. 细胞因子受体后的信号传递 多数细胞因子的作用取决于新基因的转录, 一般通过细胞因子激活的特异性 DNA 结 合蛋白 ( 转录因子 ) 而介导 不同细胞因子激活相应转录因子的胞内途径各异, 虽然尚不 完全清楚,{E! 己提出以下 4 种模式 : (~)IFN IFN 可激活受体相关的酷氨酸激酶 细胞若缺乏醋氨酸激酶 Tyk- 2, 即不 能传导 IFN α 的信号,{E! IFN γ 信号仍可传递 ; 若细胞缺失另一个酷氨酸激酶 J 且 (- 2, 则丧失传递 IFNγ 信号的功能 ; 缺乏 JAK-l 的细胞对所有类型的 IFN 均不发生反应 O IFN α 激活的酷氨酸激酶的底物是由多个亚单位组成的转录因子, 称为 ISGF- 3 当几 个亚单位发生酷氨酸磷酸化后, 该转录因子聚合, 从胞浆移到核内, 与 IFN α 诱导的基因 启动子中的特异序列 ( 即干扰素反应元素序列 ) 结合, 启动相应基因的转录 IFN γ 激活 的另一醋氨酸激酶可选择性的使 ISGF- 3 的一个亚单位磷酸化, 该亚单位可作为一个独 立的转录因子 ( 称作 γ 活化因子, GAF), 识别 γ 活化序列 (GAS), 从而启动另一些基因 的转录 ( 二 )1NF IL-l 这两种都能引起 NF-KB 复合体从胞浆向核内的转移, 使之与若干 基因的调控序列特异性结合并启动转录过程 其机制是 : 细胞因子与受体结合可激活磷 脂酷胆碱特异性磷脂酶 C(PC- PLC); 活化的 PC-PLC 可水解膜磷脂酷胆碱, 释放出甘油 二脂 (DAG) ; 游离的 DAG 可激活喃磷脂酶, 使之水解, 释放出神经酷肢 (ceramide) ; 神经酷 肢可结合并激活 1- KB 激酶, 使 1- KB(NF- KB 的抑制物 ) 磷酸化, 发生变构, 从而与 NF KB 解离 ;NF-KB 进入核内, 启动含有 NF-KB 结合序列的基因转录 ( 三 ) 趋化因子趋化因子与有 7 个跨膜 α 螺旋结构的受体结合, 使与受体相联的异 源三聚休 GIP 结合蛋白的 Gα 亚单位上的 GDP 转变成 GIP, 继而 Gα 与 G~Gγ 二聚体解离

94 盯一第七章细胞因子不同 Gα GIP 亚型可被不同受体激活, 随之又可激活胞内不同的酶 ( 如腺昔酸环化酶 ), 而 Gi3Gγ 也可激活其他的酶 o Gα GIP 可将自身 GIP 水解成 GDP, 后者再迅速与 G 间 γ 二聚体结合以终止信号 趋化因子通过 GIP 结合蛋白激活的磷酸肌醇特异性磷酸脂酶 C 有两种亚型, 即 PI - PLCj3 1 和 ~20 PI - PLC 可分解膜结合凹, 生成三磷酸肌醇 ( 皿 ) 和 DAG o IP3 诱导胞浆内钙库释放 Ca 2 + ; DAG 在 Ca 2 + 存在的情况下可激活蛋白激酶 C (PKC) ; 钙离子激活的激酶和 PKC 作用于细胞骨架蛋白如肌球蛋白 (myosin) 轻链而引起白细胞移动 ( 四 ) 造血生长因子同源二聚体的造血生长因子 ( 如 IL - 3) 可与含 WSXWS 结构的受体结合, 并使相关的信号传导亚单位聚合, 从而激活受体相关酷氨酸激酶 有关此类细胞因子受体所激活的酶尚不清楚, {E! 受体后过程类似于 1CR 复合体交联所继发的变化 : 醋氨酸激酶使受体胞浆段或受体相关信号传导亚单位的酷氨酸残基特异性磷酸化, 磷酸化的酷氨酸残基可被含有 Sf 丑结构的胞浆蛋白识别, 使不同的含 Sf 丑结构的蛋白与受体结合, 并在胞膜聚集 ; 受体相关酷氨酸激酶使与受体结合的 含 S 目结构的蛋白发生磷酸化, 从而使后者激活 T 细胞中某些含 Sf 丑结构的蛋白属于酶类, 如 PI - PLCγl( 类似于 PI - PLC- ~1 和 ~2), 它们可启动一系列反应, 导致胞浆内钙离子升高并激活 PKC, 从而影 响 T 细胞的功能 最近发现, 酷氨酸激酶的激活还与致有丝分裂相关 生长因子受体的醋氨酸磷酸化可导致其与一个非酶性的称作 G 阻 2 的蛋白结合,GRB-2 含 SH3 结构, 可结合另一称作回 S 的蛋白 后者被酷氨酸磷酸化后, 可使 Ras( 即一个单体 GIP 结合蛋白 ) 的 GDP 转变成 GIP, 而且 s - GIP( 但不是 Ras - GDP) 可进一步活化丝氨酸苏氨酸激酶, 从而导致若干转录因子 ( 如 AP-l, c -myc 等 ) 的磷酸化和活化, 使细胞发生分裂 二. 可溶性细胞因子受体可恪性细胞因子受体 (s 口也 ) 是细胞因子受体的一种特殊形式 sα 恨的氨基酸序列与 mαr 胞膜外区同源, 仅缺少跨膜区和胞浆区, 但仍可与相应配体特异性结合 多数 由与细胞因子的亲和力比 m 口也低, 可能因为 也是单链结构或缺少某些功能区域 多种 sα 也在血洁和其他体液中的水平与某些疾病的发生 发展密切相关 (~) 可洛性细胞因子受体的产生机制 1. 膜受体脱落膜受体脱落是形成 sα 远的主要途径, 此过程是一个主动过程并受各种因素的调节 如 PMA 可促进 sil- 6R 从 1 世 L-6R 的脱落, 而目 <C 抑制剂则可抑制上述过程, 提示 PKC 参与 s 口也产生的调节 膜受体的脱落可能是通过酶解作用而实现, 己证实丝氨酸蛋白酶抑制剂可促进 mil -IR 表达, 但抑制 sil - lr 的产生 通过此途径生成的 s 口也有 sil-ir( II 型受体 ) sil - 2R(α 链 ) sil - 5R(α 链 ), sil - 6R(α 链 ) 出 m CSFR(p85) sifn γr( 阔的 s1nfr( I H 型 ) 等 2. m 卧忱的不同剪接通过受体 m 卧忱的不同剪切, 形成合成可洛性受体的 m 卧恤, 经翻译后, 如同分泌型细胞因子一样直接分泌至胞外 o sil - 4R sil - 5Rα 链 sil - 6R,α 链 sil-7r 以及 sg- CSFR 等通过此机制而产生 ( 二 )s 口恨的生物学功能 1. 作为细胞因子的转运蛋白 s 口也与细胞因子结合, 将细胞因子转运至机体有关部位, 增加局部的细胞因子浓度, 从而更有利于细胞因子在局部发挥作用 此外, sα 也还可稳定细胞因子, 减慢细胞因子的 " 衰变 ", 从而发挥细胞因子 " 慢性释放库 " 的作用, 以

95 一篇免疫学基础知识维持并延长低水平细胞因子的生物学活性 2. 调节细胞因子的生物学活性 sα 也可通过多种途径调节细胞因子的效应, 如 :1 作为膜受体的清除形式之一, 使细胞对细胞因子的反应性下降 ;2 sckr 可与 ill 口也竞争性结合细胞因子, 下调细胞因子的效应 ;3 某些 sα 也可上调细胞因子的效应, 如 sil- 6R 与 IL-6 特异性结合后可被靶细胞表面 gp130 蛋白识别并传递剌激信号, 从而促进 IL- 6 效应的发挥 sα\r 究竟对细胞因子活性起抑制还是增强作用, 可能取决于细胞因子与细胞因子受体之间的浓度比 一般来说, 高浓度 s 口也可抑制相应细胞因子的活性 ; 而低浓度 s 口也则可起增强作用 ( 三 )s 口恨的临床意义 1. s 口也与疾病的诊断和预后检测 sckr 水平可用于某些疾病的早期辅助诊断, 有助于了解病程的发展与转归, 并评估患者的免疫功能状态及预后 如类风湿性关节炎患者的鉴别诊断 ; 毛细胞白血病对治疗有效者, 其水平下降, 复发时上升 ; 风湿性疾病患者血清 s 口恨水平异常增高, 关节腔 i 骨液中也可检出高水平的 sckr, 且与病情活动程度平行 2. s 口也与临床治疗多数 s 口也与细胞因子结合后可阻断细胞因子与膜受体结合, 从而阻断细胞因子的生物学活性, 这为防治细胞因子导致的病理过程提供了新的途径 88 第如应用 s1nfr 可减轻 1NF 在自身免疫病中所介导的病理损害, 并可减轻内毒素性休克的 病情 ; 给动物局部注射 sil-ir 可抑制 IL-l 介导的炎症反应等 所菊一一口细胞因予的生物学作用一细胞因子的生物学作用极其广泛而复杂, 不同的细胞因子其功能既有特殊性又有重叠性 协同性与拮抗性 (~) 参与免疫应答与免疫调节 1. 免疫应答识别阶段 IFN 等可诱导 APe 表达岛任 -[c- II 类分子, 从而促进其抗原提呈作用 ;IL- lo 则可减少岛 1H C- II 类分子和 B7 等协同剌激分子的表达, 抑制抗原提呈作用 2. 免疫应答增殖阶段 IL-2 IL-4 IL-5, IL-6 等可促进 T B 细胞的活化 增殖和分化, 而 1G F- ~ 则可起负性调节作用 3. 免疫应答效应阶段趋化因子可吸引炎性细胞 ; 巨噬细胞活化因子 (1NF α 1 1 IFN-y, ω1-csf 等 ) 可使巨噬细胞活化, 增强其吞噬 杀伤等功能 ; 淋巴毒素和 1NF α 具有细胞毒作用并促进中性粒细胞活化 ;IFN γ 可抗病毒等 4. 免疫调节在免疫应答过程中, 免疫细胞间可通过所分泌的细胞因子而相互剌激, 彼此约束, 从而对免疫应答进行调节 如 IL- 4 IL- lo 对 TH l 细胞起抑制作用, 而 IFN γ 则对 TH 2 细胞有抑制作用, 从而调节细胞免疫与体液免疫 ( 二 ) 剌激造血功能某些细胞因子如 IL-3 可剌激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化 ;ω1-csf G-CSF M-CSF 可促进粒细胞和巨噬细胞等增殖与分化 ; 而 EFD 则可促进红细胞的生戚 上述细胞因子通过促进造血功能, 参与调节机体的生理或病理过程 ( 三 ) 细胞因子与神经内分泌免疫网络神经内分泌免疫网络是体内重要的忏

96 的一第七章细胞因子调节机制, 在该网络中, 细胞因子作为免疫细胞的递质, 与激素 神经肤 神经递质共同构成细胞间信号分子系统 1. 细胞因子对神经和内分泌的影响多种细胞因子 ( 如 IL-1 IL-6 1NF 等 ) 可促进星形细胞有丝分裂 ;bfgf 可参与神经元的分化 存活和再生, 剌激神经胶质细胞的移行 ; 多种细胞因子共同参与中枢神经系统的正常发育和损伤修复 ;IL-1 1NF, IFN - 'Y, PAF 等可诱导下丘脑合成和释放促皮质素释放因子, 诱导垂体释放 A 口日, 进而促进皮质激素的释放 ;IL-1 IL-6 1NF 能直接作用于体温调节中枢而引起发热 ;IL-1 和 1NF α 还可加强慢睡眠, 抑制食欲等 ;IL-1 IL-2 和 IL-6 可直接剌激肾上腺皮质细胞分泌皮质酣 ;IL 1,1NF α IFN γ 可抑制甲状腺合成和释放甲状腺激素 2. 神经内分泌系统对细胞因子的影响应激状态下交感神经兴奋, 使儿茶酷服和糖皮质类固醇分泌增多, 进而抑制 IL-1 1NF 等的合成和分泌 ( 四 ) 参与细胞凋亡细胞凋亡 (apoptosis) 是一种具有时相性和空间性的细胞自主死亡过程 细胞凋亡广泛参与胚胎发育 形态发生 肿瘤消退 炎症反应 正常组织更新及自身反应性淋巴细胞的消除等 近年发现, 细胞因子可直接或间接参与调亡过程 1. 细胞因子直接诱导细胞凋亡 1NF α 在体外可诱导肿瘤细胞 树突状细胞 大鼠肝细胞和小鼠胸腺细胞凋亡 ;IL-2 可诱导抗原剌激后的 TCRalIT 细胞 (ωj '8+ ) 凋亡 ;IL 4 可诱导 IL-2 和 ips 激活的单核巨噬细胞凋亡, 但可抑制慢性 B 细胞白血病细胞的调亡 ( 此与 IL-4 促进 B 细胞的 bcl- 2 基因表达有关 )0 IL-1 日转化酶 (inter - lew 王 III 1 日 convertl 鸣 enzyme, ICE) 可活化 IL-1 日前体分子, 同时也可介导细胞凋亡, 故在发生凋亡的细胞中可见成熟的 IL-1 日分泌增多, 但 IL-1 日本身并不能直接诱导细胞凋亡 有关 ICE 介导细胞凋亡的机制尚不清楚 2. 细胞因子参与对细胞凋亡的调节目 s 抗原与其配体或抗体结合后, 可介导细胞凋亡 现己发现, Fas 抗原参与胸腺细胞选择 CIL 效应 免疫应答调节等多种生理活动 O IL-2,1NF IFN γ 等可促进 Fas 表达, 从而间接介导细胞凋亡 某些细胞因子 ( 如 1NF IL-1 IL- 3, IL- 5, GM - CSF 等 ) 可通过影响原癌基因 (c - myc c - fos 等 ) 的表达而参与调节细胞凋亡, 如 1NF 可促进某些肿瘤细胞的调亡 ; 而且 3 则可阻止肥大细胞发生凋亡 第四币 细胞因吾与某些病理过程的关系 某些病理过程常伴有细胞因子的异常表达, 并直接影响疾病的发生 发展及预后 一. 细胞因子与炎症感染过程可诱生多种细胞因子的产生, 细胞因子又可直接或间接参与急性和慢性炎症反应 (~) 细胞因子促进炎症细胞的渗出与趋化细胞因子可上调血管内皮细胞和白细胞表达粘附分子, 如 IL-1 1NF IFN γ 等可促使内皮细胞表达 I 巳丛 1, VC 丛 1-1 等, 促使中 性粒细胞表达 CD11b ω18 mll0 m18 等, 从而促进白细胞与血管内皮细胞的粘附作用, 有 助于白细胞的炎性渗出 ;IL-8 等趋化因子可吸引中性粒细胞 单核巨噬细胞等炎性细胞移动到炎症灶

97 一篇免疫学基础知识90 第( 二 ) 激活炎性反应 IL-1 1NF α 00-)', ω1-csf 趋化因子等可激活单核巨噬细胞 中性粒细胞等, 增强它们的吞噬杀伤功能, 促进它们释放炎症介质 此外, IL-1 1NF α 和 IL-6 还可促进肝细胞合成急性期反应蛋白, 如 C 反应蛋白 血清淀粉样蛋白 A α 酸性糖蛋白和某些补体成分, 有利于机体抵御病原微生物的侵袭 ( 三 ) 引起发热, 参与炎症病理性损害 IL-1 1NF α 和 IL-6 均为内源性致热源, 可作用于体温调节中枢, 引起发热 ;1NF α 和 IL -1 等可剌激内皮细胞和白细胞释放一系列炎性介质 ( 如二氧化氮 氧自由基等 ), 改变凝血功能, 导致组织损伤和弥漫性血管内凝血, 从而在感染性休克中起重要作用 此外, 上述细胞因子还可促进成纤维细胞增殖, 与慢性炎症的纤维性病变有关 二. 细胞因子与肿瘤细胞因子对肿瘤的作用具有双重性, 某些细胞因子可杀伤肿瘤 ; 另一些细胞因子则可促进肿瘤生长 ; 而某些细胞因子在不同条件下可发挥抑制肿瘤或促肿瘤的不同反应 (~) 抗肿瘤作用多种细胞因子具有抗肿瘤活性, 例如 :1NF α 和淋巴毒素直接杀伤肿瘤细胞 ( 坏死或调亡 ) ;00 IL- 4 等可抑制多种肿瘤细胞的生长, LIN 可抑制造血系统肿瘤细胞增殖 ;IL- 2 IL-1 00 等可诱导 CIL NK 和 LAK 细胞的杀肿瘤活性 ;00 可诱导肿瘤细胞表达岛 1HC-1 类抗原, 增强机体对肿瘤细胞的免疫应答 ( 二 ) 促肿瘤生长某些肿瘤可高表达 IL-6 M-CSF EGF 这些细胞因子可使细胞增殖失控, 对肿瘤的发生和发展起重要作用 如 IL- 6 合成增加与多发性骨髓瘤的发生有关, IL-6 在体外可促进浆细胞瘤和骨髓瘤细胞的生长 此外, IL- 6 还与 Hodgki 日淋巴瘤 慢性淋巴细胞白血病和急性髓样白血病的发病有关 M-CSF 可能参与白血病 淋巴细胞恶性增生 骨髓及骨髓外增殖性疾病 卵巢癌 子宫内膜癌等的发生 EGF 也与多种肿瘤的发生 发展有一定关系 细胞因子参与肿瘤发生的机制可能是 :1 某些肿瘤细胞可高分泌囚 F 或 IL- 6, 从而出现自分泌性生长, 并成为维持这些肿瘤细胞在体内长期生存的关键因素 此外, EGF 能促使周围正常细胞表现转化细胞的生长特性, 并促使某些瘤细胞释放基质金属蛋白酶, 该酶具有破坏组织细胞间质的作用, 从而促进肿瘤向远处转移 ;2 肿瘤细胞高表达 IL- 6 或 EGFR, 使其对相应细胞因子呈现高反应性 ;3 EGFR 与某些癌基因 ( 如 src 家族 ) 产物的氨基酸排列和组成具有高度同源性, 后者可直接与 EGFR 结合, 使受体持续激活并导致细胞不断生长和恶变 二. 细胞因子与移植排斥反应移植排斥反应的本质是宿主对移植物产生免疫应答 己证实细胞因子参与排斥反应的发生和发展 急性排斥反应时, 血清中 IL-2 IL-1 1NF α OO-)', IL-6 等细胞因子的水平升高, 但需与感染 创伤等因素引起的细胞因子变化相鉴别 移植排斥反应主要针对移植物, 故移植物局部细胞因子的变化更有意义 己发现, 移植物局部以 IL-1 1NF 和 M-CSF 升高最为明显 ; 骨髓移植后 00 γ 水平升高预示发生感染或 GVHD, 而高水平 1 2 则具有防止 GVHD 的作用 四. 细胞因子与免疫性疾病细胞因子异常参与免疫性疾病的发生 ; 反之, 免疫性疾病也会导致细胞因子的表达或功能异常

98 七章(~) 免疫缺陷病 IL-2 是参与淋巴细胞激活 增殖的重要因子, IL- 2 生成缺陷引 起的重症联合免疫缺陷症 (SCID) 己有病例报告 IL- 2 的 γ 链基因突变可使 IL- 2 丧失 功能, 见于 X 性连锁重症联合免疫缺陷病 o 1NF 可以促使 HN 感染的 ωj 细胞 NF-KB j 舌化, 后者与 HN 的长末端重复序列增强子位点结合, $ 舌化 HN 基因, 从而参与 AIDS 发 病 ;AIDS 患者血清中 1NF α IL-l 水平升高, 可引起病人长期发热, 且 1NF α 还可导致 恶液质 ( 二 ) 变态反应 IgE 是参与 I 型超敏反应的主要抗体, IL- 4 IL- 5 和 IL- 6 可正向 调节 19E 的生成及其活性, 而 IFN 则可抑制 IL-4 对 19E 的诱生作用 IL- 4 分泌过度和 或 IFN γ 产生不足可能是诱导变态反应发生的重要因素 变态反应时, 粘膜和皮肤肥大 细胞的增生依赖于 IL-3 此外, PAF 也参与过敏性休克 过敏性鼻炎 支气管哮喘等的发 生 ( 三 ) 自身免疫病 IFN γ 等细胞因子可促进某些自身组织细胞表达岛任 -[C- II 类抗 原, 使这些细胞可将自身抗原提呈给自身反应性 T 细胞, 导致自身组织的损害 ( 如 Grave 病 膜岛素依赖性糖尿病等 ) ; 系统性红斑狼疮 硬皮病 类风湿性关节炎等自身免疫性疾 病患者血清中 IL-2 水平升高 ; 应用 IL- 2 治疗者有 10% ~20% 发生自身免疫性甲状腺 功能减退 ; 心脏粘液瘤 类风湿性关节炎 系统性红斑狼疮 Castleman 病 硬皮病患者血清 中 IL-6 明显增加, 这些疾病往往伴随单克隆 B 细胞激活 I 91 第第五币细胞因予各论一. 白介素迄今为止, 己发现白介素 (interleukine, IL) 1 ~ 18, 分述如下 : (~)IL-l IL-l 家族包括 3 个成员, 即 IL-lα IL-l 日及 IL - IRa( interleukin - 1 receplor antagonist, IL - 1 受体拮抗剂, 亦称 IL-lγ) 三者的氨基酸序列不同, 但具有相似的三维结构, 且均能与 IL-IR 结合 o IL-la,~ 与 IL-IR 结合后可介导靶细胞的一系列效应 ;IL-IRa 与 IL-IR 结合则不传递任何生物信号, 从而对 IL-l 起特异性抑制作用 1. 曾用名淋巴细胞激活因子 胸腺细胞激活因子 B 细胞激活因子 内源性致热源 白细胞内源性介质 单核细胞因子 破骨细胞激活因子 肌蛋白水解因子 2. 来源 IL-lα 与自主要由活化的单核巨噬细胞产生, 此外树突状细胞 上皮细胞 内皮细胞 神经小胶质细胞 星状细胞 中性粒细胞 成纤维细胞 平滑肌细胞 B 细胞 T 细胞及 NK 细胞等也可产生 IL-lα 与日 IL-IRa 主要由单核巨噬细胞产生, 其次为角质化细胞 滑膜细胞等 3. 刺激物与抑制物 (l) IL-lα 与日的剌激物与抑制物剌激物包括 ips 微生物感染 损伤 紫外线照射 某些细胞因子 ( 如 1NF CSF IFN-Y, IL-l 本身 ) 白三烯及硅类物质等 剌激物质的性质可决定 IL-l 贮留在胞内或释放到胞外 如 ips 酵母多糖可剌激胞内外 IL-l 水平升高 ; 硅类物质及 PMA 主要剌激 IL-l 的胞外分泌 抑制物包括糖皮质激素 PGE2 1GF 日 α 黑色素细胞剌激素等, 均可非特异性抑制 IL-l 活性 (2)IL- IRa 的剌激物主要是免疫复合物, 此外还有 ips PMA IgG 及某些细胞因 细胞因子

99 一篇免疫学基础知识92 第子, 如 GM-CSF, IL-3 1GF- ~ 等 4. 分子生物学特征编码人 IL-lα 自与 γ 的基因均位于第二号染色体 IL-lα 与日的基因分别为 11 kb 及 7.5 kb 大小, 均含 7 个外显子, 其核昔酸序列同源性为 45%, 而氨基酸序列同源性为 26% 0 IL-lα 基因编码 271 个氨基酸组成的前体 ( 分子量 33 kda, 等电点 5.0);IL-l 日基因编码 269 个氨基酸组成的前体 ( 分子量 33 凶 'a, 等电点 6.8) 经酶切后, 二者均产生含 153 个氨基酸的成熟蛋白 (1 7 kda), 它们的活性单位为单体 IL-lα 前体具有生物学活性, 而且 1 日则必须成为 17 kda 成熟蛋白才具有活性 令人费解的是, IL-lα 与日均不含信号肤, 即不是以分泌蛋白方式合成而是以胞浆蛋白合成的, 迄今为止它们的分泌机制尚不明确 IL-IRa(IL-lγ) 的 edna 长 1. 8 恼, 可编码 177 个氨基酸 与 IL-lα 自分子的不同之处在于它含 25 个氨基酸的信号肤, 其成熟蛋白为 152 个氨基酸 ( 分子量 23~25 kda, 等电点 5.2) 0 IL - IRa 的氨基酸序列与 IL-lα 与日分别有 19% 和 26% 同源性 5. IL-IR IL-IR 分为两型 :1 型受体为 80 1 王 Da 的单链糖蛋白, 胞外部分有 316 个氨基酸, 而胞内部分则由 213 个氨基酸组成 ;II 型受体为 60 kda 的单链蛋白, 其胞外部分与 I 型受体一样含 19 样结构, 属 k 超家族成员, 但胞内部分仅含 29 个氨基酸 I 型受体为 IL-l 信号传导受体 ;II 型受体功能尚不清楚, 有人认为它可能释放到胞外, 成为可洛性 IL-l 受体, 作为细胞外 IL-l 的抑制型调节因子 IL-IR 分布极广, 其中 I 型受体主要表达于 T 细胞 成纤维细胞 平滑肌细胞及内皮细胞等表面 ;II 型受体主要存在于 B 细胞 嗜中性粒细胞 单核巨噬细胞及骨髓细胞上 o IL-la,~ 和 IL -IRa 与 I 型受体的亲和力相同, 但 IL-lα IL-IRa 与 H 型受体的亲和力不如 IL-l 日高 6. 生物学活性 IL-l 属于内分泌细胞因子, 具有广泛的生物学效应, 尤其在免疫应答及炎症反应中起重要作用 ( 表 7-1), 其作用无明显种属特异性 (1) 发热 IL-l 为内源性致热源, 可选择性通过血脑屏障, 通过使温度调节中枢释放前列腺素而引起发热 (2) 参与免疫应答 IL-l 是 T 细胞激活的协同剌激因子, 可促使 T 细胞产生 IL- 2 及表达 IL-2 受体 IL-l 可直接促进 B 细胞的增生与分化, 亦可通过促进 TH 细胞产生 IL-4 且 5 及 IL-6 等而间接作用于 B 细胞 此外, IL-l 还能增强 NK 细胞的细胞毒活性及促进 IL-2 激活的 lak 细胞的分化 IL-l 作用于单核巨噬细胞, 使之产生 IFN α 1NF α IL-6 IL-8 等细胞因子 (3) 参与炎症反应 IL-l 可促进单核巨噬细胞及血管内皮细胞合成细胞因子 ( 如 1 1 IL-6 IL-8 等 ) 及粘附分子等炎性介质, 激活白细胞, 促进其粘附并合成炎性蛋白 ( 如急性期反应蛋白等 ), 从而参与各种急慢性炎症反应的病理过程 (4) 促进伤口愈合注射 IL-l 可加速伤口愈合, 而角质细胞可在局部产生大量 1 1, 提示局部 IL-l 在伤口愈合上可能起重要作用 (5) 剌激造血功能 IL-l 可调控正常造血干细胞 各系祖细胞及白血病细胞的增殖 ; 能激活干细胞从 Go 期进入增殖周期, 扩大干细胞池 ; 可为早期干细胞对 CSF 起反应做准 备 ; 诱导辅助细胞产生 CSF 及其他细胞因子, 从而间接调节造血 特别在受到 X 线照射 时, IL-l 具有保护功能并剌激造血的功能, 故可用于抗癌的辅助治疗 (6)IL-IRa 的生物学活性 IL-IRa 是迄今所发现的唯一的天然特异性细胞因子抑

100 一第七章细胞因子制物, 其作用与可洛性 IL-IR 相似, 即特异性抑制 IL-l 活性, 但二者作用机制不同 o sil lr 通过与 IL-l 结合, 使后者不能与靶细胞表面 IL-IR 结合 ; 而且 IRa 则通过与靶细胞表面 IL-IR 结合, 占据位置, 使 IL-l 不能再与之结合 IL-IRa 与受体结合后并不触发任何信号, 而发挥特异性抑制作用 表 7-1 1L -1 的生物学活性 革 E 细胞 生物学活性 胸腺细胞 ( 阳 A -) 骨髓细胞 T 淋巴细胞 B 淋巴细胞单核巨噬细胞 ±i 曾生干 与 GM-CSF 协同诱导增生 ;σv-gm 干 CD4 + 细胞增生干 ; 诱生 E 司 臼 F IL-2, IL-4 IL-5; 激活 CD8 + IL-1R+ 细胞 增殖干 ; 分泌 Ig 干, 表达膜 Ig 干 诱导趋化, 激活协作剌激因子, 细胞毒活性干, 诱生 IL-1, IL-6 IL-8 GM- CSF,1NF 等, ICAM-1 和匹干 NK 细胞 中性粒细胞 软骨细胞 NK 活性干 促进从骨髓释放 ; 新陈代谢干 ; 分泌溶酶体 蛋白酶干 软骨降解干, 产生陀 胶原酶 纤溶酶原激活物干 关节滑液细胞成骨细胞 增生干 ; 产生陀 胶原酶干 纤溶酶原干产生匹干 ; 胶原干 ; 增生干 2. 刺激物与抑制物 剌激物主要是 APe 提呈的抗原和各种丝裂原 ( 如 PHA PWM), 破骨细胞内皮细胞表皮细胞 促进骨降解 ; 产生 胶原酶干 ; 钙释放干 ; ±i 曾生干 ; 前凝血质活性干 ; 产生 1NF,IL-6 IL-8 GM-CSF, IC 地 1-1 干增生干 ; 产生 N 型胶原 成纤维细胞 增生干 ; 产生陀 胶原酶 IFN- y,1nf GM - CSF, IL- 6 IL 肘, 热休克蛋白磷酸化干 骨基质细胞 产生 ω1-csf G-CSF M-CSF IL 川 肝细胞脂肪细胞肌肉细胞角质细胞肿瘤细胞肾上腺下丘脑 诱导急性期蛋白的产生, 血浆铁和锋 t 脂肪分解干 ; 脂蛋白脂酶活性干产生匹干诱导蛋白分解 ±i 曾生干 ; 分泌 IL-6 等干杀伤某些肿瘤细胞 ( 如 K562) 促进糖皮质激素的释放 PG 产生干, 导致发热 ; 血浆铜干, 口干 IL-l 的生物学效应具有剂量依赖性 低剂量 IL-l 主要参与局部炎症, 如促进单核 细胞和血管内皮细胞合成和释放 IL-l IL- 6; 促进白细胞表达粘附分子 ; 促进单核细胞 和内皮细胞产生趋化因子, 从而激活白细胞, 对机体表现出保护作用 大剂量 IL-l 释放 入血时, 可引起发热, 诱导产生急性反应蛋白, 引起全身性毒副作用及恶液质等 ( 二 )IL 年 Morgen 发现一种多肤激素, 称 T 细胞生长因子, 它可剌激人 T 细 胞增生, 并使 T 细胞在体外培养条件下持续生长,1979 年被命名为 IL 来源 IL-2 主要由 ωj 及 ms+t 细胞产生, 后者产生的量较少 此外, 施细胞 LAK 细胞亦可产生 IL- 2 0

101 一篇免疫学基础知识以及 T 细胞受体交联 抗 CD2 抗体及 IL-1 IL- 2 IL-7 等 抑制剂包括氢化可的松 前列腺素 环胞霉素 巳丛 1p 及 1, 25 双丑基 VitD3 等 3. 分子生物学特征人 IL-2 基因位于 4 号染色体, 由 4 个外显子组成, 编码 153 个氨基酸的多肤, 其中含有 20 个氨基酸的信号肤 成熟的 IL-2 约含 130 个氨基酸, 由于糖基化的程度不同, 其分子量大小不等, 约 14~17 kda( 等电点 6.8~8.2)o IL-2 活性单位为单体 天然 IL- 2 分子折叠成含有两对平行 α 螺旋结构的球形蛋白, 所有与含 wsxws 序列的受体结合的细胞因子 ( 如 IL-3, IL-4 IL-5, IL-6 ω1- CSF G-CSF 等 ) 均含有这种 α 螺旋折叠结构 4. IL- 2R IL- 2R 至少由 3 种多肤链构成 3 种不同亲和力的受体 :α 链 (p55, m Tac 抗原 ) 单独构成低亲和力受体 (KDlO- 8 M) ; 自链 (p75) 和 γ 链 (p64) 共同构成中等亲和力受体 (KDlO- 9 M) ;α 阳链的三聚体构成高亲和力受体 (KDlO- 11 M) α 链不能传导信号, 但其与 IL-2 结合解离均比自链快, 故对形成高亲和力受体有重要意义 目和 γ 链的二聚体为 IL-2 信号传递所必需 此外,γ 链也是多种细胞因子 ( 如 IL- 4 IL-7, IL-9 IL-13 IL-15 等 ) 受体的功能性组成单位 若 γ 链突变, 可引起重症联合免疫缺陷 IL- 2R~ 与 γ 属于细胞因子受体超家族 编码人 IL-2RαJ 与 γ 链的基因分别位于第 10 号 22 号与 X 染色体 IL-2R 分布于 T 细胞 B 细胞 NK 细胞及 Mφ 表面, 慢性剌激 T 细胞可使 1 2Rα 脱落, 所形成的可洛性 IL-2R 可与游离的 IL-2 结合, 从而干扰 IL- 2 与靶细胞的相 94 第互作用 临床上, 血清中 sil- 2Rα 升高是一种强烈抗原剌激的标志, 可见于器官移植急 性排斥反应及 HN 感染等 IL-2 介导 T 细胞增生的机制, 可能与一种酷氨酸激酶的激 活有关 5. 生物学活性 IL-2 可通过自分泌或旁分泌的方式发挥效应 生理性免疫应答过 程中, IL-2 不出现于血循环中, 故无内分泌样作用 在不同种属间,IL- 2 沿种系语向上 有约束性, 向下无约束性 如人 IL- 2 能促进小鼠 T 细胞增殖, 但小鼠 IL- 2 不能促进人 T 细胞增殖 (l)il- 2 对不同靶细胞的体外效应 1T 淋巴细胞 TH 细胞 CIL 和 Ts 细胞都是 IL- 2 的靶细胞 IL- 2 可促使 T 细胞 从 G] 转至 S 期, 从而促进 T 细胞增殖 静止 T 细胞仅表达 IL- 2R~ γ 需在高剂量 IL- 2 作用下才能被激活 免疫应答过程中, 激活的 TH 细胞产生 IL- 2 并作用于自身, 使之进 一步产生 IL-2 并表达 IL- 2Ra, 形成高亲和力 IL- 2R, 从而大大减低了剌激细胞增殖所 必需的 IL-2 浓度 IL-2 还可作用于邻近 T 细胞, 诱导抗原特异性 T 细胞增殖分化成效 应细胞 此外, IL-2 还可剌激 T 细胞产生 IFN γ 及 LT 等 若 T 细胞合成 IL-2 的功能 障碍, 可能引起抗原特异性 T 细胞无能 (anergy) 0 实验表明, T 细胞在胸腺的发育也需要 IL-2 参与 2IβL 根据 CD 到密度不同可将人 NK 细胞分为 CD~ 由和 CD~m 两个亚群 前者稳定 表达高亲和力 IL - 2R( IL- 2Rα 阳 ) 和中等亲和力 IL - 2R( IL - 2R~γ) ; 而后者多数仅表达中等亲和力的 IL- 2R~γ IL- 2 与高亲和力 IL- 2R 结合, 可强烈剌激 CD~ghtNK 细胞增殖 ; IL-2 与中等亲和力 IL-2R 结合, 无论对 CD~ght 还是 ω~mnk 细胞, 均能增强其细胞毒活性, 但促增殖效应 1~ 弱或无 此外, IL-2 还可诱导 lak 细胞增生, 剌激 NK 细胞产生 IFN

102 一第七章细胞因子/,,1NF α, 并增强这些细胞因子的细胞毒效应 3B 细胞 IL-2 可促使活化 B 细胞增生及产生抗体 4 单核巨噬细胞 IL-2 可促进单核巨噬细胞产生超氧离子并增强其杀瘤活性 (2) 体内效应 1 参与免疫应答 详见体外效应 2 抗肿瘤效应 IL-2 可抑制多种小鼠肿瘤的生长 IL- 2 与 1NF α IFN γ 有协 同杀瘤作用, 故可与 LAK TIL 联合用于治疗人体肿瘤 3 参与移植排斥反应 IL- 2 可引起, 心脏移植后的急性排斥反应, 并参与 G 吁币, 应 用抗体可阻断上述排斥反应的发生 ( 三 )IL- 3 见本节集落剌激因子 ( 四 ) IL - 4 Howard 等于 1982 年发现 IL- 4, 其旧名为 B 细胞生长因子 B 细胞剌激 因子 1 T 细胞生长因子 2 及肥大细胞生长因子 来源 IL- 4 主要由 ω'4+ T 细胞产生, 其他 T 细胞亚群如 TCRa~+ ω'8+, TCRγ 旷 iωi 胸腺细胞 激活的肥大细胞及嗜碱性细胞 某些 T 细胞白血病细胞株如 lurkat HSB-2 等也能产生 IL 刺激物与抑制物剌激 IL- 4 合成的物质包括各种抗原 抗 CD3 单抗 抗 TCR 单囚抗及丝裂原 (PHA ConA PWM) 等 某些细胞因子如 IL-2 PAF( 血小板活化因子 ) 及 1 4 本身等均可促进 IL-4 的产生 抑制 IL-4 产生的物质包括 1GF-~ 环胞霉素 A 等 3. 分子生物学特征人的 IL- 4 基因约有 10 恼, 是己知细胞因子基因中最大的一个, 由 4 个外显子及 3 个内含子组成, 位于第 5 号染色体 IL- 4 基因编码由 153 个氨基酸组成的多肤, 分子量为 20 凶 'a( 等电点 10.53), 分子中含 22 个氨基酸的信号肤 IL- 4 活性单位为单体, 有 2 个 N 糖基化部分及 3 个二硫键 人与鼠基因有 70% 同源性, 但前体蛋白 91 ~128 位氨基酸之间同源性很低, 故人 小鼠 IL-4 的生物学作用无交叉 o IL- 4 是含 4 个螺旋结构的细胞因子家族成员之一 4. IL- 4R IL- 4R 分子量为 130 kda, 属造血因子受体家族 由于 IL- 4 可与 IL- 2 竞争结合 IL-2R 的 γ 链, 故推测 IL-4R 是由特有的自身 α 链与 IL-2Rγ 链组成 IL-4R 广泛分布于各种类型细胞表面, 如 T 细胞 B 细胞 NK 细胞 肥大细胞 巨噬细胞 胸腺细胞 骨髓细胞 成纤维细胞等 sil- 4R 分子量与 mil- 4R 接近, 其并非来源于 mil- 4R, 而是由 IL-4R 基因转录后的不同拼接所生戚 IL-4 与 sil- 4R 和 mil -4R 的亲和力相似, 故 s 且 4R 为 mil- 4R 的强有力的竞争性抑制剂, 可用于抗移植排斥反应, 也可用于阻断 IgE 介导的过敏反应, 如哮喘 过敏性皮炎 食物过敏等 IL-4 的信号传导可能涉及激活受体相关的酷氨酸激酶 5. 生物学活性 IL-4 的生物学活性多来自体外实验研究结果 (1) 对 B 细胞 IL- 4 是 B 细胞生长和分化因子, 可使 B 细胞从 Go 进入 Gj 期, 并促进 B 细胞表达岛任 -[C- II 类抗原, 增强 B 细胞的抗原提呈作用 IL- 4 可使静止 B 细胞表达 FCE:R, 还可促进活化 B 细胞分泌 IgE 与 IgGj, 但抑制 IgG2 a IgG2 b IgG3 及酬的产生 ;IL 4 可促进 IgG 向胁 f 的类型转换, 故在 I 型超敏反应发生中起重要作用 (2) 对 T 细胞 IL-4 是 TH 2 细胞的自分泌生长因子, 对细胞的发育 增殖与分化起关

103 一篇免疫学基础知识键性作用, IL-4 基因敲除小鼠的 TH 2 细胞发育与维持均出现缺陷 ;IL-4 可促进 TH 2 细胞产生 IL-5, IL- 1O 等, 并参与 TH l 和 TH 2 细胞间的相互调节, 促进 TH 2 细胞增殖, 抑制 TH l 细胞增殖并下调 TH l 细胞介导的免疫应答 ; IL- 4 还能促进胸腺细胞及 CIL 的发育与成熟, 并增强 CIL 的杀伤活性 (3) 对巨噬细胞 IL-4 可抑制巨噬细胞激活 ; 阻断 00 γ 对巨噬细胞的激活效应 ; 抑制巨噬细胞的作用及 NO 前列腺素的产生; 促进 IL-IRa 的表达 此外,IL- 4 可诱导单核细胞分化, 促进其表达岛 1HC - II 类抗原和 CD23 分子, 增强其抗原提呈能力及吞噬作用 (4) 对内皮细胞 IL-4 可以促进内皮细胞表达某些粘附分子 ( 特别是 VAlα11-1), 促进淋巴细胞 单核细胞 嗜酸性粒细胞与内皮细胞的结合 ; 促进 IL-l 1NF α 及 00 γ 诱导的 ICAM-l 表达 此外, IL-4 还可促进内皮细胞分泌趋化因子, 如单核细胞趋化蛋 白 l( MCP- 1) 作用于嗜酸性粒细胞的趋化因子等 (5) 对肥大细胞 IL-4 是肥大细胞的生长因子, 可与 IL-3 协同剌激肥大细胞增生 (6) 对造血细胞 IL- 4 可与 G-CSF IL-3, IL-6 及 E 向协同, 促进骨髓细胞的粒系 肥大细胞 单核细胞系及红细胞系集落形成 由于 IL-4 在 19E 及嗜酸性粒细胞介导的炎症反应中起关键作用, 故可应用 IL- 4 拮 抗剂防治严重的过敏反应 ;IL-4 能抑制炎症因子的产生, 从而参加缓解炎症过程及某些 96 第实体瘤及淋巴细胞瘤的生长 ( 五 )IL-5 IL-5 旧称 T 细胞替代因子 (1RF) B 细胞生长因子 2(BαF- 2) B 细胞 分化因子 μ(bcdf 川 嗜碱性粒细胞分化因子 (EDF) 嗜酸性粒细胞集落剌激因子(Eo CSF) 剧增强因子(I 队 EF) 等 1. 来源 IL-5 主要由 TH 2 细胞和活化的肥大细胞产生 2. 刺激物 诱导 IL-5 产生的物质为细菌及肠道寄生虫感染 免疫复合物 刀豆素 A 钙离子载体 抗 1CR 单抗等 3. 分子生物学特征 人 IL- 5 基因定位于第 6 号染色体, 其编码产物含 115 个氨基 酸, 其中 19 个氨基酸为信号肤 糖基化的成熟蛋白分子量为 18 kda, 但通常以同源二聚 体 ( 约 40 kda) 形式存在, 属于 4 个 α 螺旋结构的细胞因子家族 人和小鼠 IL-5 同源性约 70%, 二者活性有交叉 0 4. IL- 5R IL 虫的私有链 (α 链 ) 含 WSXWS 结构, 其自链与 IL- 3 及 ω1-csf 共 用, 为 150 kda 的信号传导链 ( 即 KH97) 5. 生物学活性 与其他细胞因子相比, IL-5 的作用语较窄, 其作用的靶细胞主要是 嗜酸性粒细胞等 ;IL-5 的作用有种属特异性 ( 六 )IL-6 IL-6 旧称 B 细胞剌激因子 2(BSF - 2) B 细胞分化因子 (BmF) 00 ~2 杂交瘤浆细胞瘤生长因子 26 kda 蛋白 肝细胞剌激因子 (HSF) 等 1. 来源 产生 IL-6 的细胞主要是单核巨噬细胞 血管内皮细胞 成纤维细胞 角质 细胞及 T 细胞 ( 主要是 TH 2) 等, 此外还包括骨髓瘤细胞株 宫颈癌细胞株等 2. 刺激物与抑制物 能促进 IL- 6 产生的物质有 ips 病毒感染 某些细胞因子( 如 IL-l 1NF P 四 :;F 00- ~ 等 ) PHA A PA( tetradecanoyl - phorbor acetate) 等 可下调

104 一第七章细胞因子IL-6 产生的物质有地塞米松及 IL-4 等 3. 分子生物学特征人 IL-6 基因位于第 7 号染色体, 含 5 个外显子 IL-6 基因 5' 区含有若干转录调节元件, 其中 3 个元件对 IL- 6 的合成尤为重要 :1 NF-KB 结合序列 : IL-l 与 1NF 诱导 IL-6 产生即作用于这个元件 ;2 NF IL-6 序列 : IL-l IL- 6 1NF ips 诱导 IL- 6 合成时, 即通过该元件的作用加强 IL - 6 基因转录 ;3 岛但 E 序列 : forskolin 1PA 血洁 IL-l 及 1NF 即通过该元件促进 IL-6 基因转录 IL-6 由 212 个氨基酸组成, 其中包括 28 个先导序列, 其成熟糖蛋白分子量为 21 ~26 kda 人与鼠 IL- 6 DNA 序列同 源性达 60%, 而氨基酸同源性则为 42% 0 IL-6 的功能形式为同源二聚体 4. IL- 6R IL- 6R 由配体结合链 (60 kda) 和信号传递链 (gp130) 组成, 其中 gp130 虽 无配体结合能力, 但参与组成 IL- 6 高亲和力结合位点 这两条链均为跨膜的单链糖蛋 白, 属于造血因子受体超家族 配体结合链含 WSXWS 结构 ( 该结构与含 4 个 α 螺旋结构 的细胞因子相互作用 ); 信号传导链虽然也含以上两个结构, 但它对 IL- 6 并无专 - 性, 而 是 IL-6R LIFR 悦 b 但 CNIFR 共用的信号传导链 IL-6R 广泛表达于多种组织细胞, 包括活化 B 细胞 静止 T 细胞 NK 细胞 骨髓瘤细胞 肝细胞 髓样白血病细胞等 与其他可洛性细胞因子受体不同, 可洛性 IL-6R 能与 IL- 6 形成复合物, 进一步结合 gp130, 发挥 IL-6 的生物学作用 故 sil- 6R 并非膜受体拮抗剂, 而是膜受体的激动剂 盯IL-6 与其受体结合后导致 gp130 双聚体形成, 进而激活 J 且 i 激酶, 促进 SfAT3 与 胞生长因子田 (TCGF 田 ) 促肥大细胞生长活性( 岛伍 A) 原巨核细胞生长因子等 gp130 的 box3 相连, 使某些特异性基因表达, 完成信号传导 5. 生物学活性 IL-6 受体的广泛分布提示 IL-6 作用的靶细胞种类繁多, 从而在细 胞因子网络中可发挥多种效应, 如免疫调节 剌激造血 防御作用 急性期反应等 ( 七 ) IL 年从鼠骨髓基质细胞培养液上清中提取出一种因子, 可促进前 B 细 胞生长, 故称为淋巴细胞生长素 l(ip-i) 或前 B 细胞生长因子, 后定名为 IL-7o 1. 来源 主要来源于人的脾及胸腺 小鼠的骨髓基质细胞 脾 胸腺及肾脏 2. 刺激物 许多组织的基质细胞可白发产生低水平的 IL-7; 各种生长因子 植物血 凝素 丝裂原 LPS 等可剌激 IL-7 产生 3. 分子生物学特征 IL-7 基因定位于第 8 号染色体, 有 5 个内含子与 6 个外显子, 其产物的分子量为 221 王 Da 及 28 凶 a, 等电点约 9.0, 由 177 个氨基酸组成, 含 25 个氨基酸 的信号肤 人与小鼠 IL-7 基因的同源性为 85%, 氨基酸序列同源性为 60% 4. IL - 7R IL - 7R 分为低亲和力与高亲和力两型, 属于细胞因子受体超家族 高亲 和力 IL-7R 由 150~160 凶 a 的私有链与 641 王 Da 的 IL-2Rγ 链共同组成 IL-7R 分布在 T 细胞 前 B 细胞及骨髓细胞表面 酷氨酸磷酸化是 IL-7R 介导的跨膜信号产生和传递 过程中必不可少的步骤 mrna 的不同剪接可产生 sil-7r o 5. 生物学活性 IL-7 作用无种属特异性, 主要有以下作用 :1 促进前 B 细胞增生, 并有轻度促分化作用 ; 对成熟 B 细胞无作用 2 协同或直接剌激胸腺早期 T 细胞 (ω4- CD s - ) 和较成熟 T 细胞 (CD 4 + m S + 亚群 ) 增生 ; 促进 CIL 的增生分化并加强其杀伤活 性 3 促进外周血单个核细胞分化为 lak 细胞 ( 八 )IL- 8 见本节趋化因子超家族 ( 九 )IL-9 IL-9 最早作为 T 细胞生长因子被发现, 称为 P40, 其他旧名称还有 T 细

105 免疫学基础知1. 来源 主要由 TH 细胞产生, 还来源于人 T 细胞白血病病毒 l( HILV- 1) 转化的 T 细胞株 C5MT 刺激物包括病毒 PHA 抗 ω3 抗体 PMA 钙离子通道剂等 3. 分子生物学特征人 IL- 9 基因位于第 5 号染色体, 由 5 个外显子及 4 个内含子组成, 编码的蛋白由 144 个氨基酸组成 ( 含 18 个氨基酸的信号肤 ), 分子量为 37 kda 及 40 kda, 等电点 6.2~ IL- 9R IL- 9R 除配体结合链外, 与 IL-2R 共用信号传导链 (γ 链 )0 IL-9R 主要 分布于 TH 细胞 肥大细胞 巨噬细胞及部分胸腺瘤细胞表面 5. 生物学活性 IL-9 可与 IL-3 协同促进肥大细胞生长, 可促进某些 TH 细胞克隆生长, 可剌激人红细胞集落形成 ( 十 )IL- lo 1989 年 Fioretino 等发现, TH2 细胞在体外培养条件下产生一种可抑制 TH 1 细胞合成细胞因子的因子, 称为细胞因子合成抑制因子 (CSIF), 以后改称 IL- lo 1. 来源主要由 TH2 细胞产生 此外,THO 细胞 某些 TH 1 细胞 单核巨噬细胞 B 细胞及一些非淋巴细胞 ( 如角质细胞 ) 等也可产生 IL- lo 2. 刺激物包括丝裂原 ( 如 0 日 A) 等 3. 分子生物学特征 IL- lo 基因定位于第 1 号染色体, 由 4 个外显子及 3 个内含子 98 第一篇组成, 基因产物由 178 个氨基酸组成, 包括 18 个氨基酸组成的信号肤, 分子量为 18 凶 'a, 等电点 IL- lo 活性单位为同源二聚体 ( 分子量 35~40 凶 'a), 属于 4 个 α 螺旋结构的 细胞因子家族成员 IL- lo 基因和 EBV 基因组中的一段开放阅读框架具有高达 80% 以上的同源性, 该结 构称为 BCRF-1, 现名为 vil- lo, 其编码的蛋白具有部分 IL- lo 活性, 提示可能为病毒 摄取动物哺乳动物 IL- lo 的基因, 以利于自身生存 4. 生物学活性人 IL- lo 可作用于小鼠细胞, 而小鼠 IL- lo 则对人细胞无作用 (1) 对单核巨噬细胞 IL- lo 可抑制巨噬细胞产生细胞因子 ( 如 1NF IL-1 IL- 6 IL-12 ω1-csf, 趋化因子等 ) 及 PGE2 等, 并下调 MHC- II 类分子及某些协同剌激因子 识TH 1 细胞产生 IL - 12 ( IL - 12 是 NK 细胞激活剂 ), 从而间接抑制 NK 细胞活性 (5) 对其他细胞 IL- lo 是促进肥大细胞及胸腺细胞增生的协同因子 (AGIF) 0 IL-ll 主要由间充质来源的粘附细胞, 包括骨髓基质细胞株 PU - 34, MR ( 如 B7 等 ) 的表达, 从而抑制巨噬细胞的抗原提呈功能 此外,IL- lo 还可促进单核巨噬 细胞表达 IL-1Ra, 从而有抗炎作用 (2) 对 T 细胞 IL- lo 可直接抑制 TH 1 细胞增殖即产生 IL- 2 IFN - /"LT GM- CSF 等, 从而抑制 TH 1 细胞介导的免疫应答 此外, IL- lo 还可抑制 CIL 产生 IFN γ, 但对其 杀伤活性无影响 (3) 对 B 细胞 IL- lo 是 B 细胞有效的增殖分化因子, 并可上调其岛任 -I C - II 类分子 表达及产生刷 IgG 及 19A; 11 1GF - ~ 存在下, 能促进抗体的产生 ( 的对 NK 细胞 IL- lo 可抑制 TH 1 细胞 JT 细胞及 NK 细胞产生 m γ, 抑制 ( 十一 )IL-ll IL-ll 是 1990 年发现的一种造血细胞因子, 也称脂肪形成抑制因子 1. 来源

106 四一第七章细胞因子6 细胞株 胎儿肺成纤维细胞株 ( 岛 1RC- 5) 及 SV40 转化的滋养层细胞等产生 2. 刺激物 IL-1 PMA 等可剌激 IL-ll 产生 3. 分子生物学特征 IL-ll 基因位于第 19 号染色体, 由 5 个外显子与 4 个内含子组成, 编码由 219 个氨基酸组成的前体蛋白, 含 20 个氨基酸的先导序列, 成熟蛋白分子量为 25 kda 灵长类动物与人 IL-ll 基因的 DNA 序列有 97% 的同源性, 其蛋白的氨基酸序列中仅 11 个氨基酸不同 4. IL-llR IL-llR 由与配体特异性结合的 α 链及信号传导亚单位 gp30 所组成 后者与 IL-6R LIFR 也但 CNIFR 所公有 IL-ll 可诱导靶细胞的酷氨酸磷酸化 5. 生物学活性 IL-ll 最主要的功能是单独或协同其他细胞因子剌激骨髓造血干细胞的增殖 成熟 形成集落 具体如下 :1 协同 IL-3 促进巨核细胞集落形成 2 剌激 T 细胞依赖性抗体形成 B 细胞的发育 3 协同 IL-3 使骨髓早期祖细胞 Go 期缩短, 促进多 系 ( 粒细胞系 巨核细胞系和红细胞系 ) 祖细胞的增殖和分化 4 剌激 IL- 6 依赖的浆细胞瘤细胞的增生 5 增强机体初次与再次免疫应答 ( 十二 )IL - 12 IL - 12 分别由 Perusia 及 Gately 等首先发现, 他们根据该因子的不同生物学活性, 分别将其命名为 NK 细胞剌激因子 (NKSF) 和 CIL 成熟因子 (ClMF), 后统一命名为 IL 来源 IL-12 由 p35 及 p40 两条多肤链组成 p35 由 T 细胞 B 细胞 NK 细胞及单核细胞等产生 ;p40 主要由活化的单核细胞及 B 细胞产生 2. 刺激物 PMA, f 可离子通道剂等可诱导 IL-12 产生 3. 分子生物学特征完整的 IL-12 分子为 75 凶 'a, 由 40 凶 a 及 35 凶 a 的两个亚单位经共价键连接而成 IL-12 的 p40 与 p35 分别由两个基因编码, 二者均为单拷贝序列 p35 基因大于 6 恼, 而 p40 基因至少含 5 个外显子, 长度大于 20 恼 p40c 时也包括一个编码 328 个氨基酸的开放阅读框架, 内含编码由 22 个氨基酸组成的信号肤及其裂解位点的序列 IL-12 成熟蛋白含 302 个氨基酸, 为分泌蛋白 p35cdna 序列包括 1 个编码 253 个氨基酸的开放框架, 含 2 个潜在起始密码 (1, 35), 从第二个起始编码 1 个亲水信号肤 (1 5 个氨基酸 ), 第 1~34 氨基酸序列可能与膜相关蛋白有关, 也许对 pp35 与膜结合至关重要 与许多其他细胞因子一样, p35 蛋白含 4 个 α 螺旋结构, 而 p40 与 IL-6R 有高度同源性, 也含 19 样结构和 WSXWS 结构, 故认为 p40 是 p35 的可洛性受体, IL -12 异源二聚体即由细胞因子样蛋白与细胞因子受体样蛋白所组成 IL-12 为糖蛋白, 等电点 4.5~ IL-12R 单体 IL-12R 不结合 IL-12, 双体或寡聚体 IL-12R 可低亲和力与 1 12 结合, 组成高亲和力 IL - 12R 的另一个亚单位尚未确定 IL - 12R 的分子量为 110 kda, 表达于激活的 T 细胞和 NK 细胞表面 由于 IL-12 的 p35 p40 和 IL-12R 分别与 1 6 IL-6R 和 gp130 有很高的同源性, 而且相互结合的模式也十分相似, 故认为 p35 与 p40 结合后再与有传导信号作用的 IL-12R 结合, 类似于 IL- 6 IL- 6R 结合后与 gp130 的作用 5. 生物学活性 IL-12 的靶细胞主要是 T 细胞及 NK 细胞, 参与调节细胞免疫应答 ( 十三 )IL-13 IL-13 于 1993 年被命名, 人 IL-13 主要由活化 T 细胞产生, 小鼠则由 TH 2 细胞亚群产生

107 100 第一篇免疫学基础知识1. 分子生物学特征人 IL-13 基因定位于 5 号染色体, 为单拷贝基因, 全长为 4.6 恼, 包括 4 个外显子与 3 个内含子 IL-13 由 132 个氨基酸组成, 其中含有 18 个氨基酸的信号肤, 其成熟蛋白分子量约为 10 kda 人与小鼠 IL-13 基因有 66% 同源性, 其蛋白产物有 58% 同源性, 二者生物学作用有交叉 IL-13 与 IL-4 基因紧密连锁, 在蛋白水平有 30% 的同源性, 且二者生物学活性相似 最新研究表明, IL-13 和 IL-4 具有共同信号传导途径 2. 生物学活性 IL-13 可作用于单核巨噬细胞 B 细胞 NK 细胞和前骨髓细胞等多种免疫细胞 ( 十四 )IL-14 IL-14 又称高分子量 B 细胞生长因子 (high molecular weight B cell growth factor, HMW - BαF) 成熟 IL-14 由 468 个氨基酸残基组成, 单体形式, 主要由 T 细胞产生 IL-14 可诱导活化 B 细胞增殖, 但对静止 B 细胞无剌激作用 ; 还可抑制丝裂原剌激 B 细胞分泌抗体的效应 ( 十五 ) IL 年 Grabsrein 等发现了一种与 IL- 2 活性相似地细胞因子, 并命 名为 IL 来源人体大部分组织细胞可产生 IL -15, 如胎盘 骨酷肌 心 肺 肾 肝 单核 巨噬细胞及某些上皮细胞合成纤维细胞系 ( 如 CV-l EBNA 和 IMILH 等 ) 2. 分子生物学特征 猴 IL-15c 时也编码 162 个氨基酸的前体多肤, 其中包含 48 个 氨基酸的引导序列, 在 N 端切去这一引导序列即为成熟蛋白 人 IL-15c 时也包含 316bp 的 5' 端非编码区 486bp 的开放读码框及 400bp 的 3' 端非编码区 人与猴 IL-15 编码序 列的同源性达 97% 人 IL-15 分子量为 15 凶 'a, 其蛋白分子的一级结构 ( 氨基酸序列 ) 与 IL-2 不同,{E! 二者空间结构相似, 同属于 4 个 α 螺旋结构子细胞因子家族 3. IL-15 受体 IL-15R 为高亲和力受体 ( 亲和系数约在 ~ 5 X 10-10M 之间 ), 分布在多种细胞表面, 如单核巨噬细胞 T 细胞 EBV 转化的 B 细胞 NK 细胞 血管内皮 细胞及肿瘤细胞 ( 如肝细胞瘤细胞 B 淋巴细胞瘤 T 淋巴细胞瘤 单核细胞白血病细胞 等 ) 据报道 IL- 2R~ 与 γ 链均参与 IL-15 应答, 而 γ 链则与 IL-15 的结合传导都有关 4. 分子生物学特征 目前对 IL-15 功能的研究仅限于淋巴细胞, 己发现其作用与 1 2 相似 由于 IL-15 的细胞来源及靶细胞的分布均较 IL- 2 广泛 故 IL-15 可能在不 表达 IL-2 的解剖部位发挥与 IL-2 相似的作用 二. 干扰素 (interferon, IFN) 干扰素是最先发现的细胞因子, 因其具有干扰病毒感染和复制的能力故称干扰素 根据来源和理化性质, 可将干扰素分为 αj 和 γ 三种类型 IFN α 自主要由白细胞 成纤维细胞和病毒感染组织细胞产生, 也称为 I 型干扰素 IFN γ 主要由活化 T 细胞和 NK 细胞产生, 也称为 H 型干扰素 二. 趋化因子 (chemokine) 趋化因子是一个蛋白质家族, 由十余种结构有较大同源性 分子量多为 8~ 1O 凶 a 的 蛋白组成 这些蛋白在氨基端多含有一个或两个半肮氨酸 根据半肮氨酸的排列方式, 将趋化性因子又分为亚家族 两个半肮氨酸按 Cys - X - Cys( 半肮氨酸 任一氨基酸 半肮氨酸 ) 方式排列的趋化性细胞因子属 α 亚家族, 也称 CXC 趋化性细胞因子 ; 以 Cys Cys 方式排列的趋化性细胞因子属自亚家族, 也称 cc 趋化性细胞因子 近年来, 又发现

108 101 第七章了氨基端只有一个半肮氨酸 (Cys) 的趋化性因子, 这种趋化性因子被命名为 γ 亚家族趋化 性细胞因子, 也称 C 趋化性细胞因子 趋化因子主要由白细胞与造血微环境中的基质细 胞分泌, 可结合在内皮细胞的表面, 具有对中性粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 嗜酸性粒细 胞和嗜碱性粒细胞的趋化和激活活性 IL-8 是 α 亚家族系的代表对中性粒细胞有趋化 作用 单核细胞趋化蛋白 1 (monocyte chemotactic protein - 1, MCP - 1) 是自亚家族的代 表, 可趋化单核细胞 淋巴细胞趋化蛋白 (1) 叫址 lotactin) 是 γ 亚家族的代表, 对淋巴细胞有 趋化作用 四. 集落剌激因子 造血干细胞的成熟涉及不同语系细胞的分化和增殖, 分化为某一特定语系的细胞即 丧失发育为其他谱系细胞的可能性 选择性剌激造血干细胞增殖分化成某一语系的细胞 因子, 称为集落剌激因子 ( colony - stimulating factor, CSF), 它们可剌激不同造血细胞系或不 同分化阶段的细胞在半固体培养基中形成细胞集落 所菊口随着分子生物学和免疫学技术的发展, 生产高纯度高活性的基因工程产品己成为可能, 己有越来越多的细胞因子及其受体相关制剂用于临床治疗, 并显示广阔的应用前景 一. 感染性疾病细菌性服毒血症休克 (batcerial septic shock, BSS) 可在感染细菌后数小时发生 细菌细胞壁内毒素剌激巨噬细胞产生过量的 IL-1 和 1NF α 是 BSS 发生的重要原因 给 BSS 患者注射重组 IL-1 受体拮抗剂或有中和活性的抗 1NF α 单克隆抗体可显著降低其死亡率 干扰素己被用于病毒性感染如病毒性肝炎 角膜炎和感染性生殖器捷的治疗 干扰素对利什曼原虫和弓形虫也有疗效 此外, IL-5 可被用于寄生虫感染 ; IL -12 可被用于纠正艾滋病 (AIDS) 病人 TH 1 细胞的进行性减少 二. 在免疫缺陷病和肿瘤治疗方面的应用对免疫缺陷病 病毒感染和肿瘤患者, 需要增强机体的免疫力 己获批准用于临床治疗的细胞因子种类越来越多 如用肝炎疫苗和 IFN 合用治疗病毒性肝炎, 体外激活免疫效应细胞, 再与细胞因子一起输注 其中重组的 IL- 2 1NF α IFN γ 等细胞因子己成功的用于临床治疗 高剂量的 IL- 2 可激活 NK 细胞和 T 细胞, 产生具有抗肿瘤活性的 LAK 细胞和 TIL 细胞, 治疗时同时加用细胞因子, 在临床肿瘤治疗中有一定的疗效 另外, 肿瘤化疗或骨髓移植后, 可用集落剌激因子治疗白细胞减少 二. 在器官移植方面的应用各种与细胞因子相关的方法和制剂己开始用来延长移植物的生存时间, 例如 :1 用缺少跨膜区和胞内区的可洛性 IL-1R 的基因工程蛋白来阻断同种异体抗原激活 TH 细胞的反应, 结果能延长移植心脏的生存时间 用保持结合能力而丧失生物学活性的 IL- 2 突变体产品也获得相似的结果 2 用抗高亲和力 IL-2Rα 链的抗体 ( 抗 TAC) 能封阻激活的 TH 细胞增殖和 Tc 细胞的激活 给心脏移植的大鼠注射抗 TAC 抗体能延长移植物的生存时间 3 用交联各种毒素的细胞因子也能延长移植的心脏或肾脏的生存时间 如交联白喉毒素的 IL-2a 能选择性结合并杀伤激活的 TH 细胞 忏子细胞因芸及真受体在 II 备床中的应用 胞因细

109 102 第一篇免疫学基础知识5 Mantavani Aτhe chemokine s 丁 ystem: redundancy for robust outputs. Immunol Today, 1999, 20 :254 四. 超敏反应 IL-4 和 IL-13 可诱导 B 细胞发生免疫球蛋白重链的类别转换而分泌 IgEa 制 IL-4 和 IL-13 可能预防 治疗 I 型超敏反应 因此, 抑 结语细胞因子是由免疫细胞产生的具有生物学活性的蛋白类物质的统称 从不同的角度, 细胞因子有多种其他的名称 绝大多数细胞因子是低分子量 (1 5 ~ 30 1 山川的蛋白或糖蛋白, 可通过旁分泌 自分泌等方式发挥作用 一种细胞可产生多种细胞因子, 不同类型的细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子 细胞因子的生物学活性可表现为多效性 重叠性 拮抗效应和协同效应 细胞因子通过作用于靶细胞的特异性受体而表现生物学活性 细胞因子主要包括四个部分 : 造血因子家族 干扰素家族 趋化因子家族和肿瘤坏死因子家族等 功能上分别参与天然免疫 ( 涉及抗病毒因子 炎性因子和调节因子 ) 特异性免疫和造血细胞的生长分化 趋化性细胞因子作为一种小分子量的细胞因子, 在炎症反应中发挥重要作用 细胞因子选择性地和相应受体结合, 并通过共同性传导链传递激活信号 细胞因子受体因结构和功能不同而分为细胞因子受体家族 干扰素受体家族 k 受体家族 蛋白酶氨酸激酶受体家族 肿瘤坏死因子受体家族和 7 次跨膜受体家族等, 并启动下列信号传导 途径 : 细胞因子受体的信号途径 酷氨酸蛋白激酶启动的受体信号途径和 体介导的信号途径 G 蛋白结合受 参号文献 1 叶德全. 白细胞趋化因子及其受体. 上海免疫学杂志, 1998, 18:3 2 Lefkovits 1. Immunology Methods Ma nua l, τhe Cαnprehensive S::>urce1:xx:>k of Techniques, Academic Press, San Diego, Stark GR, Kerr 1M, Willianms ERG, et al. How cells respond to interfer 口 ns. Annu Rev Eiochem, 1998, 67 :277 4 Deng H - K( 邓宏魁 ), Liu R, Ellmeier W, et al. Identification of the major co - receptor for primary isolates of HIV I.Nature, 1996, 381: 661

110 一第八章免疫细胞的检测第二篇 免疫学技术 第八章 免疫细胞的检测 参与机体特异性和非特异性免疫反应的细胞均为免疫细胞, 包括淋巴细胞 (T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞 ) 抗原提呈细胞( 单核巨噬细胞 树突状细胞和朗格汉斯细胞 ) 和 NK 细胞三大类以及红细胞和各种粒细胞 在免疫应答中, 免疫细胞相互协作, 共同影响着免疫应答的发生 发展和结局 用体外试验的方法 ( 有时在体内 ) 对各种免疫细胞进行分离 纯化 鉴定 计数和功能测定, 研究其在免疫应答中的作用以及相互关系, 是了解机体免疫 功能状态的重要手段, 并直接关系到疾病的诊断 疗效观察和预后判断 m第一币免疫细胞的分离与纯化对免疫细胞进行分离和提纯是进行计数和功能检测的前提 由于检测的目的和方法不同, 分离细胞的需求和技术也各不相同 根据免疫细胞的理化性状 表面标记以及粘附和吞噬能力等方面的差异, 临床上己建立起多种成熟的分离和纯化免疫细胞的技术 现有分离细胞群的原则, 一是根据各类细胞的大小 沉降率 粘附和吞噬能力加以组分, 另一则按照各类细胞的独特表面标记, 包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离 一. 白细胞的分离血液中红细胞与白细胞的比例为 600~ 1 000: 1, 两者的比重 ( 密度 ) 不同, 其沉降速度必然存在差异 据此特性, 临床上通常采用以下两种方法加以分离 (~) 自然沉降法通常采集外周静脉血, 采用肝素及时抗凝 将含有抗凝血的试管直立静置于室温 30~60 mi 口 由于红细胞的沉降率较快, 从而达到与白细胞分离的目的 这样, 试管中的抗凝血分成明显的三层 : 上层为淡黄色的血浆, 底层为红细胞, 两者之间的灰白色层即为白细胞 轻轻吸取该细胞群, 加入蒸榴水作低渗处理或用含氯化镜的 Gey 洛液处理, 经反复离心洗涤从而得到纯度较高的白细胞悬液 ( 二 ) 高分子聚合物加速沉降法明胶 右旋糖团干 聚乙烯口比咯炕酣 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 等高分子聚合物, 可以使红细胞凝聚成串珠状, 加速红细胞的沉降速率, 使之易与白细胞分离开来 本法白细胞的获得率比自然沉阵法明显要高 二. 外周血单个核细胞的分离外用血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell, PEMe) 主要是指淋巴细胞和单核细胞, 是免疫学试验中最常用的细胞群 外周血来源的各种血细胞其体积 形态和密度各异 : 红细胞和多核白细胞的密度相对较大, 为 左右 ; 淋巴细胞和单核细胞的密度为

111 104 第一一篇1. 075~ ; 血小板为 ~ 因此, 利用一种密度介于 ~ 之间, 近于等渗的洛液 ( 分层液 ) 进行密度梯度离心, 可使不同类别的血细胞按其相应密度分布, 从而达到分离细胞的目的 对 PBMC 的分离也是进行 T 细胞和 B 细胞分离纯化的重要中间环节 (~) 聚蔚糖泛影葡肢 (ficoll - hypaque, F - H) 分层液法这是一种单次密度梯度离心分离法, 为目前最常用的分离 PBMC 的方法 聚蔚糖泛影葡肢分层液, 顾名思义是由聚蔚糖和泛影葡肢按适当比例配置而戚, 其主要成分聚蔚糖 ( 分子量 40 lilla, 具有高密度 低渗透压 无毒性的特点 ) 是一种合成的震糖聚合物, 商品名为 Ficoll ; 泛影葡肢国外常用商品名为 Iso! 泊中 Ie 和 Hypaque, 故又名 ficoll - hypaque 分层液 这是一种非常理想的细胞分层液, 一般称为淋巴细胞分离液 因为人的红细胞密度为 , 粒细胞密度为 , 单个核细胞在 ~ 之间, 所以分离人外周血淋巴细胞的分层液密度以 土.001 为最佳 配置方法 : 将适量 340g L( 密度为 ) 的泛影葡肢加入 60 g L( 密度为 ) 的聚蔚糖中即可 国内商品如上海试剂二厂生产的淋巴细胞分离液, 密度为 土 0.002, 完全符合临床要求 需要指出的是, 在动物实验中, 不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同, 如小鼠为 , 马为 操作步骤如下 : 先将淋巴细胞分离液充分混匀, 取 2 m! 置于试管底层, 将肝素抗凝全血以 Hanks 液或 PBS 液作适当稀释后, 轻轻叠加在分层液上面, 两者可形成一个清晰的界 免疫学技术面 以 2000 r rni 口低速离心 15 rni 口, 离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带 红细胞密度最大, 同时 ~ Ficoll 而凝聚成串钱状而沉积于管底 ; 粒细胞密度次之, 也在管底 ; 血小板因密度小而悬浮于血浆中 ; 在血浆层和分离液之间聚集呈灰白膜状的即为 PBMC 最后吸取该层细胞经反复洗涤离心, 可得纯度较高的单个核细胞 该法分离单个核细胞纯度可达 95%, 其中淋巴细胞占 90% ~95% 细胞获得率一般可达 80% 以上, 其高低与室温有关, 室温超过 25'C 时会影响细胞获得率 ( 二 ) Percoll 分层液法 Percoll 的主要成分为聚乙烯毗咯炕酣包被的二氧化石夕, 对细胞无毒无剌激性, 与其他密度梯度材料相比, 具有价廉 梯度易制备及可直观检测等优点, 且其对细胞的粘附较易洗脱 因此, 这是一种对细胞影响较小的新型密度梯度离心分离剂, 主要用于对 PEMC 悬液中细胞组分的进一步分离 1. Percoll 连续密度梯度分层液法用密度为 的 Percoll 原液与约等量双离子强度的磷酸盐缓冲液均匀混合, 高速离心后, 使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度 将己收集的 PBMC 悬液轻轻叠加在分层液面上, 低速离心, 可得到四个细胞层 : 底层为密度相对最大的粒细胞和红细胞 ; 表层为密度较小的死的细胞残片和血小板 ; 中间层又分为两层, 上层富含单核细胞, 下层富含淋巴细胞, 收集该细胞悬液, 淋巴细胞含量超过 98% 2. Percoll 不连续密度梯度分层液法按照分离不同密度免疫细胞的需要, 将 Percoll 原液和适量的 Hanks 液配制成不同浓度的分离液, 将分离液按浓度大小依次叠加至离心管中, 即得到不连续密度梯度分离液 余步骤同 Percoll 连续密度梯度分层液法 综上所述, Percoll 分层液法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一种较好的方法,{E:! 操作流程较长, 步骤较复杂, 试剂耗费较大, 戚本相应增加 二. 淋巴细胞的纯化与亚群分离

112 m一第八章免疫细胞的检测淋巴细胞是最重要的免疫细胞 临床上研究免疫细胞, 特别是淋巴细胞的功能, 常需用高纯度的淋巴细胞及其亚群, 为此, 需要进一步分离纯化淋巴细胞 (~) 纯淋巴细胞的采集 1. Percoll 连续密度梯度离心法人外周血依次通过 F-H 分层液密度梯度离心法和 Percoll 连续密度梯度离心法制备的淋巴细胞悬液, 淋巴细胞含量超过 98%, 可满足一般临床需要 2. 对己制备的 PBMC 悬液采取以下步骤可获得高纯度的淋巴细胞 (1) 去除红细胞先用无菌蒸榴水作低渗处理或用含氯化镜的 Gey 溶液处理, 然后用 PBS 液反复洗涤 (2) 去除血小板一般仅采用反复离心洗涤, 即可去除 PBMC 中绝大部分混杂的血小板 (3) 去除单核细胞和粒细胞这两种细胞具备特有的粘附和吞噬功能, 并且胞质内富含洛酶休颗粒, 基于以上特性, 建立了许多分离淋巴细胞的方法 1 粘附注 中性粒细胞和单核细胞均具有粘附能力, 特别是单核细胞, 在适宜条件下 对玻璃和塑料表面有很强的粘附能力, 又称粘附细胞 据此特性, 将己制备的 PBMC 悬液 放置于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中, 于 3 7'C 温箱内静置约 1 h, 单核细胞和粒细胞均贴于器皿表面, 而未贴壁的细胞几乎为纯淋巴细胞 亦可将 PBMC 悬液通过玻璃纤维或葡聚糖凝胶 Sephadex GlO 柱进行过滤, 凡有粘附能力的细胞, 即中性粒细胞和单核细胞绝大多数被粘附在柱层中, 从柱上洗脱下来的细胞便是淋巴细胞 该方法简单易行, 对细胞极少损害 但 B 细胞也有一定的粘附能力, 用此法分离时淋巴细胞中的 B 细胞会有一定的损失 2 吞噬法中性粒细胞和单核细胞均具有吞噬能力, 统称吞噬细胞, 其中单核细胞具有很强的吞噬能力 取己制备的 PBMC 悬液加入直径为 3μm 的碳基铁颗粒, 置 3 7'C 温箱内短时旋转摇动, 使吞噬细胞充分吞噬碳基铁颗粒, 此时吞噬细胞因吞噬碳基铁粉而细胞密度增大, 经 F-H 分层液密度梯度离心处理, 吞噬细胞将沉积于管底, 从而分离到较纯的淋巴细胞 亦可待单核细胞充分吞噬碳基铁粉后, 用磁铁将细胞吸至管底, 上层液中即 含较纯的淋巴细胞 3; 容酶体法将己制备的 PBMC 悬液经苯丙氨酸甲醋 (PME) 处理, 苯丙氨酸甲醋因其亲洛酶体特性而渗入单核细胞和粒细胞的洛酶体内并被水解为游离氨基酸, 这会导致洛酶体因渗透压改变而破裂, 释放出大量的酶类物质, 进而引起细胞溶解, 破坏了单核细胞和粒细胞 淋巴细胞中的 B 细胞和绝大多数 T 细胞缺乏洛酶体酶, 因而基本不受影 响 ( 二 ) 淋巴细胞亚群的分离随着免疫学的不断发展以及对淋巴细胞研究的深入, 分 离淋巴细胞亚群成为必需, 也是细胞免疫检验的基本技术 根据细胞的特性和标志选择性纯化所需细胞的方法是阳性选择法 ; 而选择性去除不要的细胞, 仅留下所需的细胞为阴性选择法 纯化和分离淋巴细胞可以根据细胞的表面标记 理化特性和功能等不同, 借助多种方法未完成 常用以下几种方法 : I. E 花环沉降法成熟的人 T 细胞表面表达绵羊红细胞 (SRBC) 受体, 即 ω2, 这是一种糖蛋白, 能与 SRBC 上的相应配体 (CD 到 ) 结合而形成 E 花环, B 细胞无此能力 据此,

113 106 第一一篇将拟分离的淋巴细胞悬液与一定比例的绵羊红细胞混合, 待淋巴细胞形成 E 花环后, 再经聚蔚糖泛影葡肢淋巴细胞分离液密度梯度离心处理 悬浮在分层液界面的即为 B 细胞 ;T 细胞因 E 花环的形成而密度增大, 经低速离心后沉积于管底, 再用低渗法裂解 SRBC, 则获得纯的 T 淋巴细胞 该方法简便易行 ; 其阳性选择所获得的 T 淋巴细胞纯度较高, 可达 95% 以上 ; 细胞获得量大 ; 可同时获得 B 淋巴细胞, 纯度可达到 80% 以上 因此, 适宜一般的实验室采用 但 E 花环的形成可能导致 T 淋巴细胞的活化 2. 尼龙毛分离法单核细胞和 B 淋巴细胞易于粘附于尼龙纤维表面, 而 T 淋巴细胞则不易粘附, 从而可以将 T B 细胞分离开来 方法如下 : 取松散而经过处理的尼龙毛 ( 聚酷肢纤维 ), 均匀填充在内径 5~6 mm 的聚乙烯塑料管 ( 经过处理的饮料管亦可 ) 内, 经 Hanks 液浸透保温, 将拟分离的 PEMC 悬液加入管内, 于 3 7'C 温箱静置约 1 h o 用预温的含 10% ~20% 小牛血清的培养液灌洗, 洗脱液内即为 T 淋巴细胞, 重复灌洗几次以去除管内残留的 T 细胞 再用冷或温的培养液边洗边挤压塑料营, 此时洗脱液内富含 B 细胞 此法简便快速, 无需特殊设备, 淋巴细胞活性不受影响, 所获 T 淋巴细胞纯度可达 90% 以上 但尼龙棉柱可能会选择性的滞留某些 T 细胞亚群, 并且 B 细胞也较难洗脱, 可能混杂有未洗尽的 T 细胞和死亡细胞, 回收率低 免疫学技术体反应的特异性来达到分离的目的, 又分为直接法和间接法 直接法步骤如下 : 用特异性抗体包被塑料反应板, 加入拟分离的淋巴细胞悬液, 表达特定膜抗原的淋巴细胞即与相应抗体结合而被吸附于反应板上, 此时从悬液获得的即为抗原阴性细胞 间接法步骤如下 : 用羊 ( 或兔 ) 抗小鼠 IgG 抗体 ( 第二抗体 ) 包被反应板, 加入己结合了特异性单抗的待分离的淋巴细胞悬液, 经抗原抗体反应, 淋巴细胞被吸附固定, 从而达到分离的目的 该方法细胞获得量较大, 可同时完成淋巴细胞的阳性选择和阴性选择 但在被吸附淋巴细胞的分离过程中易损伤细胞膜, 导致细胞活性降低 ; 淋巴细胞受体与特异抗体或抗 3. 亲和板结合分离法该方法利用不同的淋巴细胞表达不同的膜抗原以及抗原抗 原接触, 可引起细胞激活 因此, 当去除细胞悬液内某一细胞亚群时, 本法更适合, 也就是说, 亲和板结合分离法更适合进行阴性分选 4. 流式细胞术 (flow cytometry) 分选法流式细胞仪 (flow cytometer, Fα1) 是集现代电子物理技术 激光技术 电子计算机于一身的先进科学仪器, 能快速 精确的测量通过检测区液流中的各种粒子, 适用于对单个细胞进行定量分析和分选 在流式细胞仪的基础上, 又进一步发展形成了荧光激活细胞分离仪 (fluorescence acti vated cell sorter) 它主要由四个部分组成:1 细胞流动系统及气压流速控制系统 ;2 激光系统 ;3 检测与讯号处理系统 ;4 细胞分选系统 其主要原理是 : 使拟分离的细胞悬液与相应的标有荧光素的单克隆抗体反应, 将待分离细胞荧光染色后, 通过高速流动系统, 细胞排成单行, 逐个流经检测区进行测定 当细胞从流动室喷嘴处流出时, 超声振荡搅动液流, 使液流断裂成一连串的均匀小滴 ( 个 s 或更高 ), 每小滴内最多含一个细胞 ( 其中只有百分之几的液滴中含细胞 ) 细胞经激光束照射产生荧光和散射光, 检测器根据激光束的散射, 判断液滴是否含有细胞 ; 并将各种光电信号转换成脉冲信号, 数据经电脑处理, 分辨细胞的类型 还可借助光电效应, 使微滴通过电场时出现不同偏向, 对所需的细胞进行分类收集, 并以数字准确显示细胞的数量 该技术能以每秒约 5000 个细胞的速

114 第八章度无菌收集细胞 该方法分离速度快 ( 可达到 5000 个细胞 s 以上 ) ; 回收率高, 细胞纯度高 ( 一般 95% 以上, 甚至可达到 100%) ; 细胞活力和结构不受影响 ; 细胞的分析和收集同时完成 ; 并可广泛应用于淋巴细胞及其亚群的分选 白血病细胞的分型等 但仪器昂贵, 小型实验室仍难以购置, 一般仅适用于大型研究院所 5. 磁性激活细胞分离器 (magnetic activated cell sorter, MACS) 分离法该方法以磁性微粒 ( 平均直径小于 1. 5!Lm) 为固相载体, 使己知抗细胞表面标 i 己的特异性抗体与之交联形成免疫磁珠 (irm 丑 une magnetic bead, 1MB), 再用磁场吸引使之与液相分离, 从而达到分离细胞的目的 直接法步骤为 : 直接将特异性抗体与磁性微粒交联形成免疫磁珠,1MB 可与表达相应膜抗原的细胞特异性结合, 将此细胞悬液置于磁场中, 因磁珠被磁场吸引, 将磁珠结合细胞与磁珠非结合细胞分开, 可以同时完成对特定细胞的阳性和阴性分选 间接法步骤为 : 用羊 ( 或兔 ) 抗小鼠 IgG 抗体 ( 二抗 ) 包被磁性微珠, 使己结合鼠源性单克隆抗体 (~ 抗 ) 的待分离细胞与之反应, 使磁珠结合在待分离细胞上, 从而对细胞进行分 离 在此基础上, 利用生物素 ( bioti 日, B) 与亲和素 (avidi 日, A) 之间极高的特异性亲和力以及生物放大效应, 在特异性抗体和磁性微粒之间引入生物素亲和素 ( 或链霉亲和素, streptavidin) 生物素系统 ; 两个 B 分子中, 一个用来标记特异性的单克隆抗体, 另一个用来结合 IMB a 这样, 进一步提高了细胞的分离效率和所获细胞的纯度 MACS 法所获细胞纯度高, 可达到 93% ~99%, 收获率可达 90%, 分离效果可与流式细胞仪相媲美, 省时且费用较低, 操作相对简单 {E! 抗体可能导致阳性分选获得的细胞活化或调亡, 从而在一定程度上影响了分选细胞的活细胞率 以上介绍的几种纯化淋巴细胞及其亚群的方法各有利弊, 各实验主要结合实际并根 免疫细胞的检测107 据研究需要, 选择最适合的方法 四. 单核 - 巨噬细胞的分离和收集 收集和分离单核 巨噬细胞, 一般可以采取以下几种方法 : (~) 吸附分离法 单核细胞具有吸附于国相表面的特性, 把己制备的 PBMC 放于玻 璃或塑料平皿内, 3TC 孵育一定时间, 吸附于平四壁上的细胞即为单核细胞, 用机械的或 酶作用的方法剥离并富集, 4'C 保存备用 本方法操作简便, 但在单核细胞的剥离过程中 易损伤细胞并且回收率低 ( 二 )Percoll 连续密度梯度离心法 人外周血中单核 巨噬细胞可通过 Percoll 连续密 度梯度离心法获取, 方法如上文所述 所得到的细胞悬液中单核细胞纯度可达到 83%, 能满足一般临床要求 ; 但该法比较繁琐, 用血量多, 得到的细胞数量也较少 ( 三 ) 斑茧敷贴法 用滤纸蘸取 10% 中药斑茧酒精浸出液, 贴敷在病人前臂内侧皮肤 表面, 人为诱发无菌性皮炎 4~5h 后病人皮肤局部充血, 48 h 后局部形成水瘤, 吸取水 痛中的组织渗出液, 即可获得巨噬细胞 用斑茧敷贴 ; 去可从人体组织渗液中获取数量较 多且较纯的巨噬细胞, 不需作进一步体外分离, 细胞损失量亦较小 {E! 此法对病人皮肤有 一定损伤, 有时可引起局部感染, 应慎用 ( 四 ) 小动物腹腔注射法 选择小鼠 大鼠 豚鼠等小动物, 将适量无菌石蜡油注入其

115 108 第一一篇腹腔, 造成无菌性腹腔炎, 3~4 天后冲洗腹腔, 所得细胞悬液中含大量巨噬细胞, 纯度可达 80% 五. 自然杀伤细胞的制备自然杀伤细胞 (natural killer cell, NK) 无粘附作用, 是一群具有自然杀伤能力的淋巴细胞, 来源于骨髓造血干细胞, 主要分布于外周血和牌, 约占外周血的 3% 临床上, 一般通过以下步骤来制备 : 首先用聚蔚糖泛影葡肢密度梯度离心法制备 PBMC 悬液 ; 利用单核细胞吸附的特性, 用粘附法去除单核细胞, 收集未粘附的细胞并重 新制成细胞悬液 ; 将此细胞悬液加入装有饱和浓度抗町 抗 m 抗 CDs 和抗吼 抗体 的聚苯乙烯管中, 4'C 振荡孵育 30 min, 1 吏之充分结合 ; 再将该细胞悬液与磁珠混合, 冰浴 30 min, 使发生抗原抗体反应的细胞 ( 淋巴细胞 ) 包被在磁珠上 ; 用磁铁吸引, 则包被在磁珠上的淋巴细胞被吸附在靠近磁铁一侧的管壁内侧并留在试管中, 轻轻倾倒上清液, 即获得 NK 细胞 (m 3 - CD 4 - CD s - 和 CD2~ ) 本试验中, 血标本应注意保持新鲜, 宜在 4'C 下分离细胞, 以保持细胞活力 六. 外周血中性粒细胞的制备中性粒细胞是存在于血循环中的小吞噬细胞, 为外周血中含量非常丰富的免疫细胞, 免疫学技术占健康成人白细胞总量的 50% ~70% 作为感染发生时最早被招募到感染部位的吞噬细胞, 在机体抗感染免疫中起重要作用 中性粒细胞的分离方法如下 : 首先利用右旋糖团干加速红细胞的沉降 ; 再将富含白细胞的上层 ; 使用聚蔚糖泛影葡肢淋巴细胞分层液进行离心分离, 使粒细胞沉于管底而与淋巴细胞和单核细胞分离 七. 红细胞的分离红细胞是外周血中含量最丰富的免疫细胞 将抗凝外周血离心沉淀, 反复洗涤, 去除白细胞和血小板, 便可大量获得红细胞 第二币 淋巴细胞及真亚群的检测 淋巴细胞是复杂的不均一的细胞群体, 包括许多形态相似 表面标记和功能各异的细胞群和亚群 主要借助于对细胞表面的表面标记 ( 抗原或受体 ) 的检测, 完成对 T B 淋巴细胞及其亚群的测定 由于近年来 Fαf 的相对普及, 对淋巴细胞测定均可采用 Fα4 未完成 ( 详见第十五章 ), 此处不再赘述 一.T 细胞的检测 (~) 特异性受体的检测 T 细胞表面有特异性绵羊红细胞 (E) 受体 (ω2 ) 和 T 细胞抗原识别受体 (1C R), 其中 E 受体因能与绵羊红细胞特异性结合而形成 E 花环曾被广泛用作鉴定和计数 T 细胞的标志 E 花环试验基本步骤如下 : 将己制备的人淋巴细胞 ( 或 PBMC) 与绵羊红细胞悬液按一定比例 ( 约 1: 100) 混匀后, 置 4'C 至少 2h Ej 戈过夜, T 细胞表面的 E 受体可与绵羊红细胞结合而形成玫瑰花样的花环 取样涂片染色镜检, 凡受检细胞周围粘附有 3 个或更多绵羊红细胞的即为 T 细胞, 又叫 E 花环形成细胞 花环形成细胞与计数细胞总数之比即为 T 细胞的百分率 一般健康成年人外周血中测得的 T 细胞数值为 60% ~80% 如减少淋

116 m一第八章免疫细胞的检测巴细胞与绵羊红细胞的比例 ( 约 1: 20), 两者混合后, 经短时间的温育即行取样涂片镜检计数, 仍可见部分淋巴细胞形成花环, 称为活性 E(Ea) 花环, 它可能代表 T 细胞的一个亚群 其数值一般仅为总 E 花环的 1 3~1 2, 或 20% ~40% 检测 Ea 花环形成细胞比总 E 花环形成细胞更能反映受检者的细胞免疫水平 花环试验因操作简便易行, 曾被广泛使用 ; 但影响因素较多, 操作稍有不同, 所得结果差异较大, 并且结果需人工计数, 重复性差, 因此逐渐被检测特异性抗原的方法所取代 ( 二 ) 特异性抗原的检测 T 细胞表面有 CD2 m m CDs 和 ω2s 等分化抗原, 随着 抗 CD 系列单克隆抗体制备技术的日趋成熟和商品化, 对 T 细胞表面特异性抗原的检测逐渐成为主流 常用的主要有以下几种 : 1. 免疫荧光法应用荧光素标 i 己的抗 CD 单克隆抗体与己制备的 PBMC 结合 ( 直接免疫荧光法 ) 或荧光素标 i 己的羊 ( 或兔 ) 抗小鼠 IgG 抗体 ( 二抗 ) 与己结合了抗 CD 抗体的 PBMC 结合 ( 间接免疫荧光法 ), 在荧光显微镜下观察并计数 一般计数 200 个淋巴细胞, 求出荧光阳性细胞与计数细胞总数之比, 即为相应 CD 抗原阳性 T 细胞的百分含量 2. 免疫组织化学法这是利用己标 i 己的特异性抗体与组织或细胞的抗原反应, 结合形态学检查, 对抗原定性 定量 定位检测的一项技术 酶免疫组化法是使酶标记抗体与 细胞涂片反应, 通过酶对相应底物的催化显色, 检测细胞的特异性表面标记, 从而鉴定细胞种类或其亚群 最常用的是碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶 (APAAP) 免疫桥联染色法 ; 也可应用亲和素和辣根过氧化物酶标记生物素的复合物 (ABC) 与生物素特异性抗体 ( 或二抗 ) 结合, 对细胞表面抗原进行检测 另外, 还可用免疫金银染色法 (lgss, 抗体致敏的肢体金颗粒标记 ) 0 AP 丛 P 免疫桥联染色法检测 T 细胞亚群的原理为. 第一抗体与组织或细胞中的抗原结合 ; 第二抗体起桥联作用, 其中一个 Fab 段连接第一抗体, 另一个 Fab 段连接抗碱性磷酸酶抗体 ( 第三抗体 ) 与碱性磷酸酶的复合物 (AP 丛 P complexes) ; 通过 APAAP 复合物的碱性磷酸酶催化底物显色以鉴定抗原物质 由于这种方法的第一抗体和第三抗体复合物是 通过一个二抗分子交联的, 因此第一抗体和第三抗体必须来源于同一种屑的动物 其基本步骤如下 : 取人外周血通过 F-H 分层液密度梯度离心法获得 PBMC( 淋巴细胞占 90% ~95%), 并加入一滴灭活的小牛血清后, 涂片 晾干并固定 ; 依次加入单抗 二 抗 ( 羊抗鼠 ) 和三抗, 在每次反应完后都用 PBS 液冲洗 ; 再加入含有坚固红的底物液 ; 用苏 木素染色, 吹干后用明胶封片, 在油镜下镜检计数细胞 该实验染色后制备的细胞标本使用普通光镜观察和计数, 并可长期保存, 适于基层医院开展 {E! 细胞计数人工进行, 受主观因素影响较大 3. 金黄色葡萄球菌花环法金黄色葡萄球菌细胞壁中的蛋白 A(SPA) 能与人及多种哺乳动物 ( 如猪 兔等 ) 血清中的 IgG 类抗体 Fc 段结合而形成 IgG 致敏颗粒, 但并不影响抗体的活性 以金葡菌结合单克隆抗体 ( 直接法 ) 或兔抗鼠 IgG 抗体 ( 二抗, 间接法 ), 形成 SPA- IgG 复合物, 此复合物可与表达相应膜抗原的 T 淋巴细胞结合, 使金葡菌被动吸附在 T 细胞周围而形成花环状 在油镜下计数花环形成细胞, 即为 T 细胞 4. 微量细胞毒试验以特异性的抗体与 T 淋巴细胞膜上的相应抗原结合, 进而激活补体, 借助补体依赖的细胞毒作用, 造成表达特定表面抗原的淋巴细胞损伤, 破坏胞膜的完整性 这时细胞膜的通透性增高, 染料 ( 伊红或台盼蓝 ) 可渗入胞内, 并使之膨胀着色,

117 110 第一一篇口在高 f 音镜下观察, 计数着色的细胞数即得 T 淋巴细胞的百分数 二.B 细胞的检测 ( 一 ) 特异性受体的检测 B 细胞表面有膜免疫球蛋白 (SmIg) Fe 受体 补体受体 (CR) 有丝分裂原受体和细胞因子受体等, 其中 SmIg 是 B 细胞特有的, 是鉴定 B 细胞比 较可靠的指标 1. SmIg 的检测 大多采用免疫荧光法或免疫组化法 ( 如亲和素 生物素系统的 ABC I 去 ) 进行检测, 关键是选用高效价 高特异性和高亲和力的荧光或酶标 i 己的多价抗人 19 抗 体, 也可分别用各种类型的 19, 即 Iβ1, 19G, 19A, 19E 等的抗血洁, 检测带有相应类型 19 的 B 细胞 在人外周血中以带有 Sm 胁 f 的细胞数为最多 需要特别指出的是, B 细胞经荧光标 i 己的抗 k 抗体染色后, 观察时间不能超过 30 rru 日 这是因为由双层类脂组成的淋巴细胞膜呈半液体状, 其上的蛋白质镶嵌物如 SmIg 自旨在其中移动 当 SmIg 与相应抗体发生特异性结合时, 由于抗血清为双价, 使 SmIg 出现 交联现象, 这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状, 时间过长, 帽状结合物可脱落或被 吞饮而消失 为延长观察时间, 也可在染色时加叠氨铀以防止帽状物脱落或被吞饮 2. Fe 受体的检测 B 细胞表面具有与 IgGFe 段结合的受体, 极易与抗原抗体复合物 中抗体 Fe 段牢固结合 用相应抗体致敏的红细胞 (EA) 作指示物, 在一定条件下, 它能与 免疫学技术带 Fe 受体的 B 细胞形成 EA 花环, 这就是 EA 花环试验, 可用于检测 Fe 受体阳性细胞的存在 3. 补体受体 (CR) 的检测 B 细胞表面具有补体受体 用相应抗体致敏的红细胞 (EA) 作指示物, 该 EA 复合物激活补体并形成红细胞 (E) 抗红细胞抗体 (A) 补体 (C) 复合物 (EAC), 在一定条件下,B 细胞以 CR 与 EAC 中的补体相结合, 这就是 EAC 花环试验 B 细胞表面的 CR 分为 CRl, CR2 CR3 等, 其中 CR2 即 ω21 分子, 是 B 细胞上的 EB 病 毒受体, 是 B 细胞所特有的受体标志 由于单核巨噬细胞 NK 以及部分 T 细胞表面也带有 Fe 或补体受体, 因此形成 EA 或 EAC 花环并非 B 细胞所特有 也就是说, 检测 Fe 受体 CR 的特异性不高, 会导致应用 EA 或 EAC 花环试验测得的 B 细胞数值偏高 另外该类试验需制备新鲜指示物, 操作繁琐, 临床上己基本不再使用 目前, 针对 B 细胞表面的各种受体, 均有相应的单克隆抗体出售, 有条件的实验室可以采用荧光计数方法和流式细胞仪来精确计数 ( 二 ) 特异性抗原的检测 B 细胞表面有 CD19 CD20 21 (CR2) ω22 CD40 CD 矶和 ω 叽等分化抗原, 其中有些系全部 B 细胞所共有, 而有些仅为活化 B 细胞所特有 应用针对相应抗原的 ω 系列单克隆抗体, 通过间接荧光免疫法 酶免疫组化法或 ABC 法对外周血 B 细胞进行检测 CD20 的表达严格限定于 B 细胞各前体细胞以及成熟 B 细胞, 健康成年人外周血 CD20 阳性细胞占淋巴细胞总数的 8% ~12% 一. 吞噬细胞功能测定吞噬细胞包括单核吞噬细胞系统 (mononuclear phagocyte system, 岛 1PS) 和中性粒细忏所菊一一一免疫细胞功能的测定

118 一第八章免疫细胞的检测川胞, 是参与非特异性免疫的最重要的免疫细胞之一, 同时巨噬细胞作为专职抗原提呈细胞 也是特异性免疫不可或缺的 因此, 吞噬细胞的功能在一定程度上反映了机体的免疫功 能状态 可以通过测定吞噬细胞功能来了解机体免疫功能状态, 并用于某些疾病的辅助 诊断与疗效观察 吞噬细胞的吞噬活动大致分为趋化 吞噬和胞内杀灭三个阶段, 在免疫学实验研究和 临床检验中己建立相应的检测方法 (~) 中性粒细胞免疫功能的检测 1. 中性粒细胞运动功能的测定 中性粒细胞的运动可分为随机运动和定向运动 随机运动类似于布朗运动, 其定向运动能力表现为趋化运动, 常用以下两种方法来测定 (l):&yden 小室法 ( 滤膜渗透法 ) 该方法需采用特殊的小盒装置, 以一片微孔滤膜将 小盒隔开并将其分为上下两个小室 在上室加入待测细胞 ; 下室加入趋化成分, 如酵母菌 活化的血清 经 3 7'C 温育反应数小时后, 取滤膜清洗并进行固定 染色和透明化, 在高倍 镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离, 从而判断其趋化作用 (2) 琼脂糖凝胶平板法 在琼脂糖凝胶平板上打孔, 在中央孔内加白细胞悬液, 两侧 孔内分别加趋化因子或对照液, 经温育后 (3 7'C, 2~3h), 用 2% 戊二醒固定, 然后染色, 观 察并测定细胞运动的距离, 以评估细胞的定向移动能力 可采用以下公式来计算移动指 (3) 化学发光测定法中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆发, 激活细胞膜上的还原 数 : 移动指数 趋化移动距离任意移动距离 2. 中性粒细胞吞噬 杀菌功能的测定 (1) 显微镜检法 将白细胞与葡萄球菌或活的白色念珠菌悬液按一定比例混合 温 育, 取样制片 固定 染色 ; 在油镜下计数 200 个细胞并观察多核白细胞对细菌的吞噬情 况, 计算其吞噬率 (% ) 和吞噬指数 (phagocytic index) 如果用美蓝洛液作活体染色, 还可 根据被吞噬的白色念珠菌是否着色测定杀菌率, 若胞内白色念珠菌呈蓝色, 则表示该菌己 被杀死 计算公式分别如下 : 吞噬率 % 吞噬细菌的细胞数. I ':t...4~;:;" 0': ~- :;.."-;:~:., X 100 % 计数的细胞总数 (200) 胞内含着染菌体的细胞数吞噬率 % 二 \100% 计数的细胞总数 (200) 200 个粒细胞的吞菌总数吞噬指数 % 二 \100% 计数的细胞总数 (200) (2)NBr( 硝基四氨瞠蓝 ) 还原试验 临床上常用本法来检测中性粒细胞的胞内杀菌 能力 其原理为 : 中性粒细胞在吞噬 杀菌过程中, 能量消耗骤增, 其氧的需要量也相应增 加, 己糖磷酸旁路糖代谢的活性增强 ; 葡萄糖分解的中间产物 6 磷酸葡萄糖在转变为戊 糖的过程中氧化脱氢, 所释放出的氢被己摄入吞噬体的 NBr 染料所接受, 使其由淡黄色 被还原成蓝黑色的点状或块状 Fonnaza 口颗粒, 沉积于中性粒细胞的胞浆内 这种有 Fonnazan 颗粒沉积的细胞称为 NBr 阳性细胞一般阳性细胞数超过 10% 即可判定为 NBr 试验阳性 儿童慢性肉芽肿时 N 町试验阳性率明显下降 另外, 临床上可把 NBr 试验作 为发热反应的鉴别试验

119 112 第一一篇性辅酶 (NADH 氧化酶和 NADPH 氧化酶 ), 使分子氧活化, 产生反应性氧中间物 (ROls) ; ROls 参与胞内杀菌作用, 同时能激发胞内某些物质产生化学发光 由于中性粒细胞的氧代谢活性与对细菌的吞噬率密切相关, 杀菌能力与发光强度相平行, 当应用鲁米诺 (luminol) 作为发光增强剂, 用光度计测量发光强度时, 可同时对中性粒细胞的吞噬 杀菌功能及血清的调理活性进行直观 快速的检测, 并且其敏感性要高于 N 町还原试验 ( 二 ) 巨噬细胞功能的测定 1. 吞噬功能的检测将受检细胞与适量的颗粒抗原 ( 一般选用鸡红细胞 ) 混合, 振荡温育 (3TC, 0.5~lh) 后, 离心取待测定细胞制成涂片, 染色镜检, 计数 200 个细胞, 分别计算出吞噬细胞的吞噬率和吞噬指数 该方法可在一定程度上反映吞噬细胞的吞噬功能, 但影响因素较多 2. 巨噬细胞洛酶体酶的测定巨噬细胞富含洛酶体酶, 如洛菌酶 非特异性醋酶等, 测定这些酶的活性也是衡量巨噬细胞功能的实用指标之一 现仅介绍非特异性醋酶中的 α 醋酸菜盼醋酶 (alpha - naphthol actate esterase, α NAE) 染色法 α 醋酸菜盼醋酶染色法的原理如下. 巨噬细胞内 α NAE 可将 α 醋酸菜酷分解成 α 荼酷和醋酸, 荼盼再迅速与坚牢蓝 B 相联, 形成不洛性灰黑色或棕黑色沉淀, 定位于胞质内 免疫学技术α NAE 比较稳定, 酶活性丧失较慢, 细胞经涂片干燥后, 置室温至少可保存半天至一天, 非常适用于临床 但在镜检阅片判读结果时, 受主观因素影响较大, 需要操作者积累一定的经验方能准确报告结果 3. 巨噬细胞促凝血活性的测定激活巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子, 能力口速正常血浆的凝固 取己经 3TC 预温的正常兔血浆和 CaC12 的混合液, 加入粘附有单层巨噬细胞的试管中, 移置 3TC, 即时记录血浆凝固时间 实验证明当巨噬细胞先与 ips, 肿瘤相关抗原或 HBsAg 等温育时, 血浆凝固时间明显缩短 本方法无需特殊的仪器设备, 操作简单 快速, 重复性好, 也是检测不同疾病患者巨噬细胞功能的指标之一 二.T 细胞功能测定 (~)T 细胞增殖试验本试验又称 T 细胞转化试验 T 细胞在体外受到抗原或丝裂原剌激后, 细胞的代谢和形态均发生变化, 主要表现为细胞内蛋白质和核酸合成增加, 发生一系列增生反应, 如细胞体积变大 胞浆增多 出现空泡 染色质正在松 核仁明显, 淋巴细胞转变为淋巴母细胞 因此, 这种淋巴细胞增殖又称为淋巴母细胞转化 (lymphoblast trans formation) 体外引起 T 细胞转化的剌激物有以下几类 :1 丝裂原, 如植物血凝素 (PHA) 刀豆素 A( Co 日 A) 和美洲商陆 (PWM), 其中 PWM 可剌激 T 和 B 两类淋巴细胞发生细胞转化 ;2 抗原性剌激物, 如破伤风类毒素 纯化蛋白衍生物 (PPD) 和白色念珠菌等 ;3 抗 T 细胞表面分子的单克隆抗体 (mab), 如抗 CD3 单抗 ;4 超抗原, 如葡萄球菌肠毒素 其中丝裂原引 起的淋巴细胞转化属于非特异性转化, 转化率较高, 因此常用 PHA 作为 T 淋巴细胞转化的剌激物 淋巴细胞转化试验是判断 T 细胞功能的一项常用的非特异性体外免疫学检测指标 目前, 己建立多种检测 T 细胞增生反应的方法, 可根据具体情况选择

120 h 后, 取培养细胞涂片染色镜检 依据淋巴母细胞转化的形态学特征, 借助光学显微镜, 计数 200 个淋巴细胞, 按下式算出转化率 转化的淋巴细胞数转化率 % =,~' ;"-,:;:"~,'; :;-~~ ;.::;:~ x 100 % 淋巴细胞总数 (200) 本法无需特殊仪器设备, 简单易行, 便于基层实验室推广使用 ; 但结果的判读依靠肉 眼进行, 有些细胞形态难以确认, 因而重复性和可靠性较差 2, 放射性核素 eh-tdr UdR) 掺入法将 PBMC 与 PHA 共同培养, 淋巴细胞受 剌激发生增殖, 其胞内新合成的 DNA 量明显增加, 需摄取核昔酸原料 此时若加入放射 性核素标 i 己的胸腺口音院 eh-tdr) 或尿口音院 ( 山 1 - UdR) 核昔参与反应, 新合成的 DNA 中 就会掺入己标 i 己的核昔酸, 并且掺入的量与细胞的增殖程度正相关 收集己培养的细胞, 用液体闪烁仪测定样品的自射线放射活性, 就反映出淋巴细胞增殖水平 本方法灵敏度高, 可自动操作 ; 但需要特殊仪器, 并且存在放射性核素污染的危险 3, MIT 比色法 MIT 是一种唾哩盐, 化学名为 3 - ( 斗, 5 二甲基 2 唾哩 ) - 2, 5 二苯基漠化四哩 将 PBMC 与 PHA 共同培养, 在细胞培养终止前数小时加入 MIT, 活细 胞内线粒体中的玻咱酸脱氢酶作用于 MIT 可生成蓝黑色的 Fonnazan 颗粒并沉积于细胞 内或细胞周围, 其生成量与活细胞数成正比 ; 死细胞中酶的活性丧失, 不能使 MIT 还原 因此, 通过特定波长下的分光光度测定, 可对细胞存活及生长情况进行定量测定和分析 床使用 此法无放射性污染, 重复性好, 且敏感性与放射性核素掺入法大致相当, 比较适宜临 ( 二 )T 细胞介导的细胞毒试验细胞毒性 T 淋巴细胞 ( cytot 哑 ic T cell, CIL 或 Tc) 的主 要作用是特异性直接杀伤靶细胞 凡致敏的 T 细胞再次遇到相应的靶细胞抗原, 就表现 出对靶细胞的破坏和洛解作用, 这是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标 临床上, 测 定肿瘤患者 CIL 杀伤肿瘤细胞的能力, 常作为判断预后和观察疗效的指标之一 试验的原理是选用适当的靶细胞, 常用可传代的己建株的人肿瘤细胞如人肝癌 食管 癌 胃癌等细胞株, 经培养后制成单个细胞悬液, 按一定比例与待检的淋巴细胞混合, 共育 一定时间, 观察肿瘤细胞被杀伤情况, 常用检测方法如下 1. 形态学检查法实验组将淋巴细胞与肿瘤细胞混合共育, 同时, 以瑞氏染液着色, 用光学显微镜计数残留的肿瘤细胞数, 依照下式推算出淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑 制率 对照组平均残留肿瘤细胞数实验组平均残留肿瘤细胞数抑制率 % 二 \100% 对照组平均残留肿瘤细胞数 2, 放射性核素 (51 Cr UdR) 释放法 (1) 胞浆释放法常用到 Cr 释放法 其原理为 : 丑 可透过细胞膜与胞浆中的小分子 蛋白质结合, 一旦细胞膜遭到破坏, 510 会随蛋白质一起世出细胞, 并且不会被完整的细 胞再度摄入 因此, 释放的丑 量与被杀死的靶细胞的数目成正比, 通过检测 51 Cr 的释 放率可获知 CIL 的细胞毒活性 本法操作简便快速且能定量 ; 缺点是所需靶细胞数量 多, 到心的自然释放率高且半衰期短 (2) 胞核释放法常用 3 H -TdR 或山 1-UdR 作为 DNA 合成的前体物, 可被摄入靶细 1. 形态学检查法将外周血或己分离的 PBMC 与适量的 PHA 混合, 置于 3 7'C 培养 第的检测八章免疫细胞

121 114 第一一篇胞核内 当效应细胞和靶细胞共温后, 用膜酶和 DNA 酶处理可使遭破坏的胞核内容物释放 本法所用同位素自然释放率比 51 Cr 低, 半衰期较长, 方法的敏感性高, 故被大多数实验室所采用 ( 三 ) 体内试验临床上常用的主要方法有 :1 接触性超敏反应 ;2 移植物抗宿主反应 (GVHR) ;3 j 旦发型超敏反应 (DIH) 二.B 细胞功能测定 (~)B 细胞增殖试验 静息 B 细胞在剌激物的作用下活化 增殖和分化, 可用形态法 或放射性核素掺入法加以检测, 其原理与 T 细胞增殖试验相同 剌激物主要有以下几类 : 1 丝裂原, 如 ips PWM; 2 抗原性剌激物, 如富含 SPA 的金黄葡萄球菌 Cowa 口 1 株 (SAC) ;1 其他, 如抗胁 f 抗体 EB 病毒等 ( 二 ) 体内试验 B 细胞的主要功能是通过分泌免疫球蛋白分子 (Ig) 参与体液免疫 在受到剌激后, 其分泌 k 分子的能力即直观的反映了 B 细胞功能 临床上通常采用两种 方法来进行 1. 直接测定受检者血清中各种 Ig 的含量, 即可判定 B 细胞的功能 若患者 B 细胞功 能减低或缺陷, 则对外源性抗原的应答能力减弱或缺如, 仅产生极少甚至不能产生特异性 抗体, 表现为体内的 k 含量下降或缺如 ; 若患者血清中一种或多种 k 的含量或轻 重链片 免疫学技术断异常增高, 则表明 B 细胞产生 Ig 的功能异常增高 2. 给患者注射适量的抗原, 如白喉类毒素等蛋白质抗原, 经一定诱导期后, 用适当的方法测定血清中相应抗体的效价, 根据抗体的水平即可判断患者体内 B 细胞的功能 ( 三 ) 洛血空斑试验 (hemolytic plaque assay) 及反向洛血空斑试验 (reverse hemolytic plaque assay) 洛血空斑试验的基本步骤为 : 预先用绵羊红细胞 (SRBC) 免疫小鼠, 约 4 天后, 将小鼠脾脏取出制成单个细胞悬液 ( 含丰富的 B 细胞 ), 加入 SRBC 和补体并在琼脂糖凝胶内混合后倾注于小平回或玻片上, 置于 3 7'C 温育 脾细胞内的抗体生成细胞会释放 抗 SRBC 抗体, 使其周围的 SRBC 致敏, 在补体参与下, 导致 SRBC 裂解, 形成一个肉眼可见的圆形透明洛血区即洛血空斑 在恪血空斑试验的基础上, 利用 SPA 可与 IgG 的 Fc 段结合这一特性, 又进一步形成了反向恪血空斑试验, 又称 SPA-SRBC 洛血空斑试验 其基本方法为 : 将待测细胞 抗 k 抗体, SPA - SRBC 和补体 4 种成分与琼脂糖凝胶混合, 注入小室内 ; 经温育后, 抗体生成细胞产生的 k 与抗 k 抗体结合形成复合物, 复合物中的 IgG Fc 片断又与连接在 SRBC 上的 SPA 结合, 激活补体, 导致 SRBC 洛解 ; 在 Ig 分泌细胞周围形成洛血空斑 在恪血空斑实验中, 每一个空斑中央含一个抗体形成细胞, 这样, 每个洛血空斑就代表一个抗体形成细胞 (Ig 分泌细胞 ), 空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少, 因而可对抗体形成细胞进行计数并对其产生抗体的能力进行评估 洛血空斑试验只能检测抗红细胞抗体的产生细胞, 而且需要事先免疫 而反向洛血空斑试验可用于检测人类外周血中的 IgG 产生细胞以及该细胞产生 IgG 的能力, 并且与抗体的特异性无关 ; 当用抗 IgA,IgG 或刷抗体包被 SRBC 时, 可测定相应 k 的产生细胞 ; 因而, 提高了实验的敏感度和应用范围 ( 囚 ) 酶联免疫斑点法 ( enzyme - lir 也 ed immunospot, ELlSKIT) 该方法的基本步骤为 : 用己知抗原包被固相载体, 再加入待检测的抗体形成细胞 (B 细胞 ), 即可诱导相应抗体的

122 一第八章免疫细胞的检测分泌 ; 分泌的抗体与己包被抗原结合, 在抗体分泌细胞周围形成抗原抗体复合物, 这样细胞吸附于载体上 ; 再加入酶标 i 己的第二抗体与细胞上的抗体 (~ 抗 ) 结合, 通过底物显色反应的深浅, 就可检测出生成的抗体量, 并可在显微镜下计数着色的斑点形成细胞 该方法可同时定量检测不同抗原诱导的抗体分泌, 稳定性好, 特异性高 第四币 自然杀仍细胞的检测 自然杀伤细胞 (NK) 是参与非特异性免疫的重要免疫细胞, 其主要的生物学功能为 : 1 通过直接杀伤或 AI 汇 C 效应杀伤被肿瘤和病毒感染的靶细胞, 发挥抗感染和抗肿瘤作 用 ;2 通过分泌 IFN γ 等细胞因子产生免疫调节作用 对 NK 细胞进行计数和活性检测 是现代免疫学的重要研究内容 一.NK 细胞的计数人类 NK 细胞表面标记主要包括 : CD16 (FcrR 田 ) ω 元 ω11aω 川 LFA- l) CD2 (LFA 2) 分子以及杀伤细胞 ii5 化受体 (KAR) 和杀伤细胞抑制受体 (KIR) 0 但这些标志均不是 NK 细胞所特有的, 也可表达于其他免疫细胞表面 目前临床上一般将 ω3-, m 1 : ω 马淋 巴细胞视为 NK 细胞 建立在这些表面标 i 己的基础之上, 对淋巴细胞的计数方法主要有 : 1APAAP 酶免疫桥联法 : 检测原理及基本方法步骤详见本章第二节 2 流式细胞术 : 临 床上一般将其与淋巴细胞亚群的计数同时进行, 详见本书第十五章 二.NK 细胞检测法 NK 细胞无需抗原预先作用, 可直接利用抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 (A 配 对靶细胞产生定向非特异性杀伤作用 对 NK 细胞的检测, 目前更多的以检测其活性为主, 测定人 NK 细胞活性多以 K562 细胞株作为靶细胞, 而测小鼠 NK 细胞活性则用 YAC 细胞株, 检测的主要方法有形态学检查法 酶释放法 同位素法 化学发光法和流式细胞术等 (~) 形态学检查法取己制备的效应细胞 ( 人的 PBMC 或己提纯的 NK 细胞, 小鼠的脾细胞 ), 将效应细胞和靶细胞按一定比例相互混合共温育后, 用台盼蓝或伊红 Y 等活细胞拒染的染料处理, 在显微镜下计数着染的死细胞和未着染的活细胞, 由此计算出 NK 细胞的杀伤活性 本方法无需特殊仪器设备, 操作简便, 易于掌握 ; 但实验过程均为子工操作, 效率低, 而且结果的判断受主观因素影响较大 ( 二 ) 酶释放法将效靶细胞按一定比例混合反应并离心, 比色法测定上请中靶细胞膜受损从胞浆内释出的乳酸脱氢酶 ( 山 H) 活性 本方法经济 快速 简便, 并可做定量测定 ; 但山 H 分子较大, 须靶细胞膜严重破损时才能被释出, 故此法敏感性较低 ( 三 ) 放射性核素释放法其方法是将效应细胞和放射性核素标 i 己的靶细胞按一定比例混合温育后, 直接检测靶细胞 分为胞浆释放法和胞核释放法, 分别采用 51 Cr 和 3 H TdR 或因 1- UdR 11 故标记物, 51Cr 释放法因自然释放率高, 半衰期短, 己逐渐淘汰 ; 目前临床上更多的采用胞核释放法 ( 四 ) 化学发光法 NK 细胞杀伤靶细胞时发生呼吸爆发, 所生成的活性氧产物可激发 m

123 五忏口一一篇免疫学技术某些胞内物质发出光子, 在发光剂存在的条件下, 可被光电倍增管接受和计数, 发光量与 NK 细胞活性呈 IE 相关 ( 五 ) 流式细胞术用乙酷乙酸竣基荧光素 (C1FDA) 标记靶细胞, C1FDA 在细胞内被 醋酶水解为发荧光的竣基荧光素 ; 当效 靶细胞共育一定时间后, 破损的细胞内荧光即行 释放, 用流式细胞仪分析, 通过检出活靶细胞的荧光强度来推知效应细胞的杀伤活性 此外, 腆化内院 (PI) 只能渗透到死亡细胞内并与 DNA 和 RNA 结合, 在 488 ill 丑波长激发下产生绿色荧光 ; 同时, NK 细胞体积及光散射特性均不同于靶细胞 (K562 细胞 ) ; 据此, 可用流式细胞术检测靶细胞死亡率, 从而反映 NK 细胞活性 用流式细胞仪检测 NK$ 舌性, 结果准确, 重复性好, 测定时间短, 提供的信息多而且可直接分析靶细胞, 所得的结果不是细胞数的平均值, 而是分布频率, 能更准确地反映细胞毒性 ; 但仪器昂贵, 目前尚难普及应用 以上介绍的检测 NK 细胞活性的五种方法, 各有优缺点, 各实验室可根据实验要求并结合自身实际条件选用 红细胞免疫功能的检测 长期以来, 只有白细胞才被视为免疫细胞 1981 年美国生殖免疫学家 Siegel 在总结 前人研究的基础上提出了红细胞免疫系统的新概念 从而打破了 " 红细胞仅在血液的气 体运输中担负着呼吸功能和 ph 调节的作用, 没有免疫功能 " 的传统观念, 更新了人们对 红细胞功能的认识 近年来, 随着对红细胞免疫研究的不断深入, 能够预见关于红细胞免 疫的研究将会有新的突破, 并将充实现代免疫学的内容 红细胞免疫的发展经历了经验 实验和理论三个阶段 研究发现, 红细胞胞膜上有补 体受体 (CR) 淋巴细胞功能相关抗原 3(LFA - 3, 即 CD 川 膜辅助蛋白 (MCP) 衰变加速 因子 (DAF) 和阿片肤受体等抗原性免疫物质 检测红细胞免疫功能的实验主要围绕这些 抗原性物质来设计, 本节仅简单介绍红细胞 b 受体花环和免疫复合物 (IC) 花环试验 一. 原理 红细胞膜上的补体受体有 CRl (C3b 受体 ) 和 CR3, 其中 CRl 呈簇状分布, 人体内的 CR195% 分布在红细胞膜上 在一定条件下, 红细胞膜上的 b 受体可与 C3b 致敏的酵 母多糖粘附形成花环 ; 同理, 红细胞膜上粘附的 lc 中的 b 分子也可与酵母多糖粘附形 成花环 二. 细胞 b 受体花环和免疫复合物 (Ie) 花环试验基本步骤 先将待测红细胞和致敏的酵母多糖分别配成 X 10 7 r 址和 1 X 10 8 ml 浓度备用 取两试管, 每管加待测 RBC 使用液.075 时, 第一管再加补体致敏酵母多糖使用液.075 时, 第二管再加酵母多糖使用液.075 时, 都摇匀放 3 7'C 水浴 30 mi 口 ; 取出用于腕轻轻摇 匀, 加生理盐水 0.15 ml; 混匀后再加 0.25% 戊二醒.05 ml 轻轻混匀 ; 取 13 量水平涂片 吹干 J 口甲醇固定 ; 加少许瑞氏缓冲液 (ph6.4), 用盐水或自来水少许冲洗 ; 加盐水后高倍 显微镜计数 一个红细胞结上两个或以上酵母菌为一朵花环 计数 200 个红细胞, 算出 百分率 第一管为 RBC- C3b 受体花环, 第二管为 RBC-IC 花环率 二. 注意事项 所菊116 第

124 117 第的检测参号文献 (~) 计数细胞要准确, RBC 与酵母菌的比例要适合 ; ( 二 ) 酵母菌要分散而不能自凝, 要充分吹打分散 ; 水浴时试管要加盖, 避免水致红细胞破坏 ; ( 三 ) 戊二醒加入前后都应轻轻混匀, 避免假花环的出现 ; ( 四 ) 涂片要均匀且厚薄适宜, 以高 f 音镜下一个视野中有 7~8 个红细胞为最佳 四. 临床意义这两项实验结果是反映红细胞粘附功能的指标, 各实验主要建立自己的正常参考范 围 本实验室测得的健康成人参考值为 : RBC - C3b: 16% ~ 37.8%; RBC - IC: 1. 05% ~ 5.56% 两项结果都低下可判为原发性红细胞免疫功能低下, 为红细胞膜 b 受体受到破坏和影响所致 ; 如果 RBC- C3b 受体花环降低, 而 RBC- IC 花环率高, 为继发性红细胞免疫功能低下, 是 CIC 增加, 红细胞粘附 IC 过多引起 该两项实验可在临床上作为判断免疫性疾病疗效和预后的指标 1 陶义训 II. 免疫学和免疫学检验. 第 2 版. 北京 : 人民卫生出版社, 龚非力. 医学免疫学. 北京 : 科学出版社, 陈慰峰. 医学免疫学第 3 版. 北京 : 人民卫生出版社, 朱正美, 刘辉. 简明免疫学技术. 北京. 科学出版社, 刘景田, 党小军. 红细胞作为免疫细胞的事实及意义. 深圳中西医结合杂志, 2002, 12 (1) :10 6 李天星. 现代临床免疫学检验. 第 1 版. 北京. 军事医学科学出版社, 巴德年. 当代免疫学技术与应用北京 : 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 朱立平, 陈学清. 免疫学常用实验方法. 北京 : 人民军医出版社, Siegel I, Li 址 ju T, Gieicher N.τbe red - cell immune system. Lancet, 1981,2(8246) :556 八章免疫细胞

125 一一篇免疫学技术第九章 免疫分子的检测 免疫分子是整个免疫系统的重要组成部分, 分为免疫细胞膜型分子和分泌性免疫分 子两类 其中分泌性免疫分子包括免疫球蛋白 (imr 丑 unoglobulin, Ig) 补体 (complement, C) 和细胞因子 (cytokine) 等 这些免疫分子在机体的免疫应答 免疫调节 肿瘤发生和转移 等生理和病理过程中发挥着重要作用 对免疫分子的含量和功能进行检测, 不仅是免疫 学研究的重要内容, 亦是临床上探索疾病发病机制 诊断疾病 监测病情 判断预后和评价 疗效的重要指标 本章主要介绍对这些分泌性免疫分子的检测 免疫球蛋白的检测 免疫球蛋白是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白, 有五大类, 分别是 IgG 19A 胁 1,IgD 和 19E; 不同类的免疫球蛋白分子在合成部位 血清含量 组织分布 半衰 期及生物学活性等方面均存在差别 免疫球蛋白分子广泛存在于血洁 组织液以及外分 泌液中, 又以血清中含量最高, 但其正常范围较大, 并随年龄 性别等因素不同而变动 免 疫球蛋白分子在 B 细胞受到剌激后分泌并参与体液免疫, 血清中免疫球蛋白分子的水平 在一定程度上反映了 B 细胞功能的正常与否 若患者体内的免疫球蛋白含量下降或缺 如, 则其 B 细胞功能减低或缺陷 ; 若患者血清中一种或多种免疫球蛋白分子的含量或轻 重链片断含量异常增高, 则表明 B 细胞产生免疫球蛋白的功能异常增高 总的来讲, 免疫球蛋白的测定方法可分为两类 一类是将免疫球蛋白分子视为抗体, 在体外用己知抗原来检测 ; 另一类方法是将免疫球蛋白分子视为抗原, 应用多克隆或单克 隆抗体, 对各类免疫球蛋白分子进行类别鉴定及定量测定 在五类免疫球蛋白分子中,IgG,1gA 和胁 f 在血清中的含量较高, 常用单向免疫扩散 免疫固定电泳 火箭免疫电泳来检测 上述几种方法实验戚本低, 操作简便易行, 结果准 确可靠, 适宜于基层实验室的普及使用 血清中 19D 和 19E 含量很低, 需要采用放射免疫法 (RIA) 酶链免疫吸附试验 (ELISA) 等灵敏度较高的方法测定 过敏性疾病患者血清中特异性 Ig E 的含量可采用放射变应原 吸附试验 (RASf) ELISA 等方法测定, 这两种方法均为标 i 己的固相免疫测定方法 目前, 全自动免疫分析仪在临床上的使用越来越广泛, 可快速准确的对血清中的多种 免疫球蛋白分子 补体等免疫分子进行检测 忏所菊118 第口第二币 补 ( 本测定 补休 (C) 是存在于正常人和脊椎动物血清及组织液中的一组具有酶原活性的蛋白质 它包括 30 余种可洛性蛋白及膜结合蛋白统称为补体系统 血清补体总活性的测定以洛血反应为代表, 而补体各组分含量的测定常用单向免疫扩散 免疫固定电泳 火箭免

126 九章号 10 的检测疫电泳以及更为灵敏 快速的免疫比浊法 RIA ELISA 等免疫化学方法来检测 血清补体活性和各组分含量的测定有助于了解机体内补体系统的激活状况 合成功能及代谢平衡等, 对有关疾病鉴别诊断和发病机制的研究具有重要意义 一. 血清补体总活性的测定 (~) 试验原理绵羊红细胞与相应抗体 ( 洛血素 ) 结合成的抗原抗体复合物, 可激活待测血清中的补体经典途径, 导致红细胞的洛解 ; 当红细胞和洛血素量一定时, 在规定反应的时间内, 溶血程度与补体量及活性呈正相关 在接近 50% 洛血 ( 如) 时, 二者之间近似直线关系, 故以 50% 洛血作为最敏感的判定反应结果的终点, 故该试验又称为 50% 洛血试验, 即 如 根据引起 50% 洛血所需的最小补体量, 计算血清的总补体活性 ( 二 ) 操作步骤 1. 稀释血清, 取待圳人血清标本 0.2 时, 加入缓冲液 3.8 时, 配成 1:20 稀释 ; 2. 致敏绵羊红细胞, 2%SRBC 加等量 2U 洛血素, 混匀, 置 3 7'C 水浴 30 min; 3. 洛血标准管的配制, 取 2%SRBC 悬液.5 时, 加 2.0 m! 蒸榴水, 混匀, 即为全洛血管 ; 再加入 2.0 m!1. 8%NaCl 洛液校正为等渗溶液 ; 最后加入 2%SRBC 悬液.5 时, 即成为 50% 洛血标准管 ; 4. 按下表 ( 表 9-1) 所示加入各试剂, 充分混匀, 将使管置于 3 7'C 水浴 30 mi 口 ; 表 9-1 CH50 测定血清补体总活性操 ff 119 第成 分 试 管 :20 待检血清 (rnl) 缓冲液 (rnl ) 致敏红细胞 (rnl) CH50 (UrηJ) 免疫分子5. 将各试管 2500 r mi 口离心 5mi 口, 取上清液与 50% 洛血标准管目视比较, 观察洛血 程度 取与 50% 洛血标准管相接近的两管, 以缓冲液作空白调零, 在分光光度计 (542 nm) 上分别读取光密度值 A 剑, 以最接近 50% 洛血标准管的一管, 按下列公式计算 CH 川舌性 如 (U m!) 1 x 20( 稀释倍数 ) 引起 50% 洛血管的血清量 (m!) ( 三 ) 注意事项待测血清标本必须新鲜, 应无洛血 无乳廉 无污染, 试管 吸管 微量 板等实验器材应严格清洁 本方法简便快速, 但敏感性较低, 不能测定补体蛋白的绝对 值 ( 四 ) 临床意义 α 也试验测定的正常值范围为 50~100 U m! 本法主要检测的是补 体活化经典途径的洛血活性, 其结果与补体巳 ~~ 各组分的量及活性均相关, 但并非完 全相关 如果测定值过低或者完全无活性, 首先要考虑补体缺陷, 可分别对巳 巳 ι 和 飞等成分的血清含量作进一步检测 二. 血清补体旁路途径活性测定 (~) 试验原理未致敏的家兔红细胞可直接激活血清中 B 因子 (B factor, BF), 引起 补体旁路途经活化, 导致兔红细胞洛解 当红细胞量一定时, 在规定反应时间内, 洛血程

127 120 第一一篇免疫学技度与血清中参与旁路撒活的补体量及活性呈正相关 与 如测定相似, 根据引起 50% 洛 血所需的最小补体量, 可计算出待测血清中补体旁路途径洛血活性, 该试验即为旁路途径 洛血活性测定试验, 即 AP- Hso 测定 另外, 也可用包被眼镜蛇毒表因子 (CVF) 的眼酸化 红细胞来测 AP- H soo ( 二 ) 操作步骤 1. 取待圳人血清标本 0.4 时, 加入缓冲液 1. 2r 址, 配成 1 :4 稀释, 3TC 水浴 lo mi 口 ; 2. 洛血标准管的配制 取 0.5% 兔红细胞悬液.5 时, 加 2.0 m! 蒸榴水, 混匀, 即为 全洛血管 ; 再加入 2.0 r 世 1.8% NaCl 洛液校正为等渗溶液 ; 最后加入 0.5% 兔红细胞悬液.5 时, 即成为 50% 洛血标准管 ; 3. 按下表 ( 表 9-2) 所示加入各试剂, 充分混匀, 将使管置于 3TC 水浴 30 mi 口 ; 表 9-2 补体 AP- H50 测定操 ff 成 分 2 试 3 管 4 号 : 4 待检血清 ( 时 ) 工作液 (rnl) 兔红细胞 (rnl) AP-H 如何时 ) 将各试管 2500 r mi 口离心 5mi 口, 取上清液与 50% 洛血标准管目视比较, 观察洛血 程度 取与 50% 洛血标准管相接近的两管, 以缓冲液作空白调零, 用.5 em 比色杯在分 光光度计 (542 rrm) 上分别读取光密度值 A 到 2, 以最接近 50% 洛血标准管的一管, 按下列公 式计算 AP- Hso 活性 术APHso(U m!) 1 x 4( 稀释倍数 ) 引起 50% 洛血管的血清量 (m!) 预试验 ( 三 ) 注意事项 本试验所采用的兔红细胞可能存在个体差异, 更换来血时应先进行 ( 四 ) 临床意义 AP- Hso 试验测定的正常值范围为 土 2.7 U m!(~ 土 s) 本试验主 要反应补体旁路途径的洛血活性, 其结果与巳 ι~ Cg B 因子 D 因子及 P 因子等各组分 量及活性均有关系 二. 补体各组分的测定 前己述及, 整个补体系统由 30 余种可洛性蛋白和膜蛋白组成, 在临床中, 经常需要测 定补体某些具体组分的活性或含量 ; 前者一般采用免疫洛血法, 后者通常采用单向免疫扩 散法 免疫电泳以及免疫比浊法 RIA ELISA 等免疫化学方法来检测 本节仅举例介绍几 种补体成分含量或活性测定方法 (~) 单向免疫扩散法测飞含量 1. 方法及原理在含有抗巳血清 ( 抗体 ) 的琼脂板上打孔, 加入待检样品, 样品中巳 ( 抗原 ) 放射状向孔四周扩散, 与琼脂中相应抗体结合, 当抗原与抗体的量达到一定比例 时, 形成肉眼可见的白色沉淀环 在一定条件下, 沉淀环的直径或面积与巳浓度呈正相 关 用 C, 标准品制作标准曲线, 根据待检样品孔的沉淀环直径, 即可测出其中巳含量

128 疫分子的检测号 义时应注意两者的区别 另外, 飞不稳定, 经过一段时间的放置, 如 3 7'C 放置 3 天以上, 就会裂解为 C:J c 和 C:J d' 因此, 巳测定最好尽快完成 ( 二 ) 免疫洛血法测 C4 活性 1. 试验原理用氨水处理豚鼠血清, 制备成去 C4 的血清, 加入致敏绵羊红细胞后, 由于补体不能依次激活, 因此红细胞不洛解 当再加入含 C4 的待检血清后, 补体连锁反应又能重新完成, 导致红细胞洛解, 洛血程度与待测血清中 C4 活性呈正相关 以引起 50% 洛血所需的最小 C4 量作为一个溶血活性单位, 计算出待测血清中 C4 溶血活性 2. 操作方法 (1) 致敏羊红细胞的制备, 将 5% 羊红细胞与等量效价为 4U 的洛血素混匀, 置 3 7'C 水浴 30 mi 口 ; (2) 去 C4 血清 (R4) 的制备, 19 份豚鼠血清加 1 份 14% 的氨水 ( 用茶馆水配制 ), 1 昆匀, 置 3 7'C 水浴 30 mi 口, 用 1mol L 盐酸调 ph 至 7.2; (3) 制备 EAR4 液, 致敏红细胞 4ml 与 R ml j 昆匀, 置室温 15 min, 即为 EAR4 液 ; (4) 配制洛血标准管, 将 EAR4 液 100 r 址与茶馆水 2.6 r 址 : 昆匀, 即为全洛血管 取全洛血管液 2ml 加缓冲液 2 时, 即得 50% 洛血标准管 ; (5) 取待检血清 10μl 加缓冲液 1. 5 r 址, 使稀释比例成 1:150; (6) 按下表 ( 表 9-3) 所示, 依次加入各成分于试管中, 混匀, 置 3 7'C 水浴 30 mi 口 ; 表 9-3 ~ 溶血活性 i9!ij 定操 ff 免2. 注意事项本法测得的是补体成分口的蛋白质含量, 并不是它的活性, 分析其意 121 第九章成 分 2 3 管 : 1 到待检血清 (μi) 缓冲液 (μ I) EAR4(1'1) (7) 结果测定, 各试管加入缓冲液 25 时, 混匀, 2000 r min, 离心 10 min, 取上请, 于 420 m 丑波长用.5 式计算 C4 em 比色杯比色, 确定引起 50% 洛血的终点管 ( 参照 " 补体 CH 到测定 " ), 按公 洛血活性 1 巳 4 洛血活性 (Uml) \x 150( 稀释倍数 ) 引起 ~n. til ~ 耐巾陆陆巾 J 主旦 / ( 三 ) 免疫洛血法测 B 因子活性 1. 试验原理本法利用兔红细胞可使 BF j 舌化, 激活补体旁路途径, 导致洛血反应的 特点 将正常人新鲜血清加热去除 BF, 在此血清中加入兔红细胞, 不会发生洛血 当再 加入含 BF 的待检血清后, 补体旁路途径的连锁反应得以恢复, 又可发生洛血 洛血程度 与待检血清中 BFl 舌性呈正相关, 据此可测得 BF 的活性 2. 操作方法 (1) 将待测血清用工作液稀释成 1:8; (2) 制备去 BF 血清 (RE) : 将多份正常人新鲜血清混合并置于 O'C 以下冰箱保存过夜 ; 次日, 置 50'C 水浴 15 mi 口, 以灭活 B 因子 ; 然后用工作液稀释成 1: 10 即可 ;

129 122 第一一篇(3) 按下表 ( 表 9-4) 所示, 依次将各成分加入试管中, 混匀, 置 3 7'C 水浴 30 mi 口 ; 表 9-4 B 因子活性测定 成 分 试 2 管 号 3 4 RB(rnl) 兔红细胞 (rnl) 待检血清 (rnl) 参考血清 (rnl) ( 的结果测定, 取出试管, 以 2000 r mi 口离心 lo mi 口, 取上洁, 用.5 em 比色杯, 在波 长 540 nm 处测 D 值, 按公式计算 B 因子活性 待检血清 OD 值 BF 洛血活性 (%) = ~~=cfrt~~~~~~ 士 x 100% 参考血清附 若结果低于 60%, 即可判定为 B 因子活性降低 ( 四 ) 双抗体夹心 ELISA 法测 BF 含量 1. 试验原理将含 BF 的待检血清加入包被有羊抗人 BF 多抗的酶标板, 孵育后洗 免疫学技术涤 ; 再依次加入鼠抗人 BF 的单抗 (BF MeAb) 和酶标 i 己的羊抗鼠 Ig( 王, 在微孔中形成羊抗人 BF 多抗 BF 鼠抗人 BFMeAb 酶标羊抗鼠 Ig G 复合物 ; 最后加入底物, 底物在酶的催化作用下变为有色产物而显色, 颜色深浅与 BF 量呈正比 用 BF 标准品作标准曲线, 即可测出待检血清中 BF 含量 2. 操作方法 (1) 用含 0.05%BSA 的洗涤液适当稀释待检血清 ; (2) 用羊抗人 BF 多抗 (1 2 pg ml) 包被酶标板, 依次加入待检血洁 鼠抗人 BF 岛生 Ab (1:800) 和酶标羊抗鼠 Ig β (1: 500), 并依次进行孵育和洗涤 ; 最后加入底物及终止液 ; 于 429 nm 披长处测 D 值 用 BF 标准品制作标准曲线, 即可测定待检血清中 BF 含量 四. 补体裂解产物的测定体内补体系统经经典或旁路途径激活后, 补体成分被消耗而使其血浆内含量降低 ; 同时, 激活过程中产生一系列裂解产物, 如 C3a C3b, C3d C 阳 C5a C5b 等 补体系统的生物学活性, 大多是由补体系统激活时产生的各种活性物质, 即补体裂解产物发挥的 ; 再加上血浆补体成分含量的正常范围较宽, 补体成分的更新代谢过程很快, 故单一补体成分的含量变化有时难以确切反映补体系统的功能状况 ( 除非血浆中某一补体成分含量异常低下 ) 这样, 对补体裂解产物的定量测定就显得更有临床意义 在补体的裂解产物中, C3a C 屯和巳 5a 又被称为过敏毒素, 巳 5a 还是一种有效的中性粒细胞趋化因子 因此, 对补体裂解产物的检测, 不仅能反映补体系统活化程度, 亦有助于某些疾病的诊断 治疗和病情监测 常用的检测方法主要有免疫电泳 交叉免疫电泳 ELISA 及 RIA 等, 通常测定血浆中 C3a C3d C5a 和补体裂解末端产物 SC5b - 9 或膜攻击复合物 b-9 的水平, 本文仅举例加以简介 (~)C3 裂解产物的检测 是补体两条激 ii5 途径的关键分子, 在酶水解作用下裂解为 C3a C3b 两个片断, C3a 很快又被裂解, C3b 被 H, I 因子灭活为 C3bi, 经蛋白酶水解

130 第九章为 C3c C3d C3g 等, 检测这些裂解产物即可反应口的活化程度 1. 竞争性抑制放射免疫法定量检测 C3a 原理为用山 I 标记 ( 山 r - C3) 与待测样本 兔抗人口 a 多克隆抗体一起孵育, 待测样本中的 C3a( 未标记抗原 ) 能竞争性地与抗 C3a 结合, 使 C3a 复合物 (B) 增多, 而 125 r - C3 游离出来 (F), 根据 a 复合物的百分含量 (B% ) 来判断待测样本中 C3a 的含量 2.ELISA 双抗体夹心法定量检测 d 原理为抗 d 血清能与 C3 C3d C3bi 发生交叉反应, 根据 裂解产物与 在不同浓度聚乙二醇 (Polyethyleneglycol, PEG) 中洛解度的不同, 用 11 %PEG 洛解待测样本中的 d, 然后加至包被抗 C3d 的反应板中 ; 再依次加入辣根过氧化物酶标 i 己的抗 d 抗体和底物邻苯二肢 ; 最后用 4molLf 丑创斗终止反应, 于酶标仪上 490 ill 丑读取吸光度值, C3d 含量与其吸光度呈正相关 ( 二 )C5 裂解产物的检测 ii5 化是过敏毒素释放和膜攻击杀伤细胞机制的开始 0 6 活化后裂解产生 a 和 C5b 两个片断, C5a 很快被灭活 在 C3a C4 a 和 C5a 三种过敏毒素中, C5a 的作用最强, 并且还对肥大细胞 中性粒细胞和单核细胞巨噬细胞有趋化作用, 参加初次免疫应答, 控制抗体合成和感染的发生及发展 因此, 检测 裂解产物对临床监视病情发展有一定意义 1. ELISA 法定量检测 a 原理为将抗 a 单克隆抗体包被固相聚苯乙烯板, 加入 经 PEG 处理的待测样本, 然后依次加入兔抗人 a -lgβ 多克隆抗体和过氧化物酶标 i 己的猪抗兔 19( 王, 再加入底物 2, 2' 连氨双 (3 乙基苯唾哩琳 6 愤酸 ) (ABIS) 和 H2 C)z 显色, 于酶标仪 405 nm 处测定每分钟光密度增加量 (OD min), 按标准曲线求出待测样品中的 C5a 含量 ( 三 )ELISA 检测补体终末复合物 SC5b - 9 或 MC5b- 9 补体活化最终形成补体终末复合物 b-9 若补体激活发生在靶细胞膜, 则形成 MC5b - 9( 膜攻击复合物, MAC), 导致细胞膜攻击和损失 ; 若 C5b-9 存在于体液中, 则与 S 蛋白结合形成亲水的 无洛细胞活性的 SC5b- 9 终末复合物的检测可直接反映体内补体活化程度 原理 : 补体 C9 ii5 化后, 产生新抗原 C5b - 9 复合物 用抗 C5b - 9 新生抗原的 McAb 包被酶标反应板, 加入待检样本, 然后依次加入亲和层析纯化的兔抗人 b-9 19G 多克隆抗体, 生物素标 i 己的驴抗兔 19G 辣根过氧化物酶标 i 己的生物素亲和素复合物及底物邻苯二肢, 反应后于酶标仪 492 nm 处读取吸光度, 其吸光度值与 C5b-9 含量呈 免疫分子的检测123 正相关 五. 补体受体的测定补体系统经经典和旁路途径激活后可产生多种活性片断, 它们通过与表达在不同细胞表面的补体受体 (complement receptor, CR) 结合而发挥作用 体内常见的 CR 主要有 CR1 (C3b 或 C3b C4 b 受体, CD35 ) CR2 (C3d 受体, m21 ) CR3 (ic3b 受体, CD 11b CD 18 ) 和 CR4 (i C3b 受体, ω11cω18 ) 四种 补体受体缺陷可导致某些疾病的发生, 如红细胞表面 CR1 表达减少, 可引起循环免疫复合物 (crc) 清除障碍, 导致某些自身免疫病的发生 ; 白细胞粘附缺陷 (LAD) 患者的 CR3 和 CR4 日链 (ω18 ) 基因突变, 导致 CR3 与 CR4 缺失, 患者易反复发生服性感染 最常用的检测方法为 EAC 花环试验 FBC( 荧光素标记细菌补体 ) 花环试验 酵母多糖补休花环试验 也可将补体单一成分或其裂解产物 ( 如 C 元 C3d C5a 等 ) 用酶或荧

131 忏口一一篇免疫学技术光素标记后直接用于检测细胞上的相应 CR; 或采用间接法, 即靶细胞 CR 与补体成分结 合后, 再加标记的抗补体单克隆抗体进行检测 另外, 可用酶 荧光素或肢体金标记抗 CR 抗体, 直接检查细胞膜上的 CR a 一一一细胞因芸及真受体的检测 细胞因子是细胞分泌的具有生物学活性的小分子蛋白质的总称, 它介导了多种免疫 细胞间的相互作用 细胞因子可分为白细胞介素 干扰素 肿瘤坏死因子 集落剌激因子 生长因子和趋化性细胞因子六类 近年来, 随着重组细胞因子, 如干扰素 (00) 促红细胞 生成素 (EPO) 等在临床治疗中开始应用及其良好疗效, 细胞因子及其受体的检测显得日 益重要 一. 细胞因子检测方法概述 检测细胞因子的方法主要有生物学活性检测法 免疫学检测法和分子生物学检测法 细胞因子的检测无论是对免疫学 分子生物学的基础研究, 还是对阐明某些疾病的发病机 理, 指导临床治疗均有重要意义 由于细胞因子种类繁多, 生物学效应表现为多效性 重 叠性 拮抗效应和协同效应, 形成十分复杂的细胞因子网络 因此, 在检测细胞因子时, 常 采用多种方法综合分析 (~) 生物学检测法生物学检测又称生物活性检测, 是根据细胞因子特定的生物活 性而设计的检测方法 由于各种细胞因子具有不同的活性, 例如 00 保护细胞免受病毒 攻击,1NF 杀伤肿瘤细胞, CSF 剌激造血细胞集落形成 ; 因此选择一定的指示系统, 如各种 依赖性细胞株或靶细胞, 通过与标准品对比, 即可获知样品中细胞因子的活性水平, 一般 以 ii5 性单位 (Uml) 表示 常用的生物活性检测法有以下几类 : 1. 细胞增生或抑制法许多细胞因子具有细胞生长因子活性, 利用这一特性, 筛选 出一些对特定细胞因子起反应的细胞, 并建立只依赖于某种因子的细胞系, 即依赖 细胞株 ( 简称依赖 株 ) a 将依赖 株在体外与细胞因子一起培养, 通过测定细胞的增殖情况 ( 如使用 3H-TdR 掺入法, MIT 法等 ), 同时与相应标准品进行比较, 即可测知样品中待检细胞因子 的活性 此外, 某些细胞因子具有抑制细胞生长的作用, 如 IL-l 抑制黑色素瘤细胞 A3 52 株, 可用细胞增生抑制法测定 所菊124 第2. 细胞毒活性测定法是根据某些细胞因子 ( 如 1NF) 自旨在体外杀伤靶细胞而设计 的检测方法 通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株, 如小鼠成纤维细胞 L929 株, 利用放射性同位素 ( 如 51 Cr ) 释放法 结晶紫染色法或 MIT 比色法等方法来判定靶细胞 的死亡率 靶细胞死亡率与该细胞因子的活性成正比 3. 细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可剌激特定细胞产生特异性的生物 活性物质, 如 IL-2 IL-3 诱导骨髓细胞合成组胶 IL- 6 诱导肝细胞合成 α1 抗靡蛋白 酶等 通过测定所诱生产物的含量, 判断细胞因子的活性 4. 细胞病变抑制法病毒可造成靶细胞的损伤, 干扰素等可抑制病毒所导致的细胞 病变, 因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子 检测人 00 ) 舌性常用 VSV( 水泡性口炎 病毒 ) - WISH( 人羊膜细胞传代株 ) 细胞测试系统, 检测小鼠 00 ) 舌性则常用 VSV - L929

132 5. 集落形成法集落剌激因子 (CSF) 在体外可剌激骨髓细胞增殖, 形成造血细胞集 落, 集落的多少与 CSF 的生物学活性成正比 将集落剌激因子加入骨髓细胞体外培养系 统, 在显微镜下观察并计数细胞集落形成数, 即可获知 ( 卫 F 的生物学活性 ( 二 ) 免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肤, 具有较强的抗原性, 因此可利用抗原 抗体反应的特异性, 用免疫学技术定量检测细胞因子 特别是随着重组细胞因子的出现, 可较方便的获得细胞因子的特异性抗血请或单克隆抗体, 只要获得了针对某一因子的特 异性抗体 ( 包括多克隆抗体或单克隆抗体 ), 均可采用免疫学技术进行检测 常用的方法 包括 ELISA RIA 及免疫印迹法 目前, 几乎所有常见细胞因子的检测试剂盒均有商品供 应 另外, 在 ELISA 的基础上, 结合聚合酶链反应, 又建立了一种新的方法免疫聚合酶链 反应 (immuno - PeR) 本法可定量检测细胞因子的活性, 具有较高的敏感性和特异性, 其原 理和过程类似 ELISA 法 首先将待测抗原吸附在国相上, 经封闭和冲洗后加入特异性的生 物素标记抗体, 经孵育和冲洗后加入作为连接分子的亲和素 ; 再孵育和冲洗, 加生物素标 i 己 的 DNA, 温育和冲洗去除游离的 DNA 分子 ; 然后经 PeR 扩增放大结合于国相的 DNA 用琼 脂糖凝胶电泳检测放大的配 R 产物 经澳化乙 f 定染色和照像记录 PeR 产物的电泳结果 通过底片上 PeR 产物的光密度, 可以得出 PeR 产物的量, 即代表固相上吸附的待检细胞因 子量 将其与标准细胞因子制备的曲线比较, 可得出样本中细胞因子含量 ( 三 ) 分子生物学方法这是一类利用细胞因子的基因探针检测特定细胞因子基因表 达的技术 根据己知细胞因子的核昔酸序列制备核酸探针, 与提取的细胞因子 mrl' 业或 DNA 分别进行 DNA-RNA 杂交 (Northern blot) 或 DNA-DNA 杂交 (Southern blot) ; 亦可在细 胞或组织切片上进行原位杂交分析 核酸探针是指一段用放射性同位素 ( 如 32 p 或 35 S ) 生物素或地高辛等标记并与目的基 因互补的 DNA 片断或单链 DNA 卧忱 根据其来源可分为 edna 探针 寡核昔酸探针 基 因组基因探针及卧也探针等 其中 c 时也探针和人工合成寡核昔酸探针常用于斑点杂 交及 Northern blot, 而 RNA 探针因穿透性好更适用于原位杂交 ( 四 ) 方法学评价生物学检测法灵敏度高, 又可直接测定生物学功能, 是最可靠的方 法, 适用于各种实验, 是科研部门最常用的技术 ; 但需要特殊的细胞培养设备来培养依赖 性细胞株, 在传代的过程中细胞因子的依赖株会发生改变 ; 操作繁杂, 不容易熟练掌握 ; 检 测耗时长, 细胞因子间有干扰 免疫学检测法操作简便快速, 重复性和特异性均较好 ; 但测定所得的数值仅代表相应 细胞因子的量而不代表活性 ; 目前市场上出售的试剂盒灵敏度较低, 是生物活性检测法的 1 1 一一 ~ 一 ; 另外, 不同厂家所售试剂盒之间的测定值差异较大, 试剂盒的标准化程度尚有待 提高 分子生物学法在 m 卧也水平测定细胞因子, 灵敏 快速, 特异性高, 可有效避免生物活 性检测中可能存在的其他细胞因子的影响 ; 但只能检测基因表达情况, 不能直接提供有关 因子的浓度及活性等信息, 主要用于研究领域 上述三种方法, 各有优缺点, 可互相弥补, 在实际应用中, 可根据各自的实验目的和实 125 第九章免疫分子0 的检测细胞测试系统

133 126 第一一篇验室条件进行合理选择 二. 细胞因子的检测 (~) 白细胞介素 l( IL- 1) 活性测定 IL-1 是由活性的单核巨噬细胞合成和分泌的一种细胞因子, 有 ii5 化淋巴细胞 协同剌激胸腺细胞增生及诱导抗体形成 促进炎症反 应及其他代谢活动等生物学活性 检测单核巨噬细胞产生 IL-1 的能力, 既可了解单核 巨噬细胞的活化程度, 又可了解它在活化淋巴细胞诱导免疫应答中的作用 IL-1 有 1 1α 及 IL-1 日二类, 共享一个受体, 表现相同的生物活性 常用的是 C:J H He] 小鼠胸腺细胞 3 H -TdR 掺入法 1. 原理 IL-1 与小鼠的胸腺细胞共同培养 ( 含有亚适量的如 PHA 类的丝裂原 ), IL 1 可剌激小鼠胸腺细胞增殖 由于许多品系的鼠胸腺细胞 ip S 有反应, 而 C3 H He] 品 系小鼠胸腺细胞对 ip S 无应答, 故通常选用 C:J H He] 品系小鼠 2. 操作方法 (1) 无菌取出对 LPS 无反应的 C:J H He] 小鼠胸腺细胞, 用 Ha 血液或 RPM! 完全培养液洗涤 2 次, 重悬于 RPM! 培养液中, 使细胞浓度达到 (l~1. 5) X 10 7 ml; (2) 加入低浓度 口 A, 再加入含 IL-1 的标本, 以协同增强胸腺细胞对 na 剌激增殖反应的程度来判定 IL-1 活性 ; 将 IL-1 标本用完全培养液在 96 孔板上作倍比稀释, 每孔 免疫学技术50μ1, 每种稀释度均设三个复孔 ; (3) 每孔中加入胸腺细胞悬液 100 vi 和含 0 日 A(2~3 阅 ml) 的完全培养液 50μ1, 培养系统中 ConA 最终浓度为 0.5~0.7 阅 ml( 或加 PHA 至终浓度为 1 vg ml) ; (4) 将培养板置于 5%αL 孵育箱中, 3 7'C 培养 60 h 后, 每孔加入 0.5μCi 3 H -TdR 10 vl( 放射比活性 B Ci mol), 继续培养 12 h; (5) 用多头细胞收集仪收集细胞, 液体闪烁器测量掺入细胞的 3 H - TdR 量, 以每分钟脉冲数 (c 阳 ) 表示 ; (6) 结果判定 : 以坝 得的 c 阳对不同稀释倍数的 IL-1 标准品作标准曲线, 有良好的线性关系 参照标准曲线可得出样品 IL-1 含量 ( 二 ) 白细胞介素 2(IL-2) 生物活性测定 (MIT 法 ) 1. 原理 IL-2 是由 T 辅助细胞产生的一种淋巴因子, 它在淋巴细胞增殖分化过程中起非常重要的作用, 而且能维持 T 细胞在体外的长期生长 en 上 2 是一株来源于小 鼠的 IL-2 依赖性 T 淋巴细胞株, 在 IL- 2 存在条件下,en 上 2 能增殖分裂 本实验以 MIT 为反应底物,MIT 被细胞内线粒体中的玻咱酸脱氢酶氧化后形成蓝黑色的 Fonnazan 颗粒, 根据颗粒量的多少测算氧化酶活性, 从而反映出细胞的增殖情况 2. 操作方法将标准品及待测样品作倍比稀释, 按每孔 100μl 加入 96 孔平底细胞培养板中, 每个稀释度 3 个复孔 ; 然后, 每孔加 en 上 2 细胞悬液 100μ1; 另设三个对照孔, 只加 100 vi 细胞和 100 vi 培养液, 置于 3 7'C5%αL 孵育箱中培养 32~40 h; 轻轻吸弃上清液 100μ1, 加入 MIT 洛液 (l mg ml)50 vi, 于振荡器上振荡 1mi 口, 再放置 3 7'C5%ω2 孵育箱内反应 2 h o 取出培养板, 以 2000 r mi 日离心 5mi 口, 吸弃上清液, 每孔加入二甲亚帆 (dimethyl sulfoxide, 因但 ))120μ1, 振荡 30 s 后, 在酶标仪 540 nm 处读取 OD 值 ; 3. 实验结果观察和分析

134 IL-2 活性 (Uml) 二 标准品活性 (Uml) 标准品 D 最大值的 50% 所需稀释度 ( 三 ) 生物学检测法检测 1NF α 1. 原理肿瘤坏死因子 (1NF) 可分为 1NF α 和 1NF- ~ 两种类型, 它的主要生物学 特性就是对某些肿瘤细胞的细胞毒作用, 从而导致肿瘤发生出血坏死 因此, 可利用 1NF 敏感的靶细胞测定 1NF 活性, 根据细胞死亡的情况得出 1NF 的相对话性 通常选择对 1NF α 的细胞毒作用高度敏感的小鼠 L929 细胞株作为靶细胞来测定它的生物活性 将 定量的 L929 细胞株与含 1NF α 的待检标本在一定条件下共同孵育,1NF α 的细胞毒作 用可造成靶细胞死亡 然后对靶细胞染色, 活细胞着色, 死细胞不着色 将吸附于培养板 上的着色细胞用脱色剂洛解, 测吸光值, 与不含 1NF α 的细胞对照, 计算 1NF α 对细胞 的杀伤率 2. 操作方法 (1) 收集对数生长期的 L929 细胞, 接种到细胞培养板上, 每孔 100μl( 每孔 10 5 于 3 7'C, 5%ω 与温箱中 4 h( 三复孔 ) ; (2) 弃去培养液, 然后每孔加入 90μl 样品和 10μl 放线菌素 D, 对照孔不加 ; (3) 置于 3 7'C, 5%ω 与温箱中培养 20 h; 个 ), 置 ( 的弃去培养液, 用生理盐水洗涤 1 次, 每孔加入细胞染色液 (0.5% 中性红或结晶紫 ) 200μ1, 3 7'C 温育 2 h, 使活细胞充分着色, 弃上清液, 用生理盐水洗 3 次, 然后加脱色剂, 室 温 lo mi 口后, 用酶标仪测 A 剑 ; 日召 (5) 细胞杀伤率按下式计算 : 对照孔平均 A 值标准孔平均 A 值细胞杀伤率二 \100% ; 对照孔平均 A 值 (6) 用重组 1NF α 绘制校正曲线, 确定待测样品中 1NF α 的浓度 3. 注意事项 (1) 每次实验应同时用不同浓度重组 1NF α 标准品作阳性对照, 培养液作阴性对 (2) 放线菌素 D 能抑制 DNA 的合戚 降低靶细胞对损伤的修复机制, 因而常在检测中 加入放线菌素 D 以提高 1NF 的敏感性 ; (3)L929 细胞对 1NF α 和 1NF-~ 两种肿瘤细胞因子均敏感 ( 四川干扰素生物活性测定 1. 原理干扰素 (00) 是一种具有种属特异性和多种生物学活性的蛋白质, 是一类 重要的细胞因子, 可分为 α 日 γ 三种类型 ; 其主要功能是干扰病毒感染和复制 o 00 γ 可剌激来源于神经母细胞瘤的 2D9 细胞释放日引睐 2, 3 脱氧酶 (l ), 它使色氨酸分解成 犬尿氨酸, 产生的量与 INFγ 成比例 ; 而 00 α 00 - ~ IL-l IL- 2 IL- 6 GM- CSF 1NF 等均不能剌激 2D9 细胞产生可检测的犬尿氨酸 2. 操作方法 (1) 在 96 孔反应板的每孔加入 200 ILl 经倍比稀释的样品或标准品, 每个稀释度均设 3 个复孔, 阴性对照组仅加培养液 ; (2) 用 b 任 M 培养液 ( 含 2 mnol L L 谷氨酷肢, 5% 胎牛血清 ) 重悬 2D9 细胞, 每孔加 D 最大值的 50% 所需稀释度 127 第的检测待测样品 九章免疫分子

135 128 第一一篇入 50 ILl (3 X 10 4 ) 2D9 细胞, 另加入色氨酸 12.5 阔, 3TC 温育 72 h; (3) 将上请移至 V 型底的 96 孔板, 加入 10μl 三氯乙酸, 50'C 温育 30 mi 口, 使甲酷基犬 尿素水解成犬尿氨酸 ; (4) 离心 lo mi 口后, 将 100μl 上清液转移至平底 96 孔板, 混以 100μl 新鲜配制的欧利希试剂, 在 490 nm 测 D 值 ; (5) 结果判定, 结果以三个复孔的平均 OD 值表示, 与标准 IFN γ 对照, 即可得出样本 IFN γ 的含量 ( 五 )1GF- ~ 生物活性测定 (Mv-l- Lu 细胞增殖抑制测定法 ) 1. 原理各亚型 1GF-~ 都具有抑制上皮 内皮 淋巴来源的多种类型细胞增殖的能力, 相当低浓度的 1GF- ~(~1 ng ml) 即可强烈抑制铝肺上皮细胞株 Mv-l-Lu 的生长 ; 故可通过 3 H -TdR 掺入法或 MIT 法评价细胞增殖受抑制的程度, 未获知 1GF 2. 操作方法 (l )3 H - TdR 掺入法 目的浓度 1 将低密度 (5 000~ 个孔 )Mv-l- Lu 接种在 96 孔板中, 加入倍比稀释的 1GF 目标准品或 1GF-~ 待测样品 ; 2 于 3TC 5% ω 与孵育箱中培养 4 天, 然后加入 3 H - TdR, 继续培养 4 h; 免疫学技术3 收集细胞, 测定 c 防卫值 (2)MIT 法 1 低密度 (5 000~ 个孔 )Mv-l- Lu 接种在 96 孔板中, 加入倍比稀释的 1GF 目标准品或 1GF-~ 待测样品 ; ( 3TC 5% αl 孵育箱中培养 4 天, 然后再加入 0.5% MIT 10μl 孔, 3TC 孵育 4 h; 3 再加入含 lo%sds 的 0.02M HCL 以破坏细胞, 洛解 Fonnazan 颗粒, 2 h 后于酶标仪 570~590 nm 比色测定 D 值 3. 结果判定以 c 阳或 OD570~590 为纵坐标, 测定样本稀释倍数的对数为横坐标, 作剂量效应曲线, 只有曲线的线性部分可用来评价 1GF 目的滴度, 生长抑制百分比 (% ) 二 100 x (l 样品 c 防卫细胞对照 c 阳 ) 0 滴度即为中位 cpm 或 OD 对应的 1GF-~ 稀释 倍数的对数, 可用实验单位 (Lu ml) 表示 Lu 可以按下面公式转换成参考单位 测得样本滴度 (Lu) 样本参考单位 (Ru ml) = "Ji1 rl~~ ~~~~~; I~,J~;;;~~: \ x 标准品参考单位 (Ru) 测得的标准品滴度 (Lu) ( 六 )ω1-csf 生物活性测定 1. 原理 1F -l 细胞表面有 ω1-csf 受体, ω1-csf 可经细胞表面受体剌激人白血 病 1F -l 细胞株增殖 因而可用 3H-TdR 或 MIT 等细胞增殖检测方法测 ω1-csf 的生 物活性 2. 操作方法 (1) 取对数生长期 1F -l 细胞, 洗涤 2 次后, 用培养液配制成 5 X 10 4 ml 浓度, 加入 96 孔培养板中, 每孔 100μ1 ; (2) 倍比稀释 ω1-csf 标准品及待测样品, 将稀释后的标准品及待测样品加入细胞 中, 每孔 100μ1, 每一浓度均设 3 个复孔 ; (3) 培养 48 h 终止培养, 在终止培养前 4 h, 每孔加入 3 H -TdR 或 MIT, 检测细胞增殖

136 129 第50% 最大反应时标准品的稀释度的检测的情况 3. 结果判定在正态概率纸上作图, 以反应百分数为纵坐标, 以样品稀释倍数为横 坐标, 比较标准曲线的 50% 反应所对应的稀释度 (EC 川, 按下列公式计算样品中 ωf CSF 的活性 : 样品单位二 50% 最大反应时样品的稀释度 标准 ω1-csf 单位 ml o ( 七 )RT- PeR 法检测细胞因子 m 卧也 1. 原理细胞因子的 mrl' 也与其表达的蛋白平行 因此, 利用细胞因子的基因探针 检测其转录产物 m 卧也可反映出相应细胞因子的水平 2. 操作方法 (1) 采用一步法从组织或培养细胞中提取 m 卧也 ; (2)eDNA 的合成将 10 倍反应缓冲液 2μl 地 CLAμl dnip 混合物 2μl, p( cit )15 寻 物 1μl AMY 反转录酶 1μl 和总 RNA1μl 依次加入 750μl 微量离心管中, 最后用核糖核酸酶 洛液将体积补加至 20μ1; 1 昆匀, 于 42'C 温育 1 h, 即得到 edna, 将其保存于 20'C 备用 (3) 聚合酶链反应 1 将 PeR 微管置于冰浴中, 依次加入 10 倍 Tap 反应缓冲液 5μ1, 10 mmol LdNIP 混合 物 2.5μ1, 10 villol L 引物 (RT- PeR 法检测人类细胞因子 m 卧忱的引物序列见表 9-5, 引 物 2 碱基序列同己生口的反相互补 )2.5μl 己制备的 edna2 vi DW37.75μl 和 Taq 聚合酶 0.25μ1 ; 2 将 PeR 微管移至热循环器中, 共反应 40 周期, 每个周期包括 : 变性 复性和延伸 ; 3 取出样品, 加 10 vi 的 PeR 产物于 2μl 的负染料中, 轻轻混匀后加至琼脂糖凝胶 中, 同时做 DNA 分子质量标准品对照 ; 4 电泳, 80V, 60~90 mi 口, 电泳液为 1 倍 Tris 醋酸盐缓冲液 (TAE) ; 5 紫外光源下观察 照相 表 9-5 Rr- per 法检测人类细胞因子 mrna 的引物序列 九章免疫分子碱基序列 Fα 产物 IL-l 自 IL-2 IL-4 IL-6 IL-I0 引物 l 引物 2 引物 l 引物 2 引物 l 引物 2 引物 l 引物 2 引物 l 引物 2 5'AM 5'AGG 5 丁 w 5'GrG 5'GrA 5'AAG 5'Aα 主 5'CAT 5'AGr 5'CAC AGC GGA era AM AGC AAT AAT era ere 1CA Tτ'G τ'cc GAA ccr Tτ τ'cc τla GAT AGA τ'gg GrG τit τ 丁 TAG GGr CAC α:a GAA GAA ere AM TIT TAG AGC τ'cc τ'ga AAC GrA ere CAA ACA AAT τit ACA CIT ccr ccr Tτ'G τw TAC ccr AGG ccr erg G ccc TAG GGC TAA Aer AAT τ'gg Tτu τcg GrA TIT τit GC GCA ccc AC AGA τ'gc C τ'gc ccr 巳 A ere τ'cc AC IT 579bp 414bp 470bp 335bp 335bp 1M' IFN α γ 引物 l 引物 2 引物 l 引物 2 5'GCG 5'erA 5'GGr 5'G1T AAT AGC τit GGA τ'cc Tτ'G CIT CAT ere GGr GGC 1CA erg τ'cc τw AGr GCC AAT GAC TAC CAG ccr τ'gc ITA GGC AAG C cα 马 GTC ccc A G cc 507bp 340bp

137 130 第一一篇3. 注意事项 (1) 每次实验用不含 RNA 的缓冲液做阴性对照 ; (2)PCR 放大效率极高, 微量的 cdna 污染即会造成假阳性, 应严格遵守操作规程, 避免出现人工污染导致的假阳性 ; (3) 目前己有成套商品试剂盒出售, 可根据需要选购 二. 细胞因子受体的检测细胞因子的生物学特性是通过与相应的受体结合后发挥的, 细胞因子受体可谓是细胞因子作用的分子基础 随着免疫学检测技术的日新月异, 细胞因子受体的检测越来越受到重视 本文仅对细胞因子受体的检测技术作一归纳总结, 并以 IL-2R 为例介绍细胞因子受体的检测方法 (~) 细胞因子受体检测的基本技术 1 放射性核素标记重组细胞因子( 配体 ) 的放射性受体分析这是确定细胞受体分布及其特性的主要方法, 可测定受体的数量及亲和力 一般采用 :1 重组细胞因子体外标记放射性核素 ;2 利用 cdna 转录获得足够量的细胞因子 mrl' 性, 注入非洲爪蠕卵母细胞内, 在体外翻译的底物中加入放射性核素标 i 己的氨基酸 ( 如 35 S 蛋氨酸或 3 H 亮氨酸等 ) 通过生物合成的内标记产生的标记重组细胞因子的功能不受影响, 因此适用于那些稳定 免疫学技术2. ~ 细胞吸收试验将过量的待测细胞与限量细胞因子 ( 配体 ) 共同孵育, 若细胞膜表面存在相应的受体即可与配体 ( 细胞因子 ) 结合 ; 通过测定回收后配体生物活性的丧失情况可确定受体是否存在 此法简便, 适用于定性, 但不适用于定量检测 3. 抗细胞因子受体单克隆抗体 (McAb) 测定法利用 McAb 封闭相应的细胞因子受体从而抑制相应细胞因子的生物活性 ; 也可用标 i 己的 McAb 直接做免疫放射受体分析或免疫沉淀 4. 重组细胞因子与受体的交联分析利用化学交联剂使放射性核素标 i 己的重组细 性较差的细胞因子 胞因子与膜受体结合, 细胞裂解物经聚丙烯酷肢凝胶电泳后进行放射自显影, 通过带型分析可确定细胞因子受体的分子量及亚单位 5. 受体 c 时也分析分子克隆是在基因水平上研究细胞因子受体的最佳途径, 对通过核昔酸序列推导的氨基酸顺序进行结构功能区分析, 是深入探讨受体作用机制的基础 受体 cdna 片段可用来制作核酸探针以研究受体基因的转录功能及表达调控 此外还可利用基因工程技术生产重组细胞因子的受体分子, 目前己成功克隆出多种细胞因子受体的基因 6. 可洛性细胞因子受体的检测大部分细胞因子的受体除细胞膜结合的形式外, 还存在着分泌游离的形式即可洛性细胞因子受体 (soluble cytokine receptor, s 口也 ), 如 sil lr sil- 2R sil- 4R sil- 5R sil- 6R sil-7r sg- CSFR sgm-csfr sifn γr 和 s1n FR 等 可洛性细胞因子受体可作为相应细胞因子的运载体, 也可与相应的膜受体竞争配体而起到抑制作用 因外, 检测可洛性细胞因子受体的水平, 不但可用于免疫学基础理论研究, 还有助于某些疾病的诊断及病程的发展和转归的监测 ( 二 )IL- 2R 的检测白介素 2 受体 (interleukin 2 receptor, IL - 2R) 由 α 自两条链组成; 单独的 IL-2Rα 为低亲和力受体, 单独的 IL- 2R~ 为中等亲和力受体, 而双链的 IL- 2R,α 自

138 标 i 己的重组 IL - 2C ril - 2) 放射受体分析法测定细胞膜表面的 IL-2R 1 ril-2 的标记 用 标记重组 IL-2, 并使 _ ril - 2 的比放射性达到 6 X 10 4 ~ 10 X 10 4 d 防卫口 go ( IL- 2 与受体的结合 将待测细胞洗涤后加入不同浓度的山 1-rIL-2(5000 ~ dpm 管 ) ; 对照管加入 100 倍量的未标记 IL- 2, 3 7'C 水浴 20 mi 口后立即置于冰 浴, 加入含 0.3% 牛血清白蛋白 (lisa) 的预冷 Ham 王 s i 夜终止结合 3 离心分层法分离结合 (B) 及游离 (F) IL - 2 用.3%BSA-Ham 王 s 液 200μl 稀 释细胞沉淀, 然后小心加到预先装有 200μ11 mol L 蔚糖液的 Eppendorf 塑料离心管中, 以 r mi 口离心 2mi 口, 吸去上清及蔚糖层, 用 i 己数仪测定 c 防卫值 4 计算 1B 二总结合, 为不加未标记 IL- 2 所测得的结合值 ;NB 二非特异性结合, 为 加入 100 倍量未标记 IL-2 后的结合值 ;SB 二特异性结合, 为 1B 与 NB 之差 ; 特异性结合 率 (% ) 二 [(1B - NB) 1BJX 100% ; 非特异性结合率 (%) 二 (NB) (1B) X 100% ;F 二游离山 I IL-2 浓度, 根据下列公式计算标记配基与待测细胞结合量 (B) : 结合位点每个细胞 IL - 2 特异性结合 (mol L) X 6 X 细胞数 L 然后再计算 BF, 按受体结合理论的经典方法 Scatchard 作图, 并求出最大结合量 (Bmax) 和平衡常数 (Kd 值 ) 0 2. 可洛性 IL-2R 的测定 测定 sil- 2R 含量的方法简便, 取材容易, 所需样本量小 因此不但可用于免疫学基础理论研究, 还可作为临床某些疾病辅助诊断, 病情监测及药效 观察的一项指标 sil- 2R 含量的测定方法主要有两类, 即双抗体夹心法和竞争结合法, 其中以双抗体夹心法更为简便 敏感且常用 (1) 双抗体夹心法 为提高检测的敏感度, 常使用荧光 ELSIA 夹心法 即采用生物素 标记 McAb, 进行生物素 亲和素 酶放大步骤, 并采用荧光物质为底物, 其敏感度可达 10 U ml; 但操作步骤多, 实验要求条件高 (2)ELSIA 竞争法 本法是用纯化或重组 IL- 2R 蛋白包被微孔板, 同时加入己知量 的抗 IL-2R McAb 和待检 sil- 2R 待检 sil- 2R 和己包被的纯化 IL-2R 蛋白竞争与抗 IL-2R 抗体的结合 从抗 IL-2R 抗体与包被 IL-2R 蛋白结合受抑制的程度来计算待测 sil- 2R 的含量 131 第的检测则具有高亲和力 九章免疫分子第四币 未占附分予的检测 细胞粘附分子 (cell adhesion molecules, CAM) 是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质问相互接触和结合分子的统称, 是重要的免疫细胞膜分子 根据其结构特点, 可分为整合素家族 选择素家族 免疫球蛋白超家族和钙粘蛋白家族 在各种细胞因子 内毒素 凝血酶等的作用下, 细胞粘附分子由细胞内贮存池转移至细胞膜或合成增加, 导致细胞表面的粘附分子数量增多 因此, 在某些疾病中细胞粘附分子的数量可发生改变 此外细胞粘附分子经磷酸化 糖基化等修饰作用可发生构象改变, 导致其亲和力和扩散速率改变而影响其功能 因此定量检测细胞粘附分子的数量和

139 132 第一一篇免疫学技术功能对探索某些疾病的发病机制 监视疾病的发生 发展过程和指导临床治疗有重要意 义 目前己建立的检测方法, 大多仅限于用免疫学技术检测其数量 一. 细胞表面粘附分子的检测 (~) 酶免疫测定法主要为双抗体夹心 ELISA ~ 去, 本法应用最广, 但仅能检出一群细胞的表面粘附分子数量, 而不能反映单个细胞粘附分子数量的变化 ( 二 ) 免疫荧光测定法以间接免疫荧光法最常用, 原理为使抗粘附分子的单克隆抗体与待检细胞反应, 加入羊抗小鼠 IgG 荧光抗体进行间接免疫荧光染色, 然后借助荧光显微镜观察表达粘附分子的阳性细胞数 此外, 有条件的实验室, 还可应用不同激发波长的荧光素着染受检细胞, 在 FACS 仪上进行检测, 可同时测定两种不同的细胞粘附分子 ( 三 ) 放射免疫测定法通常用抗细胞粘附分子抗体包被载体, 然后加入受检样品, 再加入相应单克隆抗体和同位素标 i 己的二抗作非竞争性固相放射免疫测定 二. 可溶性粘附分子的检测目前大多采用双抗体夹心 ELISA 法, 研究最多的是选择素家族和免疫球蛋白超家族 参号文献 1 陶义训 II. 免疫学和免疫学检验. 第 2 版. 北京 : 人民卫生出版社, 沈关心, 用汝麟. 现代免疫学实验技术. 武汉 : 湖北科学技术出版社 龚非力. 医学免疫学 北京 : 科学出版社, 朱正美, 刘辉. 简明免疫学技术. 北京. 科学出版社, 陈慰峰. 医学免疫学. 第 3 版. 北京 : 人民卫生出版社, 朱立平, 陈学清 免疫学常用实验方法 北京 : 人民军医出版社, 巴德年. 当代免疫学技术与应用 北京 : 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1998

140 133 第度技术述 第十章 免疫浊度技术 所菊M4Aql 忏口作为五大经典免疫试验之一的沉淀试验, 因其可直接用于定量测定和应用方便而获得迅速的发展 免疫比浊测定是沉淀反应的一种形式, 它是在液相中的沉淀反应 沉淀反应的基本原理是抗原 抗体在介质中或固相表面发生特异性结合, 形成免疫复合物 ( 颗粒 ), 这种复合物的数量可用肉眼 仪器或标记法测知, 复合物的量即代表抗原或抗体的主旦 随着实验技术的发展, 血浆蛋白分析技术由最初的试管沉淀反应 琼脂凝胶的扩散试验, 发展到现代免疫分析技术 特种蛋白免疫分析技术方法逐步完善, 其灵敏度逐步提高, 检测水平由微克 ( flg) 发展到纳克 ( 鸣 ), 甚至皮克 (pg) 水平 最早, 液相内沉淀反应是在试管内以环状试验开始的, 即在试管下层放入液体抗原, 其上层加上患者血请或己知抗血洁, 温育后可在两液层交界处见到一白色环状物 ( 免疫复合物 ), 这就是 1897 年 Kr aus 描述的浊度试验, 直到 20 世纪 40 年代才由 α~di 日完善成了凝胶内的定量测定 ( 环状免疫扩散试验, RID), 该测定至今仍大量应用于免疫定量, 但由于其操作繁琐 敏感度低和费时而趋于淘汰 1959 年 Schultze 和 Schwick 提出用抗原抗体结合后形成的复合物使洛液浊度改变, 用普通比浊计测定免疫球蛋白的含量, 由于其敏感性太差未引起人们广泛注意 1965 年 Ma ncini 提出根据单向辐射免疫扩散 (single radial Immunodiffusion, SRID) 原理, 检测可恪性抗原和相应抗体在凝胶中扩散, 形成浓度梯度, 在抗原 抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环, 即可确定该抗原的浓度 1966 年, 德国 Behring 飞 ;ver 肚公司根据此法生产出 Partigen R 平板, 可测定 40 多种血清蛋白 这种系统被认为是现代实验室的一种革新 {E! 此法仅适用于大分子抗原, 反应时间长, 不能满足临床快速诊断 1967 年 Ritchie 提出激光散射比浊法, 即通过分别利用补体飞和结合珠蛋白与相应抗体形成的抗原抗体复合物, 定量测定浮悬的免疫复合物颗粒与射入光束成一定角度时产生光散射的强度来评估补体飞和结合球蛋白的含量, 并称为激光散射比浊法 (Nephelometry), 这使经典的凝胶内沉淀法的测定由数十小时一下子缩短为数小时, 这给蛋白免疫分析开创了一个新记录 1970 年 Technicon 公司根据此原理很快制造出蛋白免疫分析的自动检测系统, 称之为 A1P(a 川 ut, Oαm 阳 na 丑咀 1at 优 ed 山 limn nu 丑 lun 液相内沉淀反应 ( 浊度法 ) 的提出是 2 却 O 世纪 70 年代的事 (S 缸,te 盯 err 且 n 由 ber 喀 g, 1977), 它适应了现代测定的自动 快速和简便的要求, 尤以速率浊度法更受各实验室的欢迎 1977 年, Be hring 公司制造出了一种新的进行特种蛋白分析的激光浊度分析仪 (behring laser nephelometer, BLI' 仆, 使这种新的检测技术付诸于实际应用 其后, 随着计算机的高速发展, 该公司旺十章免疫浊

141 134 第一一篇又相继推出 BNA( behring nephelometer analyzers, 1985 年 ) TIS( turbi time system, 1987 年 ) 和 BN - 100(behring nephelometer 100, 1988 年 ) 激光散射比油分析仪 最近, 该公司又推出更先进的 BN - 11 (behring nephelometer 11) 激光散射比油分析仪 激光散射比浊法是终点比浊, 亦即抗原抗体反应形成免疫复合物后测定, 其缺点是需要温育 2~3 h, 因此, 还不能满足临床上快速测定的要求, 同时, 由于用激光作为光源, 其波长固定 ( 氢氮 633 nm, ~ 俑 442 nm), 散射角小, 降低了蛋白免疫测定的敏感度 1970 年 Hellsing Harringto 日等在反应中加入聚合物以缩短反应时间 Sternberg 于 1977 年提出了速率散射比浊法, 由于该方法是通过测定抗原抗体反应最高峰处复合物的量, 因此可使抗原结合的反应在几十秒内得出检测结果 美国 Beckma 口公司制造出免疫化学分析系统, 用计算机程序分析处理抗原抗体反应的动态数据, 直接显示受检抗原的浓度电位 20 世纪 90 年代推出的自动测定仪有 Array360 最近, 该公司推出了近红外粒子免疫浊度测定仪 ( 岛 1AGE), 解决了大分子复合物的检测问题 免疫浊度法是可溶性抗原 抗体在液相中特异结合, 产生一定大小的复合物颗粒, 当光线通过介质时, 复合物颗粒形成光的折射或吸收, 测定这种折射和吸收后的透射光的减少或散射光信号的强弱作为计算单位 光散射中的分子量指的是平均分子量 在免疫检测中任何反应均会增加洛液中颗粒的平均分子量 平均分子量越大, 光散射信号强度越 免疫学技术子 但是, 当被检测的激素 药物或血清中蛋白质或脂质形成中低浓度复合物时, 因这些单价抗原抗体复合物不能显著改变平均分子量, 从而产生区别于背景的强烈信号, 因此使得光散射法受到局 ~~o 检测血清中高浓度的高分子量蛋白质时, 该方法很有效 但当大分子浓度太高时, 则会因产生凝集而造成洛液中分子数目的改变 凝集物会被看成一个颗粒, 使得洛液中颗粒数目大大减少 因此, 实际上洛液中发生的变化常常是非线性的, 需要建立更为复杂的模式来描绘散射现象 大 原则上, 免疫浊度法直接检测免疫复合物的形成, 而不需要额外的标记或二级指示分 免疫比浊法的特点 : 自动化免疫浊度分析法克服了以前免疫测定法操作繁琐 敏感度低 (l 0~ 100 r 鸣 L) 时间长和不能自动化四个缺点, 使得自动化免疫分析受到大家的普遍重视, 其主要优势就在于如下几个方面 : 第一, 稳定性好, 敏感性高 ( 达 ngl 水平 ), 精确度高 (α1<5% ), 干扰因素少, 结果判断更加客观 准确, 也便于进行室内及室间质控 ; 第二, 分析快速简便, 标本回报时间短, 便于及时将各种信息向临床反馈, 同时又可节约大量人力 物力, 利于大批量样本的处理 ; 第三, 更好地避免了标本之间的污染及标本对人的污染 ; 第四, 同一份标本可以同时进行多参数分析, 样本血清用量少, 尤其对于儿童很方便 第二币 免疫浊度测定法的基本原理 一. 免疫浊度测定的理论基础抗原抗体反应是指由抗原物质刺激机体产生相应的抗体后, 两者在体内或体外发生的特异性结合反应 抗原与抗体在体外结合时可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种反应, 例如凝集 沉淀 补体结合以及中和反应等 近年来, 伴随着各种现代高新技术在免疫学中的运用, 以及免疫化学 分子生物学和细胞生物学的新进展, 在各种抗原物质和生物活性分子的分离纯化与鉴定特异性抗体的制备等方面取得了突

142 惶惶且骨干辑后立 以抗原抗体反应为基础的免疫浊度测定技术己成为当代生命科学各个领域中重要的研究于段 免疫浊度技术就是基于抗原抗体反应的原理, 由于抗原与抗体结合后, 形成大分子的抗原抗体复合物, 在体系中形成一定的油度, 根据浊度的变化, 可以检测出相应抗原的量 (~) 影响免疫浊度分析精确性的因素主要有以下几个方面 : 1. 抗原抗体的浓度以及纯度作为免疫反应, 抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键 如何选择好一个抗体去检测一个被检物质, 而不与结构非常相似的其他代谢产物发生交叉反应或者是出现一些没有临床意义的分析产物, 这是分析设计的重中之重 抗原抗体的量必须恰当, 否则便无法得到预期的结果 2. 抗原抗体反应的结合力度在抗原抗体反应中, 抗血清除了要求纯度外 ( 单价特异性 ) 还必须要求亲合力, 抗血清的亲合力是指抗体的质, 在非竞争免疫反应模式中, 抗体亲合力比标记物的最低检测极限更能影响分析的灵敏度 3. 抗体的类型抗体有单克隆和多克隆抗体两种类型单克隆抗体的使用会增加反应的特异性, 但同时会影响批间的分析重现性 4. 固相载体的选择固相载体的选择对非特异性结合和批间变化的消除能力将影响特异性分析的表现选择时要对其化学性能进行测试因为部分化学物质在洛液中达到一定浓度时会与国相载体结合从而影响分析的总体表现 5. 试剂及缓冲液试剂的质量在任何免疫检测中都是影响分析的最主要因素 而对于缓冲液而言, 在设计中要求降低其非特异性结合, 提高试剂稳定性和防止其他影响分析表现的问题, 例如由于异源性抗体 (H 丛丛 ) 和或异嗜性抗体带来的错误结果, 从而确保分析的灵敏度和特异性 6. 结合物及标记物的选择结合物及标记物的特性也会影响分析的灵敏度 特异性 一致性及相关性, 因此这两者的选择也是至关重要的 ( 二 ) 抗原抗体最适比例的选择抗原抗体结合出现可见反应具有一定的量比关系, 只有当两者分子比例合适时, 才发生最强的结合反应 以沉淀反应为例, 在定量的抗体内加入递增量的抗原, 抗原抗体结合形成复合物的量和抗原抗体的比例关系, 如图 10-1 所 135 第十章免疫浊, 各种微量 快速 高度特异和灵敏的自动化检测和数据分析处理方法不断建度技术破性的进展 刁亏 协调带 i 等价带 抗原过剩带 抗原量 图 10-1 抗原抗体最适比示意图 从图上可以看出, 曲线的最高峰部分是抗原抗体结合的最适范围, 两者结合充分, 形

143 高浓度样高浓度的结合物136 第一一篇成沉淀物的速度又快又多, 因此, 两虚线之间的部分即为反应的平衡区 在其两侧, 即是抗体过剩区和抗原过剩区, 在这两个区域内由于抗原抗体比例不合适, 形成的沉淀物量少, 体积小 ; 而如抗原或抗体极度过剩, 则无沉淀物的形成, 甚至己经形成的抗原抗体复合物也可解离 这就是所谓的前后带效应 :1929 年 Heiderberger 将曲线所包括的反应区域, 分为如图所示的抗体过剩区, 又称前带 (prozone) ; 抗原抗体两者比例合适浓度大致相等的区域称为等价带 (zone of equi 飞币 lence) ; 抗原过剩区又称为后带 ( postzone ) 年 Green 等根据反应曲线的形状提出了钩状效应 (hωk effect), 表示同一信号也许表现为两个截然不同的分析物浓度 因此导致假象的弱阳性或弱阴性结果, 这是免疫学测定存在的一个缺陷 前带后带效应 ( 即钩状效应 ) 的机制如图 10-2 所示 固 相 载 程队也 d 一 品态蓝 也 嚣, 图 10-2 前后带效应的机制二. 免疫浊度测定法的基本原理免疫浊度法是可溶性抗原 抗体在液相中特异结合, 产生一定大小的复合物, 形成光 的折射或吸收, 测定这种折射和吸收后的透射光或散射光作为计量单位 光线是一种电 磁波, 光散射是电磁波经过一个样品时作用于微粒的结果 当洛液中的微粒受其作用时, 电子朝一个方向移动而核相反, 形成相对的分离 由于电磁波本质上是电磁振动, 微粒发 生振动或反射, 释放与入射光同样频率的能量 发射方向是球形的, 因此可以在样品的任 何方向检测到 入射光和微粒的性质影响散射信号, 如入射光的波长 偏振 微粒的大小 微粒的浓 度 质量 检测点的距离等等 人们根据微粒大小可分成两类, 其一是小于入射光波长 1 10 的, 其二是大于入射光波长 110 的 第一类微粒细小, 受到均匀的电波作用, 成为入射 光的再辐射源, 这个现象可由 Rayleigh 公式来反映小颗粒的散射 :1871 年 Rayleigh 总结出 反映粒子对入射光散射作用的有关因素相关的公式, 即为 : Ie 二 24 1"[3 A 4 yvu (n ) (n ) J2 (l + cos 2 8) 其中, 10 是入射光强度 ; 入是入射光波长 ;I e 是与入射光束戚 角度出散射光的强度 ;γ 是单位容积内粒子的数目 ;ν 是单个粒子的容积或大小 ; 且是粒子的折射率 ; 口 是洛剂的折 射率 ;8 是光信号检测器与入射光之间的夹角 从上式可作出如下推论 :

144 -Ill-M霄蜻时间 = Ie 与 [ (n 2 日 0 2 ) (n 2 +2no 2 )J 呈正比, 即粒子洛剂的折射率相差愈大, 散射光愈强 Ie 与粒子容积的 2 次方呈正比, 但这一规律只适用于粒子直径 5~ 100 nm 的范围 当粒子直径大于 100 nm 时, 散射光渐弱, 主要是反射和折射等现象 Ie 和检测器与入射光夹角之间的关系在 90 处最小, 在 0 处最大 若想知道肢体洛液中存在的粒子及其大小和数量, 经比浊测定便可达到目的 {E! 临床医学中更重要的是要鉴别样品中粒子的性质, 这样才能对疾病作出诊断 抗原与抗体的反应具有很高的特异性, 且随反应的进行形成的免疫复合物分子和大小不断发生变化 免疫化学反应的基本特点 : 抗原与抗体反应形成免疫复合物是个可逆的过程,{E! 反应的可逆程度主要取决于抗体的亲合力及亲和力 当抗体的亲和力很高, 尤其是亲和力及亲合力都很强, 抗原和抗体的比例又较适当时, 形成的复合物实际上并不解离, 即反应为不可逆的 若在定量的抗体中加入一定量 ( 未过量 ) 的抗原, 经一定时间后, 便基本全部形成免疫复合物, 此时反应达到了平稳或 " 终点 ", 一般为 1O~30 mi 日 这一过程并非以匀速进行的, 抗原与抗体混合的瞬间便引发反应, 开始至少有数秒钟的滞后时间, 随后反应速度加快, 即单位时间内形成较多的复合物, 被测信号变化也相应较大 ( 图 10-3) 在此动态变化过程中选取反应速率最大, 而且与被测物浓度成线性关系的瞬间 ( 一般在反应开始后 5~15 mi 川, 对信号进行检测的方法, 称为速率测定法 (rate measurement) ; 检测反应终点与起始点之间信号变化的方法称为终点测定法 (end - po 川 meas 旧 ement) 由图可以看出, 当反应接近终点时, 信号不一定最大, 主要是由于形成的大分子复合物之间由于相互碰撞而凝聚成更大颗粒, 发生沉淀使悬浮粒子数减少, 而造成被检信号减弱 Ie 与入成反比即入射光波长愈短, 粒子对它产生的散射光愈强 137 第十章免疫浊度技术 散射随时间的变化率即曲线的斜率 图 10-3 速率法的散射比浊测定在加入抗体后的反应速率变化曲线 所菊l 加缓冲液 2 加样品.3. 加抗体 一一口免疫浊度法的分类一以测定方式分类, 免疫浊度法可分为散射光免疫浊度法 (nephelometry immunoassay 或 nephelometry) 和透射光免疫浊度法 (turbidimetric immunoassay 或 t 旧 bidime 町 ) 散射比 f 虫法忏

145 138 第一一篇是在光路的 5 ~96 角的方向上测量散射光强度和被测洛液中微粒浓度关系的方法, 而在光源的光路方向 (0 0 ), 亦即在直射角度上测量透射光强度和被测洛液中微粒浓度关系的方法称为透射比浊法 若是按照复合物形成的速度测定可分为终点法和速率法 运用各种方法的测定仪都可以使用 有些现代自动化免疫分析仪使两种方法结合起来 一. 透射光免疫浊度法免疫透射浊度测定可分为沉淀反应免疫透射浊度法和免疫胶乳浊度测定法 免疫复合物大小约 35~100 ill 丑, 选择波长 290~4 1O nm 最佳 (~) 沉淀反应免疫透射浊度测定沉淀反应免疫比浊测定的基本原理是 : 抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物, 使反应液出现浊度 当反应液中保持抗体过剩时, 形成的复合物随抗原增加而增加, 反应液的浊度也随之增加, 与一系列的标准品对照, 即可计算出未知蛋白质的含量 由于免疫复合物形成有时限变化, 即当抗原抗体相 ~ 后立即结合成小复合物 ( 约 < 19s), 几分钟到数小时才形成可见的复合物 ( 约 >19s) 做为快速比浊, 这种速度太慢, 加入聚合剂 ( 或促聚剂 ) 则会立即形成大的免疫复合物 目前, 最常用的促聚剂是 4% 聚乙二醇 (MW6 000~8 000), 可使复合物在 3~ 1O min 形成 该方法的缺点是 : 第一, 抗原或抗体量大大过剩时, 易出现可洛性复合物造成误差, 尤其是进行单克隆抗体蛋白的测定时 ; 第二, 应维持反应管中抗体蛋白量始终过剩, 这个值 免疫学技术需要预先测定, 使仪器的测定范围在低于生理到高于正常范围之间 ; 第三, 尤其是在低稀释度时, 脂蛋白的小颗粒可形成浊度, 造成假性升高, 因此受血脂浓度的影响 ( 二 ) 免疫胶乳浊度测定法或粒子强化免疫浊度测定法免疫胶乳浊度测定法是一种带载体的免疫比浊法, 其敏感度大大高于比浊法, 操作也极为简便 其基本原理为, 选择一种大小适中 均匀一致的胶乳颗粒, 吸附或交联抗体后, 当遇到相应抗原时, 则发生凝集 单个胶乳颗粒在入射光波长之内, 光线可透过 当两个胶乳颗粒凝集时, 则使透过光减少, 这种减少的程度与胶乳凝集成正比, 当然也与抗原量成正比 与其他方法的区别是, 从抗血清提纯特异的免疫球蛋白 (IgG) 后, 经吸附或共价交联反应固定于胶乳表面, 作为主要的试剂 改变胶乳的原材料可改变其折光率, 又因它有一定粒径, 可增强正向散射光强度等原因, 可使浊度法灵敏度达到 μgl 或 I 鸣 L 水平 该技术首先是要选择适用的胶乳, 其直径要略小于波长, 研究认为, 用 500 nm 波长者, 选择直径为 0.1μm 的胶乳, 用 585 nm 波长者, 则选择直径.1~0.2μm 胶乳 目前常用.2μm 胶乳 其次, 抗体与胶乳结合, 用化学交联较好, 但因失活也较大, 目前一般用吸附注 分析小分子半抗原 (hapten) 物质, 如国体激素 治疗药物和毒物等, 多采用免疫抑制浊度法 抗体的固相化还可增加其稳定性, 因此粒子强化免疫浊度法测定发展较快 例如 Bayer - Technicon 公司生产的 RA 系列, 并有茶碱和 T4 检测试剂盒, 用直径较小的胶乳颗粒与特异性抗体共价结合, 并与聚蔚糖 (Ficoll ) 结合形成 Ag - Ficoll 复合物 聚蔚糖作为促凝剂,Ag - Ficoll 与被测 Ag 竞争与 Ab 的结合 RA 系列自动生化分析仪在 600 nm 波长处测定, ~ 虫度与被测物浓度成反比 二. 散射光免疫浊度法散射光免疫浊度法按测试的方式不同又分为终点散射比浊法 ( end - nephelometry) 和

146 第十章速率散射比浊法 (rate - nephelometry) 散射比浊法的基本原理是: 依据雷利 (Rayleigh) 公式提出的, 散射光系沿水平轴照射, 通过洛液碰到小颗粒 ( 直径 <3 X 10 nm) 的抗原抗体免疫复合物时, 呈全透射, 透射与散射相当 当复合物大于入射光波的 120 时, 形成不对称的前向散射, 导致光线被折射, 发生偏转 偏转角度可以从 0 到 90', 这种偏转的角度可 因光线波长和离子大小不同而有所区别 散射光的强度与抗原 抗体复合物的含量成正 比, 同时也和散射夹角成正比, 和波长成反比 (~) 终点散射比浊法终点法是当抗原抗体反应达到动态平衡时, 即复合物形成后作用一定时间, 复合物油度不再受时间的影响, 通常为 30~60 min, 测定抗原抗体结合完成后复合物的量, 但必须在聚合形成絮状沉淀以前进行浊度测定 优点是稳定性好, 但灵敏度和特异性都较速率法差 ( 二 ) 速率散射比浊法速率法是在抗原抗体反应的最高峰测定其复合物形成的量 所谓速率是抗原 抗体结合反应过程中, 在单位时间内两者结合的速度, 当仪器测定到某 一时间单位内形成的速率下降时, 即出现速率峰, 该峰值的高低即代表抗原的量 速率法与终点法相比, 比较快速, 不需要减去样本和试剂的本底读数, 校正结果也较稳定, 节省试剂, 灵敏度与特异性都优于终点法 散射比油在许多自动化仪器上大多为终点法, 个别公司专门设计了速率比浊仪, 如 Beckman 公司的 Arr ay360 以及最新推出的 IMMAGE 全自动特定蛋白分析仪即是利用速率散射比浊法的原理进行测定的 该方法有如下特点 :1 反应时间快, 一般在 30~60 s 内完成测试 ;2 因为测定的是抗原抗体复合物的形成速率, 抗原多, 反应的速率快, 因而结果比较准确 ;3 因为测试的时间短, 节省试剂和标本用量, 特别是对于儿童很是方便 由此可以看出, 该方法适合了现代医学的快速 准确 经济及实用的要求, 因此在临床上得到了广泛的普及和应用 二. 两种方法的比较在实际工作中, 散射浊度法灵敏度比透射比浊法高, 可测浓度为 fl g 级, 但干扰因素多, 故其应用没有透射比浊法方便 透射比浊结果准确, 所用仪器多为全自动化, 且能与 免疫浊度技术139 其他光度测定 ( 如酶测定 ) 结合, 尤其是随着胶乳粒子强化比浊法的出现使灵敏度提高, 因而其应用更为广泛 两种方法的样品制备是一样的, 在标本收集 处理过程中需防止能散射光的物质, 如灰尘等 选择波长很重要, 防止位于洛液成分的过渡带上, 因为若血清成分吸收了部分入射光即会减弱发射光 透射比 f 虫仪会误测为分析物的高浓度, 而散射比浊仪只产生极微弱的信号 来自磷光或荧光的干扰可通过良好的光学设计或偏振滤光片得以控制 两种方法均存在抗原过量的问题, 在自动化仪器中, 通过复杂的反应动力学数据处理, 可确定反应是否正处于抗体过剩区 平衡区或抗原过剩区, 但不同公司设计的仪器其检测的原理不相同 如 Beckma 口公司对抗原过量的监测是根据抗原抗体沉淀反应的动力学变化规律设计的 在抗体量一定的情况下, 免疫复合物生成量随着抗原量的增加而增多, 但抗原量超过一定阔值后, 免疫复合物的量却随之减少 速率散射浊度法是利用免疫复合物产生的散射光变化的信号达到检测抗原的目的, 因此受此变化规律的影响, 即在抗体量一定的前提下, 速率峰值随抗原量的增加而增大, 直到抗原量过剩后速率峰又随之减少

147 140 第一一篇为了避免由于抗原过量造成的结果误差, Beckma 口系统设置有检查抗原过剩的程序 其工作原理如下 : 如果混合反应液中有游离抗体存在, 再次加入抗原可出现新的速率峰值信号 如果没有游离的抗体存在, 也即抗原过剩时, 就不会有或者只有很小的速率信号出现 在抗体过剩的情况下, 仪器将确认第一次出现的速率峰有效, 并将结果打印出来 在抗原过剩的情况下, 仪器重新对标本进行更高稀释, 然后测定结果 ( 图 10-4) 图 10-4 抗原过量的检测 美国 Dehring 公司的特定蛋白分析测定系统测定方法实质上是透射比浊的一种改良, 免疫学技术利用发光二极管 (840 nm) 作为光源, 检测在前向角 13 ~24 的散射光, 由硅化光电二极管接收散射光信号, 这种散射光的强度与免疫复合物浓度成正比 散射光电信号与贮存在计算机内的标准曲线 ( 图 10-5) 进行比较, 然后转换成检测物的浓度单位 图 10-5 在速率基础上完成的标准曲线 Beckma 口公司近年推出了新一代全自动特种蛋白分析 药物浓度监测为一体的免疫分析系统 (IlVMA..GE) 岛 1AGE 免疫分析测定仪使用 760 ill 卫和近红外 940 nm 波长作为光源, 采用速率散射比浊 (rate nephelometry) 速率抑制散射比浊 (rate i 日 hibitio 日 nephelometry) 速率近红外颗粒透射法 (rate near infarared particle immunoassay) 速率抑制近红外颗粒透射法 (rate inhibition near infarared particle immunoassay) 四种检测技术, 并采用不同的散射角度测量发散的散射光强度,90 角度的散射法测定小颗粒( 直接反应产物 ),0 角度的透射光检测大颗粒 ( 抗体颗粒结合物 ), 扩大了检测免疫项目的范围, 增强了检测敏感度和精度, 减少了非特异性颗粒的干扰

148 141 第度技术免疫浊度法应用及测定中的注意事顶 b 岱 1AGE 免疫分析测定仪加大抗原过量检测范围以区分非特异性反应, 使检测结果更加可靠, 添加了试剂冷藏系统以增加试剂的稳定性, 采用全方位的条形码系统可以自动检测试剂及试剂的批号 校正的状态 试剂过期的日期 试剂的体积及质控 标准和样品标本, 具有双试剂加样探针 ( 避免交叉污染 ) 和智能液面感应器, 处理标本自动化程度高 (75 ~180 测试 h) Dehring 公司于 2000 年推出了新一代全自动特种蛋白免疫分析系统 (BN Prospec), 使用远红外发光二极管作为光源, 采用固定时间散射比浊法 (fixed time nephelometry) 终点散射比浊法 (final measurement mephelometry) 和 Vl in - 1ntergral 散射比浊法三种检测技术, 部分试剂采用了乳胶增强剂, 提高反应灵敏度, 大大加强了检测范围, 检测项目多达 60 多工页 该分析仪由于测定范围宽, 优化了反应过程, 因而无需抗原过量检测 第四币 一. 免疫浊度法的试剂要求 (~) 抗血洁的基本要求免疫浊度法最重要的是抗体或抗血清, 抗血清的效价 特异性 亲和力及亲合力都应尽可能地高 1. 抗体的效价这是决定抗血清用量的关键 目前常用的测定血清效价的方法是双向扩散法 即将抗原 ( 如血清 ) 和抗体均按原倍 1:2 1:5, 1:10 1:20 1:40 1 :60 等 6 个稀释度双相稀释, 抗体放周围, 抗原放琼脂板的中心孔, 组成 7 个互为比例的双扩散板, 由此可测得抗血洁的效价及血清的最适用量 一个合格的比浊用抗体其效价必须在 1:16 ( 抗体稀释度 ) 以上, 否则伪浊度太大 2. 抗血洁的特异性抗血洁的特异性是免疫反应的决定因素 因此测定用的抗血清不是任何动物的抗血清都适用于比浊法 最常用的是由兔产生的 R 型多价抗血洁, 因为这类抗血清亲和力高, 与抗原结合后不容易解离, 抗体过剩时易形成大而稳定的复合物, 因此在抗体过剩的条件下用于比浊法, 但值得注意的是在抗原过剩的情况下会形成可洛的复合物 3. 抗血洁的亲和力抗血清的亲和力是必须要求的, 亲和力是指抗体的质 亲和力的测定一般用平衡 ; 去, 即将稀释抗原和抗体混合后观察速率峰出现的最短时间, 一般在 30 s 之内, 越短越好, 10 s 左右亲和力最好 ( 二 ) 高分子物质加强剂为了促进抗原抗体复合物的形成, 在反应体系中常常加入非离子性亲水性多聚物, 即高分子物质, 如聚乙二醇 (PEG) 氟化纳等, 现多用 PEG8000, 其原理是解除蛋白质 ( 抗原 抗体 ) 周围的电子云和水化层, 促进有结合力的抗原 抗体靠近并结合成大复合物 当反应体系中 PEG 浓度达到 4% 时, 终点法可以缩短反应时间, 速率 十章免疫浊法可以增加反应 l 峰值 PEG 还可增加扩 L 血清洁性, 增加有效抗体滴度, 促进低活性抗血清 的作用 ( 三 ) 稀释缓冲液 ( 电解质 ) 缓冲液的性质和强度影响免疫复合物的形成和稳定性, 以下阴离子按促进免疫复合物形成的递增次序排列 :SCN C104 N03 Br CC, I S042-,HfD 3 町, 阳离子中 Na+ 有利于免疫复合物的形成和稳定 ( 四 ) 抗干扰杂散光是影响比浊测定灵敏度的一个重要因素, 要求所用稀释液及以

149 142 第一一篇上试剂均应用.22μm 滤膜过滤, 消除因脂肪微粒及蛋白质等凝集产生的样品伪浊度 同时, 应做试剂空白 样品空白 抗血清空白以排除杂散光对结果的影响 二. 免疫浊度法应用中几个重要因素 ( 一 ) 抗原抗体反应的比例免疫浊度测定的基本原则是在反应体系中保持抗体过量, 如形成抗原过量则造成测定失败 因此, 在自动化仪器, 通过复杂的反应动力学数据处理, 必须有抗原过量校正, 确定反应是否处于抗体过剩区 平衡区或抗原过剩区 在免疫比油分析中, 抗原抗体复合物的生成量和颗粒的大小与反应体系中两者的比例有极大关系 两者必须在一个恰当浓度才会出现最高结合峰 任何一种的过量存在, 都会引起复合物的再洛解 抗原过量的检测方法 : 1. 标本用两种稀释度测定 ; 2. 测定后的反应液中追加被检样品, f 虫度上升表示有多余抗体, 反之, 如浊度下降, 可能为抗原过量 ; 3. 测定后的反应液追加抗体, 继续观察浊度, 浊度升高表示抗原过量 ; 4. 连续监测抗原抗体反应曲线, 抗原过量时曲线异形 ( 二 ) 伪浊度这是临床检验中最常见而且较难排除的现象, 即假阳性和假阴性结果 免疫学技术1. 抗血洁的抗体不纯 ~ 虫度试剂中要求的抗血清具有单价特异性, 即抗体只会针对某一抗原, 对其他抗原决不交叉, 这是抗血清最核心的要求 抗血清不纯, 即可造成假性升高 2. 增 f 虫剂的使用可使反应速度加快, 但如一味加大增 f 虫剂的使用量, 则会使伪浊度增加, 造成假性升高 如 12% 的 PEG 可沉淀 19( 王, 20% 的 PEG 可沉淀白蛋白, 一般 PEG 浓度为 4% 左右为好 3. 反应时间掌握不当 4. 样品本身的浊度处理不当 ; 试剂的污染和变质 的判断 原因有以下几个方面 : 5. 比色杯等器材不够清洁 ( 三 ) 钩状效应如前所述, 钩状效应是免疫学测定的一个缺陷, 可造成假象的弱阳性 或假阴性结果 现代自动化的仪器虽己具备检查抗原过量的功能, 但是一经发现必须对 样品进行稀释后再测, 当发现病人症状与检验结果不符时, 应怀疑钩状效应的存在 ( 四 ) 报告结果中的计量问题一般来说, 应该使用标准的国际单位 (ill 或 U), 而且 病人报告应与校正品使用相同的单位 因为, 医学检验中针对的许多物质是大分子物质, 其 ill 计量与其纯度及活性等因素间的关系极为复杂, 仍是免疫学测定标准化中的一个重 要研究课题 因此, 对于免疫浊度测定要严格实施实验室内部质控 一. 免疫浊度法的应用洛性抗原抗体反应, 形成不洛性免疫复合物的过程 因此, 后三种方法可做的检测均可忏所菊五口免疫浊度法的应用与展望 免疫浊度法的原理和传统的凝胶沉淀试验 血凝试验及胶乳凝集试验一样, 均基于可

150 第十章用免疫浊度法代替, 不但灵敏度有突破, 可与放免方法媲美, 而且使分析由定性及半定量进入了精确的定量分析 这些技术的进步有助于肿瘤标志 病毒等的定量分析, 为疾病的疗效监测和预后分析提供了帮助 免疫浊度法早期主要用于测定人血洁 尿液和脑脊液中的蛋白质含量 随着现代科学技术的飞速发展, 近十年来, 各种先进的医学分析仪器纷纷问世, 为免疫浊度法在科研与临床检测中的广泛应用奠定了坚实的基础 免疫浊度法同其他免疫学分析 ( 如酶免疫测定技术 放射免疫测定技术 发光测定技术等 ) 相比, 其最大的优点是无放射性污染 操作简便快速 标准曲线稳定 易于自动化 大批量样品可以同时测定 缺点是特异性差 灵敏度不如可见光与紫外光谱分析等方法高, 特别是对于单克隆蛋白和多态性蛋白的检测准确度稍差, 易受血脂 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白 乳靡微粒等的影响, 尤其是低稀释度时, 脂蛋白的小颗粒可形成浊度而造成假性增高, 使其使用受到一定的局 ~~o 目前, 免疫浊度法的应用不断扩大, 不仅是用于传统的免疫球蛋白的测定, 还用于分子量在 10 ~ 50 KThlton, 样品浓度为 0.01~100 g L 的各种蛋白质分子的测定, 载脂蛋白 半抗原 ( 如画体类激素 毒物和各种治疗药物 ) 及微生物等的测定 在应用中应注意如上所述的问题, 坚持做室内质控及校正 二. 免疫浊度法展望 (~) 由上可以看出, 免疫反应的关键是抗原抗体的反应, 因此对抗原或抗体的质量要求很严, 包括抗血清的亲和力 效价 含量 抗血清的多表位等等, 这些问题一直是阻碍浊度法广泛应用的关键, 可望在不久的将来就能得到解决 ( 二 ) 实际测定过程中, 抗原过量或抗体过量是很难控制的, 因此, 比浊法的测定仪器必须有抗原过量或抗体过量的自动检测程序, 这是这类仪器必备的条件, 现在很多厂家的自动生化分析仪实际上并不具备免疫比浊测试条件, 因为没有自动检测过量程序 今后, 随着科技的进步, 这一问题有望解决得更好更科学 ( 三 ) 由于抗原抗体结合形成复合物需要有一定的时间, 因此运用免疫比浊法测定存 免疫浊度技术143 在的一个明显的缺陷就是速度较其他方法为慢, 如果将来有更好的促进二者结合的办法出现, 这个问题可望得到解决, 目前更新的仪器是通过设计多通道的办法来提高速度的 总之, 免疫浊度法是一项快速 实用的技术, 为让其准确 真实地反映患者的实际情况, 我们应充分注意其技术特点和试剂质量 二. 免疫浊度法的测定仪器如上所述, 免疫比浊法有透射光免疫浊度法 散射光免疫浊度法 速率免疫浊度法和终点免疫浊度法, 其相应的测定仪器有许多, 目前国内常用的有以下几种型别 (~) 自动生化分析仪许多自动生化分析仪可用于浊度测定, 有专门编有散射或透射测试程序的自动化生化分析仪, 如 Cobas, Bio Technicon DuPont, Monach 等 目前, 国内较流行的大型多通道自动分析仪如 Technicon RA - XT, OlympusAU560 AU600 AU800 AU1000 AU5000, Hitachi7150 Hitachi7170 Beckman ex 等专门编有或可自编透射浊度分析程序, 并可选用许多自动校正和计算公式, 大大提高了检测的精密度与准确性 ( 二 ) 散射浊度分析仪 1. 离心式自动分析仪如 IL MultistatF LS, Monarch, Roche Cobas hra, Mira 等, 常用银弧光源, 采用与入射角呈 90 的位置检测, 可选速率法 固定时间法或终点法进行测定

151 144 第一一篇2. 氨氢激光比浊仪如 Dade Behring Nephelometer 特定蛋白分析仪, 采用氨氢光源, 发射波长 nm, 在 90 角和向前角度( 即光电倍增管的位置与光源轴所呈角度常为 13 ~24 ) 检测, 也可选用高效近红外光发射二极管使发射波长增至 840 nmo 3. 速率法自动散射浊度仪 (1) 采用向前角度监测的速率法自动散射浊度仪, 有两类, 如 Beckman ICS 和 Arr ay 系统是流动式的, Bayer DPA 系统是任选式的, 测定向前散射的光强度, 可减少内源性物质光散射的干扰, 自动化程度高, 能保证在光散射速率最大时进行检测 (2) 运用双光路检测法的速率法自动散射浊度仪, 常用的有 Beckman Co ulter 公司继 Array 后最近新推出的 IMMAGE, 它采用近红外检测免疫分析法 (NIPlA) 和速率散射浊度法, 多选择 高输出, 使用 760 nm 和近红外 940nm 两个波长作为光源, 采用 90 和 0 两个角度来测量发散的散射光强度, 0 角度的透射度检测大颗粒( 抗原抗体结合物 ), 90 角度的 散射法测定小颗粒 ( 直接反应产物 ), 由此可以扩大检测免疫项目范围, 增强了检测敏感度 和精度, 减少了非特异性颗粒的干扰 可用于小分子 微含量的物质, 如铁蛋白 地高辛和 IgE, hs-crp, 1 届亚型等 IMMAGE 免疫分析仪加大了抗原过量的检测范围以区分非特异性反应, 使检测结果更加准确可靠 ; 采用全方位的条码系统可以自动检测试剂及试剂的批号 校正的状态 试剂过期的日期 试剂的体积 质控 标准及样品标本 ; 添加了试剂冷藏 免疫学技术系统以增加试剂的稳定性, 具有双试剂加样探针 ( 避免交叉污染 ), 具有智能液面感应器, 每个样品 5 s 循环时间, 2 s 1 昆旋, 3 s 洗涤, 使反应速度和自动化程度更高, 每小时可测试 75~180 个样品 (3) 运用终点法散射比浊的自动化特定蛋白测定仪, 主要有美国德灵 (Dade Behri 鸣 ) 公司于 2000 年继 BN100 特种蛋白分析系统之后推出的新一代全自动特种蛋白分析仪, 它 使用远红外发光二极管作为光源, 采用固定时间散射比油 终点散射比油和 VIi 日 散射比浊法三种检测技术, 部分试剂采用了乳胶增强剂, 提高了反应灵敏度, 同时可使用 Integral 两种不同规格的原始管和样品杯, 当分析小儿微量样品时, 操作者可使用特定的微量样品杯, 减少了标本的用血量, 为儿童标本的测定提供了方便 机内设有试剂 质控品冷藏系统, 保证试剂的稳定性, 同时使反应温度控制在 3TC, 使反应条件稳定 Dade Behring 公司不断开发新的检测指标, 补充到 BN 系统的程序中, 如监测肾小球滤过率最敏感的指标 cystatinc( 血清后 γ 微球蛋白 ), 这是 BN ProSpec 系统所特有的 该系统没有抗原过量的检测, 它对抗原过量的干扰进行保护, 其具体做法是采用预先反应程序来加强防止抗原过剩的干扰, 此方法不但能加强试验的灵敏度, 还可拓宽测试范围 预先反应程序的原理是首先让少量样品与抗血清混合, 然后在短时间内监测它的反应, 若反应是正常的, 样品量就会加进反应物内, 当反应讯号超出界点时, 样品会自动稀释后再进行分析 通过这种方法使系统内所有抗原抗体反应都是在一个优化的环境下进行, 即使样品浓度高时, 反应仍可在抗体过剩的环境下进行 参号文献 1 丛玉隆, 王丁, x x x, 等. 当代检验分析技术与临床. 北京 : 中国科学技术出版社, 朱立平, 陈学清免疫学常用实验方法北京 : 人民军医出版社, 2000

152 145 第十章免疫浊度技术3 Yam 日 nishi H, Lyama S.The Effect of reaction temperature for neph e1αnetric assays for rheumatoid factor. Clin Chern Acta, 2000, 292: 巴德年主编. 当代免疫学技术与应用. 北京 : 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, Lelong M, Renard MF, Giraudeaux V. Solid immunoassay and immunoephelometri methods for serum C reaction protein (CRP) deter mination: discrepancy in CRP value for a patient presenting a ill 口 noclonal immunoglobulin G. Clin Chern Acta, 1999, 288: 沈霞, 李稻. 临床免疫学与免疫学检验新技术. 北京 : 人民军医出版社, 陶义训, 吴文俊现代医学检验仪器导论上海. 上海科学技术出版社, 沈关心, 用汝麟现代免疫学实验技术武汉 : 湖北科学技术出版社, 龚非力. 医学免疫学. 北京 : 科学出版社,2001

153 旺M4Aql 忏口一一篇免疫学技术第十一章 酶免疫分析技术 述 酶免疫分析技术 (enzyme immunoassay, EIA) 是以免疫学和酶学为共同基础发展起来 所菊146 第的 它是将抗原与抗体免疫反应的特异性与酶的催化放大作用有机结合在一起的一种微 量免疫分析技术 酶标 i 己抗体或抗原后, 既不影响抗体或抗原的免疫反应特异性, 也不改 变酶本身的活性 在 EIA 检测过程中, 首先抗原抗体间发生免疫反应, 然后加入底物, 酶 催化相应底物水解显色, 根据有无颜色变化及颜色的深浅, 即可进行定性或半定量分析 酶免疫分析技术等非放射性免疫分析技术是在放射性免疫分析技术的基础上发展起 来的 1959 年 Yalow 和 Berson 等应用抗原抗体特异结合的特性及放射性核素 ( 125 1) 标 i 己的 抗原和非标 i 己的抗原与限量抗体竞争结合的原理建立了竞争性放射免疫分析 (radioimmu noassay, RIA) a 很快这种灵敏的微量免疫分析技术被广泛应用于体液中的激素 微量蛋白 及药物测定 1967 年 Catt 和 Tregear 首先应用塑料管包被固相抗体, 在此基础上, 同年 Wide 等首先建立了固相抗体抗原山 I 标记抗体的反应模式, 以后逐渐发展为非竞争性的免疫放射分析 (immunoradiometric assay, IRMA) a 20 世纪 60~70 年代, RIA 和 IRMA 等放射性免疫分析技术得到了迅速发展, 在免疫分析中占主导地位, 同时也为非放射性免疫分析技术开辟了道路 1971 年 Engvall 和 Penlrnann 及 Vanweemen 和 Schu 旧两组学者分别 用酶代替放射性同位素制备了酶标试剂, 创立了酶免疫分析技术 1975 年问世的杂交瘤 技术可大量生产针对不同抗原决定簇的单克隆抗体, 使 EIA 技术灵敏性和特异性得到了显著提高, 推动了新一代 EIA 技术的发展 同 RIA 和 IRMA 等放射性免疫分析技术相比较, EIA 除可避免放射性同位素对操作人员的伤害及对环境的污染外, 还具有很多优点, 比如酶标记物的有效期长, 在无菌或防腐条件下, 4'C 或冻干放室温保存期可超过一年 而常用的山 I 标记物半衰期一般只有两个月左右 另外, 随着酶免疫分析自身的发展以及酶免疫分析与荧光技术和化学发光技术等其他分析技术相结合, 在酶免疫分析固有的优点上, 又进一步提高了灵敏度, 使其测定的灵敏度超过了 RIA, 达到 mol La 综合上述, 酶免疫分析等非放射性免疫分析技术将逐步取代放射性免疫分析技术, 在医学生物学领域中将占据更加重要的位置 第二币 酶免疫分析技术的分类 酶免疫分析技术一般根据测定过程中是否需要将结合的酶标记物和游离的酶标记物 分离而分为均相酶免疫分析 (homogeneous EIA) 和异相酶免疫分析 (hetrogeneous EIA) 一. 均相 EIA 在均相 EIA 中, 由于抗原抗体结合后, 使酶活性发生改变, 因此不需将游离和结合的

154 第十一章酶标记物分开即可达到检测目的 均相 EIA 的设计主要基于以下几点 :1 抗原与抗体具 有特异性结合的特性 ;2 酶标抗原 (Ag* ) 保留抗原与酶的活性 ;3 酶标抗原抗体结合后形 成的复合物可使酶的活性发生改变 ;4 待测抗原与酶标抗原可相互竞争与限量的抗体结 合, 因此可直接测定酶的活性变化而不需将 AbAg 怜与 Ag 怜进行分离 上述为均相 EIA 共 有的特点, 在此基础上又发展出一些各具特色的分析方法 (~) 酶放大免疫分 + 析斤技术 酶放大免疫分析技术 (e 臼 I 皿 yme multi 旺 ipl mq 阳 ue 乌, 卧但 Tη) 是最早获得实际应用的均相酶免疫测定方法, 是由美国时 va 公司研究成功并 命名的 此法主要用于检测小分子抗原或半抗原, 在药物激素和毒品检测中应用较为广 泛 卧但 T 的基本原理 : 半抗原与酶结合成酶标半抗原, 保留半抗原和酶的活性 当酶标 半抗原与抗体结合后, 由于抗体与酶密切接触, 影响了酶的活性中心, 而使酶的活性被抑 制 当加入待测半抗原时, 待测半抗原与酶标半抗原相互竞争限量抗体, 使结合的酶标记 物 ( 酶活性被抑制 ) 减少, 游离的酶标记物 ( 具有酶活性 ) 增加 因此待测半抗原的浓度与 酶活性成正比, 即待测半抗原浓度越高, 酶的活性就越大, 从而根据酶活力的测定既可推 断出标本中半抗原的量 在卧但 T 中最常用的酶是葡萄糖 6 磷酸脱氢酶和洛菌酶 ( 二 ) 克隆酶供体免疫分析技术 (cloned enz)'l 丑 e donor immunoassay, CEDIA) 利用重组 DNA 技术制备自半乳糖昔酶的两个片段 : 大片段称为酶受体 (er 町 me acceptor, EA), 小片段称为酶供体 (enz)'lne donor, ED) 两个片段均不具酶活性, 只有在适宜条件下结合在一起, 才具有酶活性 应用这一特性,Mi cre 皂白 11CS 公司建立了以竞争法为模式的均相酶免疫试验, 称为 CEDIA o 其原理为 : 标本中的抗原和 ED 标 i 己的抗原与特异性抗体竞争结合, 形成两种抗原抗体复合物 ED 标 i 己的抗原与抗体结合后, 由于空间位阻, 不能与 EA 结合 反应平衡后剩余的 ED 标记抗原与 EA 结合, 形成具有活性的酶, 酶活力的大小与标本中抗原含量呈正比 此法己成功用于甲状腺素和地高辛等的测定, 也可用于大分子量 酶免疫分析技术147 抗原单一抗原决定簇的定量分析 ( 三 ) 辅基标记免疫分析技术 (prosthetic group labeled antigen immunoassay, 因 LIA) 又称酶蛋白复活免疫分析技术 (apoer 町 me reactl\ 币 tion immunoassay, ARIS) 酶蛋白为酶的蛋白质成分, 可与辅基分离, 但只有在辅基存在的条件下, 才能形成活性复合酶 ( 即全酶 ), ARIS 利用辅基来标记抗原, 标 i 己有抗原的辅基具有与酶蛋白结合形成全酶的能力, 而当辅基标记抗原与抗体结合形成复合物后, 即失去与酶蛋白结合形成全酶的能力 当辅基标 i 己抗原与标本中抗原竞争, 同限量抗体结合时, 标本中抗原浓度越高, 游离的辅基标记抗原也就越多, 形成的具有酶活性的全酶也就越多 因此 ARIS 标本中抗原的浓度与酶活性也是成正比的 可通过直接测定酶的活性得到标本抗原的浓度 均相 EIA 由于不要求分离结合与游离的标记抗原, 可减少因物理分离而引起的误差 操作步骤简单快速, 便于自动化 灵敏度为 1O- 9 mol L, 主要用于小分子半抗原如药物和小分子激素等物质的测定 其主要缺点是由于没有物理分离步骤, 样品中一些非特异性的干扰物质容易影响检测结果, 另外由于均相 EIA 利用的是竞争性结合的原理, 其测定的灵敏度不如非均相 EIA 高, 而且由于制剂的制备多较为繁琐, 其应用普及的程度远低于非均相 EIA 二. 异相 EIA

155 148 第一一篇异相 EIA 须将结合的标记物和游离的标记物分离开才能进行测定 在医学检验中, 酶免疫分析多为异相 EIA o 在异相 EIA 中, 分离主要是通过固相载体, 即将一种反应物固定在国相载体上, 当另一种反应物与之结合后, 可通过洗涤 离心等方法与液相中的其他物质相分离 这类异相 EIA 称为国相酶免疫测定 (solid phase EIA) 年, Engvall 和 Perlmann 首先建立了这种方法, 并称之为酶联免疫吸附试验 (enzyme lir 也 ed immunosorbent assay, ELISA) 0 ELISA 己成为固相酶免疫测定的通称 根据测定对象的不同, ELISA 可采用不同的模式, 主要有以下几种 : (~) 双抗体夹心法 ELISA 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法, 主要原理是用酶标记特异性抗体来检测己于固相结合的待测抗原 其方法步骤如下 : 首先将特异性抗体包被于国相载体上, 形成固相抗体 再加入待测标本, 经温育, 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合, 形成固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他未结合的物质 然后加入酶标抗体, 使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合, 形成固相抗体抗原酶标抗体复合物, 彻底洗涤未结合的酶标抗体 最后加入底物, 夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物, 根据颜色反应的深浅程度即可对抗原进行定性或半定量分析 根据同样原理, 用大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物, 即可用双抗原夹 免疫学技术此外, 在双抗体夹心法测定抗原时, 如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为国相抗体和酶标抗体, 则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步, 称为双位点一步法 这种双位点一步法不但简化了操作, 缩短了反应时间, 且应用高亲和力的单克隆抗体, 测定的敏感性和特异性也显著提高 单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELISA 提高到新水平 在一步法测定中, 应注意钩状效应 (hωk effect), 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象 当标本中待测抗原浓度相当高时, 过量抗原分别和国相抗体及酶标抗体结合, 而不 心法测定标本中的抗体 再形成夹心复合物, 所得结果将低于实际含量 钩 1 文效应严重时甚至可出现假阴性结果 ( 二 ) 间接法 ELISA 间接法是检测抗体最常用的方法, 其原理是利用酶标 i 己的抗人免疫球蛋白抗体 ( 二抗 ) 检测己与固相结合的待测抗体, 故称为间接法 其方法步骤如下 : 首先将特异性抗原包被于固相载体上, 形成固相抗原 再加入待测血清, 经温育, 其中的特异抗体与固相抗原结合, 形成固相抗原抗体复合物 经洗涤后, 固相载体上只留下特异性抗体, 其他免疫球蛋白及杂质在洗涤过程中被洗去 然后加入酶标二抗, 其与固相复合物中的抗体结合, 形成固相抗原抗体酶标二抗复合物, 从而使该抗体间接地标记上酶 最后洗去过量的酶标二抗, 加入底物显色, 颜色深度代表标本中待测抗体的量 本法只要更换不同的固相抗原, 即可以用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体 此外, 间接法也可用于抗原的检测 首先, 用两个夹心抗体将抗原固定于国相载体上 这两个夹心抗体必须来自两种不同动物, 第一种动物的抗体包被于固相载体上, 待测抗原与之结合, 再与第二种动物的抗体结合形成双抗体夹心免疫复合物 然后加入抗第二种动物抗体的酶标抗体, 经温育 洗涤后, 加底物显色 这一方法的优点是只标记一种抗抗体就可检测多种抗原 由于多加一层抗体, 放大倍数高, 提高了试验的敏感性

156 待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合, 因此结合于固相的酶标抗原量与待测抗原的量呈反比 方法步骤如下 : 首先将特异抗体与固相载体连接, 形成固相抗体 然后, 加入待测标本和一定量酶标抗原的混合溶液, 使之与固相抗体反应 如待测标本中无抗原, 则酶标抗原能! 顺利地与国相抗体结合 如待测标本中含有抗原, 则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合, 竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会, 使酶标抗原与固相载体的结合量减少 保温后, 酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量 经洗涤, 洗去过量的酶标抗原 最后, 加底物显色, 结合于固相的酶标抗原与标本中待测抗原的含量成反比, 即待测管颜色越淡, 表示标本中抗原含量越多 ( 四 ) 捕获法 ELISA 用于检测特异性胁 f 或 19A 等分类抗体 血清中针对某些抗原的特异性胁 f 或 19A 常与特异性 Ig G 同时存在, 后者会干扰胁 f 或 19A 抗体的测定 因此测定 I 剧或 19A 抗体多用捕获法 先将所有血清剧或 19A 抗体固定于固相上, 去除 IgG 后再测定特异性 I 剧或 19A 抗体 以检测特异性胁 f 抗体为例, 方法步骤如下 : 首先, 将抗人胁 f 抗体连接在固相载体上, 形成固相抗人胁 4 加入待测标本, 保温反应后标本中的 I 圳抗体被固相抗人刷抗体捕获 洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分 然后加入特异性抗原试剂, 它只与固相上的特异性 I 剧结合 再加入针对特异性抗原的酶标抗体, 使之与结合在固相上的抗原反应结合, 这时即可形成固相抗人胁 f 抗体胁 f 抗体特异性抗原特异性酶标抗体复合物, 经洗涤, 洗去过量的酶标抗体 最后加底物显色, 显色深浅与特异性胁 f 抗体含量成正比 ( 五 ) 生物素亲和素系统 ELISA 亲和素是一种糖蛋白, 可在蛋清中提取, 分子量 60 kd, 每个分子由 4 个亚基组成, 可以和 4 个生物素分子亲密结合 现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素 ( strepavidin) 生物素( bioti 日 ) 又称维生素 H, 分子量 , 存在于蛋黄中 用化学方法制成的衍生物, 生物素丑基玻咱亚肢醋 ( biotin - hydroxysuccini mide, BNHS) 可与蛋白质 糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物 亲和素与生物素的结合, 虽不属免疫反应, 但特异性强, 亲和力大, 两者一经结合就极为稳定 由于 1 个亲和素分子有 4 个生物素分子的结合位置, 可以连接更多的生物素化的分子, 形成一种类似晶体的复合体 因此把亲和素和生物素与 ELISA 相联起来, 就可大提高 ELISA 的敏感度 亲和素生物素系统在 ELISA 中的应用有多种形式, 可用于间接包被, 亦可用于终反应放大 可以在国相上先预包被亲和素, 原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合, 通过亲和素生物素反应而使生物素化的抗体或抗原在相化 这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量, 而且使其结合点充分暴露 另外, 在常规 ELISA 中的酶标抗体也 ( 三 ) 竞争法 ELISA 竞争法可用于测定抗原, 也可用于测定抗体 以测定抗原为例, 149 第析技术十一章酶免疫分可用生物素化的抗体替代, 然后连接亲和素 酶结合物, 以放大反应信号 ( 六 ) 其他 1. 亲和层析介导的免疫测定 (affinity chromatograph mediated immunoassay, AIα;fiA) 其特点是只要求被测抗原有一个抗原结合位点即可被检测, 所以可用于半抗原的检测 主要步骤是使过量的酶标单价抗体与样品中的被测抗原反应, 反应混合液通过含固相抗原

157 一一篇免疫学技术的亲和层析柱, 混合液中多余的酶标抗体即滞留在柱子上, 而酶标抗体抗原复合物可通过 柱子并被收集 由于酶活性大小与样品中抗原浓度呈正比所以可以通过检测收集液中 的酶活性未获得样品中抗原浓度 2. 单位点非竞争 ELISA 用于测定单价抗原也可分为酶标抗原和酶标抗体两种类 型 用酶标抗原时, 将被测半抗原先同适度过量固相抗体温育, 洗涤后加入过量酶标半抗 原, 待其与未被占据的固相特异性抗体反应形成酶标抗原抗体复合物后, 再次洗涤, 去除未同固相抗体结合的酶标半抗原 然后加入酶底物, 室温反应一定时间, 测光密度 酶的活性同被测半抗原浓度成反比 用酶标抗体时, 将待测半抗原同过量的酶标抗体温育, 待反应达到平衡后, 再与过量 的固相半抗原反应, 以去除未反应的酶标抗体 洗涤后, 加入底物洛液, 通过测光密度对反应产物进行定量 酶的活性同待测半抗原的浓度成反比 此法适于单价半抗原和药物 的定量, 也可用于多价蛋白质抗原的测定 所菊150 第一一一口酶免疫分析相关仪器随着检验医学的发展, 检测项目和标本量急剧增加, 在大型实验室中自动化系统取代子工操作是必然的趋势 20 世纪 50 年代生化自动分析仪即获得实际应用 免疫测定在技术上有其特殊性, 自动化发展较迟, 20 世纪 80 年代后才有自动化分析系统问世 目前除放射免疫测定外, 几乎所有的免疫测定方法均可进行全自动分析 在酶免疫分析中, 由于均相酶免疫分析只需通过酶活力测定而不需要进行物理分离即可完成检测, 而酶活力的测定方法与临床化学法相同, 因此一般均相酶免疫分析的试剂在生化自动分析仪上即可进行标本的检测 也有专用于均相酶免疫分析的全自动分析仪, 如市 va 公司开发的专用于卧但 T 测定的 IS 全自动分析仪等 这里重点阐述一下在日常检验工作中较常用的异相酶免疫分析的相关仪器, 即 ELISA 自动分析仪 在 ELISA 中通常用聚苯乙烯为国相载体, 有微孔板 小管 小珠 微粒 磁性微粒等类型, 不同形式的固相载体要求不同的洗涤装置 根据各种 ELISA 自动分析仪所采用的固相载体的不同类型, 分述如下 : -.1 敬孔板固相酶免疫分析仪微孔板式 ELISA 使用的载体为 96 孔板 20 世纪 80 年代初, 可直接检测微孔板吸光度的酶标仪商品问世, 后经不断改进, 己发展为自动化 高效率 高精密度的测定仪 在 ELISA 中, 洗涤步骤非常重要, 洗板机己代替子工操作在实验室中被广泛采用 洗板机要求洗涤后固相表面非特异性物质洗涤干净, 吸液后每孔中残留的液量极少 较精密的洗板机有可调节的定时 洗涤液定量及振荡微孔板的功能 半白动微孔板式 ELISA 分析仪由加液器 温育器 洗板机和酶标仪组成 测定中一个步骤完成后由于工将微孔板移至下一个步骤的仪器中 20 世纪 90 年代末, 全自动微孔板 ELISA 分析仪问世, 在大批量标本的检测中, 不但提高了工作效率, 而且测定的精密度亦得到改善 板式 ELISA 自动分析仪均为 " 开放式 ", 即适用于各家的试剂产品 微孔板每一孔的彻底清洗是 ELISA 的关键, 亦是自动分析的难点 因此直至近年才有全自动的板式分析仪问世 Bio- Rad 公司的 ωida 自动酶免疫分析仪和四 Tnex 公司的 DIAS 型微孔板自动处理系统均可同时进行多块微板的全自动测定 忏

158 第十一章全自动微孔板 ELISA 分析仪检测结果的精密度主要取决于试剂的质量 二. 管式固相酶免疫测定仪器管式固相酶免疫测定仪器以聚苯乙烯管为国相载体, 一般都配有仪器专用试剂 德国宝灵曼公司 (:&ehringer Ma r 址 1eim) 开发的 ES300 型分析仪是管式配有专用试剂的全自动分析系统, 试剂包括用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管 生物素结合的抗原或抗体, 辣根过氧化物酶标 i 己的抗体及显色底物 ABIS 和 I 丑 02 0 主要原理为 : 在包被有链霉亲和素的小管内加入生物素标 i 己的特异性抗体和待测抗原, 经温育, 即可形成固相包被亲和素生物素特异性抗体待测抗原复合物, 然后洗涤去除被结合的抗原和生物素标 i 己的抗体 加入酶标抗体经温育形成固相包被亲和素生物素特异性抗体待测抗原酶标抗体复合物, 再次洗涤, 除去多余的酶标抗体 加入底物显色, 然后吸入流动比色杯, 经 422 皿丑的酶标仪测定获得 OD 值, 即可得到待测抗原的含量 此外, 美国强生公司的 Vitros Eci 全自动增强化学发光酶免疫分析仪系统与上述 ES300 型分析仪基本原理大致相同 法国 Bio - Merieux 公司生产的 Vidas 也是一种管式全自动 ELISA 分析仪 该系统以碱性磷酸酶标记抗原或抗体, 塑料吸嘴 (SPR) 为固相载体, 还配套使用了一种特别的试剂条, 其基本原理和步骤为 : 首先将待测标本加入多孔试剂条的样本孔中, 将多孔试剂条插 入仪器内, 然后将单克隆抗体包被的塑料吸嘴插入多孔试剂条的上方 仪器会自动将待测样本来回多次吸入塑料吸嘴, 以促进抗原抗体反应, 经温育后吸入缓冲液进行洗涤 然后仪器来回多次吸入碱性磷酸酶标记抗体, 使塑料吸嘴表面形成包被抗体待测抗原酶标抗体复合物, 经温育后洗涤 最后加入底物 4 甲基伞形酣磷酸盐, 产物经 370 nm 激光照射发出 450 nm 的荧光, 经荧光读数仪测定, 即可得到所测物质的含量 二. 小珠固相酶免疫测定仪器珠式固相的特点是均一性优于板孔 ; 可在容器内成批包被 ; 可在洗液中该动, 便于洗 酶免疫分析技术151 涤 ; 小珠表面经磨砂处理后吸附面积增大 美国 Abbott 公司最早采用.6cm 直径的小珠作为载体, 小珠放在相应大小的塑料孔盘中滚动冲洗, 属半自动类型 Roche 公司的 ωbasω 阻 H 自动分析仪则采用粒径较小的小珠, 为全自动分析系统 四. 微粒固相酶免疫测定仪器美国 Abbott 公司应用聚苯乙烯微粒 ( 直径.47μm) 作为固相载体, 设计生产出岛位自动分析系统, 较小珠型更为先进 岛位自动分析系统主要采用微粒子捕捉酶免疫分析技术 ( 岛伍 IA), 该技术基本原理为 : 在己包被了抗体的微粒试剂中加入待测标本和碱性磷酸酶标 i 己的抗体, 经温育可形成抗体抗原酶标抗体复合物 然后将其转移到玻璃纤维柱上, 用缓冲液洗涤, 聚苯乙烯微粒可吸附在玻璃纤维膜上, 而没有结合的抗原 酶标抗体被洗掉 这时再加入底物 4 甲基伞型酣磷酸盐, 酶将其分解, 产物在 365 nm 激光照射下发出 448 nm 的荧光, 经荧光读数仪检测, 即可获得所测抗原的含量 岛位现己与该公司生产的用于药物测定的 1Dx 荧光偏振仪合并组成全自巨型的 Axsyr 丑系统 五. 磁微粒固相酶免疫测定仪器近年发展起来的磁性微粒子分离技术采用磁性微粒为固相载体 由于磁性微粒表面积大, 可用磁铁吸引进行分离, 是较为理想的载体, 现己广泛应用于各种固相免疫测定中

159 152 第一一篇美国贝克曼公司和法国巴斯德研究院合作设计生产的 Access 全自动微粒子酶放大 化学发光免疫分析系统即采用上述磁性微粒子分离技术, 其基本原理为 : 将包被了单克隆 抗体的磁性微粒中加入待测标本和碱性磷酸酶标 i 己的抗体, 经温育可形成固相包被抗体 抗原 酶标抗体复合物 在电磁场中进行 3~5 次洗涤, 这时未结合的抗原和酶标抗体 即被洗去 最后加入底物 A 岛 1PPD 发光剂, 经碱性磷酸酶分解发光, 通过光量子阅读系统记录发光强度, 可从标准曲线上计算出待测抗原的含量 另外, 德国拜耳 (Bayer) 生产的 ACS:180SE 和 ACS: CENrAUR 全自动分析仪与上述贝克曼公司产品测定原理基本相同 第四币 酶免疫分析的应用 酶免疫分析技术具有高度的敏感性和特异性, 几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测 均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测 ELISA 则应用更为广泛, 可用以检测的项目包括以下几个方面 :1 病原体及其抗体, 广泛应用于传染病的诊断 包括病毒, 如肝炎病毒 艾滋病毒 风彦病毒 痛彦病毒 轮状病毒等 ; 细菌如链球菌 结核分枝杆菌 幽 n 螺杆菌和布氏杆菌等 ; 寄生虫如弓形体 阿米巴 症原虫等 2 蛋白质包括 免疫学技术各种免疫球蛋白 补体组分 肿瘤标志物 ( 例如甲胎蛋白 癌胚抗原 前列腺特异性抗原等 ) 各种血浆蛋白质 同工酶( 如肌酸激酶阻 ) 激素( 如 He 口 FSH,1SH) 3 非肤类激素如 T3, T4, 雌激素 皮质醇等 4 药物和毒品, 如地高辛 苯巴比妥 庆大霉素 吗啡等 酶免疫分析的最小可测值达鸣甚至 pg 水平 与放射免疫分析相比, 酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定, 且无放射性危害 因此, 酶免疫分析在医学和生物学领域中获得越来越广泛的应用, 酶免疫测定的新方法 新技术不断涌现 然而, 酶免疫测定在医学检验中的普及应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世 随着医学分子生物学的发展, EIA 检测试剂发展非常迅速 在抗原制备方面, 抗原纯度越来越高, 针对性也越来越强 以 HN 检测试剂为例, 在短短的二十几年中, HN 检测试剂己经历了四代 第一代试剂采用间接酶联反应, 抗原主要为组织培养全病毒或部分提纯病毒 第二代试剂原理与第一代相似, 主要特点是改用基因工程表达后经过提纯的抗原或合成肤作为抗原 第一代与第二代试剂敏感性相近, 但特异性第二代要优于第一代 第三代试剂使用双抗原夹心法原理, 抗原选择和提纯工艺也更精细, 因而试剂的敏感性和特异性较前两代均有明显提高 目前正在出现的第四代 EIA 试剂己超出完整抗体的传统酶联方法, 可同时测出抗体和抗原, 其最大优点是可缩短 HN 感染后出现的无抗体窗口期而增加用血安全 在 Hα7 的检测中, 由于 Hα7 难以培养, 基因工程抗原成为其抗原的主要来源, 己生日 Hα7 基因组由 7 个功能区组成 : 核心 E1 E2N 挝 NS2 NS3 NS 斗和 NS5 区 最近, 美国 Chim 口公司 Chien 等研制了一种包括 Hα7 基因组 7 个功能区所有免疫决定基因的单一融合蛋白, 称为多表位融合抗原 6 (mutiple - epitope fusion antigen, ~ 伍 FA-6) 使用该融合蛋白建立的免疫测定方法, 其测定敏感性较使用由 NS3 - NS4 核心 (α5) 区组成的融合蛋白所建立的测定方法要高 2~4 倍 基因工程抗原对建立高灵敏高特异的免疫测定方法具有不可替代的作用, 己成为难以培养的病原体抗原的主要来源, 亦解决了病原体裂解提取抗原纯度差的问题 基因工程抗原的发展趋势主要为由单一病原

160 体强免疫应答的决定簇, 同时所表达的重组抗原将不含或尽可能少含非特异性抗原或共同抗原, 使试剂具有更高的灵敏性和特异性 在抗体制备方面, 单克隆抗体将完全或部分取代多克隆抗血洁, 因为单克隆抗体具有特异性强, 只与抗原分子上某一抗原决定簇结合 ; 质地均一, 重复性好 ; 可用少量不纯抗原 全细胞或组织粗提物作为免疫原 ; 以及可大批量生产等优点 另外, 部分 EIA 将用 Fab' 或 F(ab' )2 片段取代整个 Ig G, 因为片段可除外 Fe 的干扰, 进一步提高测定的特异性 在今后的 EIA 中, 利用基因工程或杂交瘤 (hybrid hybridoma) 技术制备的双特异性或杂交抗体可能会在一定范围内得到推广使用, 所谓双特异性或杂交抗体即 I 剧的一条轻链和重链对 Agl( 如促黄体素等 ) 特异 另一条轻链和重链对 Ag2( 如 I 虫 P) 特异, 这样就不必预先制备 I 虫 P 标记抗体, 在测定时直接加入 I 虫 P 即可, 使试验步骤得到进一步简化 此外, 抗独特型抗体在 EIA 中的应用, 可简化半抗原的测定步骤并提高某些 EIA 的特异性, 为 EIA 提供了一种新的模式 除了基因工程抗原抗体外, 与标记免疫测定有关的另一种重要的基因工程试剂就是酶及其融合蛋白 以重组酶建立免疫测定方法较为成功的是 CEDIA1M 均相酶免疫试验 该测定方法的建立, 对于均相酶免疫测定是一个突破, 其最大的特点是具有较高的测定敏感性和线性化的剂量反应曲线, 这是一般竞争均相酶免疫测定方法所没有的, 现己有商品试剂盒供应 使用基因工程技术生产免疫测定标记用酶是得到符合标记要求的高纯度酶的一条新途径, 且如直接以其他蛋白 ( 抗体或抗原 ) 融合的方式表达, 不但避免了繁琐且低效率的酶与酶或蛋白的化学交联, 而且无需得到纯化的酶和抗体或抗原 随着分子生物学技术的发展, 将有越来越多的酶免疫测定方法建立在基因工程酶和其融合蛋白的基础之上 近年来, 应用多种放大系统的全自动化超微量 EIA 测定分析仪在临床实验中应用越来越多, 不但减轻了实验室人员的劳动强度, 而且大大提高了测定的准确性和重复性 与此同时, 一些不需加任何试剂 一步完成 可在数分钟内完成反应和用目测法进行定性和半定量的 ELISA 如斑点免疫测试法也得到进一步发展 后者可推动某些疾病 ( 如自身免疫病 传染病和绒毛膜上皮癌等 ) 的大规模筛查和促进 ELISA 进入家庭 ( 如排卵和娃振及绒毛膜上皮癌化疗效果等的自我监测 ) 153 第十一章酶免疫分析技术体蛋白向多决定簇融合蛋白转变并尽可能地包括病原体基因组功能区所有的能引起机 参号文献 1 Schiff, E R; de Medina,M;Kahn, R S.New perspectives in the diagn 口 sis of hepatitis C.Se min Liver Dis.1999, 19 Suppl13~15 2 Plest 时, J S; Coull, P A;Gidney, MA.ELISA.Methods 岛 101 Med. 2003; 71: 243 ~ DeSimone, J A;P lerantz, R J.New methods for the detection of HIV Clin Lab Med Sep; 22(3): 573 ~ Steimer, - W. Performance and specificity of monoclonal immunoassays for cyclosp 口.rine monitoring: how specific is specific? Clin Chem.1999 Mar;45(3): 371 ~381 5 Khatkhatay, M I;Desai, M.A cαn 归 rison of performances of fo 旧 enz 咒口 es used in ELISA w 地 special reference to beta - lactamase.j Immunoassay.1999 ;20(3): 151 ~ Hamwi, A; Veitl, M; Manner, G. Evaluation of four au t<αnated methods for deter mination of whole blood cyclosporine

161 154 第一一篇免疫学技术concentrations. Am J Clin Pathol.1999; 112(3): 358~365 7 Vaira, D; Holton, J; Menegatti, M.New immunological assays for the diagn 口 sis of Helicobacter pylori infection. Gut Jul; 45 Suppl 1123 ~ Tuu minen, T;Palαnaki, P;Paavonen, J.τbe use of serologic tests for the diagnosis of chlamydial infections. J MicrobioI Methods.2000 Nov;42(3): 265~279 9 Aoyagi K, et al. Enzyme immunoassay of immunoreactive progastrin - releasing peptide( 31 ~ 98) as tumor of small cell lung carcinoma: develo 阳 lent and evaluation. Clin Chern, 1995, 41: 537 ~ 陶义训 II 免疫学和免疫学检验第 2 版北京 : 人民卫生出版社, 金奇. 医学分子病毒学. 第 1 版. 北京. 科学出版社, 吴从愿. 抗体与内分泌. 中华内科杂志, 1995, 32 (1 0): 704~ 沈霞. 临床免疫学与免疫学检验新技术. 第 1 版, 北京 : 人民军医出版社, 2002

162 第十二章 免疫荧光标记技术 所菊述旺M4Aql 忏口免疫荧光标记技术 (immunofluorescence techni 年 Ie) 可应用于生物学的各个领域, 在微生物学领域主要应用于病毒 细菌 立克次氏体 原生动物及真菌以及抗各种微生物抗体的检测 (Fraser1976, Jentzsch1967, 鸟鱼贯等 1977, McEntegart1976, Wagner1967) 该技术在医学和生物学中的应用己有近 60 年的历史, 随着荧光物质的发现及标记方法的不断改进和发展, 逐渐成为微生物学 免疫学 病理学及免疫理化中常用的一种免疫学技术 该技术始创于 20 世纪 40 年代初, 由 ous 等 (1 941) 首次用异氨酸荧光物质标记抗体, 检查小鼠组织切片中的可洛性肺炎球菌多糖抗原 因该方法称为稳定性装填 ( 同义词 : 相联 结合 连接 标记, 英语为 La belir 毯, 亦即 " 标记 " ), 是用具有高度检验敏感性的荧光染料相联, 因此 通常称为免疫荧光 ( IF) 或荧光抗体技术 最初因荧光标记物的性能较差, 未能推广应用, 直至 20 世纪 50 年代末期, Riggs 等 (1 958) 合成性能较为优良的异硫氨酸荧光黄 (Fluoresce 1 日 isothiocyanate, FITC), 并由比 rshall 等 (1 958) 对荧光抗体的标记方法进行了改进, 从而使这一技术逐渐推广应用 20 世纪 70 年代以来, 在传统荧光标记技术的基础上, 根据放射免疫和酶免疫测定的原理, 以各种荧光素为标记物发展建立了各种免疫荧光测定法 Urn rnunofluorescence assay, IFA), 可用于体液中抗原或抗体的定量测定, 使这一方法实现了仪器自动化, 使其应用前景更广 同时荧光标记技术近年来在免疫学领域, 尤其是各种自身抗体的检测, 以及在流式细胞仪上的应用, 使之在临床检验工作中的作用更加突出 一. 免疫荧光标记技术的基本原理免疫荧光检测法是以荧光物质作为标记物, 与己知的抗体 ( 或抗原 ) 结合, 但不影响其免疫学特性, 应用荧光显微镜直接观察, 根据呈现特异性荧光的抗原抗体复合物存在与否 155 第十一一章免疫荧光标记技术及存在部位来检测或鉴定抗原或抗体存在与否 ( 定性检测 ), 或运用流式细胞仪自动化电子成像计算机, 根据发出的荧光强度的强弱, 经与标准品对照对待测物质进行定量测定 二. 荧光与荧光染料荧光是指由荧光物质的一个分子或原子, 受到照射并吸收了给予的能量后, 即刻引起自身发射的一种波长较长且不具有明显惯性的光线 ; 停止能量供给, 发光亦瞬即停止 根据来源不同, 分为原发荧光与激发荧光 在未经处理的标本上观察到的荧光现象, 称为原发荧光 ( 自然荧光 固有荧光 ) 或白发荧光 如果荧光是用发生荧光的物质人工引起, 则称为激发荧光 Haitinger 称这类物质为荧光染料 荧光素或荧光染料是一种具有共辄双键化学结构的有机化合物, 当接受紫外光等照射后能吸收光自旨, 由低能量级的基态向高能量级跃迁, 形成激发态 ; 当从激发态恢复至基态时, 释放光子产生荧光, 并能作为染料使用 在这个过程中丢失了一部分能量, 因而释放的光子比激发光的波长更长 前后两者波长之差是荧光物质的特征, 称为 " stokes" 改变 各种荧光物质所发射的荧光半衰期有所不

163 156 第一一篇同, 这与物理环境有关, 利用这一特征, 出现了 " 立即 " 和 " 延迟 " 两大类荧光测定仪 此外, 荧光向所有方向发散, 因而可在样品的任意方向置放检测器, 而不在激发光的直线上 适用对抗体进行标 i 己的荧光素所必须具备的条件 :1 能简单 迅速而稳定地与抗体蛋白结合 ;2 即使较长时间保存也不会改变抗体的特性 ( 即具有恒定的亲和性与亲合力 ) ;3 有强的荧光效应, 即使标记后也不出现非特异性染色 ;4 容易与其他荧光染料及白发荧光相区别 ( 如双重标记时 ) ;5 尽可能少褪色 ;6 容易制备, 耐久, 有良好的水洛性, 纯净, 可用标准试剂检验, 价廉 目前常用的荧光素有异硫氨酸荧光黄 (FI1C) 四乙基罗丹明( tetraethlroda mine B200, RB200 ) 及四甲基异硫氨酸罗丹明 (tetramethy1 rhoda mine isothiocyanate, 1RI1C) 实际上应用最广的只有 FI1C 一种, 罗丹明常作为衬比染色或双标记 (~) 异硫氨酸荧光黄 (fluorescein isothiocyanate, FI1C) 为黄 橙黄或褐黄色结晶粉末, 分子量为 389. 斗, 有两种异物体, 其中异物体 I 的荧光效应较高, 与蛋白质结合更稳定, 易溶于水和乙醇等洛剂, 性质稳定, 低温干燥条件下可保存多年, 最大的吸收光谱为 490~495 m 丑, 最大发射光谱为 520 ~ 530 nrn, 产生发亮的黄绿色荧光 ( 苹果绿色 ) 在碱性条件下, FI1C 的异硫氨基 ( -N 二 C 二 S) 活性基因与抗体蛋白的自由氨基 ( 主要是赖氨酸 :E: 氨基 ) 经碳酸氧化而形成稳定的硫碳氨酸基键 1 个 19 分子中有 86 个赖氨酸残基, 但最多可标记 15~20 个荧光素分子 免疫学技术( 二 ) 四乙基罗丹明 (tetraethlroda mine B200, RB200 ) RB200 为褐红色粉末, 不洛于水, 易洛于乙醇和内酣 分子量为 580, 最大吸收光谱为 570 ~ 575 nrn, 激发产生的荧光波长为 595 ~ 600 nrn, 呈橙红色荧光, 本品性质稳定, 可长期保存 RB200 为愤酸纳盐, 其愤酸基不能直接与蛋白质结合, 需先将陆,200 与过氯化磷 ( 配 L,) 作用, 变为硫酷氯 (-:D2 cl) 后, 储存在碱性条件下 (ph 二 8.5), 易与蛋白质的赖氨酸 E 氨基反应形成稳定的硫氨键, 并基本保持 RB200 的结构不变, 对抗体蛋白也无明显的变性作用 但由于荧光效率较低, 一般不单独使用, 多用于 FI1C 的衬比染色或双标记 化学反应式如下 ( 三 ) 四甲基异硫氨酸罗丹明 (tetramethylrhoda mine isothiocyanate, 1RI1C) 其为 RB200 的衍生物, 紫红色粉末, 性质稳定, 可长期保存, 分子量为 376. 斗, 最大吸收光谱为 550 nrn, 激发产生的荧光波长为 620 nrn, 呈橙红色荧光, 与 FI1C 的黄绿色荧光对比清晰 1RI1C 的激发峰与荧光距离较大, 有利于选择滤光系统, 通过分子中的异硫氨基 ( -N 二 C 二 S) 易 与蛋白质的氨基结合, 较阳,200 使用方便, 近年来常用于免疫荧光双标记技术 1RI1C 与蛋白质结合的方式与 FIπ 相同 ( 四 ) 其他荧光素作为 FI1C 的其他代用品, 有二氯三嗦烯基肢荧光素 ( dichlorotrianyla mino - fluoreszein, DfAF) 及新近生产的碳花青前 ( carbocyanin, CY 刀, 具有光稳定性 较新的荧光染料首选的是用睐碳花青前 ( cya 口 1 日, CY5) 以及其他 (Em 町等 1989, Mujurndar 等 1989, 也 uthnwick 等 1990), 其中最好的是氨基 4 甲基香豆素醋酸 (a mino methylco 旧 nannacetic acid, AMCA; Khalfan 等 1986) 还有藻红蛋白( phycoerythri 日, PE), 它是从红藻 (red algate) 中提取的一种藻胆蛋白 (phyco - biliprotein), 是天然荧光素, 最大吸收光谱为 490~565 m 丑, 激发产生的红色荧光波长为 595 nrn o CY3 最大吸收光谱为 550 nrn, 激发产生的红色荧光波长为 570 nrn, AMCA 最大吸收光谱为 354 ill 丑, 激发产生的蓝色荧光波长为 430 nrn, AMC 为黄色结晶固体 PE 和 FI1C 同时用于对各种抗体或配体进行双标记, 在流式细胞仪 (FIα11) 中较常用, 发蓝色荧光的 AMCA 的优点是可以参与混合染色, 特别是作三重标记

164 157 第记技术荧光抗体 时 对于共聚焦激光显微镜而言, 目前应用 CY2 CY3 CY5 作三重标记最合适 某些化合物本身无荧光效应, 一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质 例如 4 甲基伞酣 ~-D 半乳糖昔受日半乳糖昔酶的作用分解成 4 甲基伞酬, 后者可发出荧光, 激发光波长为 360 ill 丑, 发射光波长为 450 nm 其他如碱性酸酶的底物 4 甲基伞酣磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对丑基苯乙酸等 榈系整合物, 如某些 3 价稀土榈系元素铺 (Eu3+ ) 时(Th3+ ) 前 (Ce3+ ) 等的整合物经激发后也可发射特征性荧光, 其中以 Eu3+ 应用最广 Eu 3 + 整合物的激发光波长范围宽, 发射光波长范围窄, 荧光衰变时间长, 最适合用于分辨荧光免疫测定 第二币 抗体抗血洁的质量对于免疫荧光检查能否成功具有决定性意义 (knapp 与 Ludwig 1976) 用于制备荧光素结合物的抗体要求特异性强, 纯度高, 效价满意 制备抗体有很多方法 现在己有越来越多的高质量抗血清商品供应, 但有时还必须自行制备特异性抗血洁, 方法可参阅旭日 brosi us (1986 ) Huet( 1994) Celis (1994 ) 等的报告 一般是从特异性抗血请或抗人 ( 及其他动物 )lg 的免疫血清中提纯的 ( 亦可用葡萄球菌 A 蛋白代替 ), 或其相应的单克隆抗体 (McAb) 用于标记荧光素 一. 抗血清的制备 (~) 抗血清根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体 单克隆抗体和基因工程抗体 HUmans 等介绍了一种获取抗人 19G 的简单方法 具体步骤如下 : 将 50 mg 葡聚糖凝胶 (sephadex) 和 2mgI 届置于 2 ml PBS 中, 在冰浴的条件下, 不断搅拌并点滴加入 2ml 完全弗氏佐剂, 形成稳定的乳剂 将此? 昆悬液约 0.2 r 世皮内注射于每只家兔的足趾间, 另取 2 1 址皮内注射于剃毛的家兔背部皮肤, 其余的注射于家兔大腿肌肉内 此后每隔 10 天, 用半剂量对家兔作重复注射 20 天后, 如特别重视抗体和 L 链, 则需补作静脉内注射 方法是在 2.5 r 世 PBS 中加入 lo mg 酌, 再加入 15 r 世 1 mol L 的碳酸氢盐洛液, 点滴加入 10% 硫酸铝饵洛液 2.5 r 址, 制成的混悬液置冰箱过夜, 离心 (l 500g) 沉淀 30 min, 将沉淀物置于 4 ml PBS 中重新混悬 第一周 0.05 ml 及 0.1 时, 第二周 0.1 ml 和 0.2 时, 第三周 0.2 ml 和 0.4 ml 分别作静脉注射 最 jg 在末次注射 1~2 周后进行第一次来血样, 运用双向扩散法进行抗体的效价鉴定, 血清于 20'C 保存 此法获得的抗体为多克隆抗体 若想制备单克隆抗体可参阅有关章节 近年来, 随着 DNA 重组和蛋白质技术的发展, 基因工程抗体己构建成功 ( 二 )Hebert 等 1972 年介绍了用硫酸锻沉淀法获取丙种球蛋白的方法 具体做法为 : 在 lo r 址家兔血清中不断搅拌滴入 lo r 世 70% 的饱和硫酸锻溶液 取 55g 纯 (NI-L )2 S04 溶 十一一章免疫荧光标入茶馆水中制成饱和洛液, 室温放置一段时间, 每天进行多次搅拌, 3~4 天后倾出上清液 i 周至 ph 为 5.8 备用, 此即为硫酸锻原液 ], 室温静置至少 4 h, 4'C 下离心 (l 400 g)30 min o 经反复多次洗涤沉淀后, 即可制备出免疫球蛋白液 二. 荧光标记抗体的制备 (~ )FI1C 标记法关于与 FI1C 的相联有不同的规定 (Wagner 1967), 一般要求在相联时 ph 值为 9~9.5, 蛋白含量应为 1O ~40 mg ml( 每毫升含蛋白 1O ~40 mg; 即 1 % ~4%)

165 158 第一一篇FI1C 的量则取决于所期望的荧光染料与蛋白之比, 此时必须注意到染料的纯度及预期相 免疫学技术联程度并无直接联系 其中, 反应时间与温度有关, 在 25'C 时, 30~60 mi 口己足够 (" 快标记 " ) ; 在 4'C 时, 为 12 h(" 慢标记 " ) 方法分为直接标记法(Marshal 法, Chadwick 法 ) 和半透膜渗透标记法 ( Clark 法 ) 1. 岛 1arshall 法 1 取提纯的 IgG 适量, 用生理盐水和 0.5 M ph9.5 碳酸缓冲液 (9: 1) 稀释为 1O~20 r 鸣 1 址, 将容器放冰浴内 ;2 用少许 0.5 MpH9.5 的碳酸缓冲液洛解 FI1C, 按每 1 鸣抗体蛋白内加入 0.01 ~0.02 r 鸣 FI1C( 即二者比例为 1 :50 ~ 1 : 100 ) 的比例缓慢地加入蛋白液内, 边加边搅拌混匀, 避免产生气泡, 约在 5~ lo mi 口内加完 ;3 将容器及电磁搅拌器移入 4~6'C 冰箱内, 继续缓慢搅拌结合 12~18h( 若在 20~25'C 室温下, 搅拌结合 2 ~4h 亦可 ) ;4 去除游离荧光素, 将结合物 rpm, 20 mi 且离心除去沉淀物, 取上清置于透析袋内, 4'C 条件下用.01 M ph7.2 的 PBS 透析 3~5 天 (PBS i 夜量为结合物的 100 倍, 其间需多次更换透析液 ), 也可将结合物用 Sephadex G50 或 Sephadex G25 凝胶柱层析, 收集第 1 洗脱峰, 合并即为荧光抗体 2. Chadwick 法 1 用于员冷至 0~4'C 的 0.01 M ph8.0 的 PBS 将抗体蛋白稀释为 30~ 40 rug ml, 置于三角烧瓶内放入冰浴 ;2 用 3% 重碳酸纳水洛液洛解 FI1C, 按每 rug 抗体蛋白内加入 0.01 r 鸣 Ff 茸的比例加入蛋白液内 ;3 蛋白液与荧光素洛液按等量混合, 瓶口加塞密闭, 于 0~4'C 冰箱内电磁缓慢搅拌结合 18~24 h; 4 如同 Marshall 法去除结合物中游离的荧光素 3. 半透膜渗透标记法 ( clark) 1 用.025 M ph9.6 碳酸盐缓冲液将 FI1C 配成 0.1 rugml 浓度的洛液 ;2 用相同缓冲液将抗体蛋白稀释为 10 rug r 址, 装入透析袋后将袋口扎紧, 仅留少量空隙 ;3 将透析袋浸没于装有 FI1C 洛液的烧杯内 (FI1C 洛液量与抗体蛋白液量之比为 10: 1), 置于 4~6'C 冰箱, 在电磁缓慢搅拌下平衡结合 18~24 h 后取出 ;4 吸出透析袋内结合物, 用 Sephadex G50 凝胶柱层析获得标记抗体 ; 也可将透析袋另置入 0.01 MpH7. 斗的 PBS 洛液中, 以便终止荧光素标记反应, 4'C 条件下每日换液 3~4 次, 直至透析外液在紫外线照射下无荧光为止, 即可过滤保存备用 4. FI1C 标记 SPA 法 1 用.5 M ph9.0 碳酸盐缓冲液将纯化的 SPA 配成终浓度为 lo rugml 的洛液 ;2 用少量碳酸盐缓冲液洛解 FI1C, 再逐滴加入 SPA 液内, 二者比例为 4: 1, 室温下继续搅拌结合 3~6 h; 3 将结合物通过 Sephadex G25 或 G50 凝胶柱层析, 收集第一洗脱峰合并即得到标 i 己的 SPA o ( 二 )1RI1C 标记法关于用 1RI1C 标 i 己也有明显不同的报道, 这首先是由于所用材料的纯度不同 (Amante 等 1972 ;Mckinney 与 Spillanel 1975) 用 1RI1C 标 i 己的原理和方法与 FI1C 基本相同, 即在碱性条件下 ( ph8. 2 ~ 9.3), 通过 1RI1C 的异硫氨基与抗体蛋白的氨基结合, 结合比例为 1 rug 1RI1C 100 rug 蛋白的比例 ( 三 )RB200 标记法 1 取 0.5 g RB200 和 0.1 g Pels 置于乳钵中, 研磨约 5mi 口, 加入 无水丙酣 5 时, 搅拌混合, 使洛解成为紫褐色洛液 ;2 用滤纸过滤 ( 或离心沉淀 ) 的方法用来除去不洛性杂质, 澄清的滤液即是瞒自先氯化的阳,200; 3 取待标 i 己的蛋白 (l 0~20 r 鸣叫 ), 与 0.5 M ph9.5 的 CB 按 1:2 的体积比例混合, 加入瞒自先化的 RB200(0.1 r 址 50~60 rug 蛋白 ), 在电磁搅拌下逐滴加入 RB200, i 商加完毕后, 继续搅拌 30 min, 同时注意检测闹, 加入臼调节使结合物的 ph 值不低于 8.5; 4 加入标记蛋白 12 量的活性炭于标记溶

166 液中继续搅拌且, 4000 rpm 离心 30 min, 取上清液装入透析袋, 用.01 M, ph7.4pbs, 4'C 透析化 ;5 用 Sephadex G50 凝胶柱层析或用 40% 饱和度的硫酸锻沉淀 PBS 中, 再凝胶过 滤或透析脱盐, 最终得到标记好的 RB200 标记抗体 ( 四 ) 藻红蛋白 (PE) 标记技术 1. PE- IgG 标记法 1 疏基化 PE 的制备 取 600μl 氯化硫醇亚服 (1 5.5 mg ml), 加 至 1. 2 ml PE 内 (3.6mgml, 洛于 125 r 出 1 ph6.8 的 PBS 中 ), 室温 90 min; 用 5 r 由 f ph6. 8PBS, 4'C 透析过夜, 换用 ph7.5 的 PBS 透析平衡 6 h, 每个 PE 分子中可结合 8 个硫 基 ;2 PE- IgG 结合物的制备 取 30μl 异型双功能交联 SPDP( 1. 1 mg ml 乙醇洛液 ) 加至 700 vl IgG 内 (4.2 r 鸣 1 址, 洛 PBS 于 50 rrmph7. 5PBS 中 ), 室温反应 2.5 h; 加入 100μI 50 rrm 腆乙酸铀封闭残余疏基 4'C 透析过夜 2. PE-SPA 标记法 1 在 0.5 ml PEe 4.08 mg ml, 洛于 0.1 M ph7.4pbs, 含 0.1 mol Nacl) 内加入 10μI SPDP(2.65 mg ml, 洛于无水甲醇 ), 室温 22'C 反应 5 min o 通过 Sephadex G50 凝胶柱用上述 PBS 平衡及洗脱, 收集团蛋白峰 ;2 在 0.5 r 世 SPA(2 mg ml, 洛于同上 述 PBS) 内加入 2.6 vi SPDP 甲醇洛液, 室温反应 40 mi 口 ; 加入 25 Vl1M 硫苏糖醇 (DIT, 洛于 同上述 PBS), 室温反应 25 min o 通过凝胶柱层析, 收集 SPA 洗脱峰 ;3 活化 PE, 疏基化 SPA 的克分子比为 1 :2, 取 O.77mgmlPE 和 0.27 mg ml SPA 混合, 室温反应 6 h o 结合物 置 4'C 保存 以上两种 PE 标记制剂用 10 rrm ph7.4pbs( 内含 0.1 M EDfA 1M 硫乙酷胶 l%bsa 及 0.1 %NAN3 ) 配制, 0~5'C 保存备用 ( 五 )AMC 标记法 1 称取 7 氨基 4 甲基香豆素 (AMC)260μg 洛解于 25 vi 二甲 亚帆 ;2 用.5 MpH8.5 的巴比妥缓冲液将 Igβ 稀释为 50~100 mg ml; 3 将 AMC 洛液加入 IgG 液内, 室温下反应 2 h; 4 通过 Sephadex G50 凝胶柱层析, 收集第一峰洗脱液, 即得到标 记抗体 二. 抗血清及精联物的纯化及质量鉴定 抗体及相联物的纯度与质量好坏是决定荧光标记技术成功与否的关键 因此必须对 抗血清与相联物的纯度及质量进行鉴定 同时为了使不同实验室室问及室内工作的重复 第十一一章免疫荧光标记技术159 性具有可比性, 必须用相同特异性和性能的相联物 为了标准化, 必须有相应的国际标准或至少是参照血洁, 还要遵守统一的相似性测定方法 (~) 抗血清及相联物的纯化纯化的目的在于清除未结合的游离荧光素, 结合荧光素过多的抗体, 以及非特异性交叉反应的标记抗体 1. 去除游离的荧光素 (1) 透析法将荧光素标 i 己的抗体装入透析袋中, 先用流水透析 10 min, 再用.01 M ph7.1 的 PBS 或 N.S 透析 1 周左右, 其间每天换液 3 次, 直至外透液在紫外灯下不发射荧光为止 (2)Sephadex G25 或 G50 滤过法原理为用横向交联的右旋糖团干 ( 葡聚糖, 生物凝胶 ) 进行分离, 后者在水中膨化后可起分子筛的作用, 因其能构成不洛性的 具有一定大小微孔的凝肢, 小分子 ( 如游离的 FIE) 可进入这些微孔, 而较大的分子 ( 如与蛋白结合的 FIE) 则不能进入而被洗脱下来, 收集到的洗脱液即是己标记好的蛋白 2. 去除过度标 i 己的蛋白抗体蛋白质每结合 1 分子荧光素, 就可增加 2 个单位的负

167 电荷 因此, 结合荧光素越多, 标记蛋白质的负电荷越强 采用离子交换层析法, 可分离各种离子化高分子物质 其原理在于各种蛋白质的等电点不同, 在不同的 ph 值和离子强度的陪液中, 能够可逆地吸附和解离, 据此可将其分离 中间被洗脱下来的部分是荧光素标记适当的抗体部分, 常用的离子交换剂有 DEAE - CeUulose 和 DEAE - Sephadex A 去除非特异性交叉反应的标记抗体在用特异性抗原免疫功物时, 某些非特异的微量抗原被带入动物体内, 诱导产生了相应的抗体, 这些抗体也会引起交叉荧光反应, 需清除 常用的清除方法有 :1 组织制剂吸收法 常用的组织制剂是干粉, 用干粉与标记过的抗体混合, 吸收掉与同种脏器组织成份有交叉或额外特异性反应的标记抗体 ;2 免疫吸 附法 该法对吸附剂有要求, 所用吸附剂不得同时将特异性抗体除去或减少, 也不可在操 作过程中带入具干扰性的试剂 抗原或免疫复合物 此法主要用来除去可洛性共同抗原所引起的交叉反应 免疫吸附剂比较理想的是不洛性基质, 通过一定的化学反应与可洛性抗原或抗体连接, 形成稳定的不洛性复合物, 利用此复合物特异地吸附抗原或抗体, 然后, 再通过一定条件的洛液, 使抗原抗体复合物解离, 从而洗脱出纯的抗原或抗体 常用 160 第一一篇免疫学技术的免疫吸附剂是 DEAE 纤维素和琼脂糖 Huet 等 (1 994 ) 曾报道较简单的方法, 此外也可参阅 Nairn (1 976) Ambrosius (1986 ) 以及 Beesley (1 993 ) 等的方法 ( 二 ) 抗血清及相联物的质量鉴定 1. 抗血清含量及效价的鉴定抗体的效价一般用琼脂双向扩散法测定 抗体浓度越大, 标记抗体在应用时特异性就越高, 非特异荧光越少 理想的抗体效价为 1: 16~ 1: 荧光素标记抗体的效价测定通常采用检测抗核抗体的方法测定荧光素标记抗体的效价 直接法时, 将标记抗体作倍比稀释 ( 1 :40 ~ 1 :256), 分别用于 ANA 阳性标本及阴性标本染色, 出现清晰明亮的特异性荧光 ("+++") 的最高稀释度, 即为该抗体的染色滴度或单位 间接法时, 将抗核抗体阳性血清按 1: 10 1:40 1:160 1:640 稀释, 然后分别将此不同稀释度的 ANA 阳性血清加入涂有细胞的玻片上, 将此玻片置于湿盒中, 3TC 温育 30 min, 用 PBS 冲洗, 再将不同稀释度的荧光素标记抗体 (1 : 4 ~ 1 :256 ) 分别加入标本片, 温育 3TC 30 min, 用 PBS 冲洗, 用荧光显微镜观察, 凡能显示最清晰明亮的阳性细胞核, 而非特异性细胞核, 且非特异性荧光最弱的最高稀释度即为使用效价 3. 标记抗体的特异性鉴定 (1) 吸收试验在标记抗体内加入过量的相应抗原进行吸收后, 再用于阳性标本染色, 应不出现明显荧光 (2) 抑制试验阳性标本先加适当稀释的同种未标记抗体, 作用一定时间后洗去, 再加标记抗体染色, 应受到明显抑制 0 4. 标记抗体的荧光素 (F) 与蛋白质 (P) 结合比率 (F P 值 ) 的测定 F( 荧光素 ) 和 P( 抗体蛋白 ) 的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量, 一般要求 FP 的克分子比值为 1 ~2 过高时, 非特异性染色增强 ; 过低时, 荧光恨弱, 降低敏感性 一般采用紫外分光光度计测定和换算的简便方法 如 FI1C 标记抗体时, 将 FI1C 标记抗体适当稀释, 使其 280 nmod 值接近 1. 0, 先在入二 495 nm 测定 FI1C (F) 的 OD 值, 再于入二 280 nm 读取蛋白质 (P) 的 OD 值 然后按下式计算 FP 比值 :

168 161 第( 阻,200)F P 学 15 记技术(FI1C)F P 二 2.78 X ~95 A2 凶.35 X ~95 "'280 FP 值越高, 说明抗体分子上结合的荧光素越多, 反之则越少 检查组织细胞抗原成份时, 以 FP 二 1~2 为合适 ; 检查细菌涂片时, 以 FP 二 2~3 为合适 如用 1RI1C 标记抗体, 计算公式则为 :FP 二 OD515 nin OD280 nin o 此比值在 2 川.1 之间均可用, { 且以数值较低者为佳 5. 标记抗体的保存荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭 鉴定合格的荧光抗体, 可加入 0.01 % 硫柳示或 0.1 %NAN 3 防腐, 小量分装 (0.5 ml 瓶 ), 0~4'C 条件下可保存 1 年左右, -20'C 可保存 2~3 年, 但使用时应避免反复冻融 ( 三 ) 免疫荧光技术检测的标本及处理 1. 荧光标记技术标本的处理荧光抗体技术应用范围十分广泛, 常用于测定细胞表面的抗原和受体, 各种病原微生物 组织内抗原的定性和定位, 以及各种自身抗体 因此可用此技术检查的标本种类很多, 包括各种细胞 细菌涂片 组织印片或切片 ( 常用冰冻切片法, 标本厚度不超过 10 em) 以及感染病毒的单层培养细胞及血清和全血 对于所有的血清标本, 采血离心分离时应保存于 20'C 条件下, 避免反复冻融, 以免且 (il 性受到破坏, 同时相联物, 阳性 阴性对照均应以恰当的检测剂量冻存 对于组织 细菌 细胞标本要求取材新鲜, 并立即处理或冷藏, 以保持其抗原性和细胞及组织的结构完整 除 i 舌细胞外, 标本片应在染色前以恰当方式固定, 对制作好的标本应尽快染色检查, 或置 20'C 以下低温保存 组织样本保存在液氮 ( - 196'C ) 内最为理想, 通常多数抗原在 20'C ~ 30'C 条件下只保存几周, 也可在 70'C ~ - 90'C 保存, 以免抗原性减弱, 非特异性染色增强, 影响检查效果 2. 荧光抗体染色于己固定的标本上滴加适当稀释的荧光抗体 置湿盒内, 在一定温度下温育一定时间, 一般可为 25~3TC30 mi 日, 不耐热抗原的检测则以 4'C 过夜为宜 用 PBS 充分洗涤, 干燥 3. 荧光显微镜检查经荧光抗体染色的标本, 需要在荧光显微镜下观察 最好在染色当天即作镜检, 以防荧光消退, 影响结果 荧光显微镜观察由短波长 ( 紫外 紫 蓝等 ) 激发的生物物质或经荧光剂 ( 荧光染料 ) 标记 ( 染色 ) 的物质所发生的荧光 荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行 首先要选择好光源或滤光片 滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件 在光源前面的一组激发滤光片, 其作用是提供合适的激发光 激发滤光片有两种, UV 为紫外光滤片, 只允许波长 275~400 nin 的紫外光通过, 最大透光度在 365 nin ;BG 为蓝紫外光滤片, 只允许波长 325~500 ill 丑的蓝外光通过, 最大透光度为 410 nin o 靠近目镜的一组发射滤光片 ( 又称吸收滤光片或抑制滤光片 ) 的作用是滤除激发光, 只允许荧光通过, 透光范围为 4 1O ~650 nin, 代号有 ( 橙 黄色 ) 和 GG( 淡绿黄色 ) 两种 观察 FI1C 标记物可选用激发滤光片 BG12, 配以吸收滤光片 剧或 GG9; 观察阻, 200 标记物时, 可选用 BG12 与 α:;5 配合 使用荧光显微镜的注意事项 :1 光源应安装稳压器, 以保持电压稳定 ;2 光源灯室注 十一一章免疫荧光标

169 162 第一一篇意不要碰撞 漏光, 如高压京灯等高压光源二次启动不成功或关灯后, 至少要半小时后再启动使用, 开启后至少要 15 mi 口才可关闭 ;3 长时间的激发光照射可使荧光衰减或消失, 因此应尽量缩短观察时间 ( 四 ) 荧光抗体染色方法免疫荧光抗体检测的原理有异源性 同源性 竞争性等 所用方法有直接法 间接法和补体法三种 1. 直接法这是荧光抗体技术最简单基本的方法 于待检标本片上直接滴加上荧光抗体, 经 3 7'C 孵育反应和洗涤后封片, 在荧光显微镜下观察 如在镜下见有荧光的抗原抗体复合物存在, 则表明标本中有相应的抗原存在, 即为阳性 它的优点是方法简便 特异 快速 ; 缺点是需制备每种抗原相应的特异性荧光抗体敏感性较间接法低 临床上细菌 病毒等的快速检查和淋巴细胞表面抗原与受体的检测常用此法 2. 间接法 ( 两步法 ) 荧光抗体为抗抗体 检测过程有二 : 第一, 将待测抗体加在含有己知抗原的标本片上, 孵育一定时间后, 洗涤去除未结合的抗体 ; 第二, ~ 商加上标记抗抗体, 孵育洗涤后封片用显微镜检查, 如发现有特异荧光的抗原抗体抗抗体复合物存在, 则表明标本有相应的抗体存在 它的优点是, 敏感性较直接法高, 只需制备一种荧光标 i 己的抗抗体, 即可检测同种动物的多种抗原抗体系统 ; 缺点是易产生非特异性荧光, 操作略繁琐 临床上常用于各种自身抗体的检测, 以及 EB 病毒 α 町 肺炎衣原体及军团 免疫学技术菌 腺病毒等的检测 了补体法此方法是一种改良的间接法, 是利用补体结合反应的原理, 来检测补体结合抗体 {E! 应注意所有的抗血清首先必须在 56'C 条件下灭活 30 mi 日, 所有的稀释液和清洗过程均应使用巴比妥缓冲液 (ph7.4) (Wick 等 1976 年 ), 荧光标 i 己的物质为抗补体抗体, 优点是只需制备一种荧光物质标 i 己的抗补体抗体, 即可检测各种能固定补体的抗原抗体系统, 不受抗体来源的动物种属限制, 敏感性也较高 ; 缺点是容易出现非特异荧光, 加之补体不稳定, 每次需采新鲜豚鼠血洁, 操作较复杂 0 4. 特殊方法在同一标本内检测两种以上抗原时, 需要用多标记法 如流式细胞仪的双标记 三标记法 主要用于细胞表面的抗原和受体的研究以及某些疾病的诊断 20 世纪 70 年代以来, 随着技术的进步, 根据放射免疫和酶免疫测定的原理, 在传统荧光抗体 技术的基础上, 又建立了各种免疫荧光测定法 (imnunofluorecence, IFA), 使免疫荧光分析 进入了一个标准化 定量化 自动化阶段, 用于体液中抗原或抗体的定量测定 主要的仪 器有时间分辨荧光测定仪 荧光偏振免疫分析仪 作用于荧光底物的酶免疫测定仪以及流 式细胞仪 所菊一一口免疫荧光测定仪器一近年来, 随着一系列新仪器和新方法的建立, 各种免疫荧光测定技术有很大改进和发展 目前, 用于医学检验的免疫荧光测定仪器主要可分为三类 :1 时间分辨免疫荧光测定仪 ;2 荧光偏振免疫分析仪 ;3 酶免疫荧光分析系统 一. 时间分辨荧光免疫测定仪年代初期发展建立的一种新型免疫分析技术 其基本原理和方法与传统的免疫荧光法不忏时间分辨荧光免疫测定 (time - resolved fluorescene imnunoassay,1rfla) 是 20 世纪 80

170 同, 所用示踪剂不是荧光素, 而是采用榈系稀土元素铺 (Eu3 + ) 轻( 趾 12+) 时(Th3 + ) 等标记抗体或抗原, 并利用时间分辨荧光计测量法排除样本中非特异荧光的干扰, 最大限度地提高了测定方法的特异性和灵敏度 1RFIA 法在灵敏度 特异性 稳定性等方面都可与放射免疫测定 (RIA) 相媲美, 而其标准曲线范围 ( 跨越 4~5 个数量级 ) 最小检出值( 可达 1O ~18 mol L) 和分析速度等则远远超过 RIA 和 EIA, 并具有结合物制备较简便 有效使用期长 无放射性污染 应用范围宽等优点 (~) 基本原理采用榈系稀土元素铺 (Eu3+ ) 轻 (Sm 2 + ) 时(Th3+ ) 等具有双功能基团的整合剂, 与抗体 ( 或抗原 ) 分子以共辄双键结合形成标记物, 而此类整合物在紫外光 (340 m 丑 ) 激发下, 不仅能发射出高强度的荧光 (613 nm), 且衰变时间也较长 (1 0~ 1 000μs) 延缓测量时间, 待所测样品中蛋白质等自然发生的短寿命荧光 (1 ~ 10 ns) 全部衰变后, 再测量稀土元素整合物的特异荧光, 这样可以完全排除非特异本底荧光的干扰 此外, EJ+ 或 Sm 2 + 的散发光与发射光之间有很大的 stokes( 约 270 nm) 位移, 激发光的光谱较宽, 有利于增高激发自旨, 增强榈系标记物的比活性, 因发射荧光的语带恨窄, 又有助于降低本底, 从而提高分析的特异性和灵敏度 但是稀土元素离子不能与蛋白质直接连接, 而需要利用具有双功能基团的萤合剂与抗体或抗原分子的氨基连接 常用的整合剂有 : 1. 多竣基酸类整合剂异硫氨酸苯基, E 囚叉, 异硫氨酸苯基 DITA 和二乙烯三肢五乙酸 (DPfA) 及其环团干 (CD 町 A) 等 2. ~ 二酣体类整合剂 2 荼盼三氟丙酣 (2- NrA) 是 DELFIA 免疫检测系统荧光增强液的主要成分 3. 其他 W1174 及 ( 斗, 7) 双 ( 氯化苯盼石黄酸盐 )1, 10 菲洛林 ( 简称 BCPDA) 是加拿大 CyberFluor 分析系统的主要整合剂 ( 二 ) 标记方法标记方法有一步法和二步法 标记抗原与抗体的方法相同, 小分子半抗原则需先与大分子载体蛋白, 如 BSA 多聚赖氨酸等连接, 再标记 Eu 一步标记法取纯化抗体配成含 IgGlmgr 世的洛液 加入 Eu DITA 整合物 250~350 阅 用.25 mol L NaOH 调至 ph9.5, 置斗 C 反应过夜 通过 Sephaeryl S 凝胶柱 (1. 0 em X 42 em) 层析分离, 用 50 mrnol L ph 7.75 Tris - HCl 缓冲液 ( 含 0.9%NaCl 及 0.05%NaN3 ) 洗脱 收集含蛋白的洗脱液, 同时取样加荧光增强液测定 Eu3+ 含量 计算 第十一一章免疫荧光标记技术163 标记率 (Eu3+ 1 届 ) 二 Eu3+ (μmol L) 蛋白 (vmol L), 一般为 10.0 左右, 合并峰管, 每毫升结合物加 1 mg BSA, 放入 ~4'C 冰箱或 20'C 保存备用 2. 二步标记法取浓度为 lo mgml 的纯化 Ig G 洛液 100μ1, DPfA 整合剂 260 vg 用.25 mol L NaOH i 周至 ph7.0, 快速旋动混合 1 min, 再置室温反应 30 min o 将反应液装入透析袋, 用 ll 50 mrnol L ph6.0 拘梅酸盐缓冲液于 4'C 透析 4h 换液一次, 4'C 继续透析 24 h, 除去未结合的 DPfA o 加入用同样缓冲液配制的 33 mrnol L EuC1 3 ( 或 SmC1 3 )25 ~ 50 vlo 室温下搅拌反应 30 min o 通过 Sephadex G - 50 柱 (2 em x 30 em) 层析, 用 50 mrnol L 磷酸盐缓冲液 (ph8.3) 洗脱, 其余步骤同一步法 ( 三 ) 反应过程增强液的作用是使荧光信号增强 因为免疫反应完成后, 生成的抗原抗体锦标记物复合物在弱碱性洛液中, 经激发后所产生的荧光信号甚弱 在增强 液中可至 pf 丑 ~3, 铺离子很容易解离出来, 并与增强液中的自 二酣体生成带有强烈荧光

171 164 第一一篇的新铺盖合物, 大大有利于荧光测量 所用检测仪器为时间分辨荧光计, 与一般的荧光分光光度计不同, 采用脉冲光源 ( 每秒闪烁 1000 次的缸灯 ), 照射样品后即短暂熄灭, 以电子设备控制延缓时间, 待非特异本底荧光衰退后, 再测定样品发出的长榈系荧光 检测灵敏度可达 0.2~1 ng ml o 二. 荧光偏振免疫分析仪荧光偏振免疫测定 (fluorescence polarization imnunoassay, FPlA) 是根据荧光物质经单一波长 ( 蓝光 ) 的偏振光照射后, 能吸收光能并发射出相应的偏振荧光, 其强弱度与荧光分子的大小呈正相关, 由此而建立的一种定量免疫分析技术 荧光偏振利用了荧光分子的 3 个特征 :1 光量子 ;2 吸收和发散的时间差 ;3 发散光与激发光的波长差异 分子吸收激发光的能量而上升至激发状态, 相对于激发光而言, 分子有一定的方向 正常光是各个方向光线的混合, 如果在光源和样品之间放置一块偏振滤光片, 则只有一个方向的电磁波照射到样品上 由于分子转动, 且分子从激发态回到基态需要一定时间, 因而得到的荧光是各个方向电磁波的混合物 如果在样品和检测器之间放置另一块偏振滤片, 则只检测一定方向的荧光 因此, 偏振荧光信号的强度与分子的方向相关 也就是说, 如果能降低荧光分子转动的速率, 使之发荧光时保持最初的方向, 则荧光信号强度增强 在荧光偏振免疫检测法中, 分析物标记上快速转动的小分子荧光 免疫学技术体, 发射动能显著增加, 从而使转动下降, 具有方向的分子数量增加, 荧光强度增强 在这种情况下建立竞争性免疫检测法, 在缺乏未标记分析物时荧光信号最强 ; 当加入未标记分析物时, 在己标记和未标记样品之间的竞争将减弱荧光信号 分析物的浓度与荧光信号强度成正比, 通过与标准曲线比较而得到定量值 此技术常用于免疫复合物的定量测定, 如半抗原药物的浓度测定 利用竞争结合反应的原理, 反应系统内除待测药物外, 同时加入一定量用荧光物质标 i 己的相应药物 ( 小分 物质, 极少分子发射出能检测到的偏振光线 然而, 一旦这些标 i 己的分析物分子结合了抗 子 ), 使二者与有限量的特异性抗体 ( 大分子 ) 竞争结合 当待测药物浓度高时, 经过竞争反应, 大部分抗体被其结合, 而荧光物质标 i 己的药物多呈游离的小分子状态, 由于其分子小, 在液相中转动速度较快, 测量到的荧光偏振程度也较低 反之, 如待测药物浓度低时, 大部分荧光物质标记药物与抗体结合, 形成大分子的标记抗原抗体复合物, 此时检测到的荧光偏振程度也较高 荧光偏振程度与药物浓度呈反比关系, 以药物浓度为横坐标, 荧光偏振强度为纵坐标, 绘制竞争结合抑制标准曲线 通过测定反应系统的偏振光大小, 从标准曲线上就可精确地得知样品中待测药物的相应含量 FPlA 法的优点是, 血清标本无需进行分离提取便可直接用于测定, 且样品用量少, 测定用时短, 精密度高, 仪器不需每日校准 ; 但缺点是仪器设备昂贵, 药品试剂盒专属性强, 尚需从国外进口, 难以普及 FPlA 测定的灵敏度很高, 可达 0.2 r 毯 ml o 二. 酶免疫荧光分析系统酶免疫荧光测定 ( 岛伍 la) 美国 Abbott 公司 20 世纪 90 年代中期推出多功能高自动化的免疫测定仪器 AXSYM 及岛位 该方法是以微粒子为固相, 以荧光物质为底物的微粒子酶免疫测定仪, 应用于激素 病毒标志 肿瘤标志 心肌标志等的测定 岛伍 la 法使用的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体, 用单克隆抗体包被塑料微粒, 用碱性磷酸酶标记多克隆抗体 4 甲基伞酣磷酸盐 (4 岛 1UP) 为荧光底物 岛 1ElA 法是用直径为 0.5μm 的塑料

172 165 第记技术免疫荧光标记法的应用和展望 微粒作为固相载体, 其表面多孔, 从而大大增加了反应的表面积, 提高了反应的灵敏度, 缩短了反应的时间 微粒由高分子塑料制戚, 具有很好的亲水性, 且比重与水相仿, 悬源性好 微粒在参与抗原抗体反应后需通过玻璃纤维进行分离和洗涤 由于微粒与玻璃纤维结合不可逆, 因此分离效果好 未结合的抗原抗体容易被洗下来 结合在玻璃纤维上的塑料微粒, 经过洗涤后与加入的底物液 4-MUP 发生反应, 底物被塑料微粒上的碱性磷酸酶分解, 去掉磷酸基因生成 4-MU, 它被 360 nm 的激发光照射后发出 448 nm 的荧光, 由荧光信号读数仪记录 2s 内的荧光强度, 每秒连续记录 8 次, 每次 500 InS, 因此大大提高了读数的准确性 该法的优点是血清样本可直接用于测定, 无需样本分离, 准确度高, 测定用时少, 仪器精密度高, 不需要每日校准 仪器价格适中, 测定项目较多, 便于在县级以上医院检验科使用 四. 荧光激活细胞分析仪荧光激活细胞分析仪 (fluorescence activated cell sorter, FACS), 即流式细胞仪 ( flowcytome 町, Fα1), 是将免疫荧光与细胞生物学 流体力学 激光和微机信息处理系统等多学科高新技术融为一体, 进行细胞和分子水平基础理论与应用研究的一种新的先进仪器 近年来, 在医学和生物学各领域中的应用日益广泛 详细情况见流式细胞术一章 第四币 一. 荧光技术的局限性 (~) 荧光对温度和粘滞度敏感, 因此反应条件必须严格控制在一定范围内 ( 二 ) 多数生物样品中所含物质能产生自然荧光, 如血请或血浆中的胆红素能产生荧光而形成显著的背景信号, 因此需进行质控或数据校正以将检测物信号与背景信号分开 ( 三 ) 内部滤光片效应 由于生物制品多存在吸收荧光物质发射的荧光分子, 但多吸收较短波长的可见光, 因此可选择较长波长荧光的荧光标记物以减少此效应 二. 免疫荧光技术的应用 (~) 传统荧光显微技术的临床应用传统的荧光显微技术, 虽然是进行定性测定, 但其测定标本范围宽, 观察结果直观, 无需大批量标本, 灵活性大, 试剂浪费小, 只需一台荧光显微镜即可, 仪器 试剂戚本低, 在基层医院即可开展 1. 细菌学应用在细菌学检验中主要用于菌种的鉴定 标本材料可以是培养物 感染组织 病人分泌排泄物等 本法较其他鉴定细菌的血清学方法速度快 操作简单 敏感性高, 但在细菌实验诊断中, 一般只能作为一种补充手段使用, 而不能代替常规诊断 荧光抗体染色法对脑膜炎奈氏菌 病疾志贺菌 霍乱弧菌 布氏杆菌和炭瘟杆菌等的实验诊断有较好效果 荧光间接染色法测定血清中的抗体, 可用于流行病学调查和临床回顾诊断 免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异性诊断常用方法之一 目前临床上常用的有运用二步标记法检测军团菌 肺炎衣原体 立克次氏体等 2. 病毒学应用免疫荧光技术在病毒学检验中有重要意义, 因为普通光学显微镜看不到病毒, 用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情况 在病毒领域应用最广泛, 目前临床上常用的有巨细胞病毒 EB 病毒 腺病毒 艾滋病病毒等 3. 免疫病理方面的应用对于免疫复合物病如肾小球肾炎 类风湿性关节炎 红斑 十一一章免疫荧光标

173 166 第一一篇免疫学技术性狼疮疾病, 利用补体荧光法定位免疫复合物沉着的位置, 以了解病变侵犯部位和病变基础 4. 自身免疫病中的应用自身免疫病所出现的抗体有两类, 一类游离在外周血中, 一类固定在组织中 检查血循环中的抗体, 其抗原组织是人或动物的相应组织, 标记抗体是用抗 X 的 γ 球蛋白或抗 IgG 抗 19A 抗胁 f 等, 采用间接荧光染色法 免疫荧光法还是检测自身抗体的好工具, 在自身免疫病的实验诊断中应用广泛 其突出优点是能以简单方法同时检测抗体和与抗体起特异反应的组织成分, 并自旨在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体 主要有抗核抗体 抗平滑肌抗体和抗线粒体抗体等 抗核抗体的检测最常采用鼠肝作核抗原, 可做成冰冻切片 印片或匀浆 用组织培养细胞如 Hep-2 细胞或 Hela 细胞涂片还可检出抗着丝点抗体 抗中性粒细胞胞浆抗体等 应用免疫荧光技术可以检出的其他自身抗体有抗 ( 胃 ) 壁细胞抗体 抗双链 DNA 抗体 抗甲状腺球蛋白抗体 抗甲状腺微粒体抗体 抗骨酷肌抗体及抗肾上腺抗体等 各种自身抗体的免疫荧光模式和相关的疾病诊断见下表 ( 表 12-1) 表 12-1 自身抗体的免疫荧光模式和常见疾病 抗体 使用的抗原底物 荧光模式 常见疾病 肝细胞膜 自体细胞或兔肝细胞 颗粒状 慢性侵袭性肝炎 甲状腺细胞膜 人甲状腺细胞 线状 毒性甲状腺肿 淋巴细胞膜抗原 自体淋巴细胞 线状 病毒性疾病,LED 肿瘤细胞膜 自体或培养肿瘤细胞 线状或颗粒状 成黑色素细胞瘤, 乳腺癌 胃壁细胞微粒体 人胃底部 胃十二指肠子壁细胞胞浆 恶性贫血, 慢性萎缩性胃炎, 甲状腺疾 术取材或器官组织 病, 60 岁以上健康人 血小板 自体巨核细胞 ( 胸骨骨髓 ) 细胞浆 特发性血小板减少性紫殿 分离的血小板 细胞核 大鼠肾 兔肝和小鼠胃或均质, 边缘, 斑点状, 点状 播散性红斑狼疮硬皮病, 类风湿性关 Hep-2 细胞 节炎, 混合性结缔组织病, 结节性动脉 平滑肌 炎, 重症肌无力, 慢性进行性肝炎大鼠肾组织, 兔肝和小鼠肌层和教膜肌层, 去占膜间隔, 慢性侵袭性肝炎, 病毒性肝炎, 急性病 胃 小动脉, 肾小球系膜 毒感染, 恶性肿瘤 骨路肌 人或牛骨路肌, 人胸腺 横纹, 运动终板 重症肌无力, 皮肌炎 5. 在寄生虫学的应用在寄生虫感染诊断中, 间接荧光抗体染色法有非常广泛的应用 间接免疫荧光试验 (IFAT) 是当前公认的最有效的检测芜疾抗体的方法 常用抗原为茫疾患者血液中红内期裂殖体抗原 IFAT 对肠外阿米巴 尤其是阿米巴肝脏肿也有很高的诊断价值, 所用抗原是阿米巴培养物悬液或提取的可洛性抗原 ( 二 ) 定量荧光免疫分析技术的临床应用随着新技术新方法的建立以及近年来一系列新仪器的问世,IFA 技术有了很大改进和发展 荧光标记技术的应用更加广泛, 荧光免疫分析进入了标准化 定量化和自动化的一个崭新阶段 近年来, 国内己有一些单位开展 1RFIA 技术的应用研究 在临床检验中, 应用 AXSl:M 或 IMx, FPIA EIA 方法可用于血清 13 T4 TSH 孕酣 乙肝病毒的五项定量 血清同型半肮氨酸 CEA AFP PSA 叶酸 Vit E12 铁蛋白等几十个项目的检测 运用 1RFIA 法用于药物的检测, 运用 Fαf 用于 T 细胞亚

174 167 第记技术参号文献 群 HlA- B27 白血病的分型标记检测 李振甲等(1 992) 报道应用国产试剂自行合成了环化二乙烯三月安五醋酸酷 ωipa 酷, 并利用所标 i 己的 EU 3 + 示踪物先后建立了 HBsAg 抗 HBc αa 和 AFP 的 1RFIA 测定方法 张安胜等 (1991) 报道将生物素亲合素系统与荧光增强液融为一体, 建立了检测 CEA 的新型 1RFIA 技术, 明显提高了方法的灵敏度和稳定性 通过国产化试剂和检测仪器的进一步研制和开发, 相信在短期内这一新型免疫分析技术将在我国逐步推广应用 荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析 (flow cytometry) 在这种分析方法中, 检测仪器不是荧光显微镜, 检测对象不是固定了的标本, 而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后, 在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出, 经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测, 并自动处理各处数据 这种方法可用于检测细胞大小 折散率 粘滞度等, 更常用于 T 细胞亚群 团 A-B27 白血病分型 细胞因子及肿瘤病人染色体及 DNA 等的检测 流式细胞仪因其方法简便, 用途广泛, 目前也逐步由科研发展到实际临床应用中来 1 Beesley, J.E. (Hrsg.).ImmunocYtochemistry: a practical approach. Oxford Univ Press, Oxford(1993) 2 Celis, J.E. (Hrsg. ).Cell biolc 町 : a laboratory handbook, Bd. 2, Academic Press, Iρndon (1 994) 3 沈霞. 临床免疫学与免疫学检验新技术. 北京 : 人民军医出版社, 陶义训 II 吴文俊 现代医学检验仪器导论 上海. 上海科学技术出版社, 阮幼冰, 武忠粥主编. 免疫病理学. 武汉 : 湖北科学技术出版杜, 王雪明, 毛伟红.HIA- B27 对强直性脊柱炎的诊断价值. 临床检验杂志, 2000, 18(2) : UlrichG. Useαflow cyt 1etry for HIλB27 phenotyping: study of a HIλB27 HIλB7 double marker tech nique. Allerg - Immunol- Paris, 1997 ;]an;29(1) : 11 ~ 14 8 Celis,J.E. (Hrsg. ).Cell biolc 町 : a laboratory handbook, Bd. 2,Academic Press, Iρndon(1994a).257~268 9 Celis,J.E. (Hrsg. ).Cell biolc 町 : a laboratory handbook, Bd. 2,Academic Press, Iρndon(1994b), 291~ Khalfan H.,Abuknesha R., Rand - Weaver M., et ala mino - methylcoumarin acetic aid: a new flu 口 -rescent la beling agent for protein.histochemical J.18(1986), 497 ~ Muj undar R. 丘, Ernst L. A., Mujumdar S. R. et a1. Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups. CYtometry 10(1989), 11 ~ Southwick P.L., Ernst L. A., Tauriello E. W., et al. Cyanine dye labeling reagents - Carboxylmethylindocyanine succinimidyl esters. Cyrαnetry 11 (1990), 418~ 沈关心, 用汝麟. 现代免疫学实验技术. 武汉 : 湖北科学技术出版社, 龚非力 医学免疫学. 北京. 科学出版社, 2001 十一一章免疫荧光标

175 168 第一一篇第十三章 化学发光免疫分析技术 1981 年 Pannagli 建立了化学发光免疫分析 (chemilu minescence immunoassay, 也 la), 并应用于测定血清皮质醇 辜丸酬, 对于临床免疫分析中检测超微量活性物质的技术进步起到极大的促进作用 但这种方法的建立初期也存在明显的缺点, 如发光持续时间过短 衰减过快 仅为数秒或更短的闪光型 (flash type), 信号强度弱, 本底较高, 易受环境物质干扰 这些缺点使化学发光免疫分析长期以来只能停留在实验室应用阶段, 且对测量仪器条件要求甚高, 无法推广应用 近几十年来通过不断改进和发展, 使化学发光免疫分析成为实用 灵敏的方法 ( 灵敏度可达 mo1 ), 己经成为非放射性标记免疫分析中最有前途的方法之一 化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪剂, 将具有高灵敏度的化学发光测定技术与具有高度特异性的抗原抗体反应结合起来的一种超微量分析方法 其突出特点是设备简单, 试剂稳定, 且无放射性污染 CL 技术发展的过程可以分 免疫学技术为传统的 CL 技术 ( 经典的方法 ) 和现代的 CL 技术 ( 即微磁粒子标记全自动分析 )0 CL 经典方法历史悠久, 在对免疫物质的定性 定量和生物细胞活性功能检测方面应用较为广泛, 所用多种发光剂可以由实验室研究方法配制, 所以国内应用较普遍 所谓现代 CL 技术, 是指目前仪器和试剂依靠进口 高科技含量多 自动化和智能化程度高 微磁粒标记免疫反应的高特异性与光反应 ( 发光剂生成 ) 的高灵敏性相结合, 无污染, 准确 快速, 对激素系统 肿瘤系统等多种指标定量在 10-9 ~ g 量级的分析技术 近年来现代化 CL 技术在国内应用发展较快, 主要应用在超微定量分析上, 但较昂贵 所菊化学发光免疫分析法 一. 基本原理 化学发光免疫测定法的原理与放射免疫测定 (RlA) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 相 似, 主要区别在于标记物不同 RlA 是由免疫系统和放射系统组成 ;ELISA 是由免疫系统 和显色系统组成 ; 而 α~la 则是由免疫系统和发光系统组成 化学发光免疫分析 (CLlA) 也由免疫结合反应和产生信号的标记物两部分组成, 只是 所用的标记物或检测信号不同 化学发光分析系统利用在化学反应中释放的大量自由 自旨, 产生激发态中间体, 当其回到稳定的基态时, 同时也发出光子 (hγ), 利用发光信号测量 仪对所发出的光量子进行测量 在 CLlA 中, 常用的发光剂有鲁米诺及其衍生物 邻苯三酷 双或经过酶促反应来放大发光底物的发光反应 忏(2, 斗, 6 三氯苯基 ) 草 酸醋 (1CPO) 和日丫盹醋等, 它们在合适的条件下都能产生化学发光 通过用发光测定仪检 测 CLlA 中的发光强度来对抗原 抗体等物质进行定量分析 α~la 的主要原理是将发光物质 ( 或触发产生发光的物质 ) 直接标记在抗原 ( 化学发光

176 169 第十三章化学发光免疫分析技术这其中包括两个过程, 即免疫反应和化学发光反应 发光反应的基本过程为 : 激发发光试剂 电子激发态中间体 基态 + hγ( 光量子 ) 其反应原理如下 : 子 ) ; Y 非竞争结合反应 : Ab + Ag + Ab- L 双抗体夹心法 Y Ab- Ag -Ab- L 激发发光 ~~- hγ( 光量 Y 竞争法 Y 激发发光 竞争结合反应 :Ag + Ag -L + Ab ~~..~ Ag - Ab + Ab _ Ag -L C<, U_U_"_ hγ( 光量子 ) 二. 化学发光免疫分析的分型与技术特点从上述的基本原理可见化学发光免疫分析法按标记方法不同, 可分为直接标记法和化学发光酶免疫分析法两种 (~) 化学发光物直接标记法此法主要是利用发光体系作为抗原抗体反应的指示系统, 来定量检测抗原或抗体 在直接标 i 己的化学发光物质中, 日丫眩目旨 (acridiniur 丑 ester, AE) 衍生物是常用且有效的发光标记物 日丫盹醋分子中有 N 怪基玻咱眈亚服醋活化基团, 可与抗体或抗原分子末端的氨基在缓和条件下共价结合, 并生成化学发光活性强 免疫反应特异性高的标记抗体, 这类抗体稳定性好, 易于制成广泛推广的商品 日丫院自旨衍生物有几种分子结构, 它们的结构中都有共同的日丫盹环, 通过启动发光试剂, 在过氧化阴离子的作用下, 生成电子激发态的中间体 N 甲基 H 丫盹酣, 当其回到基态时发出光子 (hγ), 其发光为快速闪烁发光, 其检测灵敏度可达 0.8 amol L( 即 8 兴 10-19mol L) 日丫眩目旨作为免疫分析示踪物具有许多优点 因为无需催化剂, 简化了反应 ; 发光反应快速, 增加了计数的充分性 ; 背景噪音低 其主要的优势在于当其与一种蛋白质 多肤或是其他有机分子结合成免疫示踪物时, 由于这种结合可以发生在分子的一定部位, 日丫眩目旨分子通过氧化过程可以从发光的部分断裂并分离下来, 这就排除了任何对于发光的抑制作用, 因此也增加了敏感度 这种标 i 己的试剂极其稳定, 并因其独特的形式 (2 甲基 H 丫盹醋 ) 而使其有效期长达 1 年甚至更长 发光过程快速, 在 1 s 内光子散射达到高峰, 整个过程在 2 s 内完成 在典型的分析过程中, 计数率可达到每秒 相对光单位 ( 或可计数的光子数 ), 即可达到 1O- 16 mol L 或 fg 级的敏感度水平 应用日丫眩目旨类化合物可以标记多抗 单抗, 可进一步制备成固相试管或微球, 可以应用于竞争法分析, 也可用于夹心法进行免疫化学发光分析 ; 而且对其进行检测的全自动测定仪器发展也很快, 这样就大大提高了这一方法的分析效率和普及推广 ( 二 ) 化学发光酶免疫分析法又称为 " 增强化学发光酶免疫分析 " (enhanced chemilu minescence enzyme immunoassay, ECLEIA) 针对化学发光信号持续时间短 容易受到外界因素干扰等缺点, ECLElA 的设计主要是将化学发光物质作为酶的作用底物, 由酶触发化学发光物质激发过程, 产生光子 通过酶标记抗原或抗体, 经过免疫学反应, 形成酶标复合物, 将酶的催化放大效应作用于发光底物 在免疫反应终点, 再用鲁米诺等发光体系测定发光强度 ECLElA 的主要特点 : 发光持续时间明显延长, 使其从极短暂的闪光型改为持续长达

177 170 第一一篇30 min, 甚至更长的持续发光型的稳定发光信号 ; 同时增强了信号, 减少了干扰, 提高了信 噪比 ; 明显提高了灵敏度, 可达 1O- 2 mol L, 使其远远超过普通的酶免疫分析, 也超过了一 般的发光免疫分析 目前常用于 ECLElA 的酶增强发光系统主要有两种 : 1. 辣根过氧化物酶 H 2 C)z 鲁米诺增强剂系统在此系统中, 辣根过氧化物酶 (f 虫 P) 可使 H2 02 产生的新生 q 作用于鲁米诺, 产生激发态的中间体, 并分解发光 ( 波长 为 425 皿丑 ) 年 Wh itehead 等在上述系统中加入了合成的荧光素 (D - luciferi 日 ) 作为系 统的发光增强剂, 可使发光信号延长持续到 7 min, 将信号本底比值提高了 80 倍 1 凹 98 盯 5 年又发 E 现见 - 些取代酣, 如对位腆盼 ( 印 P -1ωad 也 op 时内 )he ) 址臼 en 盯 01ο) 和对位苯基盼 ( 印 p-p 时内 hen 巧 1y 巾 he 臼 en 盯 01ο) 等更好 的增强剂, 发光信号延续时间可达到 30~6ωo mil 几 1, 发光信号强度可增强 1 00 of 倍音 O 如此, I 虫 P - H 2 C)z - luminal - D - luciferin 系统就成为了 Amerlite 增强化学发光酶免疫分析系列 的成熟试剂 2. 碱性磷酸酶环 1, 2 二氧乙 : 民衍生物系统 1989 年合成了具有稳定作用的金刚 炕基 1, 2 二氧乙 : 民的磷酸盐, 可以作为碱性磷酸酶 (AP) 的作用底物 因其具有高度 免疫学技术稳定, 便于应用, 酶催解后发光强度高, 持续时间达几十分钟等明显优点, 至 1991 年即建立了应用于临床的高度灵敏的增强化学发光酶免疫分析 在 hnmul 由,1M 免疫发光分析系统中常使用的发光底物是 A 肌 1PPD, 中文全名是 3 - (2' 螺旋金刚 ; 民 ) - 4 甲氧基 4 (3' 磷酷氧基 ) 苯基 1, 2 环二氧乙 : 院 A 岛 1PPD 是以 1, 2 二氧乙 : 民为基础的化合物, 螺旋金刚炕构成分子的稳定结构, 其另一侧的衍生芳香基团上存有磷酸醋基, 是碱性磷酸酶的作用部位, 易被酶解脱去一个磷酸基而得到一个中等 " 稳定 " 的中间体 A 扎伊 'PD- ( 半衰期 2~30 mi 时, 此中间体由内部电子转移裂解, 使二氧乙 : 民断裂, 分解为金刚 ; 民酣和激发态的问氧苯甲醋阴离子, 当其跃迁回到 基态时产生光子 ( 波长为 470 nm) 0 A 岛 1PPD 的特性为 : 在碱性环境下的非酶水解性很低, 即本底 1lU 民 ; 热稳定性好, 在 ph7.0 时, 室温下分解半衰期长 (l 5'C 为 675 h, 30'C 为 110 h) ;ph 为 9.5 时, AP 的酶解速度 很快 ; 发光为持续型,15 分钟达到高峰, 在 15~60 mi 口内其光信号强度维持一致, 变化很 小, 12 h 内仍可测出正确结果 ; 在含有 O.I%BSA 的反应液中能明显增强 AP 酶解 A 扎伊 'PD 的发光强度 A 岛 1PPD 是 AP 直接作用的发光底物, 在免疫发光分析中可用来测定酶标 i 己的抗原 抗 体 核酸探针等 至于检测方法, 多用抗体包被聚苯烯珠为固相载体 碱性磷酸酶标记抗体 (Fab 片段 ) 的双抗夹心法, 方法类型主要有一步法 延迟法及两步法 主要应用于许多生化指标的检 测, 灵敏度极高, 洛液中低于 mol L 的 AP 或固定膜上 10 到 mol L 的 AP 可以有效激 发 A 岛 1PPD 的持续发光反应, 现己广泛应用于各种肿瘤标志物 内分泌激素和其他微量生 物活性物质的检测 固相载体还可用铁微粒做成悬液, 应用电磁场磁法分离, 可进一步提 高分离效果 加快反应用期, 比聚苯烯珠为载体法达到最大发光信号峰值的时间更快 灵 敏度更高 近年来, 化学发光免疫分析以极快的发展速度, 在以非放射性免疫分析代替放免分析 的发展趋势中正在逐步发挥主流作用 它以灵敏度高, 分离效果好, 测定时间短, 批间误

178 171 第析技术电化学发光免疫分析法 差小, 无放射污染等特点, 己经从实验室进人临床医学的常规应用 各种不同类型的化学 发光免疫分析试剂不断问世将进一步推动化学发光免疫分析在临床医学和科研中的广 泛应用 第二币 一. 基本原理电化学发光免疫分析 (electrical chemilu minescent immunoassay, ECLIA) 是新近发展起来的既不同于传统的标记免疫分析, 也与普通的化学发光有区别的一种新型检测方法 它将电化学法和化学发光法巧妙结合起来, 具有灵敏 快速 准确 分析适应性广等特点 ECLIA 与 α~ia 不同, ECLIA 为电促发光, 其发光信号不是在通过启动化学发光剂或激发化学发光底物使其从激发态回到基态的基本过程中产生, 而是发生在电极表面由稳定前体产生的具有高度反应性的化学发光反应 其发光反应的物质基础为三联口比盹钉 [Ru(bpy);+ ] 络合物和三丙肢 (1PA) 两种电化学活性底物, 三联口比盹 [Ru(bpy);+ ] 和三丙肢基团在电场 ( 非化学反应 ) 触发下发生化学发光反应, 其最大特点是可以通过电场精确控制整个分析过程 钉标 i 己物 [Ru(bpy)γ] 的盐 1 良稳定, 经化学修饰后, 易与蛋白质 激素 核酸 半抗原等分子结合, 且自旨在 ECL 系统中循环利用, 延长发光时间, 增强发光强度, 故具有更为广泛的分析适应性 其反应过程如下 : (~) 反应前携带有三价正电子的三联口比院钉 [Ru(bpy)~+ ] 和三内肢基团 (1PA 怜 ) 相互反应, 由三内肢基团提供一个电荷, 使三联口比院钉 [Ru( bpy)γ] 还原成携带二价正电子的三联口比盹钉 [Ru( bpy); + J, 并同时通过能量转移形成激发态, 该激发态不稳定, 在 620 ill 卫处释放一个光子回到基态 ; ( 二 ) 基态的三联口比院钉 [Ru(bpy)γ] 在电极表面的电场作用下, 释放一个电子, 被氧化再生成三联毗院钉 [Ru(bpy)~+ J, 连续再生的钉复合物离子再与三丙肢基团 (1PA 怜 ) 进 十三章化学发光免疫分行下一周期反应, 这意味着测定过程可以进行许多个发光循环, 一个抗原 抗体复合物可 产生许多信号光子, 从而产生生物放大效应, 有助于该技术灵敏度的提高 ; ( 三 ) 三丙肢基团 (1PA 怜 ) 被还原成不影响化学发光的副产物, 待电场中的 1PA 被耗尽后, 光信号从最高点缓慢减小 ; ( 四 ) 三联 plt 院钉 [Ru(bpy)γ] 的盐化合物是稳定的水洛性复合物, 其衍生物 N 丑基玻咱酷肢 (NBS) 较易与蛋白质的许多氨基酸 各种小分子半抗原 核酸结合, 因而该技术可广泛应用于多项目的测定 ; ( 五 ) 电场下非化学反应触发而产生发光的化学反应, 应用中是通过给予链霉素和素包被的微磁颗粒, 用生物素结合的抗原 抗体 或其他合成多肤来增加反应的亲和力, 在电场控制电压下实现反应和分离过程, 使这一过程得到灵敏精确的控制 二. 技术特点上述电化学发光的反应过程, 集电子发光技术 超微粒技术 链霉亲和素生物素技术 抗原抗体反应技术 电磁场控制分离技术为一体, 其背景噪音信号极小, 抗原抗体的高

179 172 第亲和性反应使其特异性极高, 灵敏度可低于 1 阳 nol L, 与放射免疫分析相当, 但其宽大的线性测定范围又是放射免疫分析所不能比拟的, 显示了发光免疫分析特有的优越性 ; 其他, 如试剂的稳定性 快速反应 操作的自动化程度等等, 都是发光免疫分析所有优点较为集中的体现 参号文献 一一免疫学技2002;74(16) :3952~3962 术1 尹伯元, 等. 标记免疫学. 北京 : 原子能出版社, 巴德年. 当代免疫学技术与应用北京 : 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, Diamandis EP, et a!. Enzyme - amplified time - resolved fluoroimmunoassays. Clin Chern, 1991;37: Mora - Brugues ], et a!. Evaluation of Ciba Coming ACS 180 automated immunoassay system. Clin Chern, 1994; 40 (3): Christofides ND, et a!. Enhanced chemilu minescence labeled - antibody immunoassay for free thyr, 创 ne: desig 且, de velopment, and technical valiation. Clin Chεm, 1995;41 (1): Siddiqui], Remick ffi.1mproved sensitivity of colorimetric cαnpared to chemilu minescence ELISAs for cyrokine assays.] lmmunoassay lmmunochem, 2003 ;24 (3): 273 ~ Kricka U, Stanley PE. Electrochemilu minescence: Lu minescence, 1999; 14(2) : 113~ Ohno K, et a!. Development of novel high 段时 itiviry chemilu minescence assay for lu minal using thio 旧 ea derivatives. Lu minescence, 14(6): 355~360 9 ]ansson V,]ansson K. Enzymatic chemilu minescence assay for inorganic pyrophosphate. Anal Biochem, 2002; 304 篇(1): Agbaria RA, et a!. 岛 lolecular fluorescence phosphorescence and chemilu minescence spectrometry. Anal Chern, 11 Datta P, Dasgupta A.Evaluation of an automated chemilu minescent immunoassay for ccmplexed PSA on the Bayer ACS: 180 system.] Clin Lab Anal, 2003; 17(5) : 174~ McCapra F. Demonstrations of chemilu minescence. Methods Enzymol, 2000 ;305: 633 ~ Creton R, ] affe LF. Chemilu minescence microscopy as a t< 1 in biαnedical research. Biotechniques, 2001 ;31 (5) : 1 098~1100

180 173 第(radioimmunoassay, RIA) 是在 1960 年首先由 Yalow 和 Berson 创立的一种十四章放射免疫分析 析技术放射免疫分析 第十四章 放射免疫分析技术 体外超微量分析技术, 是将具有高灵敏性的放射性核素示踪技术与高特异性的免疫化学 技术结合起来而建立的新的分析方法 放射免疫分析技术的创立, 开创了生物活性物质 微量测定技术的新时代, 是微量分析方法学上的一个突破 从此放射免疫分析以其灵敏 度高 特异性强 重复性好 准确度高等特点而独树一帜, 几乎一切有活性的物质都可用这种方法来测定 1968 年 Mi les 和 Hales 建立了免疫放射分析 (immunoradiometric assay, IRMA) 方法, 其灵敏度比放射免疫分析 ; 去明显提高, 而且标准曲线的测量范围也明显扩大 特异性单克隆 抗体的应用, 使这种方法得到了更快的发展 近年来基因工程抗体技术的应用, 使免疫放射技术更加完善 放射性核素标记免疫分析主要包括放射免疫分析 (RIA) 和免疫放射分析 (IRMA), 由于放射免疫分析是更加传统和经典的核素标记免疫分析方法, 故经常在习惯上将两者统 一称为放射免疫分析 竞争性放射免疫分析的创立和相关技术的应用, 无疑是生物医学样品分析方面的重大突破, 为此, 其发明人之一 Yalow 于 1977 年荣获诺贝尔生物医学奖 放口一. 基本原理放射免疫分析是体外放射分析技术中建立最早且应用最广的一类技术, 它与放射受体分析 (radio receptor assay, RRA) 竞争性蛋白结合分析 (CPBA) 都属于竞争性体外放射分析技术 其基本原理是基于放射性标记抗原和非标记待测抗原同时与限量的特异抗体进行竞争结合反应, 通过分离未结合的标记抗原, 测定标记抗原与抗体复合物的放射性强度信号, 经相应的数学函数关系推算待测抗原含量 其反应式如下 : Ag 怜 + Ag+ Ab Ag 怜 Ab+ Ag -Ab+ Ag 怜 Ag* : 标记抗原 ( 反应后为游离的未结合标记抗原 ) Ag: 未标记待测抗原 Ab: 竞争结合的限量抗体 Ag* - Ab: 标 i 己的抗原抗体复合物 Ag -Ab: 未标 i 己的抗原抗体复合物反应中 Ag* 和 Ag 的理化性质相同, 并且两者与 Ab 在同一个反应体系中, 形成 Ag* Ab 复合物的量 (B) 随着待测抗原 Ag 的量增加而减少, 游离未结合的 Ag* 的量 (F) 随 Ag 的增加而增加, 因此, 由测定 Ag* - Ab 或 Ag* 的量即可推算出待测物的含量, 这一反应称 " 竞争结合反应 " 当反应体系中没有待测非标记抗原时, BF 为 2.0, B(B+F) 为 0.67, 随着待测抗原的增加, BF 或 B (B+ F) 相应减少, 加入的非标记待测物含量与相应的 BF 或 B (B + F) 值可以用函数关系曲线表示出来, 即剂量反应曲线 根据质量作用定律, 反应达到平衡时的剂量反应曲线是一种竞争抑制曲线, 该曲线可作为定量分析的依据 忏所菊射免疫分

181 174 第一一篇通常以各种己知浓度抗原与一定量的标记抗原及其抗体反应, 可测得在各种己生日浓 度下标记抗原抗体复合物的放射性结合率, 以己知浓度的标准抗原为横坐标, 以放射性结 合率为纵坐标绘成标准竞争抑制曲线, 根据被测抗原的放射性结合率, 即可得出相应的抗 原含量 标准曲线的基本形式如图 结 合半 浓乎使 ' 图 14-1 标准曲线基本形式图 二. 基本试剂及其技术特点放射免疫分析的基本试剂主要包括标准品 特异抗体以及放射性标记物三种 (~) 标准品 (cal 山 atlon sta 且也 rd) 标准品是放射免疫定量测定的依据, 它质和量的变化会直接影响样品的测定值 标准品的要求 : 免疫学技术1. 在化学结构上要求标准品与待测物质化学结构相同, 即同一种物质 ; 2. 在纯度上要求高度纯化, 不能含有任何可以影响分析的物质 ; 3. 在活性上要求在与结合剂发生反应时应该与待测物质有相等的活性和亲和能力 ; 4. 在含量定值上要求通过标准品特定的化学或物理性质进行准确标定, 蛋白质或多肤类标准品可采用精度较高的蛋白定量法定标 ; 5. 在运输保存上要求有明确的保存条件和有效期说明 ( 二 ) 特异抗体要求为与待测抗原有较高亲和力, 较高滴度和高特异性 1. 抗血清的制备采用免疫原性强的待测物质, 在动物体内诱导产生抗体, 收集含抗体的血洁, 应用于放射免疫分析 对于分子量较小的半抗原物质, 通过与载体蛋白的化学联接, 增强其免疫原性 动物的免疫应答能力与动物选择及免疫接种方法有关, 一般实验室选用家兔 豚鼠, 如抗血清用量较大可选用羊 由于存在个体差异, 免疫功物可适当多免疫几只, 可以选择满意的抗血清 免疫的成败主要取决于免疫原和动物种类 {E! 注射途径 佐剂的使用 注射剂量和时间等也起重要作用 2. 抗血洁的质量鉴定免疫功物产生的抗血清不一定都能适应放射免疫测定, 因此要对所制备的抗血清进行鉴定检测的指标主要有亲和力 特异性和滴度 (1) 亲和力 (affinity) 表示抗体与抗原的结合能力, 它与所建立的方法灵敏度有密切关系, 常用平衡亲和常数 KA 表示 在免疫学上把平衡常数 (K) 看作为抗原抗体之间的亲和常数 根据竞争性放射免疫反应, 可表示为 : 式中 : Kj P+Q 言 7 二罔 (F) (B)

182 [Q] 二特异抗体的初始浓度 [ 阳 ] 二形成复合物的浓度均以 mol 或相应质量单位表示 [K] 为平衡结合常数反应达到平衡时 K 二 K] K2 二 [ 阳 ] [p] [Q] 即 K 二 [AgAb] [Ag] [Ab] K 值越大, 反应的结合常数越大于解离常数, 即 Ab 与 Ag 的结合力越大 亲和常数的 求法多用图解法, 常用的有 Scatchard 图 K 二 ( [ 阳 ] [ p] ) X (l ([Q] - [ 阳 ] ) ) 二 (B F) X (l ([Q] - [ 阳 ] ) ) '. BF 二 K[Q]~ K[ 民主 ] 用 BF 对 [ 阳 ] 作图, [ 阳 ] 为自变量, BF 为因变量, 所得斜率为亲和常数 K o 具体做法 : 用一定稀释度的抗血洁, 加一定量的标记抗原和逐步递增的标准品进行反 应, 待反应平衡后, 测定结合部分的放射强度, 得出每一管反应管的 BF 和相应的 [ 叫, 通过作图和直线回归求出平均斜率, 即 K 值 其他还有饱和曲线法, Sips 函数法, 比较两条稀释曲线法等 (2) 特异性 ( specific 町 ) 抗体的特异性是指在所测样品中抗体与靶物质结合的能力, 即抗体与待测物以外结构类似的其他物质的结合能力 抗体的特异性实际上决定了放射 免疫分析方法的特异性和测定结果的准确性 抗体特异性的鉴定, 是通过在测定体系中, 用待测物和结构相似的交叉反应物与抗体 竞争同一结合位点, 制得各自的反应曲线, 再求出结合率被抑制 50% 时的剂量, 以求得待 测物与交叉反应物之比, 这一比例定义为这种抗血清对该交叉反应物的交叉反应率 交 叉反应率越低, 表示抗血洁的特异性越高 (3) 滴度 (t 由 r) 抗体滴度是指结合 50% 标记抗原时抗血洁的稀释度 滴度大的抗 血请表明总的抗体浓度较高 ( 并不反映亲和力的大小 ) 滴度大小的鉴定方法 : 一般采用稀释曲线法, 取适当的缓冲液按不同稀释度稀释抗血 洁, 分别加入一定量的标记抗原后, 经适当时间的温育, 测出结合部分 Ag* - Ab(B) 的放 射性计数, 计算出与总 Ag* 计数率 (T) 的比值 B%, 以 B% 为纵坐标, 以不同的稀释倍数为 横坐标, 绘制稀释曲线, 标记抗原被抗体结合 50% 时的稀释度为抗血清的滴度, 即工作稀 释度 在实际工作中, 结合 30% 标记抗原的抗血清滴度通常在 10 3 ~ 10 6 倍之间, 一般稀释 度为 10 4 ~105 倍的抗血清应用较多 低于 10 3 倍的抗血清不够理想 在上述抗血清滴度的测定中, 标记抗原和适当的 B 与 F 的分离方法是滴度测定的重 要条件 标记待测物的比活度对抗血清滴度影响较大, 标记待测物的比活度高, 测得的抗 血清滴度也大 ( 三 ) 放射性标记物 放射性标记物与放射免疫分析的灵敏度和精确度有着重要的关 系 1. 标记物的要求 1 比活度 (specific activity) 高 高比活性的标记物是确保一种分析 方法灵敏度的前提 ;2 免疫活性 (immune activity) 高 在标记和储存过程中, 很多因素可以 造成标记抗原的免疫活性下降与抗体发生反应的能力减弱因此要求测定其免疫活性 ; 175 第十四章放射免疫分[p] 二标记物 + 待测物的初始浓度析技术

183 176 第一一篇3 放射化学纯度 (radiochemical purity) 高 一般要求在 95% 以上, 若放射性杂质过多, 将使 标准曲线的斜率降低, 影响测定的灵敏度 ;4 稳定性好 (stability) 当标 i 己方法合理 保存 条件完善时, 要求货架期达到 1~3 月 2. 标记物的制备选择的放射性核素, 最常用的是 和 3 H 一般多肤类 蛋白质含 有氨基酸, 可用山 I 3 标记 ; 小分子化合物, 如固醇类激素 环核甘酸等以往多用 H 标记, 近 年来小分子化合物的腆标记技术发展较快, 在放射免疫分析中, 山 I 基本代替了 3 H, 特别是 在 pg 级水平上的分析, 山 I 标记灵敏度更高 3. 常用标记方法为直接氧化法和间接氧化法, 直接法主要有氯肢 T 法, 过氧化物 酶法, 电解法, lode 皂白 1 法等 二. 分析方法 (~) 反应方式 1. 平衡加样法 (balance assay) 又称一步法, 是将待测抗原 标记抗原和抗体同时加 入反应体系进行反应, 使待测抗原 标记抗原与抗体有相同的反应几率 一般来说, 这种 方法反应时间较长, 灵敏度相对较差, 但操作方便, 精密度较好 2. 顺序加样法 (sequence assay) 先将待测抗原与抗体反应一定时间, 形成抗原抗体 复合物, 然后加标记抗原短时间反应后再终止反应 使待测抗原与抗体结合的几率增大, 免疫学技术( 二 ) 反应条件只有合适的反应条件才能得到理想的测定结果, 这也是放射免疫分析方法成败的关键之一 1. 缓冲液 RIA 中, 不同的反应体系要求不同的 ph 值, 不同种类的试剂盒采用不同 ph 值的缓冲液 一般来说, 反应最合适的 ph 值为 7.4~7.8, 离子强度为 ~ 0. 1 mol L, 此外, 缓冲 j 夜还含有 2% ~2.5% 的兔血请或猴血洁, 0.5% 的牛血洁白蛋白, 0.01 mol L 的 EDfA 纳盐, 0.05% 的叠氨纳 2. 添加剂某些试剂盒, 要增加一些添加剂未达到某些目的, 如加入 ANS 阻断甲状腺素 面体激素与血浆结合蛋白的结合, 加入抑肤酶 8 丑基唾琳 二疏基丙醇来抑制肤 提高了待测抗原的竞争能力, 从而提高了方法的灵敏度 类激素的分解等 3. 反应温度及时间在选择反应的温度和时间时, 要在不同的温度 时间条件下进行试验, 综合评价, 以获得最合适的温度和时间的搭配参数, 然后根据需要灵活选择, 以满足实验室和临床诊断的要求 四. 常用分离方法在放射免疫分析过程中, 结合抗原和标记游离抗原的分离对测量信号和背景噪音信号比值影响很大, 是决定检测结果灵敏度和特异性的极为重要的环节 理想分离技术的要求 :1 将 B 和 F 尽可能完全分离, 并且不改变最初的平衡状态 ;2 B 和 F 的分离不易受血浆或血清等外界因素的干扰 ;3 分离试剂价廉易得, 操作简便, 分离迅速, 重复性好 常用分离方法主要有液相分离法和固相分离法 液相分离法主要有 : 双抗体免疫沉淀法, 有机洛剂 ( 聚乙二醇, PEG) 沉淀法, 活性炭吸附法, ( 选择饱和硫酸锻 ) 盐析法, 微孔滤膜吸附过滤法, 电泳和层析法等 可选择的分离方法较多, 以分离效率高 干扰因素少 使用方便 经济实用为选用原则

184 相法, 磁颗粒固相法等 这些方法各有优缺点, 以非特异结合率低, 能牢固联接或吸附抗体, 单位面积联接或吸附的抗体量多, 物化性能稳定, 价格低廉为优 五. 数据处理放射免疫分析的数据处理是以标准品的检测结构为依据, 拟合出标准曲线, 再通过标准曲线求出待测样品的浓度值 标准曲线的拟合是数据处理的关键, 是衡量样品的客观尺度, 也是 RIA 质量控制的重要内容, 因此对拟合方式要慎重选择, 使之能够真实地反映测定结果, 尽量减少人为因素的干扰 目前常用的拟合方式为数学拟合法, 是用某一种函数模型来描述标准曲线的剂量反应关系, 函数式的各系数均通过一定的数理统计方法对各标准点的实际测量数据进行拟合而求得, 然后将每一待测样品的反应量代入函数式, 计算出相应的浓度值 目前这一过程均通过测量仪器的数据处理系统, 选用合适的数学模型来实现 六. 质量控制严格的质量控制体系应该包括生产和使用两个环节. 生产厂家应建立严格的质量检测程序, 以保证进入市场的产品都符合质量要求 ; 用户应建立严格的质量控制体系, 以保证检测的质量 根据不同的目的, 质量控制体系可分为实验室内部质量控制和实验室间质量评价, 两者密切联系, 各有侧重 (~) 实验室内部质量控制实验室内部质量控制 (internal qual 町 control) 侧重于对检测质量的控制, 其目的是在从收集样品到发出报告的全过程中, 能够及时地发现检测过程中出现的各种误差, 分析产生原因, 找出纠正方法, 以确保检测质量 实验室内部质量控制常用的评价指标有精密度 准确度 特异性 灵敏度 稳定性和有效性 1. 精密度 (precisio 川是指在相同条件下对某一样品多次测量所得结果的符合程度, 即复营的重复性 主要有平均变异系数 (ABCV) 反应误差关系 (RER) 精密度图( precision profice, P - P 图 ) 等几种评价方法 2. 准确度 (accuracy) 是指测量值与真值的接近程度 主要通过回收率 ( recovery rate) 和质量控制样品来进行评价 3. 稳定性 (stability) 是指测定试剂在合理保存和正确使用的情况下, 在规定的有效期内保持其全部原有性能不变的能力 常用评价指标有零标准结合率 (Bo%), 非特异性结合率 (NSB%), 标准曲线直线化转化后的截距 斜率 相关系数 ED25 ED 如 E~5 和质控图等, 这些指标在连续工作条件下应保持稳定 4. 灵敏度 (sens 山 vity) 是指刚好能与不含有标准配体的零标准管的测定结果在统计学上区分开的最小可测值 计算方法是累积多批 ( 一般为 10 次 ) 测量结果, 计算出零标准管的结合率为 χ2sd 时对应的剂量值, 即为灵敏度 方法的灵敏度与精密度有一定的关系, 当精密度好时, 零标准管的结合率较高, 对应的浓度值较小, 则灵敏度较高 5. 特异性 (specificity) 是指高反应体系不受干扰物质影响的程度 常用的指标是交叉反应率 计算方法是将分析物及可能出现干扰的类似物, 分别在完全相同的实验条件下进行测量, 将所得结果绘制出剂量反应曲线, 计算当结合率为 50% 时所对应的浓度值 交叉反应率二 [ 待测物 ] 到 [ 类似物 ] 到 x 100% 177 第十四章放射免疫分: 塑料类试管 微球或多孔玻璃微球固相法, 纤维素或凝胶颗粒固析技术固相分离法主要有

185 178 第一一篇第二币免疫学技交叉反应率越小, 表示反应体系对分析物的专 - 性越好 6. 有效性 ( effectivity) 主要指临床诊断符合率以及临床应用评价 检测结果应能有效地实现实验目的, 应有可信的正常值及正常范围, 在正常和异常之间应有良好的区分, 以使得出结论 7. 健全性 (pe 企 ctly) 一般借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断 具体做法是将一份待测样品经过一系列倍比稀释后进行测定, 如果各稀释度测定值在标准曲线上, 或其连线与标准曲线平行, 则说明被测样品与标准品具有一致的免疫活性, 也说明被测样品的测定值不会因稀释度的不同而发生变化, 方法的健全性 f 良好 ( 二 ) 实验室间质量评价实验室间质量评价 (external qual 町 control) 是对各实验室测定结果按统一的评价方案及方法进行比较分析, 发现误差, 找出原因, 提出改进办法, 以提高各实验室所得结果可信性和可比性的过程 实验室间质量评价需要在做好内部质量控制的基础上进行, 通常的做法是根据工作或研究的需要, 由一个负责单位来领导, 提出计划和要求, 并提供实施实验室间质量评价所用的统一样品, 分发至各参加单位进行检测, 然后将所得结果反馈给负责单位进行整理分析, 对各有关单位的检测质量进行评价, 以提高检测质量和资料的可比性 用于评价的质量指标主要有 : 标准曲线的拟合方式及可用范围, 分析测定的精密度和 精密度图 通过这些分析, 为改进实验设计和试验方法提供线索 免疫放射分析 免疫放射分析 (immunoradiometric assay, IRMA) 法于 1968 年由 Mi les 和 Hales 首先提出, 应用标记抗体的方法测定牛血清 夷岛素获得成功 {E! 当时由于纯化抗体的问题, 以及抗原抗体复合物与游离标记抗体分离的问题未得到解决, 而限制了该项技术的进一步发展 术20 世纪 70 年代以后单克隆抗体的产生, 促进了该技术的迅速推广 免疫放射分析是利用过量放射性标 i 己的抗体来测定样品中的抗原或半抗原, 反应系统是非竞争性的全量反应 一. 基本原理 (~) 基本原理以过量的标记抗体直接与待测未知抗原结合, 经与游离标记抗体的分离, 测定其复合物的放射性计数 如待测抗原含量多, 复合物计数率就高, 反之则待测抗原量少 与 RIA 三种主要反应试剂参加的竞争性结合反应比较, IRMA 方法是一种非竞争性结合反应, 主要反应试剂只有过量标记抗体 (Ab 怜 ) 和待测抗原 (Ag) 两种, 反应达到平衡比较快, 所测得的抗原抗体复合物 (AgAb * ) 的放射性计数与待测抗原的浓度成正相关 由于使用过量抗体, 其灵敏度比 RIA 法提高 1O ~100 倍 这些都是 IRMA 方法的优越之处 反应式示意图如下 : Ag +Ab 飞过量 ) AgAb 怜 + Ab * Ag: 未标记待测抗原 Ab* : 过量的标记抗体 AgAb * : 标 i 己的抗原抗体复合物 Ab * : 未结合的游离标记抗体 ( 二 ) 与 RIA 的主要区别

186 179 第析技术应 1. 反应的机制不同 RIA 是竞争性反应, 而 IRMA 为非竞争性反应 2. 反应试剂 RIA 的主要试剂为 3 种, 标记物为抗原 ; 而 IRMA 的主要试剂实际是 2 种, 且标记物为抗体 3. 分离方法不同 IRMA 一般需要单克隆抗体作分离剂, 其抗原需 2 个或 2 个以上 的决定簇, 而 RIA 的抗原只需要 1 个抗原决定簇即可 4. 待测抗原复合物的放射性 RIA 中与待测抗原呈负相关, 而 IRMA 中则呈正相关 0 5. 非特异性结合 在 RIA 中主要影响高剂量反应, 而在 IRMA 中主要影响低剂量反 二, IRMA 方法分类 经典的 IRMA~ 去主要有两种 : 一种为单位点的 IRMA 法, 另一种为双位点的 IRMA~ 去 随着单克隆抗体和生物素 亲和素系统的应用, 以及固相分离技术的完善, IRMA 也有了 一些新的分析方法 (~) 单位点 IRMA 抗原分子只需一个反应位点决定簇, 与标记抗体上一个相应结合 点反应, 形成复合物后分离游离的标记抗体, 单位点的 IRMA 灵敏度和特异性都不够满 意, 目前应用较少 ( 二 ) 双位点 IRMA 亦称为双抗体夹心法 (double antibody sandwich method), 固相抗体 与标记抗体同时与待测抗原的两个决定簇结合, 使待测抗原夹在两种抗体分子之间, 通过 洗涤, 分离游离的标记抗体 非特异性结合 (NSB) 较低, 大大提高了测定的灵敏度 ( 三 ) 标记双抗法 (labeled double antibody method) 用放射性核素标记抗体的抗体, 此 抗体可作为通用示踪剂, 简化了标记每一个特异性抗体的步骤 ( 四 ) 双标记抗体法 (double labeled antibody method) 利用抗原可具有多个决定簇的特 点, 在单抗制备上可选用 3 个以上的特异性单抗, 其中一个结合在固相上, 其余两个分别 进行放射性标记 此方法抗原抗体复合物的放射性比活度高, 有利于提高灵敏度和精密 度 ( 五 ) 配体包被 抗配体桥式法 (ligand coated tube antiligand bridge method) 应用与待 测抗原无关的一个特异性配体包被试管 (SP- L), 加入待测抗原后, 再加入一个山 I 标 i 己的 特异性 Abl 与另一个用上述配体标 i 己的特异性 Ab2(L- Ab2) 进行反应, 在液相中待测抗 原将被夹在此两种标记物中间, 再加入抗配体抗体 (Ab3, 抗 L) 连接包被试管和液相中的 复合物, 达到与液相中游离山 I 标记抗体分离的目的 ( 六 )IRMA 生物素 亲和素测定系统 (biotin - avidin system IRMA, BAS - IRMA) 应 用此法最突出的优点就是利用了 BAS 的放大作用, 大大提高了检测的灵敏度, 目前一些 超灵敏的 IRMA 试剂盒多利用 BAS 的放大技术 BAS- IRMA 是最有前景的方法之一,BAS 是生物素与亲合素系统的简称, 两者的结 合具有高亲和力, 其亲和常数 Ka 值高达 L mol, 是抗原抗体反应的 10 万 ~100 万倍 使生物素化的抗体, 及山 I 标记抗体与待测抗原发生反应, 形成 " 生物素化抗体抗原 125 I 抗体 " 三联复合物, 再与固相链亲合素进行第二步反应, 借助生物素与链亲合素的高 亲和力, 进一步形成 " 固相链亲合素 生物素化抗体 抗原山 I 抗体 " 复合物, 用简单方 法移除多余的山 I 抗体, 即可得到复合物, 其放射性与待测抗原量呈正比关系 通过有效 利用生物素 亲合素系统的高亲和力和放大效应, 使 IRMA 法不仅具有更好的分离效果, 十四章放射免疫分

187 180 第一一篇而且具有更高的灵敏度 二. 技术特点 (~) 特异性由于单克隆抗体的广泛应用, 加之应用双位点系统的 IRMA, 两种待测物质必须同时具备两个抗原决定簇才能最后形成标记复合物, 故 IRMA 不易发生严重的交叉反应 有些类似物可能仅与两种抗体中的一种有交叉反应, 造成标准品的结合率下降, 但由于最终不能形成放射性复合物, 故 IRMA 不易发生严重的交叉反应, 大大提高了分析的特异性 ( 二 ) 灵敏度使用过量同位素标记单克隆抗体, 使复合物的计数效率很高 将待测抗原和标记抗体同时加入固相抗体进行反应, 使反应很快达到平衡, 加之固相结合的复合物与游离标记抗体可有效的分离, 这些极大的提高了 IRMA~ 去的灵敏度 ( 三 ) 稳定性 IRMA 法测定结果稳定性较好 由于标记抗体和国相抗体均属过量, 不易受外界环境的影响, 温度变化对 K 值的影响较小, 一般在 4~3TC 之间的温度改变对实验结果无明显影响 同时也不易受实验操作的影响 由于抗体过量, 加样误差对其影响不大 ( 但注意抗原加样误差影响较大 ) 故 IRMA~ 去的批内批间变异均比较小 ( 四 ) 示踪剂的特点 IRMA 法应用抗体作为示踪标记物, 易于腆化, 且不同抗体的标记方法均基本相同, 方法简单易于推广 而 RIA 法标记抗原, 各种抗原的化学结构及组成 免疫学技术差别较大, 标 i 己方法也各不相同, 有时甚至很难应用白 I 标记, 使测定效果差异较大 ( 五 ) 标准曲线工作范围由于 IRMA 的高灵敏度和高特异性, 一般可使 IRMA 标准曲线的有效工作范围达到三个数量级以上 ( 而 RIA 一般为两个数量级 ), 这样就使低含量的待测抗原可以得到准确的定量 特别是在病理情况下, 对于待测物含量大幅度改变的情况, 应用 IRMA 法可得到密切追踪, 从而给临床带来了方便 参号文献 1 李振甲. 放射免疫分析手册. 北京 : 科学出版社, 王浩丹, 用申. 生物医学标记示踪技术. 北京 : 人民卫生出版社, 叶维新. 实验核医学技术长春. 吉林科学技术出版社, 尹伯元, 等. 标记免疫学. 北京 : 原子能出版社, lola H Laboratory methods in immunology. CRC Press 6 Xu QQ, et a Studies on plasma endothelin changes in varicocele patients. Asian J Anciro!, 1(3) : 159~ Mellgren RL A radioimmunologic technique for assessing calpain activation in cells. Methods 岛 101 Bio!, 144: 161 ~169 8 Bonamico M, et al Radioimmun 臼 assay to detect antitransgluta minase autoantibodies is the most sensitive and specific screening methods for celiac disease. Am J Gastrontero!, 96 (5) : ~ 1 540

188 181 第胞技术流式细胞术的发展史 第十五章 流式细胞技术 流式细胞技术 (flow cytometry, Fα 们是以激光为基础, 对处在液流中的单细胞或其他 生物粒子膜表面以及内部的化学成分进行多参数快速定量分析和分选的一种检测技术 它借鉴了荧光显微镜技术, 同时利用荧光染料 激光技术 单抗技术以及计算机技术的发 展, 将荧光显微镜的激发光源改为激光, 它可以高速分析上万个细胞, 并可对一个细胞的 多个参数同时进行测定 同传统的荧光显微镜检查相比, 具有速度快 精度高 灵敏 定量 等特点, 是一种可以对细胞的物理或化学性质, 如大小 内部结构 DNA 卧性 蛋白质 抗 原等进行快速测定并可分类收集的技术 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的 细胞分析仪, 自 20 世纪 70 年代以来, 随着流式细胞术水平的不断提高, 它己广泛应用于 基础研究和临床实践, 临床上己普遍用于免疫学 血液学 肿瘤学 细胞生物学 细胞遗传 学 生物化学 药理学及临床检验等领域, 为生物医学与临床检验学的发展提供了全新的 视角和强有力的手段 所菊口追踪流式细胞仪的发展史, 第一个报道自动计数细胞的是岛生 Jldava 口, 他于 1934 年描述了这样一个装置 : 在显微镜的载物台上, 悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过, 每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来 这个实验被看成是有关流式细胞术的第一个尝试 1947 年, Cucker 等人结合喃液原理和光电技术对气洛胶中的粒子进行计数, 克服了流式细胞计中大细胞或者细胞团堵塞通道的问题 1949 年, Wallance Co ulter, 也就是库尔特公司的创始人, 发明了流动的悬浮粒子计数方法 他让粒子通过一个小孔, 只要粒子与悬浮的介质问在电导率上有差异, 小孔中粒子的存在与否即能引起可检测出的电特性变化 此现象被称为 Co ulter 效应, 他在此基础上生产了 Co ulter 计数器 1953 年, Crosland - Taylor 利用同一原理设计了一个流动室, 用光学方法来计数血细胞 并建立了流体动力学聚焦原理 1965 年, Kamentsky 等第一次用核酸紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色的细胞 他们首次将计算机与仪器连接起来对数据进行处理, 用二维散点图进行数据显示和分析 1967 年, Van Dilla 和 Los Al amos 小组率先发展了一种液流束 照明光轴和检测系统光轴三者相互垂直的流式细胞计, 并联结 ulter 计数器 Fulwyler 于 1965 年提出静电墨水喷射液滴偏转技术 后来这种流式细胞分选术得到了逐步改进 1969 年, Van Dilla 等在 Los Al amos 研制出具有现代意义的流式细胞仪, 它以氧离子激光为光源, 采用革自流技术, 首次对 Feulgen 染色细胞进行 DNA 荧光强度的检测, 极大的推忏十五章流式细

189 182 第一一篇第二币免疫学技动了细胞动力学的发展 Mullan 町等于同年发现小角度散射光与被测粒子体积有一定关系 他们以 He-Ne 激光为光源, 对直径在 5~20 的微小粒子进行测量, 这一发现使得流式细胞仪可通过小角度散射光对细胞大小进行测量 1970 年 Phywe 推出一台配有荧光显微镜的流式细胞仪, 可以对细胞的 DNA 含量进行 定量分析, 仪器名称为 impuis - cytophoto - meter, 简称为 ICP o 1972 年 Herzenberg 等在斯坦福大学研制出一台以氧离子激光为光源的荧光激活细胞 分选仪 (fluorescence - activated cell sorter, FACS), 能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞 较弱的荧光信号 BD 公司 1974 年将它投放市场, 商品名为 FACS-I 1M 0 从 20 世纪 80 年代以后至今, 世界上流式细胞仪的生产厂家不断进行科研创新, 各种新型的流式细胞仪不断涌现, 其检测原理也日趋完善 随着临床分析型流式细胞仪的开发应用, Fαf 检测手段在临床上的应用越来越普及, 己成为当今大型医疗机构对患者进行细胞免疫功能 白血病分型 HlA- B27 细胞因子 肿瘤病人染色体分型等检测的重要手段 目前, 世界上主要的流式细胞仪有美国 BeckmanCoulter 公司生产的台式带自动进样及数字信号处理技术的四色流式细胞仪 EPICS XLMCL 和具备高速分选技术的 EPICS AL1RA, 美国 BD 公司推出的 FACSAnlayzer1M, FACScan1M, FACSCalibur1M 等, 德国 Partec 公司 生产的 PASlll, 等等 一. 流式系统 - 流体动力学聚焦 流式细胞仪工作原理 基本原理是 : 首先将待测的细胞染色后制备成单细胞悬液, 细胞经染色后在革自液的包 术l 侧向服光信号 t 围和约束下, 进入流动室, 在高压作用下, 排成单列, 高速由流动室喷嘴喷出, 形成细胞液 柱 当液柱通过检测区时, 激光光源经过聚焦整形后的光束垂直照射在液柱上, 产生前向 散射光 (FS) 和侧向散射光 (SS) ( 图 15-1), 它们分别反映细胞的大小和细胞内部结构及颗粒 经特殊荧光标 i 己的样品, 在激光束的激发下产生特定的荧光 上述两种信号同时被前向光电二极管和 900 方向的光电倍增管 (PMr) 接收 荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度经过一系列的转换并输送到计算机进行分析 前向角散射光 图 15-1 销液及流动室 FCM 仪器可分为临床型和科研型两大类, 第一类有美国 BD 公司的 FACSCalibur, FAC

190 第十五章Scan 和 Co ulter 公司的 EPICS- XL, 其特点是仪器的光路调节系统固定, 自动化程度高, 操作简便, 易学易掌握 ; 第二类有 BD 公司的 FACS Vantage, Coulter 公司的 ELl1E ESP, 其特点是可快速将感兴趣的细胞分选出来, 并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上, 可同时选配多种波长和类型的激光器, 适用于更广泛的科研 二.FCM 的结构 (~) 激发光源流式细胞仪通常采用激光为光源, 激光作为光源具有单色性好 功率大 稳定性高等优点 EPICS ) 正 L 上采用的光源是 488 ill 丑氧离子空冷激光, 使发射光在可见光谱范围内 488 nm 激发, 优点是稳定性好 能量高 发射角小, 目前市场上大多数荧光素适用于此波长, 因而应用广泛 激光到达样本流之前, 经过圆柱形透镜聚焦光束 这种聚焦使激光束与液流垂直正交, 并使激光束尽可能细小, 只要能够完全检测到通过的细胞即可 利用透镜调节激光束的宽度和高度, 最终椭圆形的光束聚焦于流动室的检测区 样本流中的细胞经过流动室中的检测区时, 椭圆形的激光束即可检测到 ( 信号 ) 包括: 细胞的散射光, 激光以及细胞上标有的荧光染料发出的荧光 ( 二 ) 流动系统采用鞠流原理, 控制标本流的最高速度使细胞在鞠液中单个排列, 并形成一个很细的稳流 革自液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过检测区, 从而确保每个细胞通过照射区的时间相等, 这样才能得到准确的细胞荧光信息 ( 三 ) 光学系统和电子检测系统 1. 光学系统检测细胞样本流中的细胞经过流动室中的检测区时, 椭圆形的激光束即可检测到 ( 信号 ) 包括: 细胞的散射光, 激光以及细胞上标有的荧光染料发出的荧光 1 前向散射光 : 激光束上的低角度散射光被称为前向散射光 (FS), 主要反映细胞的大小 2 侧向散射光及荧光 : 与激光束成 90 收集的散射光信号称侧向散射光 (SS), 主要反映细胞的颗粒特性, 用于检测细胞膜 胞质 核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒 如 SS 可以区分淋巴细胞 单核细胞及粒细胞 除 SS 外, 细胞亦可发出荧光 (FL) 根据所应用的试剂, 这些荧光可以使仪器得到细胞的一些特征, 如 :FL 可以用于确认分子, 像表面抗原等 2. 光的收集, 分光及测量 (1) 前向散射光的收集前向检测器用来收集前向散射光 当有散射光到达前向检测器时, 即会产生电压信号 根据检测器收集到的光信号的不同, 电压信号亦不相同 ( 见 流式细胞技术183 图 15-3) (2) 侧向散射光的收集侧向散射光波长 488 nm, 较荧光强 它是第一个从收集镜空滤片装置中被分离出来的 应用 488 nm 的二向色性长通滤片 (488DL) 在 45 角时, 使前向散射光偏转至 SS 检测器, 同时又使波长较长的荧光通透过去 荧光的收集 :45 角放置的 550DL, 折射波长小于 550 nm 的光至 525BP( 带通滤片 ), 于 FLl 探测器收集 505~545 nm 的光谱, 并使 555~725 nm 的光通透 以此类推, 第二色荧光采用 600DL 及 575BP( 收集 560~590 nm 的光谱 ) 第三色荧光采用 645DL 及 620BP 收集 605~ 635 nm 的光谱 645DL 将 650~725 nm 的光通透过去, 于第四色荧光探测器 (FL4) 收集 660~700 ill 丑的光谱 ( 四 ) 信号检测与处理系统流式细胞仪最多有 6 个检测器, 每一细胞通过激光检测区时都会产生电压脉冲信号 电压脉冲信号反映相应的光强度, 并被接收 流式细胞仪对这些脉冲信号进行放大 调节 整和及分析

191 184 第一一篇峰值信号 : 下图显示一个细胞通过激光检测区所产生的峰值信号 脉冲的高度反映 散射光及荧光的强度, 脉冲的宽度反映荧光的分布, 所以, 总的荧光 ( 强度及分布 ) 实际是 测量脉冲的面积 ( 图 15-5) 该图显示三种总荧光相同但有不同荧光强度分布的细胞所 产生的不同峰值信号脉冲 积分信号 : 因为总荧光强度相同的三种细胞有不同的荧光分布, 脉冲被拟合产生积分信号 积分信号的高度表示总荧光强度, 当细胞出现在检测区时即可测到 对于激光光源, 由于侧向散射光的强度比前向散射光低得多, 因此光电转换器件多选用增益较大的光电倍增管 (photo multiplier tube, PMr) 而非光电二极管 荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的, 荧光波长与激发光波长不同, 因此荧光信号检测需要用光学滤光片去除非荧光信号, 并且检测器灵敏度要高 在免疫学检测中常使用对数放大器, 这是因为在进行免疫学检测的样品中, 阴性群体细胞虽然未被染色但仍有白发荧光, 而阳性群体细胞的特异性荧光强度比白发荧光强数借到数十倍, 使用对数放大器可以同时分辨出亮度差异大的多个细胞亚群, 容易选定不同亚群间的分界点, 利于流式细胞仪的分析和分选 同时, 流式细胞仪为了避免两种荧光发射光谱重叠 ( 图 15-2) 而导致的假阳性结果, 采用了荧光信号补偿的做法, 实际上是用电补偿功能来处理有关光谱重叠的问题, 补偿减去不适合荧光通道测定的重叠信号, 这使得流式细胞仪 免疫学技术分作为干扰光被检测器 1 检测到了, 被机器当成了 FITC 荧光信号分析 因此, 流式细胞仪必须通过计算减除这一部分干扰信号 同样, 在 PE 荧光的检测通道里, 检测器 2 又检测到了 FITC Eω 和配 5 的荧光信号, 这一部分干扰信号也必须被减去, 才能保证结果的准确性 Beckman - Coulter 公司的 EPICS- XL 流式细胞仪配套开发的 EXFD32AI 汇软件全面考虑到四色信号之间的相互影响, 利用逆矩阵精确计算, 去除了重叠信号的干扰 而一般的流式细胞仪所采用的数学相喊的补偿方法, 只能去除相邻的信号干扰, 如在 FITC 的 FIFe PE Ecd Pes 的准确性更高 在 FITC 绿色荧光的检测通道里漏进了部分 PE Eω 和 pes 荧光, 这一部 nM 图 15-2 囚色信号之间的相互重叠干扰现象

192 185 第II 备床应用胞技术流式细胞技术的 荧光通道里, 只能去除 PE 荧光的干扰, 对 Eω 和 PC5 的干扰却无法去除, 而 ECD 和 PC5 的干扰是客观存在的, 它会直接影响 FIπ 信号检测结果 ( 五 ) 细胞分选使所要分析的特定细胞从细胞群体中分离出来 细胞分选的技术己 经有了很大提高, 目前所用的细胞分选装置和原理基本相同, 都采用液滴偏转技术 具体 原理如下 : 把液滴形成信号在压电晶体上使之产生机械振动, 高频振动使液柱断裂成一连 串均匀的液摘, 一部分液滴中包有细胞, 当液滴将要从液流上断开的时候要给液流充电, 液滴在断开后也会带有同性电荷 下落的液滴通过一个由平行板电极形成的静电场, 带 正电荷的液滴向负极偏转, 带负电荷的液滴向正极偏转, 不带电的液滴垂直下落 据此可 将选定的带有特定电荷的细胞分离到指定收集器内, 完成细胞的分类收集 ( 六 ) 数据贮存和计算机控制系统数据的贮存采用列表排队 (list mode) 方式 其优 点在于可以保存己有原始数据, 便于对某一参数进行后期统计分析, 可以将所需要的数据 提到一个图中进行分析, 增加了分析的灵活性, 为临床数据的综合评价提供了方便 所菊一一一口一.FCM 常规检测中的样品制备主要有两种制备方法 : 一种是直接标记法, 取一定量的待测细胞, 直接加入荧光素标 i 己的抗体, 孵育 15~60 mi 口后, 用 PBS(pH7.2 ~7.4) 即鞠液洗涤两次, 再加入 PBS 适量混悬, 待上机检测 优点是操作简便, 结果准确度高, 减少了间接法中存在的较强非特异性荧光的干扰, 适合于同一细胞群的多参数同时测定, 适用于临床标本的测定, 但试剂的戚本较高 另一种是间接标记法, 取一定量的待测细胞, 先加入特异的一抗, 反应完全后洗涤除去未结合的抗体, 再加入荧光标 i 己的二抗, 上机检测复合物标 i 己的荧光素受激发后所发出的荧光强度 优点在于二抗应用广泛, 戚本低, 适用于进行科研标本的测定, 缺点是特异性差, 操作繁琐, 不适合测定细胞数较少的标本 二.FCM 在免疫学中的应用传统的定性及子工法定量的免疫学测定己经不能满足临床诊断及治疗的需要 近年来, 随着免疫学技术的不断进步, 流式免疫技术迅速发展起来, 成为免疫学的一个分支学科, 从细胞表面抗原的检测到细胞内染色 癌基因蛋白及膜受体的定量测定, 该技术己成为临床多种疾病诊断 治疗及预后评价不可或缺的一个手段, 也使得该技术在中等以上医院迅速得到推广应用 (~) 淋巴细胞及其亚群的测定淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群, 机体正常的免疫功能是由机体各淋巴细胞亚群的相互作用来维持的, 在免疫应答过程中, 末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群, 当它们的数量 功能或之间的比例异常时, 可导致免疫紊乱而引起一系列的病理变化, 引起疾病的发生 淋巴细胞亚群的检测对研究有关疾病的发病机制 病程进展 治疗及预后均有重要的意义 目前认为与淋巴亚群改变相关的疾病主要有自身免疫性疾病 免疫缺陷性疾病 变态反应性疾病 病毒感染 恶性肿瘤 器官移植物排斥反应等 FIα4 可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原, 通过对不同淋巴细胞亚群数量的测定来监控病人的免疫状态, 指导治疗 测定方法是直接荧光标记法, 标记抗体是双色或三色荧光标记, 操作简便, 准确快速 由于流式细胞仪将忏十五章流式细

193 186 第一一篇静态的 显微镜下肉眼观察改为动态的计算机信号处理, 因此, 在流式细胞仪上 T 细胞亚群统计方式己从传统的荧光显微镜下计数 200 个细胞发展成为几秒钟内计数上万个, 因此结果更真实, 更具有统计意义 临床上常用来观察的指标有 : J, 成熟 T 淋巴细胞的标志 ;ωj c 町 CDs + ;m3 + c 时, 白介素 2 受体的标志, 即激活 T 淋巴细胞 ;ω3-, CD(~ 山 ), NK 细胞的标志 ;CDA CD+ 20, B 细胞的标志 ;m 二, 活化 B 细胞的标志 健康人外周血 T 淋巴细胞亚群的参考范围为 : CD 3 + : 61 % ~ 85 % ; m3 + m 4 + m s - : 28% ~58%;C 町 ω 七 4- :19% ~48%;ωJ 's+ :0.9~2.0 ( 二 ) 临床意义 1. ω'4+ CDs+T 细胞减少 见于 γ 免疫球蛋白缺乏症 胸腺发育不良 严重联合免疫缺 陷病 2.ω's+T 细胞增多见于肿瘤及病毒感染 (HEV α 町 EBV) 等 3.ωJ CDJ 比值异常在某些疾病的急性期 活动期和病变严重侵犯器官时, 比值及亚群会发生明显的变化, 而当治疗好转和疾病恢复时各指标也可恢复正常 对于施行器官移植手术后病人的免疫监测,CDi; 高于正常 5% ~1O% 表明即将或者己经发生了排斥 反应, CD4 + CDs + 比值下降则提示有并发凶险感染的可能, 若比值小于 0.2 则必须停用免 免疫学技术疫抑制剂 3. T 细胞亚群在传染病监测中的应用艾滋病是一种由于感染了人类免疫缺陷病毒 (HN) 而导致的获得性免疫缺陷综合征即 AII 疤, HN 侵犯人的辅助 T 淋巴细胞 (Th), 发病后病毒在 Th 细胞内繁殖, 引起细胞洛解破坏,Th 数量显著下降, 各免疫器官随之受累, 最终造成全身免疫功能下降, 从而引起各种继发感染和肿瘤而导致死亡 目前, 全世界的艾滋病感染者正在迅速增加, 成为当今威胁人类健康的主要杀手, 现在尚缺乏有效的治疗方案, 因此对感染者进行 Th 数量及 CD4 CDs 比值的有效监测己成为 一项重要的常规监测 在 2003 年春天发生的非典疫情中, 由于病人的各种实验室检查中没有较特异的指标, 据卫生部临床检验中心 SRAS 培训 的报告显示, 病人 T 细胞亚群的变化是很明显的, 运用流式细胞仪检测患者全血细胞亚群的变化有助于疾病的诊断和预后判断, 这也充分证实了 Fα4 的临床应用价值 ( 四 ) 淋巴细胞亚群在器官移植排斥反应监测中的应用器官移植后的排斥反应是当前困扰器官移植的最主要问题, 移植后受体体内免疫系统的变化是一个极其复杂的过程, 有多种因素如遗传 移植物与受者的组织相容性 感染以及免疫抑制药物等等都会对其产生影响 因此, 移植后用 Fαf 监测血液或移植物内免疫成份的变化有很大提示意义, 如 J T 细胞 NK(ωl:CD~) 细胞的数量增高, 均提示存在排斥反应的可能性, 还可以通过这些指标的检测来监测治疗效果和移植物存活的情况 ( 五 )T 细胞亚群用于其他功能性疾病分析流式细胞仪便捷 准确, 可以用来对自身免疫性疾病进行检测与疗效观察 Sill 病人的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度, 活动或非活动性 SLE 伴有多系统疾病但无肾脏损害的病人可出现 m ms 比值升高, 伴有严重肾脏损害的 SLE 病人可出现低 CD4 +, 高 CDs + 的现象

194 第十五章另外, CD23 表达的增加与变态反应性疾病 自身免疫性疾病 肾病综合征有关, 而且阳 性率与病情严重程度呈正相关, 治疗有效后 CD2~ 细胞减少 二.FCM 在肿瘤学上的应用 (~)DNA 含量测定及细胞增殖周期分析 1. 细胞增殖周期分为 Go G j S G2 M 期 s 期是 DNA 合成期, 在 S 期内, DNA 进行复制, 使细胞的 DNA 含量由 2 倍体 (2C 46 条染色体 ) 变为 4 倍体 (4C) 0 Gj 和 G2 期为 DNA 合成前 后问期, 此期无 DNA 的合戚, 但 RNA 和蛋白质进行合成 M 期为有丝分裂期, 在此期一个细胞分裂为 2 个细胞 细胞内的 92 条染色体分裂成 2 组 46 条染色体, 使每个 细胞内具有 46 条染色体 在 M 期分裂成两个子细胞之前, G2 和 M 期细胞的 DNA 含量均 为恒定的 4C o M 期以后部分细胞进入 Gj 期, 继续进行增殖, 部分细胞进入 Go 期, 即静止期, 不再继续增殖 因此, Fα4 分析一个群体细胞峰 DNAf 音体与细胞周期时, 将 DNA 含量直方国分为三部分, 即 Go G j, S, G 2 M 期三个细胞峰 Go Gj 和 G2 M 细胞峰 DNA 的含量成正态分布, S 期细胞峰则是一个加宽的正态分布 2.DNA 含量的测定 在生物细胞中, DNA 含量是比较恒定的参数, 时也含量随着细 胞增殖周期各时相而发生变化 人体正常的体细胞均具有恒定的时也二倍体含量 当 人体细胞发生癌变以及具有潜在恶性变可能的时候, 其发生 发展过程中可以伴随细胞 DNA 含量的异常改变 在细胞增殖周期中, Go G j 期细胞 DNA 含量为二倍体时也含量, 即较恒定的 2C 值 ;S 期细胞的 DNA 含量较二倍体高但低于四倍体, 为 2C~4C 之间 ;G2 M 期细胞 DNA 含量为四倍体含量, 即较恒定的 4C 值 3. Fαf 进行时也分析的原理采用一种特殊的荧光染料与细胞内 DNA 特异性结合, 而这种染料与 DNA 之间的结合必须有一定量效关系, 即 DNA 含量的多少与荧光染料的结合成正比, 荧光强度与 DNA 吸收荧光分子的多少成正比, 荧光脉冲与组方图的通道值成正比, 满足这些条件后, 通过 Fαf 检测荧光染料的荧光强度即可准确定量细胞内 DNA 的含量 4. 时也指数 (DNA index, Dr) 即被测细胞 Go Gj 期荧光强度与正常细胞 Go Gj 期荧 流式细胞技术187 光强度之比 当 Dr 二 1 时, 表明被测细胞为二倍体, 细胞未发生恶变 ; 若 Dr>1 则说明为超二倍休,Dr<1 则为亚二倍体, 这两种情况均称为非整倍体 大量临床实验表明,DNA 非整倍体细胞是恶性肿瘤的特异性标志 它的出现可以是肿瘤发生的标志 ; 对己经确诊为肿瘤施行手术后的患者而言, 则提示有复发倾向 ; 若肿瘤患者的 DNA 非整倍体消失, 则表明患者病情完全缓解, 有好转倾向 由此可以看出, 通过对体细胞 DNAf 音体的定量检测, 既有助于对肿瘤患者作出早期诊断, 又有助于评价药物的疗效及肿瘤患者的预后及复发 FMC 在肿瘤学上的应用主要是利用 DNA 含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出, 化疗指导以及预后评估等 大量工作表明, 癌前病变的癌变率与病变的增生程度一致, 而增生程度与 DNA 含量的异常改变又呈平行关系 Fαf 通过精确定量 DNA 含量, 能对癌前病变的性质和发展趋势作出判断, 有助于癌变的早期诊断 时也非整 f 音体的出现可能是恶变细胞的重要标志, 目前病理学尚无法从癌前病变中

195 188 第一一篇发现癌变和即将癌变的细胞, 而 Fαf 检测中时也非整倍体细胞的出现可作为一个有价值的参数 DNAf 音体分析有助于临界性肿瘤的诊断, 如卵巢的交界性肿瘤, 异倍体的出现与病变的恶性发展有关 细胞异常增殖和分化障碍是肿瘤细胞的特性, DNA 含量不仅能非常敏感地反映细胞代谢的异常, 而且能通过 DNAf 音体分析, 细胞周期各时相细胞比例分析并结合细胞抗原的表达多参数分析, 全面了解细胞的生物学行为, 从而有助于肿瘤的诊断, 选择治疗方案和预后判断 时也异 f 音体, 高 S-PHASE 细胞比值和高增殖细胞核抗原 (PCNA) 表达与细胞增殖能力, 恶性程度和不良预后呈正相关 ( 二 ) 为治疗方案和药理学研究提供依据不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感程度是不同的, 可以利用 Fαf 进行细胞周期分析, 适当选用周期特异性药物或非周期特异性药物 MDR 是由多药耐药基因编码的 p 糖蛋白 (PGP) 是亲脂化合物, 包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵, 从人淋巴细胞排出荧光染料与细胞内因 P 的含量直接相关 当淋巴细胞出现 MDR 阳性细胞时, 病人对化疗药物开始出现耐药性, 需要考虑其他治疗方式 ( 三 ) 活细胞内活性酶的检测资料显示, 活细胞内活性酶的分析可以应用在许多医 免疫学技术学领域 根据酶的活性可以鉴别不正常细胞, 酶的活性也会因为受到药物作用而有所改变, 因为酶的活动牵涉到细胞的新陈代谢, 所以测量细胞内酶的活性能够提供许多细胞进展的讯息, 包括活化 分化 调亡 成熟和增殖等 传统上应用的测定细胞中酶活性的方法 ( 如 fluorometri c 及 colorimdtric assays), 都是测定总体细胞的总酶活性而非测定单一细胞的酶活性 若要测定单一细胞的酶活性, 通常都是涉及固定后的死细胞 近来 ωiul1er 公司推出了最新的技术及试剂 cellprobe reagent, 由于每一个特定的酶都有其专一的受质, 而受质本身是由特别的化学品与荧光染料 flourer 配 em 或 rhodamineno 共价结合的, 能迅速进入活细胞, 当其遇到特异性酶时, 其共价结构会被酶破坏而释放其荧光染料, 从而能够被 Fα4 检测到 因此, 活细胞酶探针能够用来测量单一活体细胞内酶的活性 ( 四 ) 凋亡细胞检测凋亡最初是作为形态学概念被提出来的 细胞有两种不同的死亡方式, 即坏死 (necrosis) 和调亡 ( apoptosis) 调亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离, 细胞质浓缩, 细胞膜和核膜皱曲, 核断裂形成片断, 最后形成数量不等的凋亡小体 利用 Fαf 可以进行 DNA 断裂点标记检测 时也片断可以从细胞内漏出, 导致 DNA 含量减少, 利用 Fα4 进行 DNA 含量分析, 通过二倍体细胞 Go G] 期峰前的亚二倍体峰未确定 在调亡早期, 一些与膜通透性改变及调亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达, 例如 FAS 基因蛋白 (CD95 ) 线粒体膜蛋白山回 127) 磷脂酷丝氨酸 (ANNEXIN - V) 0 pα4 结合单 克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞, 从而确定细胞的调亡情况 ( 五 ) 对肿瘤基因蛋白产物的测定随着分子生物学和免疫学的发展及对肿瘤病理学和药物治疗的深入研究, 发现某些肿瘤的基因蛋白产物与肿瘤的发生 转移 药物疗效和预后存在密切关系 临床上目前最常用的较成熟的有 :P53 bel - 2, Fas, FasL 自 1 P170 等 P53 属于抑癌基因, 它与肿瘤的关系较早受到人们的重视, 而且是研究最广泛 最系统的抑癌基因之一 P53 蛋白分为野生型和突变型 野生型 P53 可以参与调节多种基因

196 学过程, 实现其抑制肿瘤发生的作用 野生型 P53 的丢失和突变, 使其正常功能丧失而成 为突变型 突变型 P53 蛋白具有致癌作用, 近期研究发现, 大多数恶性肿瘤, 如结肠癌 肺 癌 乳腺癌 肝癌 食道癌 白血病等等都存在 P53 突变基因, 肿瘤病人标本通过 FCM 检测 均可发现异常 P53 蛋白的过量表达 P170 又称为多耐药基因 p 糖蛋白, 是近年来肿瘤耐 药性研究的分子基础 大多数的研究表明, P 糖蛋白表达处于高水平的肿瘤病人, 其疗效 差, 对化疗不敏感, 缓解率低 P21 是原癌基因 ras 的蛋白产物, 是 ras 基因发生点突变而 产生的异常蛋白, 研究表明它可参与多种肿瘤的发生, 在乳腺癌 胃癌中都可发现有自 1 的过度表达 Fas 又称 Apo -1, 即 m95 分子, 目前研究认为, FasL 是死亡因子, Fas 则是它 的受体, 是细胞表面的一种跨膜蛋白, 当一个细胞的 FasL 与另一个细胞的 Fas 结合时, 可 导致表达 Fas 的细胞凋亡 Fas - FasL 是一对介导细胞凋亡的膜蛋白, 因此与肿瘤等多系 统疾病的发生 发展密切相关 bcl- 2 是抑癌基因蛋白, 当病人发生肿瘤时, 其表达的阳 性率下降 四. 流式细胞仪在血液学上的应用 (~)Fαf 在血小板功能评价方面的应用 血小板是巨核细胞分化成熟后, 巨核细胞 浆裂解脱落的小块细胞质 其表面富含糖蛋白和一些酶, 是血小板表面特异性吸附的血 浆成分, 也是血小板粘附 聚集的反应部位 血小板膜上含有多种与凝血有关的因子, 在 止血 凝血和维持血管内皮的完整性方面具有重要的生理基础 血小板膜糖蛋白 (GP) 是 参与止血, 血栓形成的重要分子基础, 这些膜糖蛋白是一类重要的粘附分子 随着血小板 膜蛋白特异性单克隆抗体的产生, 对血小板进行免疫荧光标记, 用 Fα4 分析单个血小板 或血小板亚群, 能从分子水平诊断血小板功能和数量的异常 GP 是血小板膜糖蛋白检测 分析方法的重大发展, 方法简便 快速, 标本用量少, 灵敏度高, 结果准确 与血小板有关的抗原检测的临床意义包括 : 1. 诊断遗传性血小板功能缺陷疾病巨血小板综合征 (ESS) 患者血小板 CD42Aω 咄 复合物先天缺陷, 于阴性对照, ω61 代偿性增加 FCM 中表现为 m42a l=j m42b 不仅严重缺乏, 而且其平均荧光强度显著低 血小板无力症 (Gf) 患者 FCM 表现血小板 GPIIb, IlIa (ω'41' CD61 ) 明显缺乏, ω42a 和 ω 咄基本正常或稍高, 并可出现异常血小板亚群 2. 血栓性疾病和血栓前状态的判定由于活化血小板是血栓的主要成分之一, 也是, 是细胞增殖周期的一个调控点, 参与细胞周期 细胞凋亡和 DNA 损伤修复等生物 189 第胞技术的转录 十五章流式细引起血栓形成的主要原因, 所以血小板活化程度增高与疾病发生发展有关 m62p ;f 口 ωω 是活化血小板最特异最灵敏的分子标志物, 正常人血小板只有低水平活化, 外周血 CD62P 只有 3%~5% 有文献报导糖尿病伴有微血管病变 冠心病 高血压病 高血脂病 脑血栓形成 脑动脉硬化患者活化血小板百分率和绝对数显著高于正常人 ; 而糖尿病无微血管病变 无周围血管病以及深静脉血栓形成患者 ii5 化血小板水平与正常人无显著差异 PICA 后 24 小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄的患者 ω'62p 和 ω'63 增多, FCM 可用于检测 PICA 后急性缺血再发作的危险性 3. 血小板减少性疾病这类疾病往往存在免疫机制血液中存在抗自身血小板的抗

197 190 第一一篇体, 用 Fα4 可检测 P 且剧 P 且 β1; 血小板抗体 IgG 的量与血小板减少呈负相关 ( 二 )Fαf 在 PNH 诊断上的应用阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (PNH) 的发病机制为 X 染色体上的 PIG-A 基因发生突变, 引起糖化肌醇脂 (GPr) 锚合成障碍, 使 GPI 锚连蛋白缺乏 利用流式细胞仪检测 PNH 血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂 (GPr) 锚连接蛋白如 DAF(ω55 ) 与 MIRI(ω59 ) 并以此来确诊 PNH, 这一方法比传统的血清洛血试验具有更高的特异性与灵敏度 己证实的 GPI 锚连蛋白有 10 余种, 用于 PNH 诊断的主要为 ω55 和 CD59 两种, 如果在红细胞或白细胞上出现 CD55 或和 CD59 的减少, 可诊断为 PNH o ( 三 )Fαf 在白血病诊断上的应用 1. 白血病的免疫分型免疫分型是利用单克隆抗体检测白血病细胞膜表面和胞浆内抗原, 分析其表现型, 以了解被测白血病细胞所属系列及其分化系列, 它是研究白血病分化抗原和诊断白血病的重要手段 白血病分类是选择化疗方案和判断预后的重要依据 由于血细胞在其分化的不同阶段, 承担不同功能时有不同的特征抗原表达, 因此 Fα4 结合单克隆抗体可以提高白血病分类诊断的符和率 根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原, 可将它分为 B 细胞系 T 细胞系 髓细胞系 红细胞系和巨核细胞系, 可确诊白细胞的分类和分期, 并可探明慢粒急变时的细胞来源 2. 白血病及淋巴瘤免疫分型在正常血细胞从多能干细胞分化 发育 成熟为功能 免疫学技术细胞的过程中, 细胞膜 细胞浆或胞核抗原的出现 表达增多与减少甚至消失和血细胞的分化发育阶段密切相关, 而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性 因此, 这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础 白血病是造血系统的恶性肿瘤, 虽然在形态上变化相当大, 但仍能表达正常血细胞所具有的抗原, 因而仍可依据其抗原的表达语对白血病进行免疫分型 由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特征, 其抗原表达又不完全同于正常血细胞, 常可出现某些抗原缺乏 过度表达 系列交叉表达某一系列或阶段不应有的抗原, 这又增加了白血病免疫分型的复杂性 近年来, 白血病淋巴瘤的免疫分型己成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一 早年曾用过的荧光显微镜或 APAAP 方法基本被废弃 国际上公认的通用方法是流式细胞术 (Fα1)0 pα4 白血病免疫分型是利用荧光素标 i 己的单克隆抗体 (MeAb) 作分子探针, 多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型, 由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度 因为 Fαf 能快速 多参数 客观地, 定性又定量地测定细胞膜 J 良 核的抗原表达, 并且至今尚未发现白血病淋巴瘤的特异抗原, 所以能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型 这基于白血病形成的分化阻断学说, 即白血病细胞基因异常, 分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病 这群细胞充盈于骨髓, 抗原表达与其相应系列阶段的血细胞无明显差异 单参数免疫标志测定与形态学检查相似, 仅能根据数量的差异来判断病变细胞的属性, 易将正常细胞包括在内 因此, 近年来主张用设 n (gatir 鸣 ) 方法, 即用 CD45 与侧向角 (side sea 仕 er, SS), 对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋 巴细胞 单核细胞 成熟粒细胞 幼稚细胞和红细胞群 其理论依据是 CD45 是所有白细胞的抗原, 其表达量在淋巴细胞最高, 单核细胞 成熟粒细胞 早期造血细胞 (blasts) 依次减弱, 红细胞 ( 中 晚幼红细胞 成熟红细胞 ) 不表达 CD450 SS 反映细胞的颗粒性, 成熟粒细 胞 SS 最高, 依次为单核细胞 淋巴细胞 blasts 和红细胞 以 CD45 SS 双参数, 对数取样时

198 第十五章即可把各细胞群区分出来 若同时加上一个, 二个甚或三个荧光标 i 己的单抗, 则很容易识 别非正常细胞群所表达的抗原 这样可以排除正常细胞的干扰, 在幼稚细胞百分数低的情况下或检测残存白血病时尤为必要 Fα4 分析白血病免疫表型时, 测量细胞数量一般在 ~ 细胞之间, 而且快速 特异 准确, 重复性好, 能区分细胞起源, 划分其分化发育阶段等, 对白血病的诊断与分型, 治疗方案选择与预后判断, 发病机理研究等有重要价值 3. Fαf 白血病免疫分型的临床意义骨髓血细胞是形态学分型的基础, Fαf 白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化, 国际白血病 MIC 分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的, 对下列情况意义更大 :1 用形态学 细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病 ;2 形态学为急性淋巴细胞白血病 ( 且上 ) 或急性未分化白血病 (AUL) 但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记 ;3 混合性白血病 ;4 部分髓系白血病 ; 目前, 免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难 ;5 慢性淋巴细胞白血病 ;6 微小残留白血病 4. 免疫分型常用的免疫标志及其意义 (1) 白血病系列分化抗原 1T 淋巴细胞白血病 :CD3 m 5 m70 ( B 淋巴细胞白血病 :ω10 ω19 ω220 3NK 淋巴细胞白血病 :ω16 ω 元 ω570 4 髓系白血病 :m13 ω14 m33 旺 ( 髓过氧化物酶 ) 5 红白血病 :GlyA( 血型糖蛋白 A) 6 巨核细胞白血病 :CD41 CD42 CD610 (2) 白血病系列非特异性抗原 m34 HlA -DR 为早期细胞抗原, 无系列特异性, 可 与 CD38 联合运用于免疫分型 一般而言, 干祖细胞 m 二 团 A-DR+ ω 斗, 原始细胞 流式细胞技术191 丰且 λ DR+ ω 斗, 而幼稚细胞 ( 如早幼粒细胞 ),;;,HlA- DR CD 斗 (3) 白血病分化阶段抗原 1T 细胞抗原 m4 m80 2B 细胞抗原 :ω10 Cy,μ( 胞浆 μ 链 ) SmIg( 表面膜免疫球蛋白 ) CD38 和 Cylg( 胞浆免疫球蛋白 ) ω11co (4) 白细胞共同抗原 CD45 为白细胞共同抗原, 但原幼细胞表达量比成熟淋巴细胞低, 幼红细胞不表达 用 SSω'45 PerCP 双参数分析可十分容易地鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞 用两个系列或阶段特异性 McAb 加 CD45 进行三色免疫荧光染色, 经 FS SS, McAbl - FIE McAb2-PE CD45 Perα 五参数分析, 可特异地分析原幼白血病细胞的免 疫表型而不受成熟细胞的干扰 5. 白血病及淋巴瘤免疫分型 (1 )A 岛 1L( 图 15-3) ( MO Mo blasts 有低的 SS 和 FS 在 ω'45 - ss 图上出现在淋巴细胞位置上, 至少表 达一个特异性标志, 如 CD13 或 ω116, { MfD 比 CD13 与 CD33 更灵敏 一般淋系标志阴性, 但也可表达 C~ 或 CD4 Mo blasts 一般 HlA -DR ω 且阳性, 有些研究表明 C~ 与 CD34 共 0

199 192 第一一篇CD14 建 ι...~, 由 - E JJ r 吨 2 月, 二 ;ifiit 4., CD 咽 表达在 A 岛仕且预后差 ~ CD14 f CD14 f 二锵 te ~l II 飞 吨 ~:.:.: -..E 如 f:ftz 也 Ti 二二二争相 FFL HLADr...,.' ot""~. '," ", 如知 l 剑恒... HLADr CD14 HLADrd叫叶革 F 号 :: 早年也古CD14 图 15-3 急性髓系细胞白血病 CD14 j f:!?!?j 亨 'N ZZ FL ( M1 流式上 M1 与 MO 相似不易区分, M1 一般 ω4 CD 丰 HlA -DR-, 但 ω 且表达 免疫学技术少于 MO, 可能表达部分 ω150 (.M2 MO 与 M1 的主要区别是成熟度增加,blasts 减少, CD15 较 M1 较显著,ω 且弱于 M1, CD13 有时表达强于 ω33, 多数病例 HlA -DR ω'45 - ss 图显示从髓系 blast 区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带, CD45 - ss 图有助于确定 blasts 比例 (M3 高颗粒性, 具较高的白, 但 ω45 较成熟 C 少, 多数情况且 A-DR 或表达减 少, CD 到少于四 一般 ω13 弱 ( + ), 可有 ω2 表达 5M4 与 M5 两型表型相似, 但 M4 较 M5 表达更多的 CD 二, 较之 MO M1, M4 与 M5 有更大的 FSS 和出, CD45 - ss 图上, 成熟 C 出现在单核区, 重要的表型为 ω13 ω33 HlA -DR CD14 和 CD15, CD33 可表达强于 ω13, 主 CD 二 二很可能为师, 但只出现在少数病人中, 部分 M5 可见 CD~o ( M6 M6 较少见且特征不明显, 一般 HlA - DR, CD34 CD13 CD33 阳性, ω'45 - ss 图显示主要为红系成份 ( M7 巨核细胞白血病, 在 AML 中少于 1% 一般 ω61 (Gp III a) 和或 ω'41 (Gp II b 田 a) 阳性, 而注意由于血小板粘附在 blasts 上造成的假阳性, 可以用流式双色分析在 E 囚 A 存在下, 测 piib 田 a 与 ω 且以减少激活血小板的粘附 (2) 且上且上是儿童中最常见的恶性肿瘤, 约占全部肿瘤的 25% 在成人, 且上约占急性白血病的 25%, 我们将 ALL 分为 B 祖细胞型 (ω4 或 ω 川 前 B 细胞型 B 细胞型和 T 细胞型 1B 祖细胞型 ALL 在幼儿约占 ALL 的 65% ~70%, 青少年为 55% ~60%, 成人为 50% 在儿童, 约 90% 病例 CD1~' 在幼儿只有少于 50% 的病例 CD1~, blasts 一般 FS ss 1~ 少, 是 FAB 标准的 L1 或 L2, 一般 TcIT+ HlA - DR+ ω 斗, 此型又分为 2 个亚型, ω 斗和

200 193 第CD19 十五章CD19 胞技术ω 中, 前者预后好, 多数病例 斗 ω 二, CD20 表达随成熟度增加而增加, B 祖细胞被定义 为 slg 0 2 前 B 细胞型且上 ( 图 15-4) 此亚型约占儿童且上的 25%, 细胞一般为 ωl 4 且 λdr, 胞浆 ω 二 ω 斗, TdT 随 CD20 变化, CD34 多为阴性, 前 B 亚型被认为比 B 祖型预后更差, 这与 t (l ;19) 出现相关并由此产生 E2A - PBXl 融合蛋白, 它的表型为 ωl LCDJ, 不同程度 CD20 表达, CD 二, 确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例 CD34 CD5 CD34 CDs CDl9 CD34, "'-..-: 唱....: 咽....-r 号 i 图 15-4 急性 B 系细胞白血病 CD5 3 B 细胞型 AI 上成熟 B 细胞型 AI 上约占 ALL 的 2%~5%, B 细胞型 AI 上较之 B 祖 细胞型 ALL 有更大的 FS 和出, 在 ω'45 - ss 图上出现在淋巴和单核细胞区域, 即 FAB 标 准的口, 表型为 CD19 吼 ω22 CD24 且 slg( 多数为 I 圳 ) ; 多数病例 ω1~ 0 { 旦成熟抗原及 slg { 吏之区别于更早的 B 系 ALL, 极少数成熟 B 细胞 ALL 无 FAB- L3 形态 ( T- ALL( 图 15-5) 多数病例有大的 FS 白, 在 ω'45 - ss 图上可能出现在淋系未 成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区, 多数表现为胸腺亚型, 最常见亚型为皮质晚期 表达, m1 CD2 CDs C~ m4 CDs 双阳与极少膜表面 CD3 TdT 多为阳性 另一常见亚型 为皮质早期表达 CD2 CDs C~ TdT 强表达 髓质期亚型表达 ω2 ω5 C~ 与 CD3+ J JCDJ, 很少见 TdT 表达 前 T 细胞亚型表达 C~, 胞浆 ωj 且无其他 T 细胞抗原, T 细胞肿瘤的特征是丧失 T 细胞抗原而表现出其他异常抗原组合 5 杂合型白血病 随着流式技术的广泛应用, 我们发现许多病例并不能被严格划分 为淋系或髓系, 真正的双表型病人多为 t(9;22) 或 (l lq;23), 现在杂合型的误诊率很高 最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞, 过度强调弱的非特异性结合, 忽略了 某些抗体缺乏系特异性 最重要的系特异性抗原在 B 系 T 系 髓系分别为 m22 ω3 和 岛怔吃 ) CDs CDl9 (3)α 仕由于慢性期显著的细胞分化, 在 ω'45 - ss 图上除了髓系细胞占主导外, 只 显示一个正常骨髓像, α 仕可确诊, 如有 PhI 即 t ( 9 ; 22) ( q34 ; qll ), 它可形成新的杂合 饵 ' 流式细

201 bhutaa咛hladrpbhutaa咛c~p194 第一一篇BCR-ABL 癌基因, 其产生的一段 8.5kb 异常, RNA 可编码一个 KD(P21O) 的融合蛋 白, 使正常的造血细胞转变为 α 仕细胞, 该产物可用 PeR 扩增后用标记探针在流式细胞 仪上检测, 这种分子流式技术正在研究中并将使流式技术扩展到分子领域 d 国 F nu--anu--a 4J4 CD45F 肘,1: 峭可 :.~ 号 -..: 各 I. A. IthmF 明川, WZJa - 町, 'O r CD45 HLADr C~ HLADr E 江 ADr 免疫学技图 15-5 T 系细胞急性白血病 α 但起病与发展相对缓慢, 慢性期持续 1 年左右, 最终发展为加速期和急变期 流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值, 直接影响到治疗效果 急变期 α 仕主要表现为髓系, 1 因为淋系, 髓性急变可表现为多种形态, 包括未分化细胞 ; 淋性急变具典型形态特征, 为 ω1~b 祖细胞 ALL; 极少有 T 细胞型且上 术(4)CI 上 CI 上细胞主要为较正常淋巴细胞稍大的小淋巴细胞 免疫分型主要为 : S 胁 1, SIgD 弱表达, B 系抗原为 ω19 却 ω43 m 与 ω5 共表达, 3 表达使得 Cll 区别于帽细胞淋巴癌 MU, 即 (Cll: 二, MCL: 二 ), ω 牛 二 CDllc ;f 口 CD2S CD20 常弱表达, 尽管 Cll 起病慢,{ Cll 病人的生存率变化很大, 有染色体异常的病预后不良, 最常见的三联体甘 isonyl2 14q, 13q, llq, 免疫表型上没有特异的变化, 而免疫表型的变化并不是提示染色体异常 最近, 有研究表明, 三联体 trisonyl2 与 SIg CD20 表达量高度相关, 与 CD2~ 相关, 与 FMC7 相关 B 型前淋巴细胞白血病 (B- Dll) 较 α 上更为严重, 流式细胞技术在区分 B-DI 上和 C 且上发挥恨大作用, B-DLL 多为 CDs-, 二, 表达更强的 slgo MU 病人平均生存率不超过 5 年, 与 α 上在形态上很难区分, 与 C 且相似, 有 ω's+ B 祖细胞, 但 slg 表达强于 C 且, 且 ω 二 另一与 C 且难于区分的是 FCC, 细胞为强 slg C 町 m 斗 CD2~, 具 B 系表型 对于诊断为 Cll, ωs, FMσ CD22 与 slg, CD20 异常强表达的病例我们要考虑是否为 DLL MCC 或 Cll 的亚型 ( 甘 isomyi2), 因为它们危险性更大 (5) 淋巴瘤流式技术在淋巴瘤诊断中起重要作用, 标本多取自淋巴结或细针穿刺 (Fl' 也 ), Fl' 也获得的标本用免疫分型作诊断可免除病人昂贵的手术过程, 是细胞形态学诊

202 E--rL'川断重要的辅助手段, 诊断特异的淋巴瘤便于有效的抗体组合, 因此流式多参数分析极有价 值 此外, 许多淋巴瘤和白血病表现出一些特征性的抗原密度改变, 如 CllSU 中, CD20 减 少, HCL 中 ω 到增加, slg 在 SI 上中密度下降, 而在 FCC 中密度上升 流式定量技术同样具 有重要意义, 流式技术可对单个细胞的 DNA 含量作定量分析, 确定处于不同细胞周期的 各群细胞数 由于染色体改变而产生的异结体细胞数亦可被检测到, S 期细胞数对特定 淋巴瘤的诊断具重要意义, 流式还可通过检测 Ki - 67 表位的表达确定增殖群体, Ki 67 增殖相关抗原在最近的研究中显示与两种预后不好的非霍奇金瘤有关 ( 图 15-6) CD A :! 静 BLAMBDA '齿''叮唱,,. -u., let --'J C CDl9.. CD5 UJHF D CD22 CD22,:4 柳 毡, 15-6 典型的 B 细胞淋巴瘤 KAPPA (6)MCL: 帽细胞淋巴瘤为 B 系肿瘤, 表达 CD19, 却 ω22 CD43, 入比 κ 更多见, 19D 弱或阴性, 多数病例 ωj ω 二, 通常 m10 阴性, 但有时与 ms 共表达 CD s+ ω 旦 Ig 的类 别有助于使 MCL 区别于 F 配 Ig 轻链的表达, 胁 4 ~~ 19D CD2; m20 更强的表达有助于使 CD2D MU 区别于也 LSll 缺乏 ω li e ω1ω, 一般 二, 使之区别于 HCL o KAPPA F 195 第十五章流式细胞技术图 免疫分型与形态学及临床结合可把 MCL 与其他淋巴系肿瘤区分开, 这一点很重要, 因为其他肿瘤是低分级而 MCL 不是, 平均生存率少于 5 年, 治疗并不乐观 MCL 与特异的基因改变相关 t(ii;14)(qi3;32), 导致原癌基因 BCL-l PRAD-l 重排, 过度表达 eycli nd l 蛋白, 见于约 50% ~60%MCL, 并可通过 PCR 扩增检测到 当病人 ;, BCL-l 重排, ω 斗, CD 中, 预后不良 PRAD - 1 eyclind l 是 MCL 高度灵敏的特异性 分子标志, 用透膜剂处理细胞后用流式多参数分析方法检测 eyclind l 是一个极好的诊断 技术, 可能会优于分子学方法 尽管 eyclind l 过度表达是 MCL 敏感特异的指标, 但其水平与临床表现并无相关性 有研究表明 P53 过度表达与疾病进程相关, 可以应用于流式多参数分析 (7)HCL 毛细胞型白血病 HCL 少见, 但却是较易辩认的 B 系淋巴细胞增生性疾 病 瘤细胞一般表达 B 系抗原 ω19 CD20 CD22 ω 砚, 且为 slg +, 重链多为剧和盼 slg 中度表达, 经常 CDs-, ω 牛 CD 出 CDllc ;f 口 CD22 强表达 ω5 中度表达, 免疫表型提示是一 个晚于 Cl 上和 PLL 的发展阶段, 基因重排分析支持这一结论 粘膜淋巴细胞抗原 CD103 是 使 HCL 区别于其他 B 系白血病的最可信的标志 ω103 表位属整合素家族, 同时在粘膜相 关 T 细胞和某些激活淋巴细胞上表达, 流式细胞仪应用这一标志物可发现骨髓微小残余

203 196 第一一篇免疫学技术病变, 且灵敏度在 1% 以下 (8) 外周 T 细胞肿瘤与胸腺型 T-AI 上和原始淋巴细胞型淋巴瘤不同, 这组疾病是 以外周 T 细胞亚型为特征的, 主要为 m3 与 CD4 或 ms 共表达, 这些肿瘤多表达 α 自或 ν 四 T 细胞受体, 尽管肿瘤以 CD4 + 和 CDs + 两种为主, 但 CD4 与创并不能作为系特异性标志, 有些变异的亚型, 特别是丧失全部 T 细胞抗原的亚型在这组疾病也很常见 许多过去称为 T- C1 上, 但其中大多数如今可进一步分类 某些研究认为, 最常见的是胸腺后期亚型 T-P1 上, 约占此类疾病的 1 3, 病人表现为白细胞增多症 ( 白细胞数经常大于 100 X 10 9 L) 脾肿大 淋巴结病, 免疫表现为 ωj, J, CD;, ωj, 多数为 CD4-, 's, 但偶尔也可有町 CDs 共表达, CDs 单独表达的极少 ω'4+ CDs - 表型疗效好 T-P 且较之 B-P1 上更严重 我们认为, 大颗粒淋巴细胞白血病 (LGL) 较 T-P1 上更常见, 细胞典型形态为大颗粒淋巴细胞, 轻至中度淋巴细胞增多常伴有中性粒细胞减少, 常见两种亚型, T 细胞型 (T LGL) 表达 C 鸟, 弱 ω's, CD2 和一些 NK 细胞标志如 CD16, m 坷, ms70 多数 CD 牛, m;, m;, CD 4 -, m 二这些病例常表现出 T 细胞受体基因重排且与类风湿性关节炎显著相关 ; 另一较少见的亚型为 NK 细胞型 (NK- IβL) 表达 CD2, CD56, '16, 多数无 ω'3' CD4, 1CRα 自, CD: 乌 8 和 CD 血小板喊少等症 J 状快 O 所有亚型多进展平稳, { 但旦 ω'3+, CD 叫 j ; 变异型 T-1 皿 βl 较为凶险 O 阳和 SS, 都为 CD4+ 也表达 ω2 C 鸟, CDs ω7 有时也阴性, 很少有 CDs 表达 缺乏 异常表型和特异形态表现, 使诊断难度增加,1CR-~ 基因重排有助于区分淋巴瘤和其他 良性疾病 新的分子学方法有助于诊断和监测微小残余病变, 岛 1F 和 ss 占表皮淋巴瘤的 绝大部分, 其余的多为 B 系和 T 系细胞混合性淋巴瘤 尽管罕见, 但有报道岛 1F 和 ss 病 人中发现 T 系细胞白血病病毒 I II (HILV)o 成人 T 细胞淋巴瘤白血病, 与 HILVI 相关, 具有激活的 T 细胞表型, 表达 1CR, C 鸟, CD4, C 鸟, 因 A-DR 以及强的 CD2S, 细胞多为 ωλcds-, 流式细胞技术, 还可检测到 粘附分子 L- selecti 日的异常过度表达 P53 异常也与疾病进程有关 Lennert' s 淋巴瘤也是 CD4 + 外周 T 细胞淋巴瘤, 形态学上与霍奇金瘤难于区分 根据 我们的经验, 霍奇金瘤是良性的 ωj 小淋巴细胞, 所以除非 Lennert' s 淋巴瘤表达出异常 的 T 细胞抗原组合, 否则流式的鉴别诊断作用恨小 其余一些未分类的表达外周 T 细胞表型的淋巴细胞白血病, 在所有病例中不到 1% 形态学上细胞类似典型的 CLL, 但临床上疾病进程更为凶险, 多数病例 J, CDJ, ωj, m;, CD4 +, 极少 CDs + 这些可能是 T 细胞的 C1 上, 但是却表现出不同的临床进程 我们 建议分类独立于 C1 上 由于形态学及免疫表型上的重叠, 外周 T 细胞肿瘤难于鉴别诊断, 基因学方法有助于 区别低级与高级分类, 必须在多方法结合的基础上进行诊断 区分不同型的外周 T 细胞 肿瘤非常重要, 不同型对治疗反应不同, 分型有助于指导治疗, 并决定是否进行骨髓移植 (9) 大细胞淋巴瘤 LCL LCL 淋巴瘤占成人淋巴瘤的 40%, 在儿童中占 30% 成人 80% 是 B 细胞, 而在儿童 L 也平均分为 B 细胞 T 细胞及不确定型 约 40% 病例为 ω O 免疫表型有助于确诊 LCL o T 细胞型较其他两型严重, S 期部分增多预示病程凶险 LCL

204 第十五章多见与 B 细胞表型相关的 BCL-6 基因重排, 且预后好 (10) 霍奇金病霍奇金病是一种区别于其他肿瘤的恶性肿瘤, 在形态上可确认的肿 瘤细胞不足 1%, 多数为炎症细胞, 所以多数病例在流式上只有非特异显示 限制了流式 在霍奇金病中的应用, 对 R-S 细胞的研究难度很大, 有报道 T B 细胞表面标志及 T 细胞 受体, lg 的基因重排, 在一项研究中, 发现具 B 细胞免疫表型的霍奇金病患者 R-S 细胞 ω 马, 有重排的 VH 基因 对具结节性硬化 淋巴细胞缺失 混合细胞型的霍奇金病人的 免疫表型研究发现, CD ω 元 ω;, 且多 ω 斗, 有些病人可用 ω15ω 到双色分析确定 Reed - sternberg 细胞, 但灵敏度很低, 半数病例表达 T 细胞表面标志如 ω2 ω3 ω'4' B 细 胞表面标志如 CD19, CD20, CD 平在这一亚型极少表达 结节淋巴细胞为主的霍奇金病被认 为是 B 细胞型的, 此型 R-S 细胞表达 CD20 B 异性丁链 CD4S, 但不表达 CD30 C~O'ωm 可在 R-S 细胞表面发现细胞激活标志如 CD2S HlA -DR 和 ω 存在, 在抗原表达细胞出 现的 B7-1 B7-2, 是 T 细胞 CD28 和 CIlA 斗的配体, 在 R-S 细胞上可见表达, 属于 1NF 受体超家族的 CD40 在 R-S 也有表达 除对 R-S 细胞免疫表型的研究外, 流式对霍奇金病的研究只显示以 T 细胞为主 ( 主 要为 CD4 ) 的混合成份 有报道, 在富含 T 细胞的 B 细胞瘤病人可见 ω8 为主, 这种变异 性 LCL 尽管形态上与富含淋巴细胞的霍奇金病相似,{E! 需不同的治疗 6. 微小残留病变检出 ( 岛但 D) 和化疗效果的监测 (1) 检测微小残余病变 ( 岛但 D) 岛但 D 是白血病复发的主要根源, 对岛但 D 进行早期监测, 可避免复发, 延长缓解期 Fαf 以其高特异性与敏感性, 可以在患者缓解期检测是否有残存病变细胞, 早期探测岛但 D, 以避免复发 主要采用散射角与肿瘤特异性抗原荧光 标志相结合的多参数组合, 分析灵敏度在 ~ , 不排除单个抗体即可做出特 异诊断的情况, 如抗体与儿童期 AI 上 (l lq) 细胞上独特的表面蛋白结合 如果采用固定及透膜技术, 流式还可检测胞内抗原, 可供检测的组织包括骨髓 外周血 脑脊液及其他体液 依赖异常免疫表型的表达来检测肿瘤细胞需要清楚正常免疫表型表达的情况 正常 流式细胞技术197 人 TcIT 通常只在处于胸腺的 T 细胞及有限的骨髓细胞内表达, 而 AI 上和原始淋巴细胞淋 巴瘤表达 TcIT, 因此如在外周血和脑脊液发现 TdT 阳性的细胞, 可认为是瘤细胞 0 多数 B 系 A 且表达 TcIT ω19 m 10, 一小部分表达 CD 抖, 这些标志的任意组合加上某 些异常标志如 CD 13 ω 刀 m 1S 即可将 AI 上细胞与正常骨髓与外周血细胞分开 诊断 T AI 上时可应用 TcIT 与 T 细胞表面标志如 C 鸟, CDs 加上胞浆 CD3 的组合, 该方法的灵敏度 可达 92%, 特异性表达 75% 在 A 岛仕包括 CD34 CD 56 在内的多种标志组合, 表达 TcIT, 共 表达淋系抗原 ( 如 ω7 CD 19 ) 与散射光及抗原密度, 可确定 AML 诊断的灵敏度 有关慢性淋巴细胞增生性的疾病资料很少, 用流式双参数分析检测 FCL 灵敏度可达 1% 以下 采用的标志包括, ω103 m22 共表达, m 11e 和 m 19 的强表达, CD 19 和 CD2S 的强表 达, FCL 的 ω11e 的表达强度为 CLL SSL 的 30 倍, CD2S 为 6 倍, 这些双参数为 FCL 特有, 其 中 ω103 和 CD 平共表达特异性最强 流式可鉴 i 多外周血和骨髓的 α 上, CDs 与 CD20 或 ω 19 共表达, 具有 κ 和入轻链的吗可使微小残余病变的检测灵敏度达 5% 以下 应用町 ω 到或 ω19 κ 和入进行三色分析, 可使检测灵敏度达 1% 以下 体外 MRD 的检测灵敏度

205 198 第一一篇是否具有诊断意义, 是一个重要的问题 多项研究表明, 多参数流式分析是评估岛但 D 的快速 准确 经济且可对疗效进行预测的理想方法 (2) 评估肿瘤对治疗的反应这是流式细胞仪另一项新的应用 根据不同肿瘤的生物学作用, 设置不同的参数, 流式可检测多药耐药蛋白 (MORl) 或者 p 糖蛋白 (PgP), 它可将化疗药物泵出细胞并传递耐药性 由于流式可定量并进行多参数分析, 它对 MOR1 的检测优于传统免疫组化染色和应用配 R 技术检测 MOR1 的 m 卧忱 一旦化疗药物进入细胞即会产生杀伤作用, 主要是诱导凋亡, 所以另一新兴领域是研究抗凋亡与化疗疗效之间的关系 BCL-2 和 P53 蛋白是癌细胞凋亡的特征性分子, 可用流式检测 P53 在血液疾病的作用, 主要是在时也损伤的情况下 ( 可为化疗药物所致 ) 调控细胞周期与调亡 bcl- 2 是基因家族 (B 血豆和 bcl- X) 的一员, 是另一个重要的调亡调控点, 可增强或减弱细胞对调亡的敏感性 bcl- 2 可阻断化学治疗剂诱导的白血病细胞凋亡 Fas 受体与 Fas 配体结合后, 也可调控凋亡 应用流式多参数分析可以评估细胞凋亡的状态 应用活细胞染料 Hoechst 无需破膜可检测细胞凋亡 同时, 可检测凋亡早期膜的特异性改变 磷脂眈丝氨酸改变可用 Annexin - v 或者 MC540 检测 流式多参数分析可同时分析细胞周期和早期凋亡, 因为 Hoechst 和 MC540 是活细胞染料, 所以分选 免疫学技术后的细胞可做进一步研究 五.F'α4 对 HlA- B27 的检测有证据表明外周血 HlA- B27 的表达及其表达程度与强直性脊柱炎的发生有很大程度的相关性, 利用流式细胞仪可以进行且 A-B27 且 A- B7 双标记, 来检测 HlA- B27 阳性细胞, 同时排除交叉反应 六.F'α4 用于细胞因子的检测细胞因子 ( cytokines, 口也 ) 是指由免疫细胞 ( 如单核巨噬细胞 T 细胞 B 细胞 NK 细胞等 ) 和某些非免疫细胞 ( 如血管内皮细胞 表皮细胞 成纤维细胞等 ) 经剌激而合戚 分泌的一类参与调节多种生理功能和细胞功能的生物活性物质, 其本质大多属于小分子多肤或 糖蛋白, 它作为一种细胞间信号传递分子, 主要介导和调节免疫应答及炎症反应, 剌激造血功能, 并参与组织修复等 因此, 对细胞因子的研究, 有利于在分子水平上探讨疾病的病因及发病机制, 以及使用相应的细胞因子对某些肿瘤 自身免疫性疾病 造血功能障碍 感染等进行治疗 对某些疾病状态下细胞因子的检测和研究仍是医学研究的热门话题 由于细胞因子只有在细胞受到某种剌激的状态下才能产生, 其检测是一个比较复杂的过程, 随着抗细胞因子单抗的发展, Fαf 法与以往的许多方法相比有着快速 简便 可以同时检测细胞表面抗原 进行多参数分析等优点, 大大提高了医学研究的广度和深度, 使许多疾病的治疗取得了可喜的进步 自 20 世纪 70 年代流式细胞仪成型以来, 历经 20 多年的发展, 应用流式细胞仪的意义越来越得以体现, 尤其是 1982 年以后, 白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展, 为流式细胞仪的应用发展提供了强大的推动力 在我国, 许多科研单位早在 20 世纪 80 年代就己经开始使用流式细胞仪作为其科研工具 ; 进入 90 年代后, 以库尔特原理及其相关血细胞分析产品闻名的美国库尔特公司, 以其在流式领域研究和应用方面近二十年的积累, 在其五代流式细胞仪的基础上推出了以单激光同时激发四色荧光的新一代临床型流式细胞仪, 并为其配套了临床标本制备仪, 使临床标本制备标准化 简单化, 开

206 199 第1. 常用流式临床项目及意义概述胞技术创了流式应用的新领域 从而, 不少大中型医院也逐步引进流式细胞仪作为临床诊断的 辅助工具, 随着单抗技术 计算机技术及其他相关技术的不断发展, 流式细胞仪将会在应 用领域得到不断的开拓, 成为科研与临床不可或缺的重要手段 附录 淋巴细胞亚群分析 项目指标细胞亚群 ; J B 淋巴细胞总 T 细胞 T 辅助诱导细胞亚群 J J T 抑制细胞毒细胞亚群 J J 4 T 细胞毒细胞亚群 ; J 兰 T 抑制细胞亚群 J J 主 辅助细胞诱导亚群 J J '45 队 + 抑制诱导细胞亚群 NK 细胞 j t NK 细胞 i 舌化 T 细胞 CD2s, CD69, 因 λdr m 山 T 系 CD lo, CD22 B 系 白血病分型 CD".C 口叫 髓系 CD41, CD61, CD42b 巨核系 用 λ DR, TdT 非系列特异性 造血干细胞移植 干中且细胞标志 肿瘤 认倍体分析 让 A 周期 肿瘤预后 恶性程度 药物敏感 十五章流式细肿瘤基因表达 P53 肿瘤基因表达, 与癌症的发生 预后有相关性 多药耐药检测 fvldr 肌 1DR 高表达提示病人对所有化疗药物耐药 移植免疫 T 细胞亚群及活化 T 细胞 CD3, IgG 移植后排异及感染检测 移植前淋巴毒实验 粘附分子 CD 粒细胞吞噬能力与感染控制 '44 变异型肿瘤转移与侵润 变态反应性疾病相关性 高表达与哮哨发生及其严重程度相关 自身免疫性疾病相关性用 λb27 J-llλB7 强直型脊柱炎 小板功能 CD42a, CD42b CD41, CD61 缺乏时为巨血小板综合征 缺乏时为血小板无力症 活化血小板 CD62p, CD63 血栓, 心脑血管疾病 糖尿病伴微血管病变 细胞增殖能力 PCNA, Ki67, Cyclin 系列药敏, 细胞动力学研究

207 ( 续表 ) 项目指标细胞亚群 细胞凋亡 APα.7 ANNEXIN V Bel2 T 丑 λdr L 怔 ~C II 类分子共同抗原 其他 CD 4S 自细胞共同抗原 CDss, CDs9 阵发性睡眠性血红蛋白尿 细胞分泌功能 各类胞浆内细胞因子 2. 流式细胞仪常用荧光染料介绍 荧光染料 激发波长 发射波长 用途 颜色 FITC 488 nm 525 n 日 1 免疫标记 绿色 200 FE ECD 488 nm 488 nm 575 nm 620 nm 免疫标记免疫标记 橙黄橙红 第一一篇PE-CY5 PE-CY7 488 nm 488 nm 675 血口 755 nm 免疫标记免疫标记 红色深红 免疫学技术pi I 488 nm 620 nm DNA 分析 橙红 APC 633 nm 665 血口 免疫标记 红色 PerC>P 488 nm 675 nm 免疫标记 红色 3. 流式细胞仪常用试剂配制 (1) 氯化锻洛血剂 (ammonium chloride lysi 鸣 solution, ) 贮存液 (1 0') : 80.2 g NI-L Cl (1.5 M) 8.4 g N 过 1α)3 (1 00 日品 3.7 g EDfA Na2 (1 0 日品 菜馆水 900 ml 调节 ph 至 7.4 ( 用 1 N HCl 或 NaOH) 加蒸榴水至 1 升 4'C 保存 6 个月以内 工作液 : 蒸榴水 1:9 稀释, 新鲜配制, 冷藏保存 注 :1 贮存液不可小于 10', 否则会形成碳酸锻而失效 2 NaBω3 可由 10 gkhαl 替代, EDfANa2 可由 3.66 g EDfANa4(8.2 tim) 替代 3 有些科研工作者习惯采用 110 浓度的 E 囚叉, 即 1 r 由 1E 口 fa Na2 或 0.32 r 由 f EDfANa40

208 第十五章(2)PBS(phosphate - buffered sali 肘, 磷酸缓冲液 ) 配制.23 g N 过 -[2 罔 '4 ( 无水 ;1. 9 tim) g Na2HfD4 ( 无水 ;8.1 tim) 9.00 g NaCl (154 r 齿 加蒸榴水至 900 ml 若需要, 用 1 MNaOH 或 1 MHCl 调节 ph 至 7.2~7.4 过滤除菌, 4'C 保存注 :1 不调 ph 值, ph 通常约为 有些实验室将 PBS 配成 10' 浓缩液, 用时稀释 3 1% 多聚甲醒 ( paraformaldehyde ) 固定液配制 0.5g 多聚甲醒加入 45 ml 蒸情水中, 加 4 r 世 ION 的 NaOH, 加温至 65'C, 待粉末完全洛解 ( 通常在 30 mi 且以内 ) 后, 加 5 ml lo 'PBS, 调节 ph 值至 7. 斗, 0.2mm 滤膜过滤除去未溶颗粒 注 :4'C 可保存 2 周 ( 的用氯化锻洛血剂的洛血方法 1 100ml 全血加 2 ml 氯化锻洛血剂, ~ 昆匀 2 避光孵育 1O ~15 min o 3 离心, 去上请, PBS 洗 2 次 4 抗体染色后, PBS 洗 ( 1 ml1 % 多聚甲醒固定,2'C 直至上机检测 (5) 血小板活化检测 1 将 100 ml 全血加入 1 ml 1% 冷 (2~8'C) 多聚甲醒中 (100 ml 全血至少可做 20tests) ( 2'C ~8'C 固定 30 mine 固定的血小板可保存 5 天 ) 3 抗体染色前, 1200 g 室温离心 5 min o 4 去上请, PBS 洗 1 次, 1 r 址 PBS 重悬 流式细胞技术201 5 取 50 ml 重悬液, 加适当抗体, 避光孵育 15~20 min o 6 加 1 ml1 % 冷 (2~8'C ) 多聚甲醒,2~8'C 避光 30 mi 口, 但不可超过 24 h o 6) 先染色后固定 1 5ml 全血加入适当抗体, 避光孵育 15~20 min o 2 加 1 ml1 % 冷 (2~8'C ) 多聚甲醒,2~8'C 避光 30 mi 口, 但不可超过 24 h o 注 :1 抗凝剂可选用 EllA 或拧棱酸纳, 但不能用肝素, 因肝素对血小板有剌激活化的作用 2 染色或固定应在采血后 lo mi 口内进行 3 先固定后染色可降低血小板的白发活化, 避免标本处理过程中的人为活化, 然而有些血小板活化抗原, 如 PAC-I, ω'62p 等在固定剂的作用下会失 j 舌, 造成表达率的降低, 因此需要先染色再固定 年 Shattil 町等的经典方法 : 采血时掌心朝上, 轻扎或不扎止血带, 肘前静脉采血 先弃除最初的 2 ml 血, 然后再来 4.5 ml 血入含 0.5 ml 3.8% 拧棱酸

209 202 第一一篇免疫学技术铀的抗凝塑料注射器内, 采血后 lmi 口内, 将 5 m! 血加入含 50 m!pbs 和适量抗体的标本管中, 孵育 15 mi 日, 500 m! PBS 稀释, 上机检测 (7)PI 染液配制生理盐水 32.4 m! PI 2.5 rug Rnase 0.5 rug Triton - X m! 拘梅酸纳 50 rug 加蒸榴水至 50 r 世 4'C 避光保存数月染色方法 :106 细胞中加入 1 m! PI 染液, 避光染色至少 30 mi 口, 上机检测 (8)ID 染液配比方法甲四事 1 m! IDlrug( 储存液 ) 工作液 : 储存液用 PBS 1: 稀释染色方法 : 5 vi 全血加 50μlID 工作液染色 20 min, PBS 复容至 1 r 址, 上机检测 阴性对照 5μl 全血加 l m! PBS (9) 破膜细胞的 GFP 和时也含量检测 试剂 :1 X PBS 2% 多聚甲醒 70 % 冰乙醇 PI 储存液 (l rug m! in PBS) RNA 酶 A 12 X 75 流式管涡旋振荡器 3 7'C 水浴箱方法 : 用多聚甲醒固定细胞 1 计数细胞 2 放 106 细胞到 12 X 75 管中, 2~8'C 以 300 g 5 min 用 PBS 离心洗涤一次 3 弃上洁, 加入 500μ1 PBS, 轻轻混匀 加入 500μ If 令 2% 多聚甲醒, 混匀 2~8'C 1 h 时 用乙醇破膜 4 同上离心洗涤一次 边振荡边加入 70 % 冰冷乙醇 2~8'C 过夜 5 离心, 去上请, 加入 1 m! 含有 40μg m! PI 和 100μg m! 的 RNA 酶 A o 3 7'C 避光孵育 30 min o 过网后上机 参号文献 1 龚非力主编. 医学免疫学. 第版. 北京 : 科学出版社, 朱立平, 陈学清免疫学常用实验方法北京 : 人民军医出版社, 2000

210 203 第328 十五章流式细胞技术250 3 丛玉隆, 王丁等. 当代检验分析技术与临床. 北京 : 中国科学技术出版社, 沈霞, 李稻. 临床免疫学与免疫学检验新技术. 北京 : 人民军医出版社, 林学颜, 张玲. 现代细胞与分子免疫学 北京 : 科学出版社, Janeway C, et al. lmrnunobiol 咱,.5th 时, Current BioI 咱, Ltd, 曹雪涛. 细胞因子研究的现状与发展趋势. 中国肿瘤生物治疗杂志, 1995, 2(3) :175~181 8 TedderτF, Zhou L, Engel P.The CD19 CD21 singal transduction complex of B lymphocytes.lmrnunology Today, 1994, 15(9):437~442 9 Arne N.Akbar, Mike Salmon. Cellular environments and ap 口 ptosis: tissue microenviroments control activated T cell death.lmrnunol 唱 y Today 1997, 18: 72 ~ Craig B. Th,αnpson.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995, 267: 1 456~ 杨镇. 肿瘤免疫学 武汉. 湖北科学技术出版社, Takamizawa S et a!. Overexpression of Fas - ligand by neuroblastαna: a novel mechanism of tumor - cell killing.j Pediatr S 山 g, 2000, 35(2) :375~ Rostaing L, τkaczuk J, Durand M, et al. Kinetics of intracytoplasmicτbl and Th2 cytokine production assessed by flow cytometry following in vitro activation of peripheral bl d mononuclear cells. CYtometry, 1999; 35 (4): 318 ~ 14 唐志琴, 黄繁, 韩锋, 等. 系统性红斑狼疮患者表达 IFN γ 和 1L- 4 的 CD4 + 和 C[ 石细胞的变化. 上 海医学检验杂志, 2003, 18(1) :24~25 15 李富荣, 庄俊汉, 蔡文虹, 等 系统性红斑狼疮患者 η11 Th2 淋巴细胞类型与疾病活动指数的相关性. 中华风湿病学杂志, 2001, 5(4) :216~ O'Neil- Andersen NJ, L3\ 盯 ence DA. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab lmrnunol, 2002, Mar; 9(2) :243 ~ 17 Nagy G, Pallinger E, Antal - Szalmas P, et a!. Measurement of intracellular interferon - gamma and interleukin - 4 in whole bl d T lymphocytes rem patients with systemic lupus eryrhematosus.lmrnunol Le 仗, 2000, Nov 1; 74(3): 207~210

211 三篇临床免疫学检验第二篇 临床免疫学检验 第十六章 肝脏疾病的免疫学检测 所菊口病毒性肝炎一. 各型病毒性肝炎及病毒感染标志物的检测 (~) 甲型病毒性肝炎甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒 (HAV) 引起的一种以肝实质细胞炎性损伤为主的传染性疾病 HAV 属于小卧性病毒科的肝病毒属 ( hepatovirus), 为单股 RNA 病毒 其颗粒为圆球形, 直径 27~32nm, 无包膜, 呈二十面体立体对称 在电 204 第镜下, HAV 颗粒可分为空心与实, 心两种 其中实, 心颗粒为成熟的病毒颗粒, 由衣壳蛋白 和 RNA 基因组构成 ; 而空心颗粒为不完整的病毒颗粒, 仅含衣壳蛋白而不含核酸 甲型肝炎主要通过粪口途径传播, 摄入含有 HAV 的食物后, HAV 从胃肠道侵入, 经血行运输到达肝脏 病毒通过表面受体进入肝细胞, 开始在肝脏内复制, 复制出的新的 病毒颗粒从肝细胞释放到胆小管中, 随胆汁排泄聚集到胆囊, 最后进入肠道随粪便排出体 外 甲型病毒性肝炎是一种急性自限性疾病, 预后良好, 极少转为慢性 发病潜伏期一般 在 4 周左右, 一般于发病前两周开始从粪便排出病毒, 潜伏期末至发病初期排出病毒量达 到高峰 黄瘟出现后或 ALT 升高到峰值时排毒量逐渐下降, 故患者就诊时粪便中的 HAV 颗粒或甲型肝炎病毒抗原 (HAVAg) 检出率较低 新近发展的核酸分子杂交技术 per 技 术等分子生物学可对 HAV 卧业进行检测, 虽大大提高了检测的灵敏度,{E! 操作过程繁琐, 实验条件要求较高, 临床实际应用较少, 主要用于科研 目前临床诊断甲型肝炎的常规检 验方法为血清学方法 1. 抗 HAV 胁 f 甲型肝炎黄瘟出现时即可测出该抗体, 滴度很快升至峰值, 常在 3 ~6 个月转为阴阳个别可超过 1 年 ) 抗 HAV 刷阳性意味着患者处于甲型病毒性肝 炎的急性期, 是甲型肝炎早期诊断最简单可靠的血清学标志, 是区别急性感染和既往感染 的有力证据, 在临床诊断中常作为主要的必不可少的检测项目 在慢性乙型肝炎或自身 免疫性肝病患者血清中检测到抗 HAVIβf 阳性时, 需排除类风湿因子及其他原因引起 的假阳性后, 方可判断为 HAV 重叠感染 接种甲肝疫苗后 2~3 周, 8% ~20% 的接种者 可产生抗 HAV 胁 抗 HAV IgG 抗 HAV Ig( 王是保护性抗体, 一般于感染 HAV 后 3~12 周在血清 内出现滴度逐渐上升, 至 6 个月时达高峰, 然后缓慢下降, 可在体内存在 10 余年甚至终忏

212 第十六章生 抗 HAV IgG 单份血清阳性表明受过 HAV 感染, 机体具有免疫力, 主要用于流行病学调查, 是判断人群 HAV 自然感染强度和甲肝疫苗人群免疫效果的主要指标 如果恢复期抗体滴度较急性期增高二三 4 倍, 可诊断为 HAV 近期感染, 但由于该方法不能早期 迅速诊断甲型肝炎, 因此目前临床上己较少应用 ( 二 ) 乙型病毒性肝炎乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒 (HBV) 引起, 通过血液传播的肝炎 HBV 属嗜肝 DNA 病毒科 HBV 在电镜下可见有三种形态 大小不同的颗粒, 即 : 小球型颗粒 管型颗粒和 Dane 颗粒 其中前两者是由于病毒颗粒包膜产量过剩而形成的, 只有空心病毒包膜, 而不含病毒核酸, 无感染性 而 Dane 颗粒则为完整的具有感染性的病毒颗粒, 直径为 42 nm, 由包膜和核衣壳组成 核衣壳直径为 27 nm, 内含病毒核酸 HBV 基因组为部分环状双股 DNA, 由正链和负链组成, 负链为长链, 呈闭合型的环状 DNA, 正链为短链, 呈半闭合型的环状 DNA, 全长为负链的 50% ~75%, 与负链以碱基配对方式结合成双股 DNAo 长链 生豆链的 5' 端位置是固定的, 通过正负链的 5' 端的粘性末端互补, 短链的 3' 端长度可长可短 HBV 负链 DNA 有 4 个开放读码框区 (open readi 鸣 frame, 盯), 分别为 S C P 和 X 基因区 S 基因区由 S Pre- ~ 和 Pre 乌区组成, 分别编码 S 蛋白即 HBsAg 前 Sj 蛋白和前乌蛋白, 其中 S 蛋白是 HBV 的外膜蛋白, 是 HBV 感染后的 第一个血清学标志 c 基因区主要编码 HBcAg 和 HBeAg o 其中 HBcAg 是 HBV 的结构蛋白, 是核衣壳的重要组成部分, 为病毒颗粒装配的必需, 用常规技术无法在血清中检测到, 但在急性或慢性 HBV 感染病人的肝脏能检出 HBcAg o 而 HBeAg 不是 HBV 的结构蛋白, 不是病毒复制所必需, 不插入到病毒颗粒表面, 而是分泌到细胞外进入血循环,HBeAg 可在具有高滴度病毒的病人血清中检出 P 基因区是 HBV 基因组最长的开放读码框区, 它除了包含全部的 S 基因区外, 还与 C 基因区和 X 基因区部分重叠, 其编码的 p 蛋白具有 DNA 多聚酶 逆转录酶和卧也酶 H 活性, P 蛋白在整个 HBV DNA 复制过程中起重要作用 血清 HBVDNA 多聚酶阳性为 HBV 复制和有传染性的标志 x 基因区编码乙型肝炎 X 抗原 ( 田丛 g) 0 f 面丛 g 具有反式激活 HBV 基因的作用, 增强 HBV 基因的复制和表达 ; 同时还有反式激活细胞内原癌基因 (0 日 cage 川的作用, 可能与肝癌的发生有关 我国是乙肝的高发区, 因其对广大人民群众的身心健康带来的严重危害, 乙型肝炎的各种基础和临床研究一直备受关注 在乙型肝炎的诊断方法上, 分子生物学方法不断被 肝脏疾病的免疫学检测205 采用, 其中应用定量 PeR 方法检测患者体内病毒时也含量等方法被越来越广泛地应用于临床 而目前临床应用最广泛 实用性最强的依然是血清学免疫学方法 1. 乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) HBsAg 阳性为 HBV 感染的金标准, 但不能反映病毒复制 传染性及预后 血清 HBsAg 出现于 ALT 升高前 2~8 周 急性患者多自旨在 4~6 个月内清除 HBsAg; 若血清中 HBsAg 持续存在超过 6 个月, 意味着感染慢性化 临床意义如下. (l )HBsAg 是 HBV 感染的特异性标志, 但并不肯定意味着疾病或传染性 见于 :1 急性乙型肝炎的潜伏期或急性期 2 无症状 HBsAg 携带者, 慢性乙型肝炎 3 HBV 相关性肝硬化或肝癌 4 多次接受输血的血友病患者 血液透析患者及白血病患者等 (2)HBsAg 含量的多少及持续时间长短与病情轻重 肝功能转氨酶活性的高低无直接关系, 因乙型肝炎的发病及病情轻重主要由感染 HBV 后机体的免疫反应状态来决定 (3)HBsAg 阴性并不能完全排除 HBV 感染, 约州的患者在肝炎症状开始前 HBsAg 己

213 206 第三篇临床免疫学检验转阴 若运用 PeR 技术在血请或肝组织中能检测出 HBVDNA, 此可视为 HBsAg 阴性的 HBV 感染, {E:! 较为少见 ( 的临床上, 不能仅依据 HBsAg 一项来判断体内 HBV 的感染状态, 必须结合其他血清标志物的结果来综合分析 (5) 当肝细胞内出现 HBV 整合基因后, 可出现持续的 HBsAg 表达现象, 故无症状 m sag 携带者及慢性乙型肝炎患者很难通过药物治疗将 HBsAg 转阴 (6) 临床上, HBsAg 检测尚用于筛选供血员 孕妇普查及疫苗注射前普查等 2. 乙型肝炎表面抗体 ( 抗 HBs) 抗 HBs 是 HBsAg 相应的抗体, 为感染 HBV 或接种乙肝疫苗后产生的中和抗体, 是对 HBV 保护性免疫指标 自旨在体内存在相当长的时间, 为体液免疫中效果最好的抗体之一 临床意义如下 : (1) 血清中抗 HBs 阳性一般反映出 V 的过去感染, 是一种对 HBV 感染具有免疫力的标志, 故主要见于 : 乙型肝炎恢复期,HBV 既往感染者 注射乙肝疫苗后获得保护性免疫力 (2) 抗 HBs 的效价与保护作用成平行关系, 效价越高, 维持时间越长 其效价的高低一般用 RIA 法定量测定较好 抗 HBs 阳性具有保护性的标准为 : 二三 10 miuml o (3) 部分 HBV 感染者在 HBsAg 转阴后, 血清 HBVDNA 仍可检出, 且与抗 HBs 阳性并存, 经过一段时间后, HBVDNA 才转阴 故抗 HBS 出现并不意味 HBV 即刻清除 ( 的抗 HBs 如与 HBsAg 同时阳性说明 :1 抗 HBs 产生早期 2 HBV 的 S 基因变异或为两种不同亚型 (5) 我国是 HBV 感染高度流行区, 抗 HBs 阳性者较为常见, 大部分均同时伴存抗 HBc 阳性, 且抗 HBs 的效价也较高, 可能与抗 HBc 检测试剂灵敏度和阳性判定标准等因素影响后产生的抗 HBc 假阳性有关 3. 乙型肝炎 e 抗原 (HBeAg) HBeAg 是一种可洛性蛋白抗原, 由 HBV 基因组 C 开放读码框中的前 C 区所编码, 一般仅见于 HBsAg 阳性患者的血液中 HBeAg 在血中 jg 于 HBsAg 出现而早于 HBsAg 消失 临床意义如下 : (l)hbeag 与 HBV DNA 密切相关, 是临床上表达病毒复制较实用的血清标志物 HBeAg 阳性反映出 V 活跃复制 传染性较强, 故临床上常作为抗病毒治疗效果考核及 HBV 感染者传染性强弱评估的重要指标 :1 HBeAg 阳性的 HBsAg 携带者 ( 母亲 ), 所产新生儿易受 HBV 感染 2 生活上与 HBeAg 阳性的慢性 HBsAg 携带者密切接触的易感者, 易被传染 3 易感者被 HBeAg 阳性血液污染的针头刺伤后, 易发生 HBV 感染 (2) 急性 HBV 感染者 HBeAg 仅存在于感染的早期, 病变极期后 HBeAg 消失, 若 HBeAg 持续阳性 8~ 1O 周以上, 则预示有发展为慢性 HB 飞 Ag 携带状态的可能 1 HBV 感染过程中, HBeAg 随 HBV 复制而增加, 活跃的 HBV 复制可激发免疫应答致肝细胞破坏, 且 T 升高, 随后 HBeAg 转阴, 所以在 HBeAg 清除之前往往有且 T 升高, 肝功能恶化的表象 一般而言, 经过积极治疗后出现的病变活动被激化的患者, ALT AS[ 较治疗前明显升高后持续时间不长, 自觉症状无明显加重, 少数患者虽可有黄瘟出现, 但 EIL 水平一般不超过正常参考值上限 5 倍, 而且启 TCH 町等指标均在正常范围内; 通常经有效护肝 支持治疗后, 异常肝功能指标将在短期内明显下降或恢复正常, 同时可伴见 HBe 匈转阴 HBVDNA 水平降低或转阴, HBV 复制趋于静止, 最后获得明显的治疗效果 2 仅 HBeAg 阳性, 其余

214 4. 乙型肝炎 e 抗体 ( 抗 HBe) 抗 HBe( 亦可简写为 HBeAb) 是 HBeAg 的特异性抗 体, 通常出现在 HBeAg 消失之后 o HBeAg 消失后, 抗 HBe 出现前有一 " 窗口期 ", 一般不 超过 1 年 临床意义如下 : (l)hbeag 转阴, 抗 HBe 转阳, 大多表明 HBV 复制停止 病变活动静止, 但不能说明 传染性己消失或病情己康复 1 相当一部分抗 HBe 阳性的患者, 血清中仍可检出 HBV DNA, 经过一段时间后才逐步消失 2 前 C 区发生突变的变异株 HBV, 因不能分泌 HBeAg 而在血清中查不到 HBeAg 抗 HBe, 但 HBVDNA 仍为可检出 (2) 抗 HBe 可存在于无症状的 HBsAg 携带者及无活动性的肝病患者中, 若存在于病 变持续活动的慢性肝病患者中, 则病情可能持续发展, 并逐步演变为肝硬化 (3)HBeAg 转阴, 抗 HBe 转阳的过程中, 如果采取的是比较敏感的检测方法 ( 女问伍 IA I 剖, HBeAg 抗 HBe 可以双阳性, 但检测值通常均较低 ( 的部分 HBV 感染者, HBe 匈消失后可以不出现抗 HBe: 1 复制病毒虽己清除, 但无 抗 HBe 应答 2 复制病毒一时性减少, HBeAg 消失后再次出现 3 前 C 区变异, 不能编 码合成 HBeAg o 5. 乙型肝炎核心抗原 (HBc Ag) HBcAg 是 HBV 的核心成分, 通常包裹在病毒中, 仅 个别感染者 HBcAg 表位可暴露在病毒颗粒的表面, 肝细胞大量坏死的重症病人, 细胞内 的 HBcAg 才释放入血流 因为 HBcAg 与其相应抗体抗 HBc 易于结合形成免疫复合物, 所以难以从血清中检出 随着检测技术的提高, 利用 EIA 和 RIA 方法可以检出 但是其 检测的结果并不稳定, 所以临床应用价值不如抗 HBc 和其他 HBV 血清学标志物 临床 意义如下 : (l)hbcag 存在于 Dane 颗粒的核心和患者的肝细胞中, 是 HBV 复制的直接指标 (2)HBcAg 可作为疾病传染性和乙肝活动性病变的指标 血清和肝内的 HBcAg 水平 呈正相关, 可互补并协助早期诊断 (3 ) 急性期乙型肝炎早期 HBcAg 阳性和且 T 升高呈正相关, 提示含有 HBcAg 的肝细 胞可能是细胞免疫功能的主要攻击的靶细胞 (4)HBcAg 阳性与 HBeAg HBVDNA DNA 多聚酶阳性相关, 是患者具有传染性的指 标 (5) 可作为抗病毒及免疫治疗的有效指标, 对于疾病的发展及传染性的判断有重要意 义, 对治疗有指导意义 6. 乙型肝炎核心抗体 ( 抗 HBc) 抗 HBc( 亦可简写为 HBcAb) 是针对 HBcAg 的特 异性抗体, 在 HBV 感染早期 (HBsAg 出现 2~4 周后 ) 即可在血中出现 在急性 HBV 感染 消退阶段, 由于此时 HBsAg 己经减少甚至消失, 抗 HBs 尚未出现, 只能检出抗 HBc, 故 将此阶段称为 " 窗口期 " 临床意义如下: (1) 抗 HBc 不是保护性抗体, 不能防止 HBV 的感染, 在其他血清 HBV 标志物转阴后 仍可持续阳性多年甚至几十年, 因而是流行病学调查的良好指标 (2) 高滴度的抗 HBc 表示现行感染, 常与 HBsAg 并存 ; 而低滴度的抗 HBc 则表示 过去感染, 常与抗 HBs 并存 (3)HBsAg 阳性的血清中通常也可检出抗 HBc 阳性, 但是抗 HBc 阳性的血清中并 HBV 各项指标均为阴性者, 应进一步排除盯阳性的影响 207 第学检测十六章肝脏疾病的免疫

215 208 第三篇临床免疫学检验非均可检出 HBsAg o (4) 临床上抗 HBc 阳性检出者较为常见, 其中采用 ELISA ~ 去检测中假阳性率较高 在排除假阳性后, 其临床意义通常为 :1 急性 HBV 感染后的恢复早期, 即窗口期 该阶段 由于抗 HBc 胁 f 阳性, 可能具有传染性 若可长期随访, 终将产生抗 HBs 2 抗 HBc 的被动转移 HBsAg 携带者的母亲所生的婴儿, 可通过胎盘从母体被动转移得到抗 HBc, 从而呈现该指标单项阳性, 此种被动转移导致的抗 HBc 单项阳性可以持续超过 1 年以上 成人也可以由于被动转移而成为抗 HBc 单项阳性者, 见于输注特殊血制品者, 在随访中抗 HBc 单项阳性终将转阴 3 既往感染伴抗 HBs 消失, 此种情况在感染后 多年发生, 且相当少见 4 既往感染伴低水平的 HBsAg o 此种情况患者的血液传染危险 性不大, 但不能排除血液的传染性 7. 抗 HBc 刷抗 HBc I 圳是 HBV 感染早期出现的抗体, 90% 出现在发病第 1 周, 个别迟至 1 个月之后 滴度较高, 恢复期后滴度逐渐下降, 被抗 HBclgG 取代 临床 意义如下 : (1) 抗 HBc 胁 f 是乙型肝炎病毒急性 ( 或近期 ) 感染的重要指标, 在慢性乙型肝炎炎 症活动期也可呈阳性反应 (2) 动态观察抗 HBc 胁 f 有助于判断病情变化 急性乙型肝炎患者病情好转 痊愈 时, 抗 HBc I 圳随同 HBsAg ALT 逐渐下降而转阴 ; 若抗 HBc 刷迟迟不降至正常, 提 示有转为慢性乙型肝炎的可能 (3) 抗 HBc 胁 f 单项阳性不一定代表近期感染, 若同时滴度较高, 则可成为近期感 染的有力证据, 故有鉴别诊断意义 8. 前 S 蛋白 HBV 的衣壳蛋白是由一组 HBsAg 的糖蛋白所组成, 包括 S 前 ~ (PreS] ) 前乌 (Pre 乌 ) 蛋白, 为 HBVDNA 的 S 和前 S 基因的编码产物 前 ~ (Pre~) 由 108 或 119 个氨基酸组成, 其 21~47 月太段是 HBV 与肝细胞的结合位点, 可能与 HBV 侵入肝细 胞有关 前乌 (Pre 乌 ) 由 55 个氨基酸组成, 其在 HBV 附着和侵入肝细胞的机制中起重要 作用 平时临床上所检测的 HBsAg 为狭义的 HBsAg, 单指 S 蛋白, 同样为广义 HBsAg 糖蛋 白组分中的前 ~ 蛋白 前乌蛋白则因为其与病毒的侵入有关, 同样受到了临床的关注 临床意义如下 : (l) HBV 感染肝细胞的第一步是首先侵入肝细胞, 然后才能在肝细胞复制 繁殖, 而 前 S 蛋白在 HBV 附着和侵入肝细胞的机制中起着重要作用 前 S 蛋白同时可以引出和 调节宿主的体液 细胞免疫应答, 对于清除血液循环中的病毒和阻止病毒感染健康的肝细 胞提供重要的防御作用 (2) 前 S 蛋白出现在 HBV 感染的最早期, 甚至在 HBVDNA 出现之前 ; 常在 HBsAg 消 失之前消失, 是病毒清除的最早迹象 若前 ~ 蛋白持续存在, 则将发展为慢性 (3) 慢性乙型肝炎急性发作时, 前乌蛋白常在 ALT 升高前明显升高, 故可预测慢性乙 断 型肝炎急性发作 ; 慢性乙型肝炎 HBeAg 在转换为抗 HBe 前, 前乌蛋白滴度相对较低, 故 可预示 HBeAg 转阴与否 前乌蛋白水平的连续变化有助于急 慢性乙型肝炎预后的判 ( 的前乌蛋白与 HBVDNA 水平具有良好的相关性, 故可作为 HBV 复制的标志

216 第十六章(5) 可作为药物疗效考核的有用指标 如慢性乙型肝炎患者在应用 α 干扰素治疗过程中, 如前 S 蛋白消失, 预示治疗可能有效 ; 如前 S 蛋白持续存在, 则可能治疗无效或者将复发 9. 前 S 蛋白抗体由于前 S 蛋白比 HBsAg 具有更强的免疫原性, 因此出现前 S 蛋白后很快就有前 S 抗体出现 故前 S 抗体是存在于 HBV 感染过程中最早出现的抗体, 在抗 HBe 血清转换后达到高峰值, 但存在时间较短, 一般在急性感染者恢复期中仅持续 6 ~12 个月, 常与其他抗原同时存在 与抗 HBs 通过中和作用预防病毒再感染不同, 前 S 抗体是通过对感染细胞的破坏而清除病毒, 因而同时参与了病变的活动性和免疫清除机制 临床意义如下 : (1) 前 S 抗体阳性表示病毒正在或己经被清除, 提示预后良好 ; 若前 S 抗体迟迟不现, 则意味着预后较差 (2) 急性重症肝炎患者若出现前 S 抗体, 则在一定程度上预示着生机 (3) 前 ~ 蛋白能激活 T 细胞, 故对其他抗体的产生可以起到类似免疫佐剂的作用 10. 乙肝病毒脱氧核糖核酸 (HBV DNA) HBV 时也是病毒的基因组, 其含有 S C P 和 x 四个开放读码区, 分别编码若干蛋白 在急性感染时, 血清 HBVDNA 出现在潜伏末 期至且 T 峰值前, 较 HBsAg 早而短暂 ; 慢性感染时, 血清 HBVDNA 的存在与 HBeAg 大体一致 血清 HBVDNA 是病毒复制的直接标志, 表示血液的传染性和宿主的感染状态, 是临床疗效观察 预后判断的一项重要指标 目前 HBVDNA 的检测主要通过分子杂交和 PCR 等现代分子生物学的方法, 尤其是荧光实时定量配 R 的方法不仅可以定性测出有无 HBVDNA, 而且可以进行 DNA 的定量 但是该指标的检测属于分子生物学的范畴, 技术条件要求较高, 主要用于科研, 临床应用尚不普及 HBVDNAPCR 检测适用于以下情况 :1 HBsAg( +) 抗 HBe( + ) 时, 输血或母婴传播的鉴定 2 HBsAg( + ) 抗 HBe( + ), 未检出 HCV 或 HDV~ 昆和感染的慢性肝炎, 大部分 HBVDNA( +) 3 干扰素或者拉米夫定 (lamivudine ) 治疗后, 判断疗效及是否有复发 4 HBsAg( -) 肝病, 有或无其他 HBV 标志物, 检出其中 HBV 感染者 5 肝移植中, 评估和随访移植肝的 HBV 再感染情况 HBVDNAPCR 检测与传统免疫学检测指标的关系 :1 与出啕检测结果不一致的情 肝脏疾病的免疫学检测209 况见于 :HBsAg 阴性而 HBVDNAPCR 阳性, 可能为 HBsAg 含量低, 或者为 HBV 感染初期 ; HBsAg 阳性而 HBVDNAPCR 阴性, 排除 PCR 试剂灵敏度差的原因后, 血液中的 HBsAg 可能是由 HBVDNA 整合到人的 DNA 后而与宿主基因共表达所致 2 与抗 I 也 s 的关系 : 抗 HBS 阳性, 血清 HBVDNAPCR 一般为阴性, 少部分也可阳性 3 与 HBeAg 抗 HBe 和抗 HBc 的关系 :HBeAg 阳性血洁, HBV DNA PCR 几乎全部阳性, HBeAg 阴性而抗 HBe 和抗 HBc 阳性者, 血清 HBVDNAPCR 阳性率依产物检测方法而不同, 电泳法仅为 30%, 而核酸探针杂交法可达到 80%, {E! 电泳法与核酸杂交法较易于污染, 可能混有假阳性, 仅可用于科研 目前荧光实时定量 PCR 的方法较为灵敏, 且可以解决污染的问题, 基本排除了假阳性 笔者应用荧光实时定量配 R 方法, 统计资料显示小三阳的患者, HBV DNAPCR 的阳性率为 60% ~70% ( 三 ) 丙型病毒性肝炎丙型病毒性肝炎 ( 简称丙型肝炎 ) 是由基因组为一线状单股正

217 210 第三篇临床免疫学检验链 RNA 的内型肝炎病毒 (H 口 T) 感染所引起的一种病毒性肝炎 H 口 7 基因型有 I H 田 E 等亚型, 其中 H 田型在我国最为常见 H 口 7 主要通过注射途径 ( 输血或血制品 毒品 注射 血液透析 器官移植 手术 使用含血清的药物 ) 和非注射途径 ( 日常生活接触 性接 触 母婴传播 ) 传播 HCV 一般通过两种机制造成肝细胞的破坏 : 一个是 HCV 直接的细胞 致病作用 ; 另一个是通过激活宿主的免疫机制而破坏受感染的肝细胞 机体感染 Hα7 后, 约 50% 可转变为慢性内型肝炎, 是原发性肝细胞癌的主要风险因素之一, 若同时合并 HBV 感染则风险更大 目前, 用于 HCV 感染特异性诊断的指标主要有两种, 即抗 HCV 和 HCV RNA 其中 抗 HCV 主要通过 ELISA RIA 占伍 IA 等血清免疫学方法检测 ;HCVRNA 主要通过 PCR 方 法检测 1. 丙型肝炎病毒抗体 ( 抗 HCV) 抗 Hα7 阳性, 反映 HCV 感染 高效价抗 Hα7 阳性者, 常与现存 HCV 感染有关, 而不是反映过去感染或保护性免疫 所以抗 Hα7 既 不是中和抗体, 也非获得免疫的标志 且急性丙型肝炎患者中, 约 40% 可以始终检测不 到抗 日 σ 若要了解有无 Hα7 感染, 则需进一步用配 R 方法检测 Hσ 卧忱 而且 抗 H 口 7 的出现与 Hα7 的存在并不完全同步 怀疑有 Hα7 感染, 一般要在输血后 22 周 或在出现临床症状后 15 周, 抗 HCV 才呈阳性 因此, 常需随访 6~9 个月 故凡抗 HαT ~ 日性者, 大都说明己成为慢性 Hα7 携带状态或处于慢性乙型肝炎阶段 目前建立的抗 Hα7 检测方法多为抗 H 口 T IgG 的检测, 不能作为病毒复制 病变活 跃 药物疗效及病情预后的指标 目前我国应用的抗 HαT IgG 检测试剂多为第二代的 EIA 试剂, 存在检出率低 检出时间较晚的缺点 国外己开发了第三代的 EIA 试剂, 大大提高了 Hα7 感染的检出率 提早了 Hα7 感染的诊断时间 但是目前仍不理想, 相信在不久的将来, H 口 7 抗体的检测试剂还会有进一步的发展 随着抗 HαT IgG 检测的发展, 很多学者也研究探讨了抗 Hα7 胁 f 的检测, 但直到目前, 尚无质量可靠 性能稳定的试剂盒 其主要优点是可用于早期诊断, 且其 Hα7 感染的检出率略高于抗 HαT I 剧 抗 H 口 7 胁 f 抗体一般在发病的 2~4 天出现, 最早在发 病的第 1 天即可检测到, 7~15 天达高峰 其持续的时间一般为 1~3 个月, 持续阳性常可以作为转为慢性肝炎的指标, 或是提示病毒持续存在并有复制 输血引起的急性内型肝炎患者, 抗 Hα7 胁 f 检出率高达 95% 以上, 常于输血后 3~40 天出现 自限性肝炎抗 HαT IgG 持续时间通常为 4~21 周, 若大于 6 个月, 常表示转为慢性 采用 ELISA 法检测抗 Hα7 假阳性较为常见, 需注意排除 另外部分酒精中毒性肝炎 自身免疫性肝炎 急性重型肝炎患者, 可出现抗 HCV 假阳性, 应注意鉴别 2. 丙型肝炎病毒核糖核酸 (HCVRNA) 由于 Hα7 在被感染者体内浓度很低, 用一般的免疫学技术很难获得较高的诊断准确率, 寻求现代分子生物学技术的帮助在提高 Hα7 感染检出率方面有较大的优势, 目前多采用町 PCR 的方法检测血清中的 Hσ 阳 A o HCVRNA 可在感染者外周血血洁 血浆及外周血淋巴细胞中检出, 也可在肝内多种细胞中检出 可在 Hα7 感染后 2~3 天或 ALT 升高之前即可测得 HCVRNA 阳性, 有利于 Hα7 感染的早期诊断 该方法灵敏性和特异性均较高, 而抗 Hα7 的假阳性和假阴性均较高, 抗 HαT ~ 日 性者中只有 20% 左右具有传染性 ; 此外, 25% ~40% 的抗 Hα7 阴性的献血员具有传染

218 第十六章性 因此,Hi α7 卧也为判断传染性的重要指标, 对于血液及血制品的安全性的判断有重要意义 H 口 7 卧性的测定可直接判定病毒血症和肝损害程度及病情轻重的关系, 一般而言, HCV 感染者肝功能损害的程度与 HCVRNA 检出率及其定量呈正相关关系 ALT 持续升高者大都可以检测到 HCV RNA, 而血清 HCV RNA 持续阴性者较少出现 ALT 水平升高 经治疗后 ALT 水平恢复正常者, H 口 7 卧仙一般均低于可检测水平 因此 HCV RNA 的测定可用于监测抗病毒药物的临床疗效, 抗病毒治疗有效时, 可观察到 HCV RNA 水平逐渐降低至转阴, 并同时伴随 ALT 水平下降或恢复正常 ( 四 ) 丁型病毒性肝炎丁型病毒性肝炎 ( 简称丁型肝炎 ) 是由丁型肝炎病毒 (HDV) 感染引起的一种传染病 我国 HDV 感染率不高, 在 % ~ % 之间, 以西南地区感染率较高 HDV 是一种缺陷性负链 RNA 病毒, 其装配需要依赖宿主 HBsAg 的合戚, 其复制与表达亦需要 HBV 或其他嗜肝 DNA 病毒的辅助才能完成, 故其在流行病学方面与乙型肝炎有许多共同或相似之处, 其传染源主要是急 慢性丁型肝炎患者及 HDV 携带者 HDV 感染可通过 2 种方式进行 :1 共同感染, 即 HDV 和 HBV 两种病毒同时感染, 临床表现和生化特征类似单纯急性乙型肝炎, 常呈自限性 若一次感染 HDV 量较大, 则结局较为严重, 既可表现为重症肝炎, 又可表现为反复发作的慢性化过程 2 重叠感染, 即在慢性 HBV 感染基础上感染 HDV, 预后较差 大部分 HBsAg 携带者发生 HDV 重叠感染后, 不仅具有较高的发病率, 而且常表现为严重的急性肝炎, 有时为重症肝炎, 病死率较高 若无重症肝炎病史, 则可发展为慢性中 重度肝炎和肝硬化 丁型肝炎的发病机制现多认为, 复制状态的 HDV 与肝损害关系密切, 而机体免疫反应对发病影响不明显 HDV 感染的检测对于确定 HDV 感染为现症感染还是既往感染, 区别 HBV 与 HDV 同时感染还是重叠感染, 估计预后等具有重要意义 目前检测的项目主要有 :HDAg 抗 HDV,m-HDV I 圳 HDVRNA 急性丁型肝炎的早期诊断不易,HDAg 的免疫原性很弱, 抗 HDV 与抗 HDV I 剧产生较迟, 出现短暂, 需要连续采取 2~3 份标本检测整套血清标志 (HDAg 抗 HDV 扩'C -HDV 胁 f 和 HDV 卧 4 时, 才能避免漏诊 1. 丁型肝炎抗原 (HDAg) HDV 感染早期, 血中病毒持续时间短, 平均约 15 天, 大多数急性 HDV 感染者就诊时血中己检测不到 HDAg, 因此必须把握检测时机, 以发病第 2 周为最好, 检出率可达 100% 在慢性 HDV 感染早期, 肝内 HDAg 最为丰富, 以后则呈进行性减少, 而血中则不易检出 HDAg o 血清中 HDAg 的出现与 HBVDNA 的减少相一致 当 HDAg 表达增加时, HBVDNA 明显减少 ; 当 HDAg 表达处于高峰期时, HBVDNA 常己消失, 随着 HDAg 的阴转和抗 HD 的出现, HBVDNA 又可恢复到原来水平 说明 HDV 感染可 肝脏疾病的免疫学检测211 明显抑制 HBVDNA 的合成 2. 丁型肝炎病毒抗体 ( 抗 HD) 抗 m 为 HDAg 的特异性抗体, 包括 19( 王和胁 f 两 型 抗 HD 非 HDV 的保护性抗体, 当慢性 HDV 感染终止和 HBsAg 转阴后, 抗 HD 阳性 仍可持续数年 急性 HDV 感染后, 血清总抗 HD 出现较晚, 多在发病后 3~8 周之间, 且 滴度较低 «1:100) 慢性 HDV 感染者, 抗 HD 的滴度变化与 HDV 感染的发展过程相 平行, 主要为抗 HD 19G, 常呈持续阳性 且滴度较高, 当滴度大于 1: 1000 时, 具有诊断意 义, 是慢性 HDV 感染的主要血清学标志 低低度的抗 HDV IgG 仅反映 HDV 既往感染 3. 抗 HDV I 制抗 HDVI 圳在急性 HDV 感染中短暂存在, 出现于 HDAg 阳性和

219 212 第三篇临床免疫学检验抗 m 阳性的中间阶段, 平均持续时间约 4 周 因此抗 HDV 胁 f 阳性是急性 HDV 早 期诊断的重要指标 若抗 HDV I 圳持续阳性则预示 HDV 感染趋于慢性化 持续抗 HDV 胁 f 阳性和高滴度抗 HDV IgG 阳性是慢性丁型肝炎血清学的重要特征 4. 丁型肝炎病毒核糖核酸 (HDV 卧也 ) HDV 卧忱的存在和复制直接反映了丁型肝 炎病毒的存在, 是丁型肝炎确诊和疗效观察的最直接指标 特异性强, 敏感性高, 提高了 丁型肝炎诊断水平, 有助于进一步认识 HDV 在体内的感染状态, 有助于早期诊断 指导治 疗和判断预后等 ( 五 ) 戊型病毒性肝炎 戊型病毒性肝炎 ( 简称戊型肝炎 ) 是由戊型肝炎病毒 (HEV) 寻 起的一种病毒性肝炎, 主要经过粪口途径传播, 常引起爆发流行, 其流行病学特点和临 床表现类似于甲型肝炎 戊型肝炎引起肝细胞的病变机制主要与 HEV 在肝细胞中复制 造成的直接损伤有关, 而免疫反应性损害可能是加重因素 此病属自限性疾病, 无慢性过 程 绝大多数患者经休息 护肝支持治疗后, 临床症状和体征均逐渐消失 肝功能逐步恢 复正常, 预后良好 但是值得注意的是成人戊型肝炎的病死率高于甲型肝炎, 特别是孕妇 患者, 病死率可高达 20% 戊型肝炎抗体 ( 抗 HEV) 是检测戊型肝炎的主要指标 抗 HEV 是 HEV 的特异性 抗体, 一般于 HEV 感染后 2 周开始在血中出现,3~5 周后达到高峰, 然后逐渐下降,12 周后阴转 可作为急性戊型肝炎的特异性诊断指标 此外, 抗 HEV 刷 HEV 阳 A 也可作为检测 HEV 感染的指标, 但是其技术不如抗 HEV 成熟, 临床应用价值不大 二. 病毒性肝炎的免疫异常与免疫功能测定肝炎病毒侵入肝细胞后在肝细胞内复制, 但对肝细胞无明显的直接损伤作用, 只有当人体对入侵的肝炎病毒出现免疫应答时, 才会引起肝脏病变 目前肝炎病毒与免疫系统之间的相互作用尚未完全阐明, 病毒持续感染的机制也知之甚少 但是, HEV 转基因的小鼠模型为人类研究急慢性 HEV 感染提供了线索, 使得人们对于肝炎病毒 ( 尤其是 HEV) 的感染机制研究有了一定的进展 肝炎病毒感染后机体的体液免疫与细胞免疫均会为病毒的清除发挥作用, 同时会对肝细胞造成相应的损伤, 其中细胞免疫反应在肝细胞损害发 生中起主要作用 在感染早期由非 CD3 细胞 ( 很可能是 NK 细胞 ) 对于控制和消除病毒起 重要作用 ; 而 T 细胞则通过细胞毒性及其诱导的细胞因子, 在感染后期起主要作用, 以完全消除病毒及病毒感染的肝细胞 (~) 自然杀伤细胞 (NK 细胞 )NK 细胞是一群异质性 多功能的淋巴细胞, 其作用无须事先接受特异性抗原的致敏 与特异性免疫应答无关, 其杀伤作用不依赖于特异性抗体与补体, 同时又受到一系列其他细胞及其分泌产物的调节而表现出增强或抑制的功能, 因而是一种具有自然细胞毒活性的杀伤细胞 在乙型肝炎患者中,NK 细胞的细胞毒作用与靶细胞膜上的 HEsAg 的存在与否无直接关系, 而对于 IFN 1L- 2 1L -12 等细胞因子的直接激活作用反应敏感 其中,IL- 2 是 NK 细胞的重要激活剂, 其自然杀伤活性的维持取决于体内 1L-2 的含量, 这可能是感染早期免疫防御机制的一种重要表现 o NK 细胞的表面标志是 CD16 和 ω 坷, 临床通常通过这两种细胞标志来检测和了解 NK 细胞的功能状态 在急性乙型肝炎的早期,NK 细胞活性升高, 且与 ALT 的升高呈正相关, 提示在出现特异性 CIL 细胞毒作用之前,NK 细胞是控制 HEV 感染的一种重要免疫细胞, 并在清除

220 者, NK 细胞活性大都降低, 其降低的主要原因除与体内诱生的 IFN 能力低下有关外, 还与 慢性乙型肝炎患者淋巴细胞亚群受到 HBV 感染和体内存在血清抑制因子有关 在慢性 HBV 感染的不同阶段, NK 细胞活性有不同的变化 NK 细胞细胞功能不全, 可导致 HBV 清除不足 ;NK 细胞功能增强, 又可引起慢性进行性肝损害, 两种情况均是乙型肝炎慢性化 的重要原因之一 在内型肝炎患者中, NK 细胞活性一般都正常, 提示 HCV 不能发动体内 NK 细胞细胞 清除被病毒感染的肝细胞, 这可能是内型肝炎比乙型肝炎更容易演变为慢性肝炎的重要 原因之一 ( 二 )T 淋巴细胞亚群在各类病毒性肝炎中, T 细胞在乙型肝炎病变过程中的作用 最为明显 乙型肝炎的免疫病理变化主要由 除病毒或控制病毒扩散的同时, 也与病变的发生和加重有关 T 细胞调节, T 细胞的功能具有双重性 : 在清 T 细胞有不同的亚群, 比较 重要的有 CD3 + ( 总 T 细胞 ) CD4 + ( 辅助诱导 T 细胞,Th Ti) CDs + ( 抑制细胞毒 T 细胞, Ts Tc), 在不同情况下产生的调节因子和趋化因子不同 在急 慢性乙型肝炎患者中, 细胞的作用机制分别是 :1 急性乙型肝炎 : 急性乙型肝炎患者免疫功能正常, T 淋巴 HBV 在肝细 胞内复制并在肝细胞膜表达特异性靶抗原 HBsAg 和 HBcAg, 靶抗原 ( 主要为 HBcAg) 和 HlA- I 类抗原通过双重识别机制与 CDs + 细胞毒性 T 细胞 (Tc, CIL) 表面的 CD6 + 受体结 合而导致肝细胞洛解 同时, J 辅助性 T 细胞 (Th) 通过其表面的 HlA- II 类限制性 m4 + 受体与 B 淋巴细胞上表达的 HBsAg, HBcAg, f 丑 A-II 类抗原相结合而被激活, 转而促 进 B 淋巴细胞产生抗 HBS 而清除 HBV 2 慢性乙型肝炎 : 慢性乙型肝炎的病变主要是 由细胞免疫异常所致, 其效应细胞是自然杀伤细胞 (NK 细胞 ) 细胞毒性 T 细胞 (CIL) 抗 体依赖性淋巴细胞等三种淋巴细胞 免疫反应所攻击的靶抗原为肝细胞膜上的 HBsAg HBcAg 肝特异性脂蛋白 (LSP) 肝细胞膜抗原 ( 山伯 g) 等抗原 现在己达成共识, 慢性乙型 肝炎时 CIL 是免疫系统清除病毒感染细胞的主要效应细胞 CIL 介导的细胞毒活性可以 通过两种机制引起细胞死亡 : 一种是穿孔素引起的细胞坏死 ; 另一种是基于 Fas 的细胞凋 亡 穿于 L 素 (perforin) 是 CIL 与靶细胞结合后释放的一种洛解性颗粒, 主要由 CIL 和 NK 细胞产生, 穿孔素从颗粒中释放出来后, 插入靶细胞膜上, 由 12~16 个穿孔素分子聚合成 为穿膜的管装结构, 这种异常结构使 Na + 水分进入靶细胞,K+ 和大分子物质从细胞内释 出, 靶细胞因为肢体渗透压而被洛解 Fas 是一种细胞表面的受体, 表达于包括肝脏的组 织细胞上, 激活的 CIL 则迅速表达出 Fas 配体 (FasL), 当 FasL 结合靶细胞表达的 Fas 时, 引起细胞凋亡 临床意义 : 1. 乙型肝炎患者, 外周血 T 淋巴细胞亚群变化常表现为 m4 + 细胞减少 ωj 细胞增 多 CD4 + CD s + 比率降低 其中, 在慢性 HBV 感染中细胞免疫功能的低下, 可能与 ωj 细 胞数量不足有一定的关系 2. 丙型肝炎患者外周血 T 淋巴细胞亚群变化与乙型肝炎基本相似, 但因临床类型和 病期的不同, 二者改变的程度可有差异 213 第十六章肝脏疾病的免疫HBV 感染细胞 终止病毒感染和造成肝细胞免疫损害方面有重要作用 慢性乙型肝炎患学检测

221 214 第三篇临床免疫学检验3. 甲型肝炎患者, 病变的极期外周血 T 淋巴细胞亚群变化与乙型肝炎亦相类似, 但 随着病情的恢复, 则表现为 m4 + 细胞由极期的减少转为升高, ωj 细胞由高转低或波动 于较低水平, J J 比率逐步回升 4. 从病毒性肝炎的类型来看, 上述外周血 T 淋巴细胞亚群百分率及比值的改变, 以 重型肝炎最为明显, 而急性肝炎 慢性肝炎及无症状肝炎病毒携带者亦可有不同程度的改 变 5. 外周血 T 淋巴细胞亚群百分率及比值的改变程度与肝炎病毒在体内是否复制有 关 血清 HBeAg 阳性及 HBVDNA 阳性者较阴性者改变更为明显 6. 当应用免疫调节药物治疗病毒性肝炎 ( 特别是乙型肝炎 ) 时, 可通过观察外周血 T 淋巴细胞亚群百分率及比值的变化来了解其对于细胞免疫功能的调节作用 ( 三 ) 体液免疫指标在病毒性肝炎的发病机制中, 体液免疫反应也有着非常重要的作用 在体液免疫应答过程中, 有一系列物质产生, 如抗体 免疫球蛋白 循环免疫复合物 补体 自身抗体等 其中针对肝炎病毒抗原的特异性抗体在病毒标志物中己经详细介绍, 此不赘述, 自身抗体部分将在自身免疫性肝炎部分介绍 1. 免疫球蛋白 ( Ig) 人类的免疫球蛋白主要有 IgG 胁 1, 19A IgD IgE 五种 其中, IgG 胁 f 构成对抗原攻击的全身性体液免疫反应的主要成分, 在体液免疫反应中起主要作用 ;1gA IgD 在肝炎病人中没有特殊临床指导意义, 在此不赘述 分述如下 : (l)igg 1 急性肝炎患者 IgG 轻度增加, 可在起病后 2 周至 1 个月内达到最高值 ; 预后良好者, 2~3 个月内恢复至正常水平 O 2 急性肝炎起病 2~3 个月后, 若 IgG 仍高于正常水平, 提示急性肝炎有可能向慢性肝炎演变 3 慢性肝炎患者, IgG 持续升高是肝脏炎症活动性病变存在的证据 (2) 助 f 1 急性肝炎患者胁 f 的测定可在一定程度上鉴别甲型肝炎和乙型肝炎 甲型肝炎患者胁 f 轻中度增高, 其中以发病后最初 2 周内的改变最为显著, 在恢复期则可降至正常水平 ; 乙型肝炎患者, 刷值大都正常 2 肝炎早期有助于重型肝炎的诊断 急性肝炎患者若胁 f 持续升高超过 10 日以上, 应警惕有向重型肝炎演变的可能 ; 急性重型肝炎患者胁仨 5 倍正常值 3 慢性肝炎患者动态检测胁 f 可鉴别病变的活动性或非活动性 慢性肝炎病变活动者胁 f 水平 > 病变非活动者 4 肝硬化患者动态检测胁 f 可在一定程度上鉴别肝硬化处于代偿期或失代偿期, 肝硬化失代偿者 I 圳水平 > 代偿者 5 对部分黄瘟有鉴别诊断意义 : 原发性胆汁性肝硬化黄瘟者, 胁 f 水平可明显增高 ; 阻塞性 ( 肝外 ) 黄瘟或药物性 ( 氯丙嗦 ) 肝内胆汁淤积性黄瘟者, 胁 f 水平大都正常 (3) IgE 1 HBsAg 携带者 急性肝炎 ( 急性期 ) 患者 慢性肝炎 ( 中 重度以上 ) 患者血清 IgE 水平常明显增高 ; 急性肝炎 ( 恢复期 ) 患者 慢性肝炎病变非活动患者血清 19E 水平一般都在正常范围内 2 急性肝炎患者若出现高 IgE 血症, 提示病期可能迁延 3 HBsAg 携带者常有显著高 19E 血症, 提示 HBsAg 可能是剌激 IgE 产生的一种抗原物质 2. 总补体 补体巳补体在血清中含量相对稳定, 不因免疫应答而增加, 仅在某些病理情况下才会发生波动 补体系统的基本组成包括 9 个血清蛋白成分, 是一个复杂的反应系统, 除了洛解细胞和协助杀菌作用外, 还可促进炎症反应, 与其他生物活性系统有相互促进 相互制约的关系, 这些关系的紊乱是导致许多疾病损伤的物质基础 C 是一种自 球蛋白, 是补体中含量最多 作用最重要的一个组成部分, 是补体 2 条主要激活途径的中

222 第十六章心环节, 有重要的生物活性作用, 可在肝脏内产生 临床意义如下 : (1) 慢性肝炎患者总补体 补体巳水平降低, 主要与补体被免疫复合物固定 消耗增加有关 (2) 重型肝炎患者总补体 补体巳水平降低, 主要与肝细胞大面积坏死 补体合成减少有关 故重型肝炎患者测定补体水平, 有助于肝炎严重程度的判断 ; 动态观察总补体呈持续低水平者, 预后极差 重型肝炎患者经治疗后病情缓解时, 可见血清总补体 补体巳水平明显回升 3. 循环免疫复合物 (crc) 循环免疫复合物 ( crc) 是由抗原和特异性抗体在一定条件下相互作用形成的一种物质 急性肝炎患者血清 crc 大多数都呈低滴度 一过性阳性反应 慢性肝炎患者血清 crc 大多数都呈高滴度 持续阳性反应, 与急性肝炎患者有明显区别 二. 细胞因子细胞因子 ( cytokin 的口 是指由免疫细胞 ( 如单核巨噬细胞 T 细胞 B 细胞 NK 细胞等 ) 和某些非免疫细胞 ( 如血管内皮细胞 表皮细胞 成纤维细胞等 ) 经剌激而合戚 分泌的一类生物活性物质 细胞因子多属于小分子多肤或糖蛋白, 作为细胞间信号传递分子, 主要介导和调节免疫应答及炎症反应, 剌激造血功能, 并参与组织修复等 细胞因子按其产 生的细胞不同可以分为三类 : 由单核巨噬细胞分泌的单核因子 (monokine) 由淋巴细胞产生的淋巴因子 ( lymphokine) 及其他细胞产生的细胞因子 细胞因子虽然种类繁多, 但都具有一定的共同特点, 即多效性 高效性 来源多样性 多重作用性, 通过多种方式调节机体的免疫功能 当感染肝炎病毒 ( 特别是 HEV 和 Hα T) 后, 细胞因子的改变是机体免疫功能失调的重要表现之一, 改变明显且临床意义较大的主要有白细胞介素 (i nterl eukine, IL) 干扰素( interfero 口, 00) 肿瘤坏死因子 (tumo 旧 necrosis factor,1nf) 转化生长因子自( transforming growth factor, 1GF~) 其中白细胞介素种类较多, 迄今己发现了 10 多种, 本章仅介绍与病毒性肝炎关系较为密切的 IL- 2 IL- 2R IL- 6 IL-8 IL- lo IL-12 o (~) 白细胞介素 2(IL-2) IL-2 主要来源于活化的 CD4 + 辅助性 T 细胞产生, 主 肝脏疾病的免疫学检测215 要生物学效应表现为 : 诱导活化 T 淋巴细胞及胸腺细胞的生长, 诱导 T 细胞产生淋巴因子, 诱导 CIL 的细胞毒作用, 增强 NK 细胞 lak 细胞及单核细胞的细胞毒作用, 促进活化的 B 细胞增殖及分化 IL-2 受体 (IL- 2R) 有两种, 一种为 T B 细胞及 NK 细胞表面的胞膜 IL- 2R(mIL- 2R), 另一种为可洛性的 IL - 2R(sIL - 2R) 0 Th 细胞可产生 IL-2 和表达 IL-2R 是调节细胞免疫与体液免疫的中心环节, 在细胞因子网络中处于核心地位, 在免疫应答中起着非常重要的作用 临床意义如下 : 1. 急性乙型肝炎患者和无症状 HEsAg 携带者, 外周血中 IL-2 活力基本正常 0 2. 重型肝炎 慢性肝炎患者, 外周血 IL-2 活力显著降低 3. 慢性乙型肝炎患者, IL-2 产生减少, 加入外源性 IL- 2 亦不能纠正, 提示 IL- 2R 的表达也降低, 因而不能充分激活 T 细胞增殖 4. 病毒性肝炎患者免疫细胞产生 IL-2 的能力降低, 细胞表面 1 世 L-2R 表达减少, 必将导致缺乏足够的信号启动免疫细胞增殖, 从而导致细胞间的相互作用和相互调节不能正常进行, 这可能是病毒性肝炎免疫应答异常的重要机制之一

223 216 第三篇临床免疫学检验5. 血清 sil-2r 水平能够较好地反应疾病的活动状态, 动态观察血清 sil- 2R 水平的变化, 对判断和评价肝炎病毒感染后的病情演变情况及免疫失衡状态有较大价值 一般而言, 病毒性肝炎患者, 血清 sil- 2R 水平都较正常值明显增高, 其升高的程度与肝炎病情轻重成正比关系, 且与 ALT 活性有良好的相关性, 依次为 : 重型肝炎 > 肝硬化 ( ) 舌动期» 急性肝炎 > 慢性肝炎 ( 中 重度» 肝硬化 ( 静止期» 慢性肝炎 ( 轻度»HBV 携带者 6.IL-2 的产生下降是乙型肝炎免疫发病机制中的一个重要环节, 尤其能反映机体的细胞免疫状况, 并且 IL-2 水平的高低与肝炎病情轻重和预后密切相关, 而造成 IL- 2 产生减少的因素还不完全清楚 有研究表明, 肝炎病人淋巴细胞脂质过氧化是其 IL- 2 产生降低的重要原因之一 ( 二 ) 白细胞介素 6 (IL-6) IL-6 是单核巨噬细胞 血管内皮细胞 成纤维细胞等受 IL-l 剌激产生的细胞因子, 某些活化的 T 细胞也可产生 其主要生物学活性 : 促使活化的 B 细胞分化, 剌激 T 细胞 胸腺细胞和骨髓造血干细胞, 诱导肝细胞产生某些急性期蛋白 临床意义如下 : I. IL-6 活性在不同临床类型乙型肝炎患者中的改变情况如下 :1 急性乙型肝炎及慢性轻度乙型肝炎患者,IL- 6 活性无显著改变 2 无症状 HBV 携带者, IL- 6 活性减低 3 慢性中 重度乙型肝炎及重型乙型肝炎患者,IL-6 活性显著增强 2. 乙型肝炎患者, 外周血单个核细胞产生 IL- 6 活性的水平与 B 细胞产生免疫球蛋 白及血清球蛋白的水平有密切关系, 一般均表现为显著正相关关系 3. 乙型肝炎患者,IL-6 活性水平与血清抗 HBc 水平亦显著相关, 即 IL- 6 活性增 强者, 抗 HBc 阳性率明显增高, 而与抗 HBs 无明显相关性 4. 血清 IL-6 升高与 ALT 的升高相一致, 似与清除病毒有关 ; 而且 6 降低, 则可使 感染慢性化 ( 三 ) 白细胞介素 8(IL-8) IL-8 来源于单核细胞 巨噬细胞 单个核细胞 HBV 感染能诱导肝细胞合成大量 1NF α, 而 1NF α 又可诱导肝细胞合成 IL-8, IL-8 可能又 促进肝内炎症反应, 介导肝细胞损伤, 诱导各类细胞分化增殖, 从而使慢性肝脏炎症持续存在, 并导致纤维化形成 HCV 感染能使机体 CIL 产生 1NF α IL- 8 等多种促炎细胞因子, 从而诱导肝损伤 临床意义如下 : 1. 慢性乙型肝炎患者血清 IL-8 水平明显升高, 其中以中 重度慢性肝炎最为显著, 且 IL-8 水平与其血清胆红素水平呈显著正相关 2.Bα7 感染后的重度慢性肝炎 肝癌患者血清 IL- 8 水平较 HBV 感染的重度慢性肝炎 肝癌患者的水平高, 可能与不同类型的病毒引起的肝损伤的强度不同有关 3. 肝炎后肝硬化患者的血浆 IL-8 水平亦升高, 且与肝功能损害程度及血清胆红素水平正相关 4. 在急性肝炎的恢复期 慢性肝炎的稳定期及重型肝炎的恢复期血清 IL- 8 水平显著下降, 说明血清 IL-8 水平的高低与病情轻重一致 5.IL-8 在介导肝内炎症反应及肝细胞损伤中起重要作用, 故可作为间接反应肝内炎症反应程度的可靠指标 临床上, 应用 IL- 8 拮抗剂或其他药物阻断这一环节对防治肝细胞损伤有重要临床意义

224 增强 B 细胞增殖分化外, 其主要的生物学活性是起免疫抑制作用 它能抑制卫 1] 细胞产 生细胞因子, 如 IL- 2 IL-3, IF 矶 T 矶 GM- CSF 等, 从而抑制卫 1] 细胞介导的免疫反 应, 所以有抗肝组织炎性损伤的作用 临床意义如下 : 1. 乙型肝炎患者, 血清 IL- lo 水平常明显升高, 表明患者体内 Th2 细胞免疫反应增 强, 这可能是由 V 在体内持续感染的结果 2.HEVDNA 阳性患者, 血清 IL- lo 水平明显高于 HEV DNA 阴性者, 表明 IL- lo 水 平升高可抑制宿主抗 HEV 细胞的免疫活性, 导致 HEV 体内持续复制和表达 3. 慢性重度或慢性重型肝炎患者, 血清 IL- lo 水平却低于慢性轻度或慢性中度肝炎 患者, 表明 IL- lo 又可抑制 HBV 感染引起的肝脏炎症反应, 减轻肝脏损伤, 致使肝脏病 变迁延不愈 4. 丙型肝炎患者, 血清 IL- lo 升高, 提示 IL- lo 可能与 Hα7 感染慢性化 肝细胞肝 癌等的发生有关 5. 由于 IL- lo 既具有抑制过多炎性因子产生以减轻组织炎性损伤的作用, 又具有免 疫抑制作用, 故对病毒性肝炎有特殊的治疗作用, 但需注意 IL- lo 有使病毒感染慢性化 的一面 将 IL- lo 用于病毒性肝炎的治疗时, 注意做到既有效抑制肝脏炎症但又不过分 削弱机体的抗病毒免疫为原则 ( 五 ) 白细胞介素 12 (IL-12) IL-12 又称天然杀伤细胞剌激因子或细胞毒淋巴细 胞成熟因子 主要由包括单核细胞 巨噬细胞 树突状细胞在内的抗原提呈细胞 (APCs) 产生 其生物学活性 :1 促进 T 细胞及 NK 细胞增殖, 增强细胞毒作用 2 增强特异性 CIL 反应 3 诱导 T 细胞及 NK 细胞产生 OO-/" 肿瘤坏死因子 α 粒细胞巨噬细胞集落 剌激因子 (GM-CSF) 和 IL-3 等 4 促进卫 1] 细胞 抑制卫 12 细胞发育 5 影响 B 细胞产 生抗体类型 6 协同 IL- 3, ω1- CSF 促进造血干细胞和祖细胞的增殖等 临床意义如 下. 1. 慢性 HBV 携带者血清中 IL-12 含量明显高于正常 己清除 HBV 的患者和抗 HBe 抗体转阳的患者均伴有 IL-12 及 Th] 细胞活性的明显增加 ( 常高于基础水平 2 倍以 上 ), 明显高于对治疗无反应者, 且 IL-12 高峰值与肝细胞洛解的高峰一致, 同时又有针 对 HBcAg 特异的 T 细胞增殖, 因此,IL-12 在清除 HBV 中发挥重要作用 2. 小剂量的 IL-12 可使 Th2 介导的反应减弱而使 Th] 占优, 从而可以抑制 Th2 所介 ( 四 ) 白细胞介素 10 (IL- lo) IL- lo 主要由卫 12 细胞产生, 除了能促进 CIL 诱导, 217 第学检测十六章肝脏疾病的免疫导的自身免疫现象, 使自身抗体产生减少, 由于 Th2 占优势是病毒性肝炎慢性化的一个主 要原因, 故 IL-12 可以通过提高卫 1] 的活性 抑制 Th2 的活性, 而达到清除病毒的作用 3. CIL 通过破坏被病毒感染的肝细胞来达到清除病毒的目的, 而这种作用有可能使大部分肝细胞坏死, 而且 12 所诱导产生的 CIL 则通过非细胞洛解过程来发挥作用, 它不直接杀死细胞, 其作用的强度和持久度更高 4. 慢性内型肝炎患者, 肝内可分离出病毒特异的 CIL 识别的表面决定簇, 无论在核 壳表面或非结构区均可检测到, 提示用 IL-12 洛解活性 治疗可能促进这种病毒特异的 CIL 细胞的 ( 六 )γ 干扰素 (00 γ) 00 γ 是一种重要的具有免疫调节作用的细胞因子, 主要

225 218 第三篇临床免疫学检验由活化的 T 细胞和 NK 细胞产生 其抗病毒作用是由于它能激活细胞内抗病毒蛋白基 因, 制造抗病毒蛋白, 抑制病毒在细胞内复制 干扰素不仅可抑制己感染细胞内病毒的复 制, 而且还可使未感染细胞处于抗病毒状态, 对中断病毒的细胞间传播有一定作用 急性 肝炎 慢性肝炎 重型肝炎和原发性肝癌均可见 IFN γ 诱生能力降低 慢性丙型肝炎和 丁型肝炎外周血单个核细胞体外诱生 IFN γ 能力更明显下降 这与产生 IFN γ 的活性细胞功能降低 病毒感染影响 IFN γ 的诱生能力及 IL-2 分泌减少有关 ( 七 ) 肿瘤坏死因子 (1NF) 1NF 为多功能的细胞因子 它具有杀伤肿瘤细胞或抑制其增殖的抗肿瘤作用 ; 也可直接杀伤病毒感染细胞, 增强巨噬细胞的吞噬和杀伤功能, 发挥抗感染的作用 ; 还可诱发炎症反应, 参与骨质重建, 对造血系统和中枢神经系统也有影响 其由巨噬细胞产生的称为 1NF α, 由淋巴细胞产生的称为 1NF- ~o 病毒性肝炎的患者,1NF α 水平和 ALT 及 EIL 水平呈正相关 病毒性肝炎患者血清中 1NF α 水平升高, 且病情越重, 其升高越显著 ; 在急性肝炎的恢复期 慢性肝炎的稳定期及重型肝炎的恢复期血清 1NF α 水平的高低与病情的轻重一致, 能够反应肝细胞损害的程度 ( 八 ) 转化生长因子自 1 (1GF- ~1) 1GF- ~1 是一种与多种上皮性肿瘤生长有关的多肤性细胞生长负调控因子 该因子主要由淋巴细胞 巨噬细胞和血小板分泌 乙型肝炎 病毒对肝细胞的直接作用与 1GF- ~1 介导的免疫病理损伤有关 1GF- ~1 与肝纤维化更 有密切关系, 将在肝纤维化部分详述 慢性乙型肝炎患者血清 1GF- ~1 水平的升高与病变的严重程度和肝细胞受损程度相一致 因此检测 1GF- ~1 有利于了解慢性乙型肝炎患者肝脏病变的严重程度和肝细胞受损情况 四. 细胞间粘附分子粘附分子 (adhesion, AM) 是一类介导细胞与细胞 细胞与细胞外基质 (extracellular matr 眩, Eα1) I 可粘附作用的膜表面糖蛋白 分为五大类 : 选择素家族 茹蛋白样家族 整合素家族 免疫球蛋白超家族 钙离子依赖的细胞粘附素家族 ( 简称钙茹素 ) 其中细胞间粘附分子 I (lc 丛 1-1) 即 ω 剖, 是免疫球蛋白超家族的一种, 在 IL-l 1NF α IFN-y, 内毒 素等剌激下,ICAM-l 可广泛表达于造血和非造血系统的多种细胞表面, 其配体为 LFA 1, 二者结合可参与 T-T 细胞 T 细胞基质细胞 效应细胞和靶细胞间的相互作用和炎症反应 目前关于 IC 丛 1-1 与病毒性肝炎关系的研究成为肝病研究的热点之一, 其检测方法和正常参考值尚有待进一步确立 正常肝组织, 仅窦周细胞 n 脉血管内皮细胞有少量的 I 巳丛 1-1 表达, 肝细胞和胆管上皮细胞则为阴性 病毒性肝炎 ( 特别是乙型肝炎和内型肝炎 ) 患者, 其肝脏 I 巳丛 1-1 表达强度与肝损伤及炎症相一致, 有效治疗后,ICAM - 1 表达可减少 当炎症严重时, IC 丛 1-1 弥散地表达在整个肝脏细胞表面, 并见到 LFA-l 阳性淋巴细胞浸润到该区域 五. 甲胎蛋白甲胎蛋白 (AFP) 是胚胎期一种重要的血清糖蛋白 生理情况下, 在胚胎期 3 个月内 AFP 由肝脏 卵黄囊和胃肠道粘膜合戚, 3 个月后肝细胞是合成 AFP 的惟一场所 AFP 是胎儿血洁的正常成分, 约在娃振后 7 周开始出现, 第 14~16 周达到高峰, 第 21 周后开始

226 219 第(hepatic f 山 osis) 是指肝细胞发生坏死或炎症剌激时肝内纤维结缔组织异常学检测肝纤维化 下降, 出生后 1~2 周急剧减少, 3 个月后降至正常成人水平 AFP 是目前公认的肝癌标志 物, 不仅对原发性肝癌的诊断有重要意义, 且对肝癌治疗的疗效评价及预后估计亦有重要 价值, 将在肝癌部分详述 临床意义如下 : 1. 急性肝炎 慢性肝炎病变活动者, AFP 可升高, 但一般仅为低水平, 且持续时间不 长, 并可随病情好转而下降 如 AFP>200μgL 时, 必须同时结合影像学检查以排除原发 性肝癌 生殖系统胚胎性恶性肿瘤, ~f 振等致 AFP 明显增高的其他因素 2. 病毒性肝炎患者 ( 特别是慢性乙型肝炎 慢性内型肝炎患者 ), 定期检测 AFP 水平 的变化是早期发现原发性肝癌的有效方法 对于 AFP 持续低浓度阳性者更应提高警惕, 除动态观察 AFP 水平变化外, 还必须进行影像学检查的监测 3. 少部分慢性乙型肝炎患者 AFP 可持续增高, 并超过 400μg L, 多次影像学检查未发 现肝占位性病变, 常伴有 ALT 和 AS[ 的明显升高, 且 AS[ 升高比 ALT 更显著, 可能与肝细 胞持续大量受损并过度再生 再生的肝细胞分化不成熟而合成大量的 AFP 有关 经治疗 后, AFP 可随症状的改善而逐步降至正常水平, 并可在较长一段时间内保持稳定状态 第二币 月干纤维化与自干质化 增生的病理过程, 是纤维增生和纤维分解不平衡的结果 其中, 肝脏受损 Kupffer 细胞被激活, 是启动肝硬化的重要因素 肝纤维化实质上是慢性肝损伤的修复反应, 主要是由细胞因子介导的细胞细胞相互作用, 以及基质细胞相互作用引起星状细胞 (HSC) 激活, 而上述作用及反复的肝损伤均又可引起 HSCi 舌化的持续 $ 舌化的 HSC 产生大量问质胶原 ( I 田型胶原) 和其他细胞外基质成分, 最终导致全肝纤维化 肝纤维化是慢性肝病的重要病理特征, 是向肝硬化发展的必经环节 肝脏过度或异常的纤维结缔组织增生可使肝小叶结构发生紊乱 肝细胞总数减少或肝细胞基因发生突变 肝纤维化轻者仅引起肝功能障碍, 重者发展为肝小叶结构改建 假小叶形成的肝硬化, 极少数还可演变为原发性肝细胞癌 肝硬化 (Hepatic cirrhosis) 病理特点是 : 肝细胞变性 坏死与再生, 弥漫性纤维组织增生和残存肝细胞形成增生结节 ( 假小叶 ), 网状蛋白支撑的结构塌陷, 纤维结缔组织增生形成纤维阳, 最终导致肝小叶和血管改造, 结果使肝脏变形 质地变硬, 故名肝硬化 肝纤维化是可逆性病变, 肝硬化则不可逆转 因此, 如何有效阻断和逆转肝纤维化的发生, 是肝病研究领域的难点和热点 肝脏不仅是免疫球蛋白和补体的主要产生地, 而且是处理抗原和调节免疫的重要场所, 其免疫功能主要由肝 Kupffer 细胞和肝细胞来完成, 使肝脏成为 n 静脉血进入人体的第一道防线, 在调节机体的免疫反应方面发挥了强大的作用 肝纤维化和肝硬化是慢性肝病长期 反复发作的结果, 病情发展到该阶段, 不仅 Kupffer 细胞功能降低 易并发感染和内毒素血症, 而且机体的细胞免疫功能和体液免疫功能亦都发生明显的改变 当慢性肝病发展到肝纤维化和肝硬化阶段, 肝炎病毒相关免疫检测的重要性己不如肝炎时检测的重要, 其相应检测见病毒性肝炎章节, 本部分主要介绍运用免疫学检测反映肝脏本身储备功能及全身其他系统功能状态, 进行分析和判断肝纤维化和肝硬化诊治有较大帮助的 十六章肝脏疾病的免疫

227 220 第三篇临床免疫学检验相关指标 主要是血清肝纤维化指标 肝纤维化相关细胞因子及内分泌激素的变化 一. 血清肝纤维化指标血清肝纤维化指标检测, 是近年发展起来的无创性诊断肝纤维化的方法, 虽在一定程度上可反应肝纤维化的情况, 但无特异性, 必须动态监测 多指标联合应用, 并结合其他诊断依据方有较大的临床价值 ( 一 ) 透明质酸 (hyaluronic acid, HA) 且是肝细胞外基质成分蛋白多糖的主要组成部分, 除肝脏合成外, 其他许多体细胞皆可合戚, 但其代谢主要在肝内皮细胞, 故分析其临床价值时应全面考虑 肝纤维化时, 血清 HA 水平升高,{ HA 的升高与 ALT 变化无明显相关性, 与球蛋白升高或 AG 比例倒置具有显著相关性 在各类肝病中,HA 按下列顺序依次升高 : 急性肝炎 < 慢性肝炎 ( 轻 中 重 )< 肝硬化 < 肝癌 慢性活动性肝病患者, 血清 HA 水平可明显升高 若以 HA>350 鸣 1 世为界值, 则诊断肝硬化的敏感性可达 87.5% ; 若 HA>400 鸣 ml, 则可考虑活动性肝纤维化 晚期肝硬化患者, 血清 HA 水平可能会更高 ( 二 ) 层粘连蛋白 (lami 口 1 日,iN) in 是基底膜成分中的主要糖蛋白, 在肝内与 E 型胶原共同分布, 大量沉积则可引起肝窦毛细血管化, 故其血清值被认为是反映基底膜更新率的指标, 可反映肝窦的毛细血管化和汇管区纤维化 肝纤维化时, 血清 in 含量升高, 并与肝纤维化程度有良好的相关性,{E! 敏感性不如 PC lli 和 7S 胶原 血清 in 水平与 n 静脉高压呈正相关, 与食管静脉曲张程度亦相关, 提示其血清含量尚可反映慢性肝病患者 n 静脉高压程度 慢性多发性关节炎患者, 当形成新的 高度血管化的结缔组织时, 或原发性肝癌 其他许多肿瘤患者, 亦可出现血清 in 水平升高, 需注意鉴别 ( 三 ) 田型前胶原 (precollagen 田, 配田 ) 肝纤维化时细胞外基质过度增生或沉积, 其主要成分是胶原蛋白, 以 I 型和田型胶原为主, 在早期肝纤维化时, 田型比例大于 I 型, PC lli 可反映其合成的活性 PC 田受肝脏炎症和坏死的影响较小, 与 ElL ALT 且启等肝脏损害指标无相关性, 与肝纤维化程度呈正相关 同时联合检测 HA in 等其他血清肝纤维化指标, 可提高肝纤维化诊断指标的准确性和可靠性 ( 四 )N 型胶原 (collagen N, C - N) C - N 是肝基底膜的主要成分, 是反映基底膜更新率的指标 慢性肝病患者血清 C- N 主三螺旋区 7S 胶原和 PNCP 的增高程度, 与组织学上的肝纤维化程度相关 肝纤维化时, 肝内 C-N 合成增多并大量沉积, 致使肝血窦毛细血管化 肝纤维化时, 血清 C- N 含量明显升高, 主要反映肝血窦周围 C- N 型的沉积, 与肝纤维化程度呈正相关 慢性肝炎患者, 血清 C-N 水平亦可升高, 但低于肝硬化患者的升高水平 5. VI 型胶原 (collagen 咽, C-VI) C-VI 是存在于肝细胞外基质的五种胶原蛋白之一, 是细胞外基质中锚合胶原纤维束 胶原纤维束与细胞表面的微细丝状网络 正常情况下, 尽管 C- VI 只占肝胶原总量的 0.1 %, 但在肝纤维化时, 增加了近 10 倍, 变化非常显著 C- VI 独特的结构及其在肝纤维化时的异常改变, 显示了其在细胞外基质中的重要地位, 其血清水平较好地反映了肝内纤维化状况, 故其血清水平检测可作为早期诊断肝纤

228 第十六章维化的良好手段之一 HEV 携带者及急性肝炎患者中, 血清 c- VI 水平与常人无异, 原因是此类患者无明显肝脏病理损害或损伤只局限于小叶内, 无纤维修复过程参与, 所以 c- VI 无明显改变 慢性肝炎患者血清 c- VI 水平明显升高, 尤以慢性中度 重度肝炎及肝硬化患者更显著, 主要与肝脏的持续损伤 c- VI 的合成过度有关 因此, 血清 c- VI 水平的升高对反映慢性活动型肝病更有意义 ( 六 ) 金属蛋白酶组织抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP - 1) 基质金属蛋白酶仙 1Ps) 在降解纤维化肝脏过多细胞外基质 (EIα11) 的过程中起主要作用, 其中间质胶原酶 ( 岛 1P-l) 在降解纤维化肝脏 Eαf 的主要成分 I 田型胶原的过程中起重要作用, 而对岛 1P-l 活性起主要抑制作用的则是 TIMP-l 在肝纤维化过程中,TIMP 1 通过对鸟也 1Ps( 主要是岛 1P-l) 活性的抑制, 抑制了 I 田型胶原等 Eαf 的降解, 从而导致 Eα4 在肝脏内的过度沉积, 促进了肝纤维化的形成和发展 由于 TIMP-l 出现的时间较早 幅度较大, 因而被认为是肝纤维化发生过程中的一个非常重要的促发因素 血清 TIMP 水平在酒精性肝病肝纤维化早期即升高, 是诊断肝纤维化和肝早期硬化的有用指标 在慢性肝病的进展过程中, 血清 TIMP 水平逐步升高, 且与血清川 配田 C-N 等水平呈正相关, 与血清酶活性呈负相关 急性肝炎时, 血清 TIMP 水平与 ALT AS[ 有良好的相关性, 故又可反映肝脏的炎症情况 肝癌患者, 血清 TIMP 水平较肝硬化患者明显升高, 且与肿瘤大小 血清 AFP 水平相关, 故可能成为预示肝癌发生的较为有价值的临床指标 二. 肝纤维化相关性细胞因子随着人们对于细胞因子研究的深入, 认为细胞因子与肝纤维化的形成有密切联系, 其作用机制极为复杂 肝纤维化相关的细胞因子主要由 Kupffer 细胞分泌, 释放后作用于静止的 HSC, 使其活化肌成纤维细胞 (MF)O 多种细胞因子再与 W 表面的受体结合, 导致其不断活化增殖 胶原合成增多并沉积于细胞外, 其中由 I 型胶原替代基底膜, 使 Disse I 可隙毛细血管化, 肝细胞代谢及肝内血流因此受阻 上述因素又能使 Kupffer 细胞进一步释放 肝脏疾病的免疫学检测221 细胞因子再度作用于 HSC, 如此循环往复而使肝内胶原大量聚集, 逐渐形成肝纤维化 与 肝纤维化密切相关且可用免疫学方法检测的细胞因子主要有以下几种 (~) 转化生长因子自 1 (1GF- ~1) 在肝内,1GF- ~ 主要由非实质细胞表达, 肝细胞则 不表达, 这种生长因子可在各种病理过程中诱导肝纤维化 其中,1G F- ~1 的相对分子量 为 25000, 由 2 条多月太链组成, 具有如下作用 : 促进胶原 纤维连接蛋白 层粘蛋白和蛋白 多糖的合戚, 促进纤维连接蛋白和胶原在肝窦周围的沉积, 并可通过抑制胶原酶和蛋白酶 的产生及促进组织抑制因子 ( 如 TIMP-l 等 ) 的分泌而减少胶原的降解 加重细胞外基质 的沉积 HEV 感染后, HEV 对肝细胞的直接作用和其介导的免疫病理损伤, 导致肝细胞 变性坏死 Kupffer 细胞大量浸润 Kupffer 细胞激活后, 可合戚 分泌 1GF - ~1' 并作用于 HSC 使其激活, 转变成自巨大量合成 1G F- ~1 的肌纤维母细胞 ; 另外, 受损的肝细胞 内皮细 胞使血小板凝集释放更多的 1G F- ~1' 肝实质细胞也开始合成 1G F- ~10 综上所述,1G F 自 1 是目前所知的最强力的肝纤维化促进因子 临床意义 : 肝纤维化时, 血清 1G F- ~1 水平升高 在慢性肝炎及肝硬化患者, 血清

229 222 第三篇临床免疫学检验1GF- ~1 水平按慢性肝炎 ( 轻 中 重度 ) 肝硬化顺序依次递增 且血清 1G F- ~1 水平与 pe lli 口 4 HA 呈直线正相关, 说明 1GF- ~1 水平和 Eα4 的合戚 沉积有一定的关系 其 联合检测, 对肝纤维化的诊断具有较大的临床价值 临床上可以应用阻断 1G F- ~1 的产 生或抑制 1GF- ~1 的活性而防止肝硬化的形成 ( 二 ) 白细胞介素 l(il- l) IL-1 主要由单核巨噬细胞产生, 在某些条件下, 肝巨 噬细胞 纤维母细胞和内皮细胞也可产生 IL-1 不仅能剌激 HSC 和纤维母细胞增殖并 合成细胞外基质, 而且能促进 1GF- ~1 和 1NF α 的分泌, 并促进肝巨噬细胞产生细胞因 子 另外, IL-1 尚可促进纤维母细胞分泌前列腺素 E 2 (PC - E:z)' PC - E:z 抑制胶原的合 戚, 说明 IL-1 有间接的双向作用 在病毒性肝炎及肝纤维化的患者血清 IL-1 活性增 加 ( 三 ) 肿瘤坏死因子 (1NF α) 1NF α 在肝纤维化形成中具有双向性作用, 因此临床 分析必须结合其他检测指标综合考虑 基于 1NF α 可直接抑制出 C 胶原合戚 对抗 1GF- ~1 诱导的胶原合戚 并可剌激胶原酶合成而促进胶原的阵解等生物学作用, 所以对 于 1NF α 是否可用于抗肝纤维化的临床治疗尚需进一步探讨 ( 四 ) 干扰素 γ(00 γ) 00 γ 由 T 细胞和 NK 细胞产生 o 00 γ 能特异性抑制 胶原 ( I 田型前胶原) 基因的表达 ; 另外还可抑制 HSC 的活化与增殖, 使 HSC 的 1GF- ~1 表达下调 肝纤维化时,00 γ 血清浓度通常都低于正常水平 00γ 是一种很强的抗肝纤维化因子 目前, 己将 00 γ 用于肝纤维化的临床治 疗, 其抗肝纤维化的作用并不是单纯的通过抗病毒所引起的间接效应, 而是多方面的机制, 包括抑制 1GF 队的生戚 经过 00 γ 治疗后的患者, 可以见到配田 川等水平明显下降 肝组织内 1GF 阳最 NA 降至正常水平 肝组织内炎症及纤维化程度减轻等疗效反映, 因而 00 γ 是最有希望的抗肝纤维化的药物之一 二. 内分泌激素肝脏在激素代谢中具有重要作用 一方面, 肝脏是众多激素转化 代谢 降解的场所 ; 另一方面, 垂体 肾上腺 甲状腺 性腺 胃肠道等分泌的激素, 不仅能调节肝外器官的活动, 而且能影响或改变肝脏的许多重要功能 肝脏病变特别是肝硬化时, 将对内分泌激素的作用及其代谢产生影响, 从而影响到内分泌功能 肝硬化时, 比较重要而且变化明显的激素主要有 : 甲状腺激素 性激素 膜岛素 膜高血糖素 生长抑素 醒固酣 皮质醇 心纳索 促胃液素 催乳素 血管活性肠肤 内皮素等, 以上激素多通过 RIA 法检测, 具体变化及意义属内科学探讨内容, 此不赘述 原发性胆汁性肝硬化 (primary 原发性胆? 十性肝质化 biliary c 盯 hasis) 是一种与自身免疫有关的肝内胆汁淤积 性肝硬化, 本病主要病变是肝内小胆管的非化服性炎症与梗阻 本病多见于 40~60 岁的 女性, 男女发病比为 1:9 其主要临床表现是慢性梗阻性黄瘟和肝脾肿大, 晚期亦可出现 n 脉高压和肝功能衰竭 本病的病因至今不明, 一般认为本病是一种自身免疫性疾病 本病常与其他自身免忏所菊一一一口

230 第十六章疫性疾病如类风湿性关节炎 干燥综合征 硬皮病 慢性淋巴细胞性甲 1 文腺炎等并存 患 者可有免疫球蛋白增高 ( 剧增高尤为明显 ) 自身抗体阳性, 也提示本病与自身免疫有关, 以及线粒体抗体 核抗体 胆管细胞抗体等 本病起病隐袭, 早期症状轻微, 病人一般情况良好, 食欲及体重多无明显改变, 约 10% 的病人可以没有任何症状 本病病程呈缓慢进行 常见的临床表现有 :1 慢性进行性梗阻性黄瘟 : 早期可无黄瘟, 而有皮肤瘟痒, 多数在瘟痒出现半年到 2 年后出现黄瘟, 约 25% 患者瘟痒与黄瘟同时出现 2 脂肪代谢紊乱 : 由于胆盐缺乏, 影响脂肪的吸收和利用, 引起脂肪泻和脂洛性维生素及钙缺乏症 3 肝脾肿大 4 皮肤粘膜出血倾向 5 晚期出现肝硬化和肝功能衰竭的各种表现 50 岁左右的女性, 有长期深度黄瘟病史, 肝脾肿大, 实验室检查符合阻塞性黄瘟诊断, 且伴有自身抗体阳性基本可以确诊本病 其免疫学检测的特点主要有 :1 自身抗体阳性 90% 线粒体抗体阳性, 为本病的特征性改变 2 细胞免疫力降低, 胁 f 明显升高 一般肝硬化可以检出的相应指标本病也可阳性, 在此不赘述 一. 免疫球蛋白 M 免疫球蛋白 M( imnunoglobulin M, 1 圳 ) 是由 5 个单体组成, 为分子量最大的免疫球蛋白, 是最有效的凝聚抗体, 有很强的激活补体的能力, 是免疫后出现最早的抗体 胁 4 分子在血清中含量不高, 只占 k 总量的 6% 左右 在原发性胆汁性肝硬化患者血清中刷明显升高 此外 I 剧增高还见于急性感染 急性病毒性肝炎 肝硬化等, 需要注意鉴别 二. 分泌型免疫球蛋白 A 免疫球蛋白 A( imnunoglobulin A, 19A) 的基本结构是由两条重链和两条轻链组成, 它可以有不同的聚合形式, 从单体到五聚体不等 血清中的 19A 主要是单体, 占全身 19A 总量的 85% 左右, 称血清型 19A, 外分泌液中的 19A 则以二聚体为主, 称为分泌型 19A 即 SlgAo SIgA 是多种细菌和病毒的中和抗体, 是重要的局部抗体 在原发性胆汁性肝硬化患者血清中可以见到 SIgA 的增高, 此外血清中 SIgA 增高也可见于胆道阻塞 急性病毒性肝炎 慢性肝实质病变和酒精性肝硬化 二. 抗核抗体抗核抗体 (anti - nuclear antibody, 业性 ) 是以真核细胞的核成分为靶抗原的自身抗体的总称, 主要是 Ig( 王和部分 Ig D, 无器官和种属特异性, 抗核抗体种类繁多 ANA 阳性对于诊断原发性胆汁性肝硬化等自身免疫性疾病有重要的价值 此外, 在硬皮病 类风湿性关节炎 干燥综合征等自身免疫性疾病中, ANA 阳性率也很高 四. 胆管细胞抗体胆管细胞抗体是原发性胆汁性肝硬化患者血液中存在的一种自身免疫抗体 主要见 肝脏疾病的免疫学检测223 于原发性胆汁性肝硬化, 特异性较高 五. 线粒体抗体 抗线粒体抗体 (AMA) 分为抗 M2 抗体 抗 M 抗体 抗鸟也抗体 抗 M 抗体四种亚型, 它们与线粒体膜不同的抗原决定簇起反应 其中 M2 抗原是原发性胆汁性肝硬化特异性 标志, 它由 5 种抗原决定簇组成 不同的 AMA 亚型与疾病的预后相关, 单独证实抗鸟也抗体和或抗 M2 抗体, 预后较好 ; 抗 M2 抗体 抗 M 抗体和或抗鸟也抗体阳性患者, 病程表现为进展性

231 224 第三篇临床免疫学检验90% 以上的原发性胆汁性肝硬化患者 AMA. 阳性, 且滴度常在 1: 128 以上, 无症状的 原发性胆汁性肝硬化此检查阳性率最高达 88.1 %,AMA. 为原发性胆汁性肝硬化的特征性 改变 ; 南度与病期或病情无明显关系, 因免疫抑制剂治疗后并不消失, 因而具有诊断价 值 其中 AMA. 的抗 M2 抗体亚型对原发性胆汁性肝硬化的诊断更具有一定的特异性 第四币 自身免疫性肝炎 自身免疫性肝炎 (autoimmu 时 hepatitis, AIH) 是一种自身免疫机制引起的肝脏炎症 本病具有与慢性活动性乙型肝炎相似的临床表现, 自身免疫性肝炎以血清中出现对肝细胞的细胞核 细胞浆或微粒体成分的自身抗体, 以 IgG 升高为主的高 γ 球蛋白血症, 肝组织学检查发现碎片样坏死为特征 本病好发于青年女性 ( 占 85% ) 本病病因未明, 由于有很明显的自身免疫现象, 且都对皮质类固醇治疗有反应, 因此认为本病为自身免疫性疾病 本病具有一个或多个触发因子, 如宿主免疫调节机制的内在损害 自身靶抗原的膜表达 扩增的细胞毒性 T 淋巴细胞浸润肝组织引起细胞破坏 大约 10% 的本病患者发病同急性肝炎 大多数患者的临床表现与慢性活动性乙型肝炎基本相似, 起病隐袭或缓慢, 主诉乏力 非固定性上腹疼痛和食欲不振, 起先可有关节酸痛 低热 乏力 皮咳 闭经等, 易被误诊为关节炎 结缔组织病或月经不调, 甚至黄瘟出现才被诊断 本病与慢性活动性乙型肝炎不同之处是全身性的肝外表现更为多见 (70% 的患者 ) 和明显, 有时甚至被肝外表现所掩盖 肝外表现为 :1 对称性 游走性关节炎, 可反复发作, 无关节畸形 2 低热 皮咳 皮肤血管炎和皮下出血 3 内分泌失调 : 类 CL 时 ung 面容 紫纹 座疮 多毛 女性闭经 男性乳房发育 桥本甲状腺炎 甲状腺功能亢进 糖尿病等 4 肾小管性酸中毒 轻型肾小球肾炎 5 胸膜炎 间质性肺炎 肺不张 纤维性肺泡炎和肺间质纤维化 6 血液改变, 如轻度贫血 白细胞和血小板减少 7 溃殇性结肠炎 10% ~20% 的患者在诊断为自身免疫性肝炎时己有肝硬化失代偿的表现 大多数患者 (82% ) 肝脏肿大, 约半数患者脾脏肿大, 黄瘟主要见于有症状的患者 符合下列条件时, 可以考虑自身免疫性肝炎的诊断 :1 女性患者 2 肝功能试验呈 " 肝炎样 " 改变 3 高丙种球蛋白血症 4 甲肝和乙肝血清学试验阴性,AMA.( 抗线粒体抗体 ) 阴性或浓度很低 符合下列情况时可以明确诊断 AIH: 1 血清 ANA SMA. 和口 1-1 的浓度超过 1: 血清 IgG 浓度超过正常上限 1. 5 倍以上 3 未使用肝脏毒性药物, 不饮酒 4 血清 HCVDNA 阴性 临床上病毒性肝炎和自身免疫性肝炎的诊断 鉴别诊断非常重要, 因为两种疾病的治疗原则截然不同, 前者应用免疫剌激药物如干扰素, 而后者则需要免疫抑制药物 目前用于自身免疫性肝炎诊断的各种肝病自身抗体的检测尚未在国内推广使用, 影响了国内这方面临床研究工作的深入和发展 自身免疫性肝炎特征之一是存在疾病特异性的自身抗 体, 如自身免疫性肝炎中的抗核抗体 (ANA) 抗平滑肌抗体(SMA.) 抗肝 ( 口创 ) 和抗可洛性肝抗原抗体 (SLA) 等 一. 抗肝 - 肾微粒体抗体 肾微粒体抗体

232 的一种针对肝 肾微粒体 (liver - kidney microsome, 口 们的自身抗体, 根据其自身抗原的 不同, 又分为 3 型 :antl 口 1] anti 口 12, anti 口 130 anti 口 1] 的自身抗原为细胞色 素 P450 II 凶 (CYP2 I 削, 是与自身免疫性肝炎 H 型有关的抗体, 自身免疫性肝炎 H 型患者 可同时伴有 Hσ 阳性 ( II b 型 ), Hσ 阴性的 AIH 患者 anti 口创 1 识别 CYF2 凶的 213~ 280 和 341 ~477 位点, 而 Hα7 阳性的患者 anti 口 1] 仅识别 341 ~477 位点 AIH 患者对 激素较敏感, 而在 anti 口 1] 阳性的 Hα7 患者, 类固醇激素干扰素治疗恨困难 anti 口 12 主要针对细胞色素 P450 II C9 0 anti 口 13 的自身抗原则是 I 型家族性 UDP 葡萄昔 酸转移酶稳定区的抗原决定簇 抗 口 也是 H 型自身免疫性肝炎的基本特征, 即抗 口 1] 阳性, 而抗核抗体和抗平 滑肌抗体均为阴性 自身免疫性肝炎 IIa 型 : 抗 口 1] 多呈高滴度阳性, 抗 Hα7 阴性 自身免疫性肝炎 li b 型及非自身免疫性肝炎 H 型丙型病毒性肝炎 : 抗 口 <M] 多呈低滴度 阳性, 抗 HαT ~ 日性 抗 口 12 见于药物性肝炎 抗 口 13 见于慢性丁型病毒性肝炎 二. 抗 P450 II I 记 抗 P450 II I 泊是针对细胞色素 P450 II I 泊中 254~271 位点的抗原决定簇, 是自身免 疫性肝炎众多自身抗体中的一种 抗 P450 II 凶常见于 H 型自身免疫性肝炎 二. 抗核抗体指标简介见原发性胆汁性肝硬化节 自身免疫性肝炎也常见该抗体阳性 四. 抗平滑肌抗体抗平 i 骨肌抗体 (smooth muscle antibody, 也 1A) 主要为 IgG 类, 少量为胁 f 类, 此抗体主要见于自身免疫性肝炎, 阳性率为 69% ~81 % 抗平滑肌抗体可以为自身免疫性肝炎提供诊断依据, 但由于也住在原发性胆汁性肝硬化和慢性活动性肝炎病人血清中检测阳性率也很高, 所以应注意鉴别 因为 Sill 病人 Sl\1A 测定为阴性, 可以作为 AIH 与 Sill 鉴别诊断依据 五. 抗可溶性肝细胞抗原可 ; 容性肝细胞抗原抗体是针对肝细胞浆中细胞角蛋白 8 和 18 的自身免疫性抗体 可洛性肝细胞抗原抗体主要见于田型自身免疫性肝炎, 病人都特征性地缺少抗口 11, 但 74% 的病人的血清平滑肌抗体或抗线粒体抗体阳性, 这表明可洛性肝细胞抗原抗体阳 肾微粒体抗体 (anti - liver - ki 出 ey microsome antibody, anti 口 1) 是近年来发现 225 第学检测抗肝 十六章肝脏疾病的免疫性并不与其他免疫血清标志物相互排斥 实际上, 11 % 的 I 型 AIH 病人具有可洛性肝细 胞抗原的抗体 可洛性肝细胞抗原抗体仅见于 AIH 病人, 然而不能确定是否因该抗体的 存在即可建立 A1H 的一个亚型或者为 I 型 AIH 变异的标志物 检测可洛性肝细胞抗原 抗体最大的临床价值可能在于评估原因不明的肝炎病人, 18% 这类病人存在该抗体, 从而 被确认为是自身免疫性肝炎患者 口原发性肝癌 (primary carcinoma of the Ii 口附飞胞发生的恶性肿瘤, 为我国的常见恶性肿瘤之一, 其死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第三忏所菊五原发性肝癌

233 226 第三篇临床免疫学检验位 我国每年约有 11 万人死于肝癌, 占全球肝癌死亡数的 45% 由于依靠血清甲胎蛋白 (AFP) 高敏感的检测方法结合超声显像进行普查, 对于慢性肝病随访, 使得肝癌在亚临床 阶段即可作出诊断, 从而使得五年生存率增加至 36.6% 临床上具有典型临床表现的病例不难诊断, 但多己属晚期 因此对凡有肝脏病史的 中年人 尤其是男性患者, 如有不明原因的肝区疼痛 消瘦 进行性肝肿大者, 应作 AFP 超 声显像 肝脏 cr 等检查, 争取早期诊断 同时相应的血清免疫学检测对于肝脏疾病的早 期诊断也有帮助 原发性肝癌患者所进行的免疫学检测, 尤其是甲胎蛋白 (AFP) 等肿瘤标志物的检测 在肝癌的早期诊断中占有重要地位 但其中一些免疫学检测指标的特异性并不高, 应当 注意其临床意义及相应的鉴别诊断 一. 肿瘤系列相关指标 (~) 甲胎蛋白 (α fetoprotei 日, AFP) 是由 590 个氨基酸组成的一种单肤链糖蛋白, 属 于胚胎性蛋白, 主要由胚胎时期的肝细胞和卵黄囊产生, 胃肠道粘膜上皮也可产生少量 出生后 AFP 浓度即迅速下降, 数月至 1 年内接近成人水平 O 正常肝细胞不产生 AFP, 当肝 细胞癌变后, AFP 又重新表达 临床意义如下 : 1. 肝癌患者血清 AFP 水平明显增高, 它为目前肝癌最好的早期诊断方法, 可在症状 出现前 6~12 个月作出诊断, 其专 - 性仅次于病理检查的诊断方法 2.AFP 为反映肝癌患者病情变化和治疗效果的敏感指标, AFP 是否降至正常己成为 判断是否为根治性手术的指标之一 3.AFP 有助于检出肝癌患者亚临床期复发与转移, 提示 AFP 对肝癌预后的评价具有一定的价值 4.AFP 增高还可见于转移性肝癌 慢性肝病 娃振及生殖腺胚胎源性肿瘤及良性家族性 AFP 增高等, 但其测定值均不如肝癌患者高 ( 二 ) 其他肿瘤指标其他肿瘤指标远不如 AFP 对于肝细胞癌专 - 性好, 也可见于其他恶性肿瘤 1. 癌胚抗原 (CEA) 在肝癌患者可有明显增高, 且与其临床分期及淋巴结转移呈正相关 ; 动态监测患者血清 CEA 水平对于患者病情监测 疗效评价及预后判断具有一定的临床意义 但是该指标增高还常见于大肠癌 胃癌 膜腺癌 肺癌 胆管癌 乳腺癌 卵巢癌及膀肮癌等恶性肿瘤 2. 糖类抗原 CA-50 是一种较普遍的肿瘤相关物质, 而不是特指器官的物质 在肝癌患者血清 CA-50 可以明显升高, 且其水平与其临床分期及淋巴结转移呈正相关 ; 动态监测患者血清 CA-50 水平对于患者病情监测 疗效评价及预后判断具有一定的临床意义 但是该指标增高还常见于大肠癌 膜腺癌 胃癌 胆囊癌 卵巢癌 肺癌 子宫癌及乳腺癌等恶性肿瘤 3. 糖类抗原巳 A 是结肠直肠癌和膜腺癌较为特异的肿瘤标志, 但在肝癌患 者血清中也常见增高, 且其水平与临床分期 肿块大小及淋巴结转移呈正相关 4. 糖类抗原 CA125 是一种卵巢癌相关抗原, 在肝癌患者血清中也常见增高, 且其水 平与临床分期及淋巴结转移呈正相关 在卵巢癌 肺癌 大肠癌 胃癌 乳腺癌及膜腺癌中 也常见增高

234 第十六章5. ~2 微球蛋白 (~2 - MG) 在肝癌患者的血 尿中均有增高, 在合并浆膜腔积液时往往积液中 ~2 -MG 水平高于其血清水平 在造血系统恶性肿瘤 肺癌 胃癌 大肠癌及食管癌中也可见其增高 二. 癌基因与抑癌基因及其蛋白 (~ )P53 蛋白 P53 基因是一种抑癌基因, 肝癌患者常见 P53 蛋白过表达, P53 基因突变可能与肝癌的恶性分化程度有关 P53 基因还可见于胃癌 大肠癌 膀肮癌 乳腺癌 前列腺癌 血液系统肿瘤等 ( 二 )c - erbb - 2 蛋白 c - erbb - 2 基因是一种癌基因, 肝癌患者中存在较高的 c erbb- 2 蛋白阳性率, c - erbb - 2 的表达与肝癌的 T 也 4 分期相关, 田 E 期患者 c - erbb 2 阳性率较 I H 期患者高 此外也常见于乳腺癌 卵巢癌 胃癌 大肠癌 肾癌及宫颈癌等 ( 三 )bcl- 2 基因 bcl- 2 基因是一种癌基因, 可能参与细胞凋亡的调控 在肝癌组织中存在一定的 bcl- 2 蛋白的表达率, 其中有淋巴结转移的其阳性率明显高于无淋巴结转移者 此外还高表达于血液系统肿瘤 乳腺癌 鼻咽癌 膀肮癌 前列腺癌等 ( 四 )P21 蛋白 P21 蛋白是有 Ras 基因编码的一种蛋白, 在肝癌患者癌组织中有一定 的表达 在大肠癌 胃癌 膜腺癌及急性白血病中也见表达 二. 肝癌患者细胞免疫功能测定 (~)T 淋巴细胞亚群肝癌患者存在 T 淋巴细胞亚群表达异常, 表现为 m3 + 及 CD4 + 细胞减少, CDs + 细胞增多, CD4 + CD s + 比值下降 提示肝癌患者有细胞免疫功能的下降 肝癌患者手术前后外周血 T 淋巴细胞亚群的变化能反映患者的细胞免疫状态 肝癌患者术后复发与细胞免疫功能低下有关, 因此 T 淋巴细胞亚群的检测可能有助于肝癌患者手术疗效及预后的判断 ( 二 ) 自然杀伤 (NK) 细胞活性肝癌患者 NK 细胞活性明显低于正常人群, 且 NK 细胞活性的降低程度与肝癌临床分期相关, 即随着分期的增高,NK 细胞活性逐渐降低, 说明 肝脏疾病的免疫学检测227 NK 细胞活性检测可作为肝癌患者细胞免疫功能的判断指标, 且其细胞免疫功能的下降与 病情进展有关 四. 细胞因子 肝癌患者血清中 1NF α 水平较正常人明显增高, 且其血清中相应可洛性 1NFα 受 体水平也较高, 与肝癌患者临床分期及恶性程度相关 肝癌组织中存在有 1G F- ~1 高表 达, 随着肝癌分期的增高其 1GF- ~1 表达也会逐步增高 提示它可以作为反映肝癌进展 的一项指标 肝癌患者血清 IL-6 也会增高, 且也与其分期相关 五. 细胞间粘附分子 肝癌患者血清中 p 选择素水平明显高于正常人群, 且其水平随着临床分期的进展而 逐步增高 肝癌患者血清中 sicam -1 明显高于正常人群, 肝癌组织中存在不同程度的 IC 丛 1-1 表达, 其中伴有淋巴结转移者的 IC 丛 1-1 阳性表达率明显高于没有转移者, 提 示 ICAM-1 的表达高低与癌细胞的转移与侵袭相关 六. 与肝癌转移及复发有关的指标 肝癌患者中存在血管内皮生长因子 (VEGF) 高水平表达, 且随着 VEGF 表达水平的增

235 228 第三篇临床免疫学检加, 发生淋巴结转移和复发的危险度增大 ream -1 的表达高低也与肿瘤的侵袭转移密 切相关 骨桥蛋白 (OPN) 在肝癌组织中常会有较高的表达, 且其表达越高则其浸润率与 癌转移率也就越高 参号文献 1 范列英, 仲人前, 孔宪涛等. 慢性乙型肝炎患者血清中特异性自身抗体的检测. 第二军医大学学报, 2000, 4: 309~311 2 林嘉友, 秦晓光 掌握抗体检测的临床意义与实验要求. 中华检验医学杂志,2000, 3: 133~134 3 刘锡光, 祁自柏, 熊师松病毒性肝炎诊断学第 2 版北京 : 人民卫生出版社, 孙凯, 冯琦, 金伯泉.CD Ig 融合蛋白研究及应用概况. 中华内科杂志, 2000, 6:426~428 5 李石 肝纤维化发生机制 中华消化杂志, 1999,1: 48 6 李蕴锁 1 日, 吕敏和, 马立宪 慢性乙型肝炎患者血清 1L- 8 测定及其意义. 中华肝脏病杂志, 1999, 7:61 7 刘芳, 刘金星, 曹治康等. 转化生长因子闷在慢性乙型肝炎患者肝细胞损伤和肝纤维化形成中的意义. 中华传染病杂志, 1999, 17 :241 ~244 8 罗瑞虹, 杨绍基, 谢俊强等. 五项血清学指标在诊断肝纤维化中的应用和筛选. 中华内科杂志, 2000, 39:415~416 验9 漆德芳主编. 肝硬化. 第 1 版. 北京科学技术出版社, 斯崇文. 从 HEV 的复制过程认识抗 HEV 药物的作用 效果和抗 HEV 的策略 临床肝胆病杂志, 2000, 16: 苏菲. 重型病毒性肝炎患者血清甲胎蛋白变化的意义. 中华肝脏病杂志, 1999, 7: 53~54 12 萧树东主编. 消化病学新理论与新技术. 上海科技教育出版社, 杨长青, 胡国龄, 周文红等 秋水仙碱对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶 1 及其抑制因子表达的 影响 中华传染病杂志, 2000, 18:176~ 中华医学会传染病与寄生虫病学分会 肝病学分会 (2000 年 9 月西安会议联合修订 ). 病毒性肝炎防 治方案. 中华传染病杂志, 2001, 14: 146~ 周光炎主编. 免疫学原理. 上海科学技术文献出版社, Bertolino P, Klimpel G, Lemon SV1.Hepatic inflammation and immunity: a summaryof a conference on the function of the immune system within the liver, Hepatology, 2000; 3l(6): 1374~ Chen Zirong, Liu Xiaopen,, Zhang Guoan, et a!' Role of thymic factor D on nitric oxide in patients with chronic hepatitis B,] Gastroenter Hepatol, 1999, (SuppI) : Lan GKK, Role of C 凶 positive lymphoc 阶 s in viral hepatitis Band C infection.] Gastroenter Hepatol, 1999, (SuppI) :A Wiest R, Groszmann 阳.τbe paradox of nitric oxide in cirrhosis and portal hypertension: t, much, not enough.hepatolo 町, 2002;35 :478~ Doherty DG, Norris S, Madrigal - Estebas L, et al.τbe human liver contains multiple p 口 pulations of NK cells, T cells, and CI:\+ CD~ natural T cells with distinct 币 to 范 c activities and Th l,th 2, and 1bo 币 kine secretion pat terns.] lmmunol, 1999;163:2314~ Pinzani M,Marra F, Carloni V. Signal transduction in hepatic stellate cells.liver, 1998; 18:2 ~ Shimoda K, Mori M, 也 ibuta K, et a!' Vascular endothelical growth factor vascular permeability factor mrna ex pression in patients with chronic hepatitis C and hepatocellular carcinoma. Int ] 臼 lcol, 1999; 14: 353 ~ 359

236 所菊忏口第十七章 肾脏疾病与免疫 肾脏的生理结何和特点 肾脏 (kidney) 是人体重要的生命器官之一, 它担负着调节机体内水 电解质和酸碱平衡, 并通过尿液的排泄把体内产生的代谢终末产物 药物 毒物排出体外, 以维持机体内环境的稳定 一旦肾脏的结构受到破坏, 必将影响到肾脏的排泄功能, 最终导致机体内环境与自稳态破坏, 表现出一系列临床症状 引起肾脏功能受损的原因很多, 免疫功能的紊乱和失衡等免疫因素是造成肾脏疾病的主要原因之一 人类有两个肾脏, 肾脏的基本功能单位是肾单位, 每个肾脏大约有 100 万个肾单位 肾单位由肾小体和肾小管组成, 肾小球和肾小囊组成肾小体 肾小球的固有细胞有上皮细胞 内皮细胞和系膜细胞, 而肾小管的固有细胞有小管上皮细胞和间质纤维细胞 机体的免疫功能异常通常是一种全身性的病 理过程, 可以累及肾组织引起肾小球肾炎 间质性肾炎 肾内坏死性血管炎等肾脏免疫性疾病肾小球为血液的滤过器, 对于血液中的物质, 根据其分子大小以及带电的性质选择性地滤过 滤过膜由内皮细胞窗 基底膜 上皮细胞足突的裂隙孔组成 肾小球内皮细胞是特殊的毛细血管内皮细胞, 是肾小球滤过膜的重要组成部分, 多分布于毛细血管拌的周围, 在结构上有特殊的内皮窗, 窗口直径约 50 nin, 肾小球内皮细胞表面有糖蛋白覆盖 损伤的内皮细胞可以表达粘附分子, 分泌 IL-l 1NF IL-8 MCP-l 等细胞因子 肾小球基底膜 (glomerular basement membrane, GBM) 位于上皮细胞足突和内皮细胞之间, 其主要成分为 E 型胶原 层粘连蛋白 硫酸乙酷肝素蛋白多糖等 肾小球上皮细胞分两类, 即脏层的足细胞和覆盖肾小囊基底膜的壁层上皮细胞 足细胞的胞体伸出许多小梁结构, 这种 229 第十七章肾脏疾病. 肾小球与免疫一 小梁结构再分出许多绒毛样结构, 形成足突 足突附于肾小球基底膜上, 足突问裂隙孔的直径 25~50 nino 二. 肾小管肾小管分为近曲小管和远曲小管 近曲小管上皮细胞 基底膜起始于肾小囊, 细胞成立方形, 胞浆内有丰富的嗜碱性颗粒和线粒体 细胞的管腔侧有许多微绒毛, 组成刷状缘 远曲小管上皮细胞呈矮柱状, 排列紧密, 胞浆嗜酸性, 管腔有较短的刷状缘 肾小管上皮细胞能分泌 1GF- ~ IL-6 IL- 8 EGF 等细胞因子 肾小管为原尿重吸收和代谢终末产物分泌的部位, 原尿中的水 电解质 葡萄糖 氨基酸 多肤和小分子的蛋白质等物质绝大部分通过近曲小管上皮细胞被重吸收

237 230 第三篇临床免疫学检验第二币 引起肾脏疾病的免疫学因素 肾脏以其特殊的解剖组织结构, 通过尿的生成和排泄维持机体内环境的稳定 但是 在清除机体的代谢产物时, 肾脏非常容易受到药物 细菌 病毒等的损伤, 暴露自身抗原, 从而诱导自身免疫应答的发生 ; 同时肾脏基底膜与一些细菌存在共同抗原, 也可以使肾脏 受到损害 一般来讲, 引发自身免疫性肾病的因素有以下几点 : 第一, 自身抗原与共同抗原 肾小球基底膜 (GEM) 是人类肾脏的主要结构抗原, 其中 的 N 型胶原 层粘连蛋白 硫酸乙酷肝素蛋白多糖等都是隐蔽抗原 在手术损伤 外伤 药 物 外源性微生物的作用下, 肾脏组织被破坏, 隐蔽抗原得以暴露, 诱导机体产生自身抗 体 病毒 细菌等外源性抗原与肾脏有共同抗原, 通过分子模拟作用, 损伤肾脏组织 如 洛血性链球菌感染后, 机体针对洛血性链球菌所产生的抗体 (ASO) 可作用于肾脏的基底 膜, 导致肾小球肾炎 第二, 疾病易感基因 现有的研究表明, 肾脏的某些疾病与易感基因有关, 有遗传的 倾向 例如在我国北方的汉族人群中, 膜性疾病与 HlA - DRw11,1gA 肾病与目 A-DR 12 有显著的相关性 第三, 自身反应性 T 细胞 一般认为, 体液免疫在肾小球肾炎中起主要作用, 针对肾 脏组织成分的自身抗体, 以及免疫复合物在肾脏基底膜上的沉积是造成肾脏损害的主要 原因, 属于 H 型及田型超敏反应应答机制 目前, 动物实验以及人体的研究证明, T 细胞 能够转移某些类型的肾小球肾炎 另外, T 细胞复杂的膜受体也增加了免疫应答的多样 性 第四, 免疫介质的作用 免疫介质的作用包括免疫复合物造成的损伤 ; 补体活化产物 对免疫复合物的洛解 清除引起的损伤 ; 补体活性片段 C3a C5a 等趋化因子的作用 ;P 四 :;F 及 IL-1 1NF 等的作用 ; 肾小球细胞分泌的 IL-1 6 8,1NF MCP-1, PAF CSF 1GF- ~ 以 及内皮素等细胞因子的作用, 加剧了局部的炎症反应 第五, TH1 TH2 细胞的漂移 TH 细胞在调节免疫应答过程中起到重要的作用 一般认 为, TH1 细胞介导细胞免疫, 而 TH2 细胞介导体液免疫 在 TH2 细胞占优势的情况下, 机体体 液免疫的能力增强, 容易产生针对自身组织成分的自身抗体, 引起自身免疫性肾病 如 Sill 患者, TH2 细胞明显占优势, 体内产生大量的自身抗体, 最终累及肾脏, 导致狼疮肾 一. 肾小球肾炎的免疫损伤机制 肾小球肾炎是包括临床表现 病理改变及发病机理各不相同的肾小球疾病的总称 肾小球肾炎的发生并不是由于细菌本身或其产物直接侵犯肾脏, 感染所引起的免疫反应 是导致肾炎的起始原因 随着细菌学 生物化学和免疫学的发展以及电子显微镜和免疫 荧光技术的应用, 确立肾小球肾炎为免疫性疾病 人们将肾小球肾炎归纳为抗肾小球基 底膜抗体肾炎 ( 抗 GEM 抗体肾炎 ) 和免疫复合物性肾炎两类 (~) 抗体与肾小球肾炎抗体是引起肾小球肾炎的主要原因, 这些抗体在肾小球内 起反应的位置 性状 是否为阳离子的抗体以及所释放的炎症介质的不同, 使形成的肾小球肾炎的类型有很大的差异 和肾小球固有成分反应的抗体有 :1 和 GEM 抗原反应的抗 GEM 抗体 2 和上皮细胞的糖蛋白 (gp330) 反应的抗 Fx- IA 抗体等 3 预先在 GEM 植

238 第十七章入抗原, 然后剌激产生抗体引起反应 在人类肾炎中有抗 DNA 抗体, 在实验中典型的模型是植物血凝刀豆素 A( concanavalin A, Con A) 与 GEM 起生物化学反应之后, 再给予抗 na( 抗体 ) 发生免疫现象 4 抗血管紧张素转换酶 (angiotension converting enzyme, ACE ) 抗体 5 抗 thy-l 抗体等 1. 与肾小球组织有交叉反应的自身抗体 (1) 抗 Fx-IA 抗体 Fx-IA 是在肾近曲小管刷状缘和肾小管上皮细胞膜上共同存在的抗原物质 (gp330), 当静注抗 Fx- IA 抗体时, 在上皮细胞形成膜攻击复合物 (membrane attack complex, MAC), 发生上皮细胞损伤 这是在人类膜性肾病的发病机理上的一个重要的实验模型 (2) 抗吐 W-l 抗体 thy - 1 抗原是局限在胸腺细胞 ( thymocyte) 膜表面分子量为 18 kda 的糖蛋白 将免疫家兔制成的抗大白鼠 thy-l 抗体给大白鼠静注时, 1 ~24 h 产生补体依赖性系膜细胞的变性 坏死, 进而发生系膜融解, 几日后发生系膜细胞增殖, 3~4 个月后可以看到系膜基质增生 抗 thy -1 抗体具有促进免疫复合物在系膜细胞内沉积的功能, 人类有无相似的发病机制尚无定论, 然而在研究系膜增殖性肾炎的发病机理中, 这是一个有趣的实验结果 (3) 抗血管紧张素转换酶抗体 1987 年松尾 A 且 dres 等给家兔静注抗家兔血管紧张素 转换酶绵羊血清时, 在注射后第 10 d, 抗体在肾小球内皮细胞膜形成颗粒状, 3~24 d 可明显看到上皮下颗粒状沉积物 这是免疫复合物在内皮细胞内形成, 进而激活补体系统, 造成肾小球上皮细胞和内皮细胞损伤 2. 与肾小球组织特有抗原反应的抗体 (1) 抗 GEM 抗体 Goodpasture 综合征的最大特点是在患者血清中出现大量的抗自身 GEM 的抗体 GEM 致密层的主要成分是 E 型胶原, N 型胶原是隐蔽抗原, 正常情况下不与免疫系统接触 当病毒 细菌感染或其他因素导致肾小球滤过膜损伤时, N 型胶原的 6 聚体分解 释放, 与机体的免疫系统接触, 剌激机体产生抗 GEM 抗体, 所以抗 GEM 抗体的产生与 GEM 的损伤密切相关 抗 GEM 抗体通过血液循环到达肾小球滤过膜, 与 GEM 形成免疫复合物而诱发膜性肾炎 (2) 抗外源性嵌入抗原抗体肾小球滤过膜表面带有负电荷, 形成负电荷选择屏障 肾脏疾病与免疫231 当分子量为 55~1 000 kda 之间的阳离子物质通过滤过膜时, 容易与滤过膜上的负电荷结合, 在滤过膜上形成一种嵌入性的抗原 机体的免疫系统如果能够识别该抗原的抗原表位, 就能产生针对这种抗原的特异性的抗体, 这种抗体进一步和嵌入性的抗原结合, 这样就能在肾小球的滤过膜的表面形成抗原抗体复合物, 从而导致肾小球肾炎 除了嵌入性阳离子抗原外, 像 DNA(PI4.5) 人刷状缘抗原 (PI 5.4), HBsAg 和 HCV 均为非阳离子抗原, 也能与 GEM 结合形成嵌入性抗原 如 DNA 嵌入 GEM 后, 抗时也抗体就能与 GEM 结合生成免疫复合物, 这是狼疮性肾炎发生的原因 ( 二 ) 免疫复合物与肾小球肾炎免疫复合物型肾小球肾炎 (irm 丑 une complex glomeru 10 日 ephritis) 是因抗原抗体复台物或免疫复合物 (I C) 在肾小球内沉积导致补体系统的激活 白细胞和巨噬细胞的趋化而发生持续性肾小球的组织损伤 目前认为抗原抗体反应即 IC 形成, 有循环免疫复合物形成及肾小球内原位形成两种机理 1. 循环免疫复合物所致的肾小球肾炎当某些抗原或半抗原进入机体后, 就会剌激

239 232 第三篇临床免疫学检验机体免疫系统产生抗体, 产生的抗体在血循环中与特异性抗原结合形成可洛性的循环免疫复合物 (crc) 例如给家兔一次注射较大剂量的天然牛血清白蛋白(liSA) 时, 家兔在第 4~5d 产生针对 lisa 的相应抗体, 该抗体和血液中残存的 BSA 形成 rc o 由于血中的 lisa 在形成 rc 时被消耗而急速地减少, 于注射后 1O ~14d, 血中出现游离的抗体, 这时血液中不能检出 lisa, 也不形成新的 rc 血液中抗原抗体的比例对形成免疫复合物及其在炎症部位的沉积非常重要 在注射 BSA 的初期抗原显著过剩状态时, 形成小分子的可洛性循环免疫复合物 (crc), 持续存在于血流中, 不在肾小球沉积 当抗原抗体比例相当时则形成中等大小的可洛性 crc, 这种 crc 具有生物活性并能固定补体, 当它流经肾脏时, 通过肾小球基底膜 (GBM) 在上皮下 内皮下和系膜区沉积而引起肾炎, 肾炎以单核细胞浸润为主 当血中的抗体量增加, 成为抗体过剩状态时, 形成大的不洛性 crc, 被网状内皮系统所吞噬而不在肾脏沉积 当注射的抗原 ( 如 BSA) 消耗殆尽时, 就不再形成抗原抗体复合物 因此, 急性血清病的肾小球病变是一过性的 给动物少量多次反复注射出 A 后, BSA 与游离的抗 BSA 抗体形成 crc, 2~3 个月后形成持续性肾炎 ( 慢性肾炎 ) 人洛血性链球菌感染所引起的急性肾炎与急性血清病肾炎发病机理相同, 均为循环免疫复合物沉积所致 不过, 也有报道认为它是原位 rc 形成引起的肾炎, 目前尚无一致的意见 慢性血清病肾炎可以认为是人类慢性肾小球肾炎的模型 在由 crc 在肾小球内沉积所致的肾小球肾炎发病中, rc 分子量的大小 抗原和抗体的性状及抗体的效价有重要的影响 除此以外, 肾炎的形成还受伴随抗原抗体反应的血管活性物质的释放 作用于肾小球的血压 GBM 或 rc 的带电状态及包括系膜细胞的网状内皮系统的功能等影响 2. 原位免疫复合物所致的肾小球肾炎原位免疫复合物是指肾小球内先存在着抗原或抗体, 与循环中的相应的抗体或抗原结合, 在局部形成的免疫复合物 在肾小球免疫损伤的机制中, 主要是针对肾组织或嵌入性抗原的抗体与相应抗原结合所形成的免疫复合物 形成原位免疫复合物的抗体主要有 : 抗 GBM 的抗体 抗 Fx- la 抗体 抗 Thy-1 抗体 抗 ACE 抗体 抗 DNA 抗体等 原位免疫复合物通过激活补体系统导致肾小球损伤 ( 三 ) 补体与肾小球肾炎在肾小球肾炎的免疫损伤机制中, 单纯的免疫复合物沉淀并不能引起肾小球结构和功能的损害 ; 只有当补体系统被沉淀的免疫复合物激活后, 并释放出一系列细胞因子才能造成肾小球细胞的肿胀与坏死 GBM 破坏和系膜细胞增生等肾组织的损害 由于免疫复合物在肾组织沉淀的部位不同, 所产生的损伤的机制略有不同 1. 上皮细胞下沉积物与补体的激活在上皮下形成免疫沉积物 (immune deposit, ill) 时, 可以激活补体系统, 最终 b~9 被激活形成 MAC 而损害上皮细胞 ( 图 17-1) 这时, 无中性粒细胞移动, 不释放活性物质, 是上皮下沉积产生补体依赖性中性粒细胞非依赖性肾小球损害 当 MAC 在细胞膜形成时, 产生剂量依赖性细胞膜洛解 ( 肾小球上皮细胞剥离 细胞坏死 ), 亚溶解剂量时则可致离子流动 渗透调节的变化, 通过细胞膜的脂质代谢异常等而发生细胞膜的功能损害 亚洛解细胞毒性的 MAC 作用于肾小球上皮细胞时, 立即产生大量蛋白尿 MAC 长期作用时, 则抑制从上皮细胞分泌细胞外基质, 引起 GBM 的电荷和 ( 或 ) 大小屏障的损害,{ 吏蛋白通透性增加 因为 MAC 本身为新抗原, 故能剌激产生抗 MAC 抗体, 这在人类的膜性肾病 LN, 紫癫性肾炎 19A 肾病以及实验性肾炎中的被动性及主动性 Haymann 肾炎及抗 thy-1 抗体肾炎

240 经典途径 替阳瞌 +\ C6 C7 c8 C9n 中均得到证实 s 小球上皮细胞损伤 由 M 破辉 + 蛋白尿 血尿 管型尿 图 内皮蛐包肺胀 系膜细胞增生 1 补体系统激活与肾小球肾炎 2. 内皮细胞下免疫沉积物在肾小球内皮细胞下形成的免疫沉积物可激活巳缸, 通 第十七章肾脏疾病与免疫骨小球撞过率降低 过 C5a 趋化性和免疫吸附作用, 使中性粒细胞 单核细胞在肾小球毛细血管壁集中 凝集, 在此基础上通过活性氧 (reactive oxygen specis, ROS) 蛋白酶 前列腺素等组织损伤性因子 导致 GEM 的损伤 因此可以认为, 内皮细胞下免疫沉积物是通过补体介导进而引起中性粒细胞依赖性的肾小球损伤 3. 其他补体的作用 Cl~C3 在体外有洛解 IC 的作用, 在低补体血症性肾炎的血清中, 缺乏这种 IC 洛解作用, 所以, 低补体血症性肾炎的发病机理之一是由于血清中存在多量的 IC 沉积于肾小球所致 系统性红斑狼疮 (SLE) 时常可观察到先天性 c4 部分缺乏, 这类病例和岛怔巳 N 一样, 容易发生 IC 性肾炎 另外, 缺乏红细胞 b 受体的 SLE 亦容易发生 IC 性肾炎 另一方面, Clq C3d 层粘连蛋白 (lamini 川 纤维粘连蛋白等易与细胞外基质结合, 这种特性间接地导致含补体的 IC 与 GEM 及系膜基质起反应 ( 四 ) 细胞免疫介导的肾小球损伤 T B 淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞功能的正常以及细胞因子分泌与传递的正常是维持机体免疫功能正常的基础 当机体的细胞免疫系统出现紊乱时, 尤其是 T 细胞功能出现紊乱时, 常常就会产生细胞介导的肾小球的损害 动物实验表明, 将动物的 B 细胞用环磷酷肢杀死, 体内只残留 T 细胞时, 再用 GEM 免疫功

241 234 第三篇临床免疫学检验物, 结果该动物发生新月体肾炎, 并且在肾小球内可以观察到辅助性 T 细胞的浸润 这种肾炎可通过致敏的 T 淋巴细胞转移给同种的动物 这就提示该实验模型中抗 GEM 抗体肾炎与体液性抗体无关, 而是通过 T 细胞发生的, 也就是说与机体的体液免疫无关, 是机体的细胞免疫发挥作用的结果 在人类的疾病中 :1 系统性红斑狼疮 (Sill) 患者, 存在着显著的 TH1 TH2 漂移的现象 : 即患者休液免疫占主导地位, 患者体内出现大量的自身抗体 Sill 患者伴有 TH 与 Ts 比值 (Rr) 降低时, 大多数患者有较严重的肾脏疾病, 同时伴有淋巴细胞减少和血小板减少, 一般没有系统性疾病和干燥综合征 相反,Rr 值高的 Sill 患者通常无严重的肾损害, 但是有严重的广泛的系统性疾病和干燥综合征 淋巴结肿大 肌病等 其发病机理可能与患者的 Ts 的缺陷或降低或功能低下有关, 使 B 细胞产生抗体能力亢进, 产生过量的抗自身抗体, 主要是抗 DNA 抗体, 从而导致 IC 性肾炎 2!gA 肾病患者血液中!gAl 亚型增加, 引起!gAl 亚型增加的原因可能与患者外周血淋巴细胞产生!gA 的能力增加有关, 并且以!gAl 亚型为主!gA 的增加又可以诱导机体产生表面带有!gAl 特异性的 Fe 受体的 CD4 + 的 T 淋巳细胞, 患者表现为 CD4+ 淋巴细胞增加, ωj 淋巴细胞减少 有文献报道, I 队肾病患者血液中特异性 Tα4 细胞显著增加, T,α4 细胞被认为是具有控制免疫球蛋白合成开关作用的免疫细胞, 它能抑制酬的合成和促进 I 队的合成 ( 五 ) 肾小球肾炎的临床表现肾小球肾炎是由多种病因引起的一组常见的原发性肾小球免疫反应性疾病, 临床表现错综复杂, 时重时轻, 病程进展速度不一 肾小球疾病常有如下临床表现 : 1. 尿异常有不同程度的蛋白尿及血尿 ( 肉眼血尿或镜下血尿 ), 并常可见到透明管型或细胞管型 颗粒管型等 2. 水肿水肿是肾小球疾病最常见的临床表现, 起初为早起眼险或颜面部浮肿, 后为足部 t 果部 下肢乃至全身水肿 3. 高血压肾小球疾病重要的体征, 急性肾小球肾炎大多数病人有高血压, 发展到末期肾衰时 80% 的病人有高血压 4. 贫血肾小球疾病是引起贫血的原因之一, 但原发性肾小球肾炎只有在肾功能严重损害发展到肾功能不全时才逐渐出现贫血 根据 1982 年 WHO 和 1985 年第二届中华肾脏病学术会议, 对 " 肾小球疾病的临床表现 分型 " 归纳如下 : 1. 急性肾炎综合征突然发作血尿 蛋白尿 高血压 水纳据自和肾小球滤过率 (GFR) 减低 急性肾炎多在洛血性链球菌感染后 3~40 d( 最多在 7~20 d) 出现上述的临床表现, GFR 减低可出现一过性氯质血症 大多数病例预后良好, 一般在数月至一年痊愈 2. 急进性肾炎综合征突然或隐匿发作血尿 蛋白尿 贫血和肾功能急速进行性减退 急进性肾炎大多起病急骤 病情危重, 蛋白尿 血尿 管型尿 水肿等表现较明显 可有高血压, 迅速发展的贫血和低蛋白血症, 迅速出现进行性肾功能不全, 多数病例在短时间内出现尿毒症症状 如无有效的治疗, 多于半年内死于尿毒症 急进性肾炎的临床表现可见于抗 GEM 抗体病 G dpast 旧 e 综合征 免疫复合物性肾炎!gA 肾病 紫癫性肾炎 膜性增殖性肾炎以及极少数洛血性链球菌感染后急性肾炎 狼疮性肾炎 结节性多动脉

242 第十七章炎 Wegner 肉芽肿等 3. 慢性肾炎综合征有不同程度的蛋白尿 血尿和高血压, 常伴有缓慢发展的肾功能不全 慢性肾炎的病情迁延, 时重时轻, 根据有关资料统计 15% ~20% 病人有急性肾炎病史, 而大多病例无明显的病因可寻 大多数病例在疾病后期有不同程度的肾功能减退, 逐渐出现贫血, 最后进入肾功能衰竭终末期, 出现尿毒症的各种临床表现 病程中可因呼吸道 泌尿道或肠道等部位感染为诱因出现类似急性肾炎的表现 因此, 根据临床表现又可进一步区分为 1 慢性肾炎普通型 : 有肾炎的各种临床症状而无突出表现 ;2 高血压型 : 除一般肾炎症状外, 有高血压的突出表现 ;3 急性发作型 : 在慢性肾炎过程中出现急性肾炎综合征的临床表现 4. 肾病综合征大量蛋白尿 低蛋白血症 水肿, 常伴有高胆固醇血症 可有多种多样的肾小球病变, 如微小病变肾病 膜增殖性肾炎 局灶性节段性肾小球硬化 膜性肾病 系膜增殖性肾小球肾炎等 ; 在狼疮性肾炎 19A 肾病 紫癫性肾炎以及糖尿病性肾病 肾淀粉样病变时, 亦可表现为肾病综合征 5. 复发性或持续性血尿 蛋白尿隐匿或突然发作 大量或镜下血尿伴有或无蛋白尿 没有其他肾炎综合征的证据或急 慢性肾炎 肾病史, 无明显临床症状或体征 尿检异常, 以复发性或持续性镜下血尿为主, 1 国见肉眼血尿, 相差显微镜检查为多形型尿红细胞, 计数 >1 X 10 4 / 时, 称为 " 单纯性血尿 ", 如以少量蛋白尿为主 «1. 0 g/24 h) 称为 " 无症状性蛋白尿 " 肾功能良好 二. 肾小管及间质的免疫损伤机制肾小管间质性肾炎 (tubular interstitial nephritis, TIN) 是指以肾小管基底膜 (tubular basement membrane, IBM) 破裂, I 剧 C3 抗 IBM 抗体沉积, 肾小管上皮细胞变形与坏死以及肾小管周围有单核细胞 嗜酸性粒细胞或纤维母细胞等细胞浸润为特征的一种病理过程 它的病变可以累及肾小球, 也可以不累及肾小球, 前者称为继发性的 T 凹, 后者称为原发性的 TINa 目前认为, 绝大多数肾小管间质性疾病可能与肾小球肾炎一样也是由免疫机制所介导 (~) 体液免疫因素 1. 肾小管基底膜肾小管基底膜中相关的靶抗原是由近曲小管上皮细胞合成分泌 肾脏疾病与免疫235 的, 是分子量约 4.8 kda 的糖蛋白, 并被命名为 3M-1 根据小鼠肾小管上皮细胞 edna 文库分析, 发现不同的物种中, 3M-1 都含有 5 个独特的氨基酸末端, 其构成的环状区域 为免疫相关部位 正常时肾小管表达的 3M-1 仅仅 " 隐藏 " 在表达部位, 不能与循环中的免疫细胞接触 当在病原微生物 药物或外伤的作用下, 肾小管基底膜受到损害时," 隐藏 " 的 3M-1 靶抗原得以暴露, 使之与循环中的免疫细胞接触, 剌激机体的免疫细胞产生抗 3M-1 的抗体 抗 3M-1 的抗体通过血液循环到达肾小管基底膜, 与靶抗原结合形成 IC 并以颗粒状沉积 临床上干燥综合征患者肾小管基底膜上有 Ig( 王和补体的沉积, 其发生的机制可能是 " 隐藏 " 的肾小管抗原释放, 剌激机体产生相应的抗体, 或是与肾小管上皮细胞有交叉抗原的涎腺上皮细胞抗原剌激产生的抗体, 形成 IC 造成肾小管及间质的损伤 2. 肾小管上皮细胞某些病原体或药物的分子上, 具有与肾小管细胞表达的靶抗原结构相似的抗原表位, 通过分子模拟作用, 产生能与肾小管上皮细胞抗原发生交叉反应的

243 236 第三篇临床免疫学检验自身抗体, 从而激发机体的自身免疫反应 例如, 治疗类风湿关节炎的药物可能直接损伤肾小管上皮细胞 (1EC), 使上皮细胞暴露 " 隐藏 " 抗原, 并剌激机体产生自身抗体, 最终导致肾小管间质的损害 也有人认为, 在正常情况下,1EC 可表达少量的 MHC- II 分子, 但某些细胞因子如 IFN - Y,1NF α 等可明显增加其表达量 因此, 受剌激的 1EC 将靶抗原加工后并通过其表面的岛 1HC- II 分子向 CD4 +T 细胞递呈抗原, 此种相互作用可能引发机体自身免疫反应 抗 ωj 细胞抗体或抗阳 -IC - II 抗体可阻止 1EC 的这种抗原递呈作用 另外, 轻链肾病患者血清中游离的免疫球蛋白轻链增加, 轻链在近曲小管上皮细胞被 大量重吸收, 造成 1EC 功能和结构直接损伤 Tamm - Horsfall(T- H) 蛋白是一种交叉免 疫性抗原 ( 与肝脏组织细胞抗原有交叉性 ) 在自身免疫性 TIN 时, 肾小管间质内出现 T-H 蛋白积聚和 T-H 的 IC 沉积, 并且伴有炎性细胞的浸润 它还可以通过其 位的 3 个氨基酸残基与中性粒细胞上特异的唾液酸受体结合, 导致细胞的氧化反应和细胞完整性的破坏 除了上述因素外, 还有与肾小管间质损伤有关的靶抗原近曲小管上皮细胞刷状缘 (Fx- IA) 0 ( 二 ) 细胞免疫因素 1. 原发性 TIN 原发性 T 凹的特点是单核细胞 巨噬细胞 中性粒细胞以及浆细胞的浸润 这种炎性细胞的浸润在肾皮质较为突出, 并且常常可以引起间质水肿 IBM 断裂, 严重的病例可以出现间质结构的破坏 浸润的炎性细胞中可兼有 ωj 和 CDs + 细胞 药 物引起的肾小管间质损伤是 T 剧中较为常见的一种, 其 CD4 + 细胞为主要的浸润细胞 相反, 在各种自身免疫性 T 剧中, 则 ωj 为最终的效应细胞 CDs + 细胞对携带靶抗原的肾小管细胞有直接的细胞毒作用 此外, CD4 + 和 ωj 均可以通过释放细胞因子影响成纤维细胞和上皮细胞 2. 继发性 TIN 各种肾小球疾病常伴有肾间质性细胞的浸润, 各种肾血管性疾病, 尤其是 Wegener 肉芽肿亦伴有肾小管间质炎症, 间质浸润的程度与肾脏功能的损害程度密切相关 继发性 T 凹的浸润细胞主要是 ωj 细胞, 也有少量 ωj 细胞参与 ; 但是狼疮性 肾炎以及肾移植排异反应中, 则以细胞毒性 CDs + 细胞为主 一. 免疫荧光检测 所菊一一一免疫性肾病的实验室检测 免疫性肾脏疾病中, 绝大多数患者的确诊常常需要进行肾组织沉积物的免疫荧光检 测 此方法的优点是操作简便 直观性好 特异性强 忏口(~) 试验原理直接免疫荧光法 : 具体操作过程是首先进行肾穿刺, 取肾活组织进行 冰冻切片制备被检测标本片再将荧光素标 i 己的己知特异性抗体滴加到待检肾组织标本 上, 荧光标 i 己的抗体与小球滤过膜或小管上的 IC 沉积物中特异性抗原结合形成复合物, 然后, 荧光显微镜下观察荧光染色的 IC 沉积物的分布和性质 免疫荧光的检测方式也可 采用间接免疫荧光法 ( 二 ) 检测项目 IC 沉积物中 IgG 19A, Iβ4 19E Clq C3 c4 C5 和备解素 二. 血清 CIC 测定

244 第十七章目前认为, 肾小球肾炎绝大多数属于免疫性疾病, 其发病与 IC 密切相关 因此, 测定血循环中 CIC 的含量, 对其发病机制的了解和疾病的诊断有着非常重要的意义 (~) 试验原理根据 CIC 的物理学 免疫学和生物学特性, 目前较为适合临床检测 CIC 的方法主要有 5 种 : 1.Clq 结合试验 ( 固相法 ) 先将 Clq 吸附于国相载体表面, 然后将待检血清加热到 56'C 灭活游离的补体和 CIC 中结合的补体, 灭活后待检血清加入吸附 Clq 的固相载体上, 待检血清中 CIC 与 Clq 结合 再加入同位素标记或酶标 i 己的抗人 19β 抗体, 最后检测标记物放射活性或酶活性 2.Clq 偏差试验 先将同位素标 i 己的 Clq 与灭活的待检血清混合, 再加抗体致敏的绵 羊红细胞, 温育 离心后, 检测红细胞的放射活性 3. 胶固素结合试验胶固素 ( 能与 C3d 特异结合 ) 先固定于固相载体表面, 再加入灭活的待检血清 (CIC 都带有 C3d), 温育 洗涤后, 加入同位素标记或酶标 i 己的抗人 IgG 抗体, 最后检测标记物放射 ii5 性或酶活性 4. 单克隆盯 (m 町 ) 固相抑制试验将单克隆盯吸附于国相载体上, 加入待检血清之后再加入同位素标 i 己的可洛性热聚合 I 剧 如果标本中含有 CIC, 固相 m-rf 与 CIC 结合, 热聚合 19G 与 m-rf 结合被抑制 5.Raij 细胞试验 Rail 细胞表面无免疫球蛋白, 但有大量的 Clq C3b 和 C3d 受体 因此, 在补体参与下,Rai] 细胞能与 CIC 中的补体成分结合, 再加入标 i 己的抗人抗体即可检 ~~ CICo ( 二 ) 检测项目 IgG 型 CIC,!gA 型 CICo 二. 血清自身抗体检测由于血清中抗体的性质和所针对的抗原不同, 引起肾小球滤过膜或肾小管的 IC 沉积机制和部位也略有差别, 故导致的肾脏功能损伤机制也不相同 通过对血清抗体的检测 肾脏疾病与免疫237 将有助于肾疾病的诊断和鉴别诊断 (~) 试验原理临床实验室检测血清抗体的方法主要有 5 种 : 放射免疫分析法 免疫浊度法 ELISA 法 间接免疫荧光法和免疫印迹法 1. 间接免疫荧光法检测方法是用动物或人的肾组织冰冻切片作为抗原基质, 加入 被检血清与之孵育, 血清中特异性抗体可与基质中特异抗原结合形成 IC, 再加入荧光标 i 己的抗人抗体与 IC 中被检抗体结合形成荧光染色复合体, 荧光显微镜下观察荧光染色的分布, 判断被检血清中抗体的性质 例如, 抗 GBM 抗体阳性反应可见与肾小球血管走行相一致的荧光染色 2. 放射免疫分析法采用的检测原理多为 Faη 法, 其原理为 : 用同位素标记纯化的特异性抗原和被检血清中特异性抗体结合形成 IC, 反应液中加入抗人 19G 抗体或饱和硫酸馁, 经离心 沉淀后, 检测和比较沉淀物与上清液中的放射活性, 得出标记抗原与特异性抗体的结合量 3. 免疫浊度法检测原理是根据抗原与抗体自旨在液体内快速结合, 形成抗原抗体复合物, 使反应液出现浊度 在反应液中保持抗体过剩, 复合物的形成随待检样品中抗原量的增加, 反应液的油度亦随之增加, 与一系列标准品对照, 即可计算出样本中抗原的含 E 旦

245 238 第三篇临床免疫学检验4.ELISA 法 检测原理为间接法测定. 即纯化的特异性抗原包被聚苯乙烯板形成固 相抗原, 加入被检血清后, 血清中特异性抗体与国相抗原结合形成 IC, 再加入酶标 i 己的抗人抗体与 IC 中被检抗体结合, 最后通过酶的底物显色测定被检血清中抗体的含量 5. 免疫印迹法检测原理是先将粗制抗原 ( 例如人 GBM 经胶原酶水解处理后, 提取 含 α3 多肤链的 E 型胶原抗原 ) 进行 SDS- PAGE 电泳, 然后把按分子大小分离的抗原转印 到硝酸纤维膜 (NC) 上, 印迹后 NC 膜与被检血清温育, 使膜上抗原与血清中特异抗体结合形成 IC, 再加入酶标 i 己的抗人 IgG 抗体与 IC 中被检抗体结合, 最后通过酶的底物显色确定被检血清中所含的特异抗体 ( 如抗 GBM 抗体可以在膜上出现 281 王 D 和 501 王 D 显色区带 ) ( 二 ) 检测项目抗 GBM 抗体 抗 3M-l 抗体 ( 抗 IBM 抗体 ) 抗 DNA 抗体 抗中性粒细胞胞质抗体 (ANCA) 抗 Tamm - Horsfall 抗体 抗近曲小管上皮细胞刷状缘 (Fx-IA) 抗体 抗 HBsAg 抗体 抗 HCV 抗体 抗链球菌素抗体 (AS)) 抗内皮细胞抗体 (AFCA) 抗核抗体和抗 Ia 抗原的抗体等 四. 血清补体测定补休在 IC 型肾小球肾炎的发病机制中起着非常重要的作用 补体系统在被 IC( CIC) 激活过程中大量消耗, 例如血洁 含量显著下降, 尤其是膜性增生性肾小球肾炎 H 型患者更为明显, 血洁 如水平基本与 C3 呈平行性下降 19A 肾病中 C3 备解素等参与旁路系统激活而沉积在系膜区 但是肾小球肾炎患者血清补体水平的变化与临床表现不是显著相关, 对疾病的预后及发展趋势的估计价值不大, 因此血清补体的测定仅对疾病的诊断有一定的辅助参考价值 (~) 试验原理 1. 细胞毒洛血试验补体与一定量洛血素 ( 抗绵羊红细胞抗体 ) 致敏的绵羊红细胞混合孵育后, 可产生洛血现象, 其洛血程度与补体含量成正比, 但其曲线是 S 形而非直线关系, 因此以敏感性最高的曲线中间部分 (50% 洛血 ) 来判定, 即 CH 到测定 2. 免疫学检测试验 各种补体成分可作为抗原, 用免疫学检测技术进行测定 临床 测定方法较多, 常用的有单向免疫扩散 火箭电泳 免疫浊度法和 ELISA 法等 ( 二 ) 检测项目 CH 到 C3 C4, C3b Clq B 因子 C3NeF 等 五. 血清 19A 测定血清 19A 的测定对诊断 I 队肾病有十分重要的意义 在 I 队肾病中约 40% ~50% 患 者血清 19A 含量明显高于正常值 有的患者血清 19A 无明显增高, 但同 IgG 助 f 等其他免 疫球蛋白相比, 比值增加 另外, 正常人血清 19A 的轻链以 κ 为主,lgA 肾病患者的轻链是 以入为主 因此,!gAl 的测定具有更为重要的诊断价值 (~) 试验原理 1.lgA 测定 把 19A Ej 戈!gAl 作为抗原, 采用免疫检测技术进行测定, 实验室检测较为 常用的是单向免疫扩散 免疫浊度法 放射免疫分析法和 ELISA 法等检测方法 前三者为 抗原 抗体结合反应, 后者为双抗体夹心法检测 2. lga -FN 测定 将 C3b 包被聚苯乙烯板形成固相 C3b, 加入被检血清后, 血清 19A FN 中 19A 与固相 C3b 结合形成复合体, 再加入酶标 i 己的抗 FN 抗体与复合体中 FN 结合, 最后通过酶的底物显色测定被检血清中 19A -FN 的含量 ( 二 ) 检测项目 19A!gAl 19A - FN o

246 大多数肾小球肾炎是由 IC 介导的, 在病理过程大都又伴有肾小球滤过膜的通透性增 加使 IC 得以滤出, 或原位 IC 的脱落进入尿液 因此有人认为, urc 也可用来作为肾小球 肾炎的免疫相关性诊断指标, 而且较 CIC 测定更具特异性 例如 : 膜性肾病 链球菌感染 后急性肾小球肾炎和特发性新月体肾炎时, 尿中的 urc 可显著增高 (~) 试验原理 与血清 CIC 测定的方法基本一样 ( 二 ) 检测项目 IgG 型 urc,lga 型 urc a 七. 尿蛋白检测 任何一种肾脏疾病都能引起肾功能和结构损害, 并由此导致蛋白尿 血尿和管型尿产 生, 但由于肾功能损伤程度和损伤部位不同, 尿蛋白成分和尿蛋白浓度也不尽相同 当肾 小球滤过膜的电荷选择性屏障损伤为主时, 血浆白蛋白 (Al b) 和转铁蛋白 (1RF) 受滤过膜 负电荷的同性排斥力下降, 二者经肾小球滤过膜滤出增加导致蛋白尿 如果是单纯性电 荷选择性屏障障碍, 尿液中只表现 Al b 和 1RF 含量增加为主 ( 中分子蛋白尿 ) 当肾小球 滤过膜损伤同时合并分子大小选择性屏障损伤时, 血浆中大分子蛋白 (NAG IgG, IC lga 和胁 f 等 ) 受滤过膜孔径大小阻挡减少, 大分子蛋白经滤过膜滤出增加 尿液中除了出现 Al b 1RF 外, 还可出现大量的 NAG IgG 19A IC 和胁 1( 混合性蛋白尿 ) 但当肾脏病变只 局限于肾小管时, 肾小管对小球滤出的水 电解质 葡萄糖 氨基酸 多肤和小分子蛋白的 重吸收过程发生障碍, 其中 α1 微球蛋白 (α] -MG) 自 2 微球蛋白 (~2 - MG) 视黄醇结合蛋 白 (REP) 和轻链蛋白等小分子蛋白重吸收减少, 排泄增加, 尿中 α]-mg ~2 -MG REP 和 轻链蛋白含量增加 ( 低分子蛋白尿 ) 如肾小管髓拌升支受损, 由升支细胞分泌的 Tamm Horsfall (1H) 蛋白减少, 尿中 1H 蛋白含量下降 ( 正常值 40 mg/24 h) 所以通过对尿蛋白成 分的分类检测, 将有利于肾脏损伤部位和损伤程度的判断 (~) 试验原理 各类尿蛋白的检测通常采用放射免疫分析法 免疫比浊法和 ELISA 法 1. 放射免疫分析法的检测模式是竞争法 ( 同位素标记己知量的尿蛋白与被检尿中未 知量的尿蛋白竞争结合一定量的特异扩 L 体 ) a 2. 免疫比浊法检测模式分散射光免疫比浊法和透射光免疫比浊法 3. ELISA ~ 去的检测模式是双抗体夹心法 ( 二 ) 检测项目 尿 Alb 尿 1RF 尿 IgG 尿 19A 尿胁 4 尿 IC 尿 α]-mg 尿 ~2 -MG 尿 REP 尿 1H 蛋白和尿轻链蛋白 八. 其他检测项目 四 λ 相关抗原的检测 尿 1H 蛋白包裹红细胞的检测 尿纤维蛋白降解产物 (FDP) 的 检测 T 淋巴细胞亚群免疫学检测和分子生物学检测 (ERin 的 R[ -PCR 检测 ) 肾活检组 织的细胞因子 m 卧也表达量检测的 RT-PCR 测定以及电镜检查 239 第十七章肾脏疾病. 尿液免疫复合物 (uie) 检测与免疫六 参号文献 1 蒋明. 风湿病学. 北京 : 科学出版社, 许以平. 现代免疫学检验与临床实践. 上海 : 上海科学技术文献出版社, 1999

247 240 第三篇临床免疫学检验3 McCluskey lit et a1. Kidney Diagnostic Immunopathology. Colvin.R. E, Raven Press. Ltd, 1995, 109~ Rantala I et a!. Small bowel T cells, HL 生 class II antigen DR, and GroEL stress protein in 19A nephropathy.kidney International, 1999, 55: Eanu N, et a!. IFNγand LPS differentially modulate class II MHC and E7-1 expression on murine renal tubular epithelial cells.kidney International, 1999, 55: Lan H Y, et a1.expression of macrophage migration inhibitory factor in hur 口 an glcmerulonephritis.kidney International, 2000, 57: 499 ~ 509

248 所菊自身免疫与自身免疫病忏口241 第. 自身免疫的概念学检测一 第十八章 自身免疫及自身免疫病与免疫学检测 (~) 自身免疫正常情况下, 机体将自身组织成分识别为 " 自我 ", 一般不对其产生免疫应答, 或仅产生微弱的免疫应答, 此为自身耐受 ( self - tolerance) 在某些情况下, 自身耐受遭到破坏, 机体免疫系统针对自身抗原产生免疫应答, 体内检出自身抗体 (ωa 缸削山 u I b 怡 od 巾 y) 豆或戈自身反应性 T 淋巴细胞 (ωau 川 to 创,re 臼 acωttv 陀 e T lymphocyte), 此为自身免疫 ( 二 ) 自身免疫病自身免疫不一定都引起自身免疫病 若自身免疫达到一定强度, 以致能破坏自身正常组织结构并引起相应临床症状时, 就称为自身免疫病 (autoimmune disease, AID) 0 己经证明, 所有 AID 患者体内均存在针对自身抗原的自身抗体和 ( 或 ) 自身反应性 T 淋巴细胞 ( 三 ) 自身抗体自身抗体虽然是自身免疫应答和 AID 的重要标志, 但正常人血清中亦可测出 将纯化的血清自身抗体转输给同种动物, 大多并不引起自身免疫病 在健康人, 自身抗体出现的频率和滴度随年龄增长而增高,60 岁以后 50% 以上的人可检出多种自身抗体, 如抗核抗体 抗线粒体抗体等 某些自身抗体由于效价低, 不足以引起自身组织的破坏, 但却可以协助清除衰老蜕变的自身成分, 故亦称为 " 生理性自身抗体 " 某些自身抗体可直接导致疾病的发生, 称 " 病理性自身抗体 ", 如抗血小板抗体 抗甲状腺球蛋白抗体 抗乙酷胆碱受体抗体等 EB 病毒可剌激健康人 B 细胞产生和释放多种自身抗体, 称天然自身抗体 (natural autoantibody), 其中大部分属酬, 也有 19A 与 I 剧 另外, 某些自身抗体属器官特异性, 如慢性淋巴细胞性甲状腺炎的抗甲状腺球蛋白抗体和抗甲 1 文腺微粒体抗体 甲状腺毒症 (Graves 病 ) 的长效甲状腺剌激素 原发性 Addison 病的抗肾上腺皮质细胞自身抗体等 ; 而某些自身抗体为非器官特异性, 如慢性活动性肝炎 类风湿性关节炎 Sill 等多种疾病均可出现的抗核抗体 ( 四 ) 自身攻击性 T 细胞针对自身组织的 T 细胞虽可产生相应的自身免疫应答, 但并非一定引起自身免疫病 能引起帮助的所谓 " 自身攻击性 T 细胞 " (autoaggressive T lymphocyte) 应满足以下三个条件 :1 在特异性帮助组织能分离出自身反应性 T 细胞 ;2 将这种淋巴细胞转输给健康受者, 可引起相应 AID; 3 从受者病变器官也可获得同样的自身反应性 T 细胞 二. 自身免疫病的分类与特征 (~) 自身免疫病的分类 1. 按自身抗原分布的范围分类可分为器官特异性 (organ spec 出 c) 与非器官特异性 (non - organ spec 出 c) 两类 这些疾病形成一个 " 病谱 "(spectrum) 0 语系的一端为器官特 十八章自身免疫及自身免疫病与免疫

249 242 第三篇临床免疫学检验异性, 是指自身抗原为某一器官的特定成分, 病变也严格局限在该器官 ; 语系的另一端为非器官特异性, 是指自身抗原为细胞核成分或线粒体等, 病变可遍及全身各器官系统 在上述两类自身免疫病之间, 还有一些中间型, 其损伤倾向于局限在某一器官内,{E! 自身抗体却是非器官特异性的 2. 按发病原因分类某些 AID 由特定的外因所致, 称为继发性自身免疫病, 如慢性活动性肝炎 眼外伤后交感性眼炎 外伤后辜丸炎所致的男性不育症等 这类疾病往往属 器官特异性自身免疫病一般预后较好 但是大多数自身免疫病的发生与外因无明显关 系, 称原发性自身免疫病, 可以是器官特异性 非器官特异性或中间型 3. 按病程分类 可分为 :1 急性局限性如特发性血小板减少性紫癫 自身免疫性洛 血性贫血 ;2 急性全身性, 如 EB 病毒感染后出现的多种自身抗体 ;3 慢性局限性, 如重症 肌无力 自身免疫性甲状腺炎 ;4 慢性全身性, 如类风湿性关节炎 SLE 等 ( 二 ) 自身免疫病的共同特征 自身免疫病种类很多, 但它们都具有以下一些共同的 特征 : 1. 某些自身免疫病有明显的诱因, 但多数病因不洁, 属白发性免疫性疾病, 感染 药 物等外因可有一定影响 2. 患者以女性多见, 发病率随年龄增长而增高, 有遗传倾向, 但大多并非单一遗传位 点的作用 3. 患者外周血中存在高滴度的自身抗体和 ( 或 ) 针对自身抗原的致敏淋巴细胞 4. 疾病具有重叠现象, 即一个病人可同时患一种以上的自身免疫病, 且这些病分布 在 " 病谱 " 两端中的一端 在动物中可复制出相似的疾病模型, 并能通过血请或淋巴细胞 使疾病被动转移 5. 多数自身免疫病病情迁延, 发作与缓解反复交替, 有的成为终生宿疾 6. 用免疫抑制药物治疗有一定疗效 7. 免疫缺陷病或肿瘤患者易伴发 第二币 自身免疫病的发生机制 AID 的发生机制十分复杂, 每种 AID 的发生均可能涉及多种因素的综合作用 在不同的 AID, 其致病机制各异 对患有同一种 AID 的不同个体, 其致病机制可有差别 即使在同一患者, 在 AID 发生发展的不同阶段, 起关键作用的致病机制也可能不尽相同 在诸多因素中, 遗传背景可能是最重要 但并非惟 - 的因素 异常自身免疫应答的发生机制主要在于自身耐受的破坏, 使机体产生自身抗体和 ( 或 ) 致敏淋巴细胞, 损伤表达相应自身抗原的靶器官组织, 导致疾病发生 参与破坏自身耐受的因素多种多样, 它们之间相互影响 相互制约 在不同的自身免疫病中, 这些因素不尽相同, 其作用机制尚未完全阐明 一. 自身抗原方面的因素 (~) 隐蔽抗原的释放由于特殊的解剖部位, 体内某些器官或组织 ( 如脑 眼晶状体 辜丸 桔子等 ) 成分在正常情况下不与免疫细胞接触, 称为隐蔽抗原 (sequestered antigen) 按照 Burnet 的克隆排除学说, 这些抗原在胚胎期未与免疫系统接触, 故相应免疫活性细胞

250 第十八章未被消灭或抑制 在外伤 感染等情况下, 若隔绝屏障被打破, 这些隐蔽抗原可能释放入血或淋巴系统, 激活相应自身反应性淋巴细胞, 导致自身免疫病的发生 ( 二 ) 自身抗原的改变物理因素 ( 如冷 热 电离辐射 ) 化学因素( 如药物等 ) 或生物学因素 ( 如细菌 病毒 寄生虫等 ) 都可影响自身组织抗原的性质, 使其发生改变, 使机体的免疫系统将其视为异己物质而予以排斥 此外自身抗原量的改变也可能引起自身免疫病 ( 三 ) 针对外来抗原的抗体与自身抗原发生交叉免疫反应某些外来抗原与人体特定组织抗原具有相同或相似的抗原决定簇, 由前者激发人体所产生的抗体, 可与这些自身组织抗原发生交叉免疫反应 二. 免疫活性细胞方面的因素 (~) 自身反应性淋巴细胞逃避 " 克隆丢失 " 在胸腺 ( 或骨髓 ) 内的分化成熟过程中, 自身反应性 T 细胞 ( 或 B 细胞 ) 通过识别基质细胞所提呈的自身抗原肤岛但 c- II 类分子而发生凋亡, 此即阴性选择所致的 " 克隆丢失 " 由于胸腺( 或骨髓 ) 功能障碍或微环境 发生改变, 某些自身反应性淋巴细胞可能逃避阴性选择, 免于被 " 排除 " 该克隆进入外周 血循环后即可对相应自身抗原产生应答, 引起 AIDa 另外, 正常情况下少数在胸腺中逃避了阴性选择的自身反应性 T 细胞可能进入外周 血中, 一旦识别自身抗原后, 可通过激活诱导的细胞死亡 (AICD) 机制而被清除 该过程 与 Fas FasL 途径介导的细胞凋亡有关 若因 Fas 基因突变而使该途径受阻, 大量自身反 应性 T 细胞有可能破坏自身耐受导致自身免疫病的发生 ( 二 ) 淋巴细胞突变 自身免疫应答均为胸腺依赖性, TH 细胞在其中起重要作用 正 常情况下, 体内存在针对自身抗原的 TB 细胞克隆, 由于 TH 细胞易产生免疫耐受, 故不出 现自身免疫应答 在某些致病因素作用下, 可能通过不同的旁路机制, 绕过耐受的 TH 细 胞直接或间接激活静止的效应 TB 细胞, 导致自身免疫病的发生 l. TH 细胞旁路 某些外来抗原具有与自身抗原相似或相同的 B 细胞决定簇, 但具有 不同的 T 细胞决定簇 ( 载体决定簇 ) 此类外来抗原进入机体, 可激活相应 TH 细胞, 从而 绕过原己产生耐受的 TH 细胞, 使由于缺乏 TH 细胞辅助信号而处于静止状态的自身反应性 B 细胞克隆激活, 产生自身免疫应答, 此机制称为 TH 细胞旁路活化 自身免疫及自身免疫病与免疫学检测243 另外, 自身抗原性质改变 ( 如抗原修饰 异常降解等 ) 交叉抗原剌激 自身抗原与药物结合等情况下, 也可能出现 TH 细胞旁路 2. 多克隆激活 EB 病毒 细菌产物 ( 如内毒素 ) 等可绕过耐受的特异性 TH, 直接非特异性地激活多克隆 T B 细胞 3. 独特型旁路某些外源性致病因子 ( 如病毒 寄生虫等 ) 本身或它们剌激机体产生的抗体, 可与自身反应性 T B 细胞抗原受体有 " 公有独特型 " (public 凶 otype), 故这些致病因子或其抗体可激活特异性独特型 TH 细胞 ( 绕过耐受 Th 细胞 ), 使之辅助携带相应 " 公有 独特型 " 的自身反应性淋巴细胞发生自身免疫应答 此外, 某些致病因子本身亦可与独特型发生交叉反应, 从而可直接通过抗独特型细胞, 激活带有相应独特型的自身反应性淋巴细胞 二. 免疫调节机制紊乱 TH

251 244 第三篇临床免疫学检验正常机体具有一个精密的 严格控制的免疫调节系统, 故体内虽存在针对自身抗原的 T B 细胞, 却不出现 AIDa 即使在机体受到各种因素影响, 启动了自身免疫应答的情况下, 由于这个调控系统的作用, 也不致引起组织损伤和发生 AIDa 若该调控系统发生紊乱, 使自身免疫发生 持续与强度失控, 则可能发生 AIDa (~) 岛任 -IC- II 类抗原表达异常正常情况下, 大多数组织器官仅表达岛任 -IC- I 类抗原, 而不表达岛 1HC- II 类抗原 在某些因素 ( 如 IFN γ) 作用下, 组织细胞表面可异常表达岛任 -IC- II 类抗原, 从而可能将自身抗原提呈给 TH 细胞, 启动自身免疫应答, 导致自身免疫病 己发现甲状腺毒症的甲状腺上皮细胞 原发性胆汁性肝硬化的胆管上皮 糖尿病的膜腺内皮细胞和自细胞表面均异常表达岛 1HC- II 类抗原 ( 二 ) 细胞因子产生失调细胞因子产生失调可导致自身免疫应答 细胞因子的致病机制可能是 : 诱导 MHC- II 类抗原异常表达或表达增加 ; 诱导粘附分子表达增加, 使 APe 与 T 细胞的亲和力增强 ; 促进自身免疫应答的发生 例如, 类风湿性关节炎的关节滑膜 T 细胞可白发性产生大量 1NF α 和 ω1- CSF, 继而强烈激活 Mφ, 导致慢性炎症, 从而参与持续性白身免疫应答 ( 三 ) 抑制性免疫调节作用减弱长期以来, Ts 细胞功能减弱曾被认为是自身免疫病的发病机制之一 {E! 目前对体内是否存在一个具有特定表面标志的 独立的 Ts 细胞亚群 存在疑问 某些学者着眼于整体的免疫调节机制, 认为抑制性调节作用减弱可能参与自 身免疫病的发生 该机制涉及 TH1 和 TH2 细胞 ( 以及一定程度上 Tel 和 Te2 细胞 ) 功能失 调 胸腺功能异常 ( 如病毒感染 增生 肿瘤等 ) 以及神经 内分泌 免疫网络调节功能紊 乱等 四. 生理性因素 (~) 年龄 AID 发病率随年龄增长而升高, 这可能是由于老年人胸腺功能低下或衰 老导致免疫系统功能紊乱, 从而有利于 AID 的发生 己发现 NZB 小鼠患 SLE 样综合征的 发病率很高, 且其病变随鼠龄的增长而进行性发展 ( 二 ) 性激素 许多实验研究与临床资料提示, AID 可能与性激素有关 另外, AID 的 发病率与体内激素水平的波动相关 五. 遗传因素 (~)AID 发病的家族性倾向 AID 常有家系发病的现象 单卵双生子和双卵双生子 的发病模式以及某些与性染色体相关的 AID 均提示, 其发病与遗传因素密切相关 此类易在家系中发病的 AID 常属器官特异性, 遗传因素在选择受累器官中起主要作用 另外, 某些品系小鼠易患某些 AID, 也提示了遗传背景参与 AID 的发生 ( 二 ) 岛但 C 与 AID 易感性关联在遗传因素与 AID 发病的关系中, 岛 1HC 特别受到重视 对大样本各种 AID 病人进行 HlA 型别分析, 发现携带某些 HlA 等位基因或单元型的个体患特定 AID 的频率远高于正常人群 目前的研究进展认为, 岛任 -IC 与自身免疫病关联的本质很可能与岛任 -IC 在抗原提呈中发挥的关键作用有关, 即特定的岛任 -IC 等位基因产物决定了是否可有效地提呈特定的致病性自身抗原肤, 从而决定携带该岛但 C 等位基因的个体是否易感某种自身免疫病

252 所菊一一一口一. 自身抗体的检测技术自身抗体的检测, 对于自身免疫病的临床诊断 病情评价以及疗效评估都有重要的意义, 而且比其他免疫学变化的检测更容易做到 自身抗体检测技术的发展是很快的, 从简单的凝集反应直观方法发展到对流免疫电泳 (CIE) 免疫扩散分析 (IDA) 酶标 金标 免疫荧光测定法 (IFA) 化学发光免疫标记 ( 也 IA) 核素标记等新技术, 近些年来把免疫荧光 酶免疫斑点技术 免疫印迹法 ( IE) 等与经典的方法结合应用, 较好地满足了临床的需求 (~) 免疫荧光测定 (immunofluorescence assay, IFA) 技术分为直接免疫荧光法 ( direct immunofluorescence assay, DIFA) 和间接免疫荧光法 (indirect immunofluorescence assay, IIFA 或 IIF) 0 以间接免疫荧光法最为常用, 其特点是特异性强 阴阳性样品的信号强度对比明显 可精确判断细胞内的荧光分布 原理 : 标本中有阳性抗体存在时, 将和实验制作的基质进行特异结合, 去除非特异结合后, 再与加入的荧光标 i 己的抗人 IgG 抗体进行特异性结合, 去除游离的非特异性结合, 即可获得在基质上的特异免疫荧光复合物, 通过显微镜进行观察测定 ( 二 ) 基质载片的化学活化技术 (chemically activitated substrate slides) 利用固定可溶性抗原 抗体及酶的方法处理盖玻片, 使盖玻片表面包被上活性醒基, 然后贴入组织切片, 组织中的自由氨基酸 ( 尤其是胶原中的丑赖氨酸 ) 以共价键结合在盖玻片上 ( 三 ) 生物薄片技术 (produce automated and analyses standardized: BioCHIP technol 唱 y) 采用类似电子工业中微芯片的生产工艺作荧光法的基质, 机械化切割成 mm 级的小片, 可以在 190'C 液氮中保存数年而其生物活性不变 生物薄片马赛克技术 : 在载玻片同一血清反应区粘上贴附有不同基质的生物薄片, 可以同时检测针对不同组织或病原体的抗体 ; 根据不同需要, 一张载玻片上可粘贴 1~45 种不同的基质, 此即所谓的生物薄片马赛克 ( 四 )HEp - 2 细胞 HEp-2 细胞含有人类的抗原, 普遍适用于人类特异性抗体识别基质抗原谱, 可以取代用灵长类肝组织冰冻切片的 ANA 基质 其优点是 :HEp -2 可以通过细胞培养大量繁殖, 核荧光清晰明亮, 易标准化 对一份血清可只进行一次试验, 由于不同基质获得的结果相互补充, 就可显示出患者血清中自身抗体谱的详细信息, 简便易行 二. 抗核抗体的检测 (~) 检测方法抗核抗体 (anti - nuclear antibody, ANA) 检测最常用的方法是间接免疫荧光法, 本法十分敏感, 多用作筛选试验 高度特异性的确认试验如 ELISA 印迹或免疫印迹法 ( Western blot) 的联合应用, 则为 ANA 的检测提供了可靠的方法学保证 血清学检测 ANA, 建议首先使用含生物薄片的间接免疫荧光法 每反应区由人类上皮细胞 (HEp - 2) 和灵长类肝组织冰冻切片两种生物基质组成, 通过比较两种基质的荧光模型, 可区分大多数的 ANA, 且两者的结果可以相互补充 灵长类肝组织还可增大抗体的检测范围, 为临床提供重要的诊断依据 忏245 第学检测自身免疫病的免疫学检测 十八章自身免疫及自身免疫病与免疫

253 246 第三篇临床免疫学检验抗 DNA 抗体的检测可用琼脂扩散法 对流免疫电泳 补体结合试验 间接血凝 RIA 及 ELISA 等方法进行, 其中以 RIA 法最为敏感 抗可提取核抗原 (extractable nuclear antigen, El' 也 ) 抗体的检测可用琼脂双向扩散法 对流免疫电泳 间接血凝 (La 抗原不能用 ) 补体结合试验 免疫荧光及 ELISA 等方法进行 ELISA 法以天然抗原为固相包被在微孔板上, 可检测 I 武 NP Sm, Sm SS-A SS-B Scl-70 Jo- LdsDNA ssdna 组蛋白或核糖体 p 蛋白, 可在同一时间内定量检测多种不同的抗体 印迹法 : 每反应区由 6 条分别包被了不同抗原的膜条组成, 抗原经亲和层析纯化并以一组细平行线的形式包被在膜条上, 与血清中相应抗体结合后可在酶免疫反应中显色 免疫印迹技术 : 用 SDS 提取的 HEp-2 细胞抗原经电泳分离后固定在膜条上, 免疫印迹可检测其抗体相应的单一蛋白, 还能有效地检测抗 CENP AB CKu 或 PM-Scl 抗体 ( 二 ) 临床意义 ANA 是一种抗细胞核成分的抗体, 在某些自身免疫病中特别重要 O ANA 由对各种核成分有特异性的许多不同的抗体所组成, 按照其对哪种核成分起反应而分为抗核蛋白 (ANP) 抗体 抗双链 DNA(dsDNA) 抗体 抗单链 DNA(ssDNA) 抗体 抗可提取核抗原 (ENA) 抗体及抗核仁抗体 ANA 在 2% 的健康人群中可出现滴度为 1: 10 或更高 妇女中 ANA 的出现率较高, 约 20% 的 60 岁以上女性 ANA 为阳性 一般来说健康人群中 ANA~ 商度低于 1: 不同荧光谱与临床的关系 (1) 斑点状谱核中央部分染色较重, 荧光呈斑点样 在大约 25% 的系统性红斑狼 疮 (Sill) 患者 慢性盘状红斑狼疮患者 进行性全身性硬化症 斯耶格伦综合征及雷诺病 的部分患者的血清中, 可见到这种斑点状谱 清中 (2) 核仁状谱仅核仁显示均匀的荧光 可见于 SLE 硬皮病及干燥综合征患者的血 (3) 均匀性谱细胞核被着色成漫射谱, 全核呈现均匀一致的荧光 大多数急性 Sill 当其抗体滴度高时均可出现这种语, 此外还多见于硬皮病和皮肌炎等 (4) 周边谱引起此种类型染色的抗体与核边缘中的 DNA 反应, 且常发现与均匀性 谱有关 这种谱的出现表明为 SLE 活动期且通常肾脏己受累 2.ANA 对疾病的意义 (l)sill ANA 对 S 庄的诊断具有重要意义, 抗 dsdna 抗体的存在几乎完全可对 Sill 作出肯定诊断 在 Sill 中可见到上述四种类型的 ANA 荧光谱, 而周边谱对此病是特异性 的 95% ~100% 的 ANA~ 商度通常为 1 :40 或以上, 且滴度随治疗降低恨慢 (2) 肝病慢性活动性肝炎 (C 址 {) 中的狼疮状肝炎型患者,ANA~ 商度常超过 1:2000, 而其他 C 址 1 患者 ANA 可能是阴性或低滴度 大约 25% 的原发性胆汁性肝硬化患者 酒 精中毒患者或隐伏性肝硬化患者可出现 ANA 尚未发现抗线粒体抗体的原发性胆汁性 肝硬化患者 (3) 其他疾病如类风湿关节炎 硬皮病 皮肌炎 干燥综合征 由殇性结肠炎 肾小球 肾炎 恶性贫血 自身免疫性溶血性贫血 慢性淋巴细胞性甲状腺炎 传染性单核细胞增多 症 结核病 瘤型麻风 恶性肿瘤以及慢性白血病等, 均可见 ANA 滴度增高, 但不如 SLE 明 El 且业 (4) 药物 某些药物可使 ANA 滴度增高, 如脚苯贴嗦 普鲁卡因自先胶 异烟月丹 苯妥英

254 第十八章纳 三甲双酣 j 黄肢类 保泰松以及对氨基水杨酸等,{E!f 亭药后即降至正常水平 O 二. 类风湿因子的检测类风湿因子 (rheumatoid factor, RF) 是最先在类风湿性关节炎患者血清中发现的具有抗 IgG 性质的自身抗体, 根据町免疫球蛋白构成的不同可分为刷型 IgG 型和 I 队型 引起组织破坏的主要是胁 f 型 RF, 因其有较高的凝集性 (~) 检测方法检测总的类风湿因子常用的方法有免疫浊度技术 胶乳凝集试验 致敏羊红细胞凝集试验和曙红胶乳试验等, 现在临床上以免疫浊度技术较为常用 RF 刷 ELISA 试剂用于检测抗体酬, 其方法是在固相微孔上包被纯化的抗原, 加入经稀释的待测血清后, 若血清中存在与包被抗原相应的抗体, 则形成抗原抗体复合物, 加入酶结合物就会显色, 再次孵育后用终止液终止反应, 测定洛液的吸光度, 计算出助 f 型盯的结果 I 后型盯应用 RIA 或 ELISA ~ 去测定, 其含量与病情相关 I 队类盯可能与预 后有关, 主要应用胶乳凝集试验来检测 ( 二 ) 临床意义 1. 类风湿性关节炎 RF 主要用于诊断类风湿性关节炎, 通常 70% ~80% 的患者血清中存在高滴度的町 己证实具有很高滴度盯的患者, 其关节炎的发展往往较快, 预后不良, 并常出现全身性并发症, 如各种结节 脉管炎 皮肤溃殇 神经疾病及费耳提综合征等 约 20% ~30% 患者无刷型町, 但在采用适当的方法时可见到许多患者有 IgG 型或 19A 型町 因此, 用标准测定法测定时, 盯阴性不能排除类风湿性关节炎的诊断 ; 同样, 单纯 RF 的存在也不能肯定类风湿性关节炎的诊断 2. 某些结缔组织病在干燥综合征 SLE 幼年型类风湿性关节炎患者血清中, 町阳性率可达 75% 30% 25%, 此外, 在皮肌炎 硬皮病以及结节性多动脉炎, 也可出现 RF 阳性 3. 非关节炎许多非类风湿性病患者可出现高滴度的 RF, 如某些细菌及病毒感染等, 多是暂时性的, 炎性反应消退后, RF 通常消失 对于这类病, 胶乳凝集试验阳性较绵羊红细胞凝集试验阳性常见得多 4. 其他关节炎在强直性脊柱炎 牛皮癌性关节炎 莱特勒病患者中, 未发现胁 f 型 RF,{E! 常常出现 IgG 型 RF o 四. 抗甲状腺抗体的检测某些甲状腺疾病, 如慢性淋巴细胞性甲状腺炎 原发性甲喊 弥漫性甲状腺肿伴甲亢, 均与甲状腺的自身免疫性损伤有关 在这些患者的血中可发现几种自身抗体, 其中最重要的是抗甲状腺球蛋白 (1G) 抗体 抗甲状腺微粒体 (1M) 抗体 抗甲状腺肢体 (CA2 ) 抗体 1G 与 CA2 系统存在于甲状腺肢体内,1M 系统则存在于与微粒体囊脂蛋白膜密切相关的 自身免疫及自身免疫病与免疫学检测247 甲状腺上皮胞质中 大约有 1%~2% 的正常人有抗 1G 或 1M 抗体, 在女性中出现率较高 ( 约 3%~5%), 并随年龄增长而增高, 在 70 岁以上的男性和女性中 1G 抗体出现的几率差别不大 在甲状腺功能正常的患者中可发现甲状腺抗体滴度在 1:400 以下, 而滴度在 1:800 以上的大多数患者其甲状腺功能试验异常 1G 及 1M 抗体可用免疫荧光 血凝反应 RIA 等方法进行检测, 但巳 A2 只能用免疫荧光法检测

255 248 第三篇临床免疫学检验临床意义 :1 抗甲 1 文腺抗体阴性, 通常可排除原发性粘液水肿 21G 与 1M 抗体的阳性率, 以慢性淋巴细胞性甲状腺炎 ( 即桥本甲状腺炎 ) 最高, 其次为原发性甲减 弥漫性甲状腺月中伴甲亢患者虽然也为阳性, 但其阳性率及效价均较上述二者低 3 若甲状腺 肢体及细胞浆抗体试验均为阴性, 基本可排除桥本甲 1 文腺炎的诊断, 这些试验通常用于桥本病与甲状腺癌及非中毒性甲状腺肿的鉴别诊断 4 若甲状腺剌激性免疫球蛋白 (TIl) 阳性, 不仅对弥漫性甲状腺肿伴甲亢有诊断意义, 而且有助于患者的疗效观察 5 85% 的甲 1 文腺毒症患者存在 1M 抗体或肢体抗体, 有助于轻度甲状腺毒症与焦虑状态的鉴别 6 大约 60% 的亚急性甲状腺炎出现 CA2 抗体 7 其他 : 约半数恶性贫血患者出现甲状腺抗 体且伴发甲减 ; 糖尿病患者甲状腺细胞浆抗体及胃壁细胞浆抗体阳性率增高且与年龄及性别无关 ; 慢性麻风病患者 1G 抗体阳性率增高等 五. 抗胃壁细胞抗体的检测胃壁细胞抗体存在于某些自身免疫性疾病患者的血请或胃液中, 有两类 :1 针对胃壁细胞微粒体抗原的胃壁细胞抗体 (P 巳时, 属于 19( 王或 19A 型 在慢性萎缩性胃炎伴恶性贫血患者中阳性率高, 不伴恶性贫血患者中阳性率较低 PCA 可用人 猪或鼠胃做底物的免疫荧光法检测 2 针对胃壁细胞产生的内因子抗原的内因子抗体, 主要为 IgG 型, 此抗体有两种类型 :1 型能阻止维生素 E12 与胃内因子结合 ( 又称封闭性抗体 ), II 型能与维生素 E12 和胃内因子结合后的复合物结合 ( 故又称结合性抗体 ) 0 胃壁细胞内因子抗体可用 RIA 法检测 临床意义 :1 调查结果表明, 30 岁以下正常人配 A 极为罕见 ;30 岁以上配 A 阳性率女性为 6%, 男性为 2% ;60 岁以后配 A 阳性率逐渐升高, 70 岁以上阳性率女性为 15%, 男性为 12% 2 80% ~90% 的恶性贫血患者可检测出 P 巳 A, 少数缺铁性贫血患者也可出现阳性 3 慢性萎缩性胃炎中 P 巳 A 阳性率很高, 据此又可把该病分为 A B 两型, 存在配 A 者称为 A 型, 其胃窦炎发生率低, 常发展为恶性贫血 ; 无配 A 者称为 B 型, 胃窦炎发生率高, 不发展为恶性贫血 4 55% ~60% 的恶性贫血患者可检测内因子抗体, 而健康人则很少有这种抗体 5 大约 20% 的胃癌患者配 A 阳性, 约 1 3 的桥本甲状腺炎和甲亢患者 P 巳 A 阳性, 少数原发性肾上腺皮质机能减退 原发性甲减及青年型糖尿病患者 PeA 阳性 六. 抗平滑肌抗体的检测抗平 i 骨肌抗体 (SMA) 的出现与肝细胞损伤有关, 肝细胞内含有与平滑肌的肌动蛋白类似的蛋白成分, 当肝细胞感染病毒后该成分发生变性, 剌激机体产生能与平滑肌抗原发生交叉反应的 SMA, 也 11\ 主要为 IgG 型 大约 2% 的正常人存在也且, 但其中某些人可能与最近病毒感染有关 SMA 可用免疫荧光法检测 临床意义 :1 80% ~90% 的慢性活动性肝炎患者血清中存在岛位, 且常伴有 ANA 阳性及 IgG 升高, 其中狼疮细胞阳性患者也仙的检出率可达 80% 以上, 滴度为 1:80 以上 而且 E 患者中则极少见也恤, 具有鉴别意义 2 10% ~ 50% 的原发性胆汁性肝硬变患者可有低滴度的 SMA, 隐匿性肝硬变患者的 SMA 检出率约为 25%, 约 60% 的病毒性肝炎患者可暂时出现 SMA 3 其他如一些病毒感染患者可暂时出现 SMA; 约 80% 的传染性单核细胞增多症患者血清中可出现 SMA, 一旦病愈即消失 ; 某些原发性非典型肺炎 上呼吸道感染及大约 10% 的类风湿性关节炎患者可出现 SMA; 各种癌症患者也可出现 SMA 阳性 七. 抗线粒体抗体的检测

256 249 第学检测参号文献 抗线粒体抗体 (AM!\.) 是一种抗线粒体内膜质蛋白抗原的自身抗体, 可属于任一种免疫球蛋白 AM!\. 可用于辅助诊断黄瘟及肝病的病因, 也与许多自身免疫病有关 AM!\. 在正常人中极少出现, 因此 AM!\. 是一种很有临床意义的指标 AM!\. 可采用以人甲状腺 胃或肾组织为底物的免疫荧光法来检测 临床意义 :1 90% 的原发性胆汁性肝硬变患者可检出 AM!\., 其中半数滴度在 1:200 以 上 AM!\. 与肝病的持续时间或处于何期没有关系, 且其滴度也趋于保持不变 2 在慢性 活动性肝炎和隐匿性肝硬变患者中,AM!\. 的检出率变化较大 在其他类型的肝硬变 肝 外胆梗阻或传染性肝炎中则很少出现 AM!\. o 3 其他疾病如甲状腺毒症 桥本甲状腺炎及 恶性贫血等, 均可有低滴度的 AM!\. 出现 八. 抗心肌抗体的检测当炎症 缺氧 缺血及手术等各种因素引起, 心肌损害时, 可释放出心肌抗原, 引起机体产生抗心肌抗体 抗, 心肌抗体的检测, 可采用以胎儿或大鼠, 心肌组织为基质的免疫荧光法 当冠心病反复心绞痛发作 心肌梗死 风湿热及心脏手术等使心肌受损的情况出现时, 均可出现抗心肌抗体阳性, 尤其以严重病毒性, 心肌炎的抗体滴度最高且持续时间长, 但经激素治疗后可转阴 1 Elaine Bell NF - R homologues in autoimmune disease.lmmunol 咱 rtoday, 21(6) :253 2 Rajneesh M, et a Innate immunity: a primitive system in humans.lmmunology Today, 21 (11) : 534~ Dimitrios B, et a Cell- cycle regulation in immunity, tolerance and autoimmunity.lmmunology Today, 21 (1 1):551~555 4 Adrian F, et al Natural antilxxlies and complement link innate and acquired immunity.lmmunology Today, 21 (12) :624~630 5 Medzhitov R, et a Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science, 29: 298 ~ Bachmann MF, et a 臼 1 the role of the innate immunity in autoimmune disease.] Exp M 时, 193 (12) :47~50 7 Katsorida 1\ 缸, et a AutoimmunitY and autoimmune disease.nephrol Dial Transplant, 16(suppl 6) :65~67 8τhα 口 as ]VV.2001.Antigen - specific responses in autoimmunity and tolerance.lmmunol Res, 23(2-3) : 235~244 9τbeofilopoulos AN, et a τbe genes of systemic autoimmunity.proc Assoc Am Physicians, 111(3) :228~ Ring G 日, et a Breakdown of self - tolerance and the path, 鸣 enesis of autoimmunity. Semin Nephro!, 19 (1) : 25~33 11 Eggert M, et a Molecular mechanisms of glucocorticoid action in rheumatic autoimmune diseases.] Steroid Biochem Mol Bio!, 77 (4-5) :185 ~ 191 十八章自身免疫及自身免疫病与免疫

257 述旺M4Aql 忏口三篇临床免疫学检验第十九章 免疫缺陷及 AIDS 病毒 所菊250 第免疫缺陷病 (immunodeficiency disease, IDD) 是免疫系统中任何一个成分的缺失或功能 不全而导致免疫功能障碍所引起的疾病, 涉及免疫细胞 免疫分子或信号转导的缺陷 免疫缺陷病可分为两类 : 其一为先天性或原发性免疫缺陷 (primary irm 丑 unodeficiency disease, PID), 是遗传性缺陷所致 ; 其二为获得性或继发性免疫缺陷 (secondary immunodefi ciency disease, SID) a 原发性免疫缺陷包括抗体缺陷病 T 细胞缺陷病 联合免疫缺陷病 吞 噬功能缺陷病及补体系统缺陷病 获得性免疫缺陷是由于治疗其他疾病而合并的免疫缺 陷, 又分为暂时性获得性免疫缺陷 永久性获得性免疫缺陷和医源性获得性免疫缺陷 获 得性免疫缺陷可继发于营养不良 感染 肿瘤 蛋白丢失 代谢和内分泌紊乱 自身免疫病 外科手术 老年性变化以及免疫抑制等因素 获得性免疫缺陷综合征 (acquired immunode ficiency syndrome, AIDS) 己成为当今流行最广泛的疾病, 另有章节介绍 对病原微生物及机会菌群高度易感是免疫缺陷的主要后果, 其感染的性质与免疫系 统的缺损成分有关, 如体液免疫缺损患者对化服菌易! 茧, 细胞免疫缺陷对病毒及胞内寄生的微生物易感 此外, 免疫缺陷病人高发自身免疫病, 也易患某些类型的肿瘤特别是致癌病毒引起的癌症 免疫缺陷病在临床特征与病理改变方面表现复杂多样, 这不仅是由于涉及免疫系统 的不同成分, 有时累及多个系统与器官, 而且还涉及其功能和基因 第二币 原发性免疫缺陷病 一. 原发性 B 细胞缺陷 (~)X 连锁丙种球蛋白缺乏血症 X 连锁丙种球蛋白缺乏血症 (X - linked agarmna globulinemia, 丑 A) 在 1952 年由 Ogden Bruto 日首先报道, 故亦称 Bruton 丙种球蛋白缺乏血症 1. 主要免疫学特征 (1) 患儿子生后 6~9 个月时开始出现反复化服性细菌感染, 有些患儿伴有自身免疫病 (2) 血清中 19A 胁 4 19D 及 IgE 水平明显降低或缺失, IgG 浓度低于 2g La (3) 血循环中 B 细胞数目减少, 淋巴结及淋巴组织缺乏生发中心和淋巴滤泡, 骨髓中无浆细胞, 但前 B 细胞数目正常, T 细胞数量及功能亦正常 2. 发病机制及临床症状 X 连锁丙种球蛋白缺乏血症为 X 连锁隐性遗传, 患者均为 男性 随着从母体移来的免疫球蛋白的自然衰退, 一般在 6~9 个月出现临床症状, 表现

258 第十九章为严重慢性细菌感染 婴儿期, 患者骨髓和外周血中存在的前 B 细胞不分泌抗体, 提示 此病发生在 B 细胞分化的晚期阶段 研究发现, 该病的发病机制是位于 X 染色体上的酷肢酸激酶 (B 匹 ) 基因缺失, 这就更精确地检测诊断隐形基因携带者, 最后进行基因治疗 性联婴儿低丙种球蛋白血症有家族发病史, 病人均为男性 有缺陷的 X 染色体复制 并遗传到下一代时, 若子代为女性, 因女性有两个 X 染色体, 往往有一个是正常的, 故此 病可成隐性而不表现症状 ; 若子代为男性, 因仅含有缺陷的 X 染色体, 症状就表现出来, 即性联遗传 患儿多为 5~12 个月龄, 初发症状包括反复发作的细菌性感染如中耳炎 鼻窦炎 支气管炎 肺炎 脑膜炎 皮肤感染 骨髓炎 败血症 肠炎等 常见的病原体为葡萄球菌 肺炎球菌 流行性感冒杆菌 洛血性链球菌 金黄色葡萄球菌等, 个别的革兰氏阴性球菌偶尔也引起感染 少数病例反复发作卡氏肺甩子虫引起的肺炎 患者细胞免疫功能正常, 对水症 麻磅等病毒性感染反应如常, 有报道用活疫苗免疫或接触野毒株而发生麻痹性骨髓灰质炎和渐进性肠埃可病毒性脑炎 有人提出, 埃可病毒感染 皮肌炎与低丙种球蛋白血症之间有相关性 有的病人直到学龄前期 (4~5 岁 ) 才出现症状如慢性关节炎 异常口腔溃殇或吸收不良, 吸收不良常与蓝氏贾第鞭毛虫感染有关, 严重的吸收不良可使身高与体重发育迟缓 有报道一种类风湿性关节炎与本病有联系 患者的体征常与反复性化服性感染有关, 常 表现为慢性中耳 外耳炎症, 浆液性中耳炎, 关节炎, 严重口腔溃殇和皮肤湿彦 虽然反复感染, 但扁桃体和淋巴结较正常为小, 而且脾脏大小正常 五种免疫球蛋白完全缺乏或明显减少是此病诊断的基础, 除用免疫电泳之外, 要定量测定免疫球蛋白的含量 免疫球蛋白总量常低于 2.5 g L, IgG 常低于 2.0 g L, 胁 1,lgA IgD IgE 水平极低或不能测到 极少数患者 IgG 19A 刷 IgD 完全缺失 {E! 19E 却正常, IgG 降低 刷或 19A 正常的患者不常见 在确诊前应检查患者在抗原剌激下能否产生抗体 小于 6 个月的婴儿血清中有母体的 I 剧, 但缺乏胁 1,lgA 和 B 细胞 1 岁婴儿 ABO 血型凝集素抗 A 抗 B 效价之比应大于 1: 斗 可经免疫后测定对特定抗原的抗体反应, 但绝不应该用减毒活疫苗免疫 患者对伤寒疫苗 白百破三联疫苗等缺乏免疫应答, 肠活检可发现肠道固有层中存在浆细胞, 循环 B 细胞完全缺乏 T 细胞数目正常或稍增加, 对 PHA 和对同种异常淋巴细胞混合培养反应正常, 皮肤 DIH 试验正常 NK 细胞活性正常 ( 二 ) 选择性 19A 缺陷和 I 届亚类缺陷选择性 19A 缺陷 (immunodeficiency with hyper - 19A) 是最常见的免疫缺陷病, 发病率约在 1 :800 ~ 1 : 600 之间 确切的病因还不清楚, 但己观察到尽管病人带有膜刷 19A I 挡的 B 细胞数增多, 而 19A 的合成与分泌却减少, 可能是由于 B 细胞的发育受到阻碍 由于 19A 缺乏, 机体暴露于微生物抗原及其他抗原较长时间时, 在体液免疫受损的情况下, 这些抗原的剌激会导致感染 变态反应与自身免疫病, 甚至肿瘤的发病率也高 研究发现, 免疫缺陷及AIDS病毒251 患选择性 19A 缺陷病病人伴发自身免疫病者,HlA -A1 和 DW3 的几率高 取病人淋巴细胞培养证明, 其 B 细胞可合成但不能分泌 19A, 患者体内有抑制性 T 细胞可选择性抑制正常 B 细胞产生 19A o 用苯妥英纳和青霉肢治疗的病人, 易患获得性 19A 缺陷和鼻窦 肺部感染 反复性鼻窦 肺部感染为最常见症状, 细菌或病毒感染偶见, 表现为反复性或慢性右中叶肺炎 非含铁血黄素沉着症发生率增加, 可被误诊为慢性肺疾患

259 252 第三篇临床免疫学检验一些自身免疫病与选择性 19A 缺陷有关, 包括 SI 五 类风湿性关节炎 皮肌炎 恶性贫血 甲状腺炎 Coombs 阳性洛血性贫血 干燥综合征和慢性活动性肝炎 本病伴发 Sill 或类风湿关节炎的几率为 1 :200~1: 100 本病患者能产生抗核抗体 抗时也抗体等自身免疫病的抗体 有些病例怀疑与服用苯妥英纳和抗 ' 国厥药有关, 这些病人经常发生鼻炎和肺部感染, 去除这些药物不能全部使 19A 恢复正常 在体外, 患者外周血淋巴细胞产生 19A 正常或减少 一些病人 T B 细胞相互作用缺陷 患者血清 19A 低于 0.05 g L, IgG 胁 1, lgd 19E 正常或升高, 有的病人 I 届亚类缺乏 接受免疫之后 B 细胞能产生正常数量的抗体 大部分病例中, 血清 19A 的缺乏与分泌异常有关 有的病人抑制性 T 细胞增多, DIH 高敏反应, PHA 及混合淋巴细胞反应降低, T 细胞干扰素产生减少 慢性鼻窦 肺部感染病人 X 线表现及肺功能异常, 有胃肠疾患的病人胃肠道活检出现相应的病理学特征, 木糖吸收受损, 或有抗基底膜的抗体 选择性 19A 缺陷病病人未伴发其他严重疾病时, 可存活 60~70 年, { 旦大多数患者在第一个 10 年 内就表现出症状 认识与确诊潜在的并发症并及时处理可延长寿命 降低病死率 很少 病人在经历多年 19A 缺乏后 19A 水平又恢复正常 选择性 I 届亚类缺陷病人常见反复性呼吸道感染 ( 如反复性化服性鼻窦炎及肺部感 染 ), 有些病人患 Sill 或肺含铁血黄素沉着症等自身免疫病, 也有的发生共济失调毛细血管扩张症或 19A 缺乏等免疫缺陷病 IgG l 亚类缺乏与其他亚类有关, 总 19G 水平降低, 与常见变异性免疫缺陷病相同 IgG2 缺陷病常表现鼻窦 肺部反复性感染, 不能对肺炎球菌 流感杆菌多糖抗原发生反应, 但可对破伤风或白喉杆菌毒素这些蛋白质抗原发生正常 反应 19G2, 19G3, 19G4 缺乏症常见于反复感染或自身免疫性疾病病人 免疫学诊断依据各年龄组 I 届亚类几何平均值, 大于 2 岁的患者 IgG l 一般低于 25 mg L, IgG2<5 mg L, IgG3<2.5 mg L, 总 19G 浓度可以正常, 也可以对多糖抗原产生选择性 无反应性, 细胞免疫正常 对选择性 I 届亚类缺陷病人可以使用免疫球蛋白治疗, 使用时要注意制剂中 I 届亚类的比例 要决定是否对病人终生用药要慎重, 不仅要根据 19 水平进行判断, 还要着重考虑免疫接种后抗体应答和病程情况 二.T 细胞免疫缺陷病单独的 T 细胞免疫缺陷病很少见, 大多数免疫缺陷病患者伴有 B 细胞免疫的异常, 这反映了在抗体形成过程中, T 细胞和 B 细胞共同起作用 几乎所有患完全性 T 细胞免 疫缺陷病患者的抗体形成都有一些障碍, 一些 T 细胞免疫缺陷患者有正常水平的免疫球蛋白, 但经免疫接种不能产生相应的抗体 细胞性免疫缺陷患者易患病毒性 真菌性和原虫性感染, 这些感染可以是急性的, 也可以是慢性的 可有以下临床表现 :1 ii5 病毒 活卡介苗接种可全身散擂 2 良性病毒感染可引起致命并发症 3 易患慢性皮肤粘膜白色念珠菌感染 4 移植物抗宿主病, 发生在宫内或输血后, 前者表现为鳞屑红皮病 秃发 眉缺, 后者表现为厌食 贫血 腹泻等 5 可有口 耳 眼 心畸形 6 小淋巴细胞绝对计数很少, 临床上易发生胞内感染, 病毒 ( 麻彦病毒 腺病毒 痛彦病毒 症病毒 风彦病毒 腮腺炎病毒等 ) 及霉菌感染 (~) 先天性无胸腺病 (D 昨 eorge syn 也 Dme) 病变影响到第三 四日因囊发育而致胸腺 甲状旁腺缺失及严重心血管畸形, 大血管异常, Fallot 四联症, 新生儿抽擂, 食管闭锁, T 细

260 第十九章胞免疫缺陷 有的 19 正常, 产生抗体能力受损, 有的 T 辅助细胞受损, 严重则 k 产生少 {E! B 细胞数正常, 有的 T 抑制细胞损伤而存在高丙种球蛋白血症 此病还有典型外貌, 如耳 低环有切迹 上唇无人中沟 下顿小 二 ~ 宽, X 线检查无胸腺 常发生霉菌感染及其他细 菌感染 可用胸腺移植来重建免疫, 胸腺素也可治疗 ( 二 ) 慢性皮肤粘膜白色念珠菌病 患者淋巴细胞数并不降低, 但不能产生淋巴因子, 有时有内分泌腺相应抗体可能由于 T 抑制细胞缺乏而产生自身抗体 可有鹅口疮, 但对 该菌抗原的皮肤 j 旦发性过敏反应阴性, 臀部湿彦且常引起内分泌 ( 如肾上腺皮质 甲状旁 腺 甲状腺和性腺 ) 功能衰竭 在体外可见患者 T 细胞不能产生淋巴因子 ( 如 MIF)O 治疗 可用转移因子等 ( 三 ) 常见变异免疫缺陷病 (comnon variable imnunodeficicncy) 起病可从幼年到成人, 可能由于基因结构和调节上的异常, 因年龄增长而控制抗体产生基因下降 发病机理不 太清楚也不一致, 有的 TH 降低, 有的 Ts 亢进而抑制 B 细胞产生免疫球蛋白 患者有不同 程度免疫球蛋白减少, 临床表现可有反复化服性感染 萎缩性胃炎 恶性贫血 并发蓝氏 贾第鞭毛虫感染率高, 也可造成营养不良 腹泻, 灭滴灵可治疗 自身免疫病发生率高 但与一般自身免疫病不同, 一般自身免疫病时 Ts 可降低 淋巴结活检可显示淋巴样增 生,{E! B 细胞区的细胞明显缺乏 二. 联合免疫缺陷病 严重联合免疫缺陷病 (severe combined imnonodeficiencyt diseases, SCID), 是指细胞免疫 和体液免疫先天性缺乏, 属性联或常染色体隐性遗传 患儿因淋巴干细胞发育成熟障碍, 致使 T 及 B 细胞功能缺乏, 如易罹细菌 病毒和真菌感染, 多在一年内死亡 (~) 理论基础该病的病因还未完全阐明, 可能与以下两种因素有关 1. 淋巴干细胞发育成熟障碍严重联合免疫缺陷病属性联或常染色体隐性遗传, 己 阐明与白介素 2 受体的 γ 链突变有关 IL- 2R 由 α 自和 γ 链所组成, 此 γ 链也是细胞 因子 IL-4 IL-7, IL-9 及 IL-15 等白介素受体的自链, 故称共有 γ 链 (γc) 编码 γ 链的 基因位点在性染色体长臂 1 区 3 带 1 亚带, 当此基因发生突变的位点影响了胞质内的 γc, 致使信号传导通路失 i 舌, 可使淋巴干细胞的发育受阻 2. 腺昔酸脱氨酶缺乏腺昔酸脱氨酶 (adenosine deaminase, ADA) 是一种瞟岭替代途 径酶, 能使腺昔和脱氧腺昔分别转化为肌昔和脱氧肌昔 当第 20 号染色体上编码 ADA 的基因 5' 端内缺少核昔酸和存在一个点突变时, { 吏 ADA 缺陷, 致使脱氧三磷酸腺昔 (deoxy A1P) 不能转化为脱氧肌昔而含量增高, 可超出正常水平的 50~100 倍, 进而抑制核糖核昔 酸还原酶, 干扰时性的合戚, 抑制了淋巴细胞有丝分裂, 影响淋巴细胞功能, 造成 T B 淋 巴细胞和免疫缺陷 ( 二 ) 检验项目严重联合免疫缺陷病可同时表现为细胞免疫缺陷和体液免疫缺陷 免疫缺陷及AIDS病毒253 以下介绍细胞免疫缺陷检测项目 1. 细胞表面标志的检测可根据 T 细胞表面存在着特异性的簇分化抗原 (CD) 和受体定量 T 细胞 (1) 分化抗原 (ω) 的检测 T 细胞表面存在着特异性 CD 抗原, 如表 19-1 所示, 可通过特异性单克隆抗体进行检测, 这是诊断细胞免疫最有价值的试验

261 254 第三篇临床免疫学检验表 19-1 抗原 CD, CD 3 CD 4 CD, CD 2s T 细胞表面主要抗原及其特异性特异性全部 T 细胞和部分 NK 细胞成熟 T 细胞 T( 辅助诱导 ) 细胞 T( 抑制杀伤 ) 细胞 NK 细胞亚型活化 T 细胞 应用单克隆抗体检测 T 细胞表面抗原的方法有间接免疫荧光法和酶免疫法两类 1 间接免疫荧光法通常将肝素抗凝血经相对密度为 的葡聚糖泛影葡肢液分离得淋巴细胞, 分别与相应的特异性针对细胞膜表面抗原的鼠单克隆抗体 (m3 m4 创 ) 结合, 洗去游离的抗体, 加入荧光素标 i 己的羊或兔抗小鼠 IgG 抗体 (Ft 芷呈现黄绿色, R - phycoerotl 町 m 呈现红色 ) 经温育并洗去多余的标记抗体 取样制片, 用荧光显微镜观察并计数约 200 个淋巴细胞, 以荧光阳性细胞及细胞总数之比, 求得相应 ω 抗原阳性的 T 细胞百分率 CD3 反映总 T 细胞值, ω4 为 T 辅助诱导细胞, ms 为 T 抑制杀伤细胞 若有条件, 上述经荧光标记抗体染色的细胞可用流式细胞仪计数, 快速而准确, 但仪器较昂贵 2 酶免疫法与上述方法操作类同, 所不同的是以酶标 i 己的羊或兔抗小鼠 IgG 抗体取代荧光标记抗体, 当与相应底物反应可使阳性细胞呈棕黄色 可用一般光学显微镜观 察, 标本又便于长期保存 此法简便易行, 一般实验室均可采用, 有时为增强特异性染色, 选用抗生物素蛋白生物素 ( 过氧化物酶 ) 复合物染色 (2) 特异性受体的检测 T 细胞表面有特异性绵羊红细胞 (E) 受体和 T 细胞抗原识别受体 (TCR), 其中 E 受体曾广泛用作计数 T 细胞的标志 花环试验操作简便易行, 但影响因素较多, 操作稍有不同, 所得结果差异很大, 因此己被检测 ω 抗原方法所取代 2.T 细胞功能的检测 T 细胞具有多种生物学功能, 如对特异性抗原和促有丝分裂原 的应答反应及产生细胞因子 直接杀伤靶细胞 辅助或抑制细胞产生抗体等, 据此建立了一系列体内外检测方法, 其中有些己用作临床检测细胞免疫功能的指标 (1) 淋巴细胞增殖试验该试验又称 T 细胞转化试验 将能剌激 T 细胞增殖的植物血凝素 ( phytohemagglutini 日, PHA) 刀豆蛋白 A( concanavalin A, Con A) 或患者过去接触过的抗原与淋巴细胞共同培养, 在这些剌激下, T 淋巴细胞的代谢和形态相继发生变化, 数小时后细胞内酶活化, RNA 合成增加, 接着 DNA 合成也增加, 细胞增大, 形态变为不规则, 胞质增多, 染色偏嗜碱性, 出现空泡, 核仁明显, 染色质疏松, 这种增殖变化在 48~72 小时最为明显 淋巴细胞增殖和转化试验是判断 T 细胞功能的一项常用的体外免疫学检测指标, 该试验有形态学和放射线核素两种方法 1 形态法将外周血或分离的单个核细胞与适量植物血凝素混合, 置 3 7'C 培养 72 小时, 取培养细胞作染色镜检 根据淋巴细胞的大小 核和胞质的比例 胞质的染色性和核 结构以及有无核仁等特征, 区分转化的淋巴细胞和正常淋巴细胞 每份标本计数 200 细胞, 按下列公式计算转化率 : 转化率 (% ) 二转化的淋巴细胞数 ( 转化的淋巴细胞数 + 未转化的淋巴细胞数 ) X 100% 个

262 第十九章健康人外周血经 PHA 剌激的淋巴细胞转化率为 60 % ~ 80 %, < 50 % 可视为降低 此法简便易行, 但判断结果受主观因素影响较大, 有些细胞形态难于分辨, 因此重复性较大 2 放射线核素法全血或分离的淋巴细胞与有丝分裂原或特异性抗原在 3 7'C 培养 56 小时, 淋巴细胞受剌激而发生增殖转化时, 必然伴有 DNA 的大量合戚, 此时将 3 H 胸腺暗 盹核昔 eh-tdr) 加到培养液中, 3 H -TdR 则被作为 DNA 的原料摄入转化的细胞内, 继续培养 16 小时后将细胞收集在玻璃纤维膜上, 经处理, 用液体闪烁器测定放射核素活性 ( 以脉冲数表示 ), 此法能客观的反映淋巴细胞对剌激物的应答能力 增殖程度通常用剌激指数表示, 即受到剌激细胞每分钟脉冲数与等量未剌激细胞的每分钟脉冲数的比值 采用 PHA 所产生的增殖反应, 其剌激指数为 50% ~100%, 明显高于用抗原或同种细胞作为剌激剂的增殖反应 ( 其剌激指数为 3% ~30%) 此法较客观, 重复性较好, 结果也准确, 新生儿出生不久即可呈正常反应 细胞缺陷患者存在着与免疫受损程度一致的增殖应答低下甚至消失的现象 (2) j 旦发性皮肤过敏反应是常用的反映机体细胞免疫状态的体内检测方法 其方法为将一定量的抗原注入体内或涂抹于皮肤上, 经 48~72 小时后观察注射或涂抹部位是否出现红肿 硬结浸润 无红肿 硬结或其直径 <5 mr 丑者均为阴性, 表示受试者细胞免疫功能低下或有缺陷 可通过以下三种方法作检查 :1 用致敏机体有关因子的检查, 包括旧 结核菌素 (Or) 和纯蛋白衍生物 (PPD),~!E! 腺炎病毒 白色念珠菌 毛发痛菌素等 ;2 用无关因子预先致敏机体, 然后再检测其迟发型皮肤过敏反应, 多用二硝基氯苯 (DNCB) 或二硝基氟苯 (DNFB) ;3 不经致敏, 直接检测机体的 j 旦发型皮肤过敏反应, 如植物血凝素 (PHA) 临床上应用较多的是 Of,PPD 和 PHA 皮试 3. 淋巴结和组织活检 (1) 淋巴结活检是免疫缺陷病常规检查项目, 严重联合免疫缺陷病患者淋巴结皮质区和副皮质区界限不洁, 生发中心消失 (2) 直肠粘膜活检直肠粘膜下固有层中的浆细胞显著减少甚至缺如 (3) 骨髓检查患者骨髓中的淋巴细胞及浆细胞均显著减少 4. 胸部 X 线检查胸部 X 线检查是筛查婴幼儿 T 细胞缺陷的方法, 侧位胸片若不见 免疫缺陷及AIDS病毒255 胸腺阴影, 提示有 T 细胞缺陷 ( 三 ) 临床实践 1. 诊断 (1) 临床表现患者因严重的细胞及抗体免疫缺陷, 往往于出生后 2 个月起即有生长停滞, 3 个月起即有各种严重感染, 如呼吸道感染 服皮病 脑膜炎 败血症 念珠菌口炎 食管炎 肺炎 巨细胞病毒感染 麻彦病毒感染 卡氏肺囊虫病和间质肺炎等 患者不能预防接种, 否则易致疫苗 ( 如卡介苗 脊髓灰质炎病毒 ) 感染, 若治疗不及时, 则全身日渐衰弱, 于 2 岁以内死亡 患者缺乏排异能力, 易发生移植物抗宿主病 (GVHD), 常在输血或母体免疫活性细胞越过胎盘进入婴儿血循环后发生 GVHD 可表现为三种类型 :1 超急性型, 产生迅速扩展的剥脱性皮炎 严重腹泻 金葡菌感染等迅速致死 ;2 急性型, 有斑丘彦样红斑, 继之有肝 脾 淋巴结肿大 黄瘟 腹泻 发热 心律失常 中枢神经功能紊乱等, 患者多死于败血症 ;3 慢性型, 慢性皮肤表皮剥脱, 肝 脾或淋巴结肿大 腹泻 继发感染等 患儿淋巴组织发育障碍, 扁桃体小或缺如 即使存在严重感染, 患者肝 脾和淋巴结也不

263 256 第三篇临床免疫学检验大 ( 伴发 GVHD 时例外 ) (2) 实验室检查严重联合免疫缺陷病以细胞免疫缺陷为主, 首先需选择判断 T 细胞 缺陷的一些检测手段, 如 T 细胞计数 X 线胸腺检查 j 旦发型皮肤过敏反应可作为筛选检 查试验, 阳性反应可排除细胞免疫缺陷 由于个体差异, 接种某种抗原浓度 试剂质量和操作误差, 阴性结果尚不能确诊细胞免疫缺陷, 还需进一步作淋巴细胞增殖试验 当怀疑存在抗体缺陷或酶缺陷时, 可进行有关的检测 此病的实验室特征是外周血淋巴细胞总数降低, T 细胞减少或消失, j 旦发型皮肤过敏反应消失, 对植物血凝素 (PHA) 剌激缺乏反应 多数患儿还有 B 细胞和免疫球蛋白缺乏, 抗原剌激后缺乏特异性抗体反应, 缺乏同种血型凝集素 胸部 X 线检查不显示胸腺阴影, 肠道粘膜活检不见浆细胞 2. 鉴别诊断此病需与其他四种联合免疫缺陷病相鉴别 (1) 腺昔酸脱氨酶缺乏 80% ~90% 的腺昔酸脱氨酶缺乏患者表现为典型的严重联合免疫缺陷病症状,30% 的严重联合免疫缺陷病患者伴有腺昔酸脱氨酶缺乏 该病无性别差异, 出生后 1 周内就可发病, 有的发病较晚, 称为迟发型 患者有严重的腹泻 肺炎 中耳炎 败血症 脑膜炎和生长发育障碍 真菌 病毒 细菌和原虫均可引起感染 除淋巴系统外, 骨发育畸形, 方额 前肋凹陷或突出 扁平胸腰推, 以及短肢保儒最常见, 部分患者表现中枢神经症状, 如轻度的舞蹈症和震颤等 实验室检查的特征是患者红细胞腺昔酸脱氨酶含量只有正常红细胞含量的 2%~4%, 其他组织中腺昔酸脱氨酶含量也下降至正常值的 10% ~30% ;4~6 周患者外周淋巴细胞数量明显减少 ;IgG 缺乏不明显,19A 和胁 f 缺乏显著, 特异性抗体效价降低 ; 细胞免疫降低更明显, 对植物血凝素剌激缺乏反应和迟发型皮肤过敏反应降低 胸部 X 线检查不显示胸腺阴影 (2) 瞟岭核昔酸化酶缺乏该病发病无性别差异, 多发病于出生后 6~12 个月的婴儿, 随着年龄的增长, 病情逐渐加重, 患者反复发生病毒 细菌和真菌感染 有的患者可表现为自身免疫性洛血性贫血 类风湿关节炎等自身免疫病 患者红细胞再生能力低下, 疾病后期也可出现细胞功能障碍 实验室检查的特征是血 19 水平基本正常, B 细胞和浆细胞数基本正常 ; 外周血中 T 细胞数显著减少, 抑制性 T 细胞常低于正常水平 ; 淋巴细胞对植物血凝素剌激 同种异体混合淋巴细胞反应均极低, 迟发型皮肤过敏反应阴性 更有价 值的诊断指标是尿中尿酸含量低, 尿中出现鸟 ( 脱氧鸟 ) 昔和次黄日票口令核昔 淋巴细胞中脱 氧三磷酸鸟昔显著增高, 红细胞缺乏瞟岭核昔酸化酶可确诊为该病 (3) 主要组织相容性复合物 H 类抗原缺乏症这是一种不多见的免疫缺陷病 患者 外周淋巴细胞数正常,CD4 + T 细胞数减少, 抗体产生受影响, 细胞免疫功能下降 ( 的网状组织发育不良此病可发生于男女两性 患者出生几天后出现呕吐 腹泻 局部感染或发育障碍 常见鹅口疮 呼吸道感染 败血症等, 有的患者全身斑丘彦分布广泛 体检未能查及扁桃体或淋巴结, 病情恶化迅速, 一般 3 个月之内死于严重感染 实验室检查的特征是患者血白细胞 <2 X 10 9 L, 淋巴细胞对植物血凝素反应低下, 胸部 X 线检查未见胸腺影 3. 疗效评价和预后监测严重联合免疫缺陷病若未经治疗, 患者多在出生一年内因严重感染死亡 骨髓移植有时可完全纠正免疫缺陷, 采用人白细胞抗原 ( 且 A) 同型 混合淋巴细胞培养 ( 岛但 L) 匹配的同胞骨髓进行移植, 由此获得康复的患者己超过 100 例 如

264 中会引起移植物抗宿主 (GVH) 的成熟 T 淋巴细胞 也可移植胚肝 胎儿胸腺和胸腺上皮 胎肝是造血器官, 有丰富的多能干细胞, 胎儿在 15 周以内不存在人白细胞抗原相容性问 题, 因此利用 15 周以内的胎肝 胎儿胸腺和胸腺上皮进行移植不会发生移植物抗宿主反 应, 在治疗严重联合免疫缺陷病己有成功的报道, 可借助于上述检测判断疗效 四. 补体系统缺陷病 补体系统缺陷病也属原发非特异性免疫缺陷病, 它包括补体成分的缺陷 补体调节蛋 白质的缺陷和补体受体的缺陷三种, 其后果是会导致反复感染 某些自身免疫性疾病及其 他病理损伤 补体成分缺陷病在原发性免疫缺陷病中仅占 测手段尚不够灵敏, 漏检了一些病例有关 2.2%, 但有人认为可能与检 ( 一 ) 补体固有成分缺陷补体两条激活途径的固有成分包括 Clq Clr CIs c4 α C3, P 因子 D 因子等均可能出现遗传性缺陷病 缺陷可导致严重的甚至是致死性的 化服性细菌感染, 其机制在于 C3 缺陷的患者吞噬细胞的吞噬 杀菌作用明显减弱 C 斗和 α 缺陷使经典途径激活受阻, 导致免疫复合物病的发生 旁路途经的 D 因子 P 因子缺 陷使补休激活受阻, 患者易感染化服性细菌和奈瑟菌屑 菌属感染 ( 二 ) 补体调节分子缺陷 MA.C( C5 ~ C9) 缺陷可引起奈瑟 I.CIINH 缺陷补调节分子中以 CIINH 缺陷最常见, 属常染色体显性遗传病 CIINH 与活化的 Clr Cl q CIs 结合, 从而使 Cl 醋酶失 j 舌 遗传性 CIINH 缺陷者不能控制 α 的 裂解, 产生过多的 αa, 使血管通透性增高 此症又称为遗传性血管神经性水肿, 临床表 现为反复发作的皮下组织 肠道水肿, 会厌水肿可导致窒息死亡 2. 衰变加速因子 (DAF) 和 m S9 缺陷 DAF 和 CD S9 借助糖基化的磷脂酷肌醇 (GP r) 锚 定在细胞膜上 CD S9 通过与 c8 结合, 干扰 C5678 与 C9 结合而抑制 MAC 形成, 阻止细胞 洛解 DAF 加速补体经典途径 转化酶解离为 C4 b 和 αb 或旁路途经 C3 转化酶的 Bb 与 C3b 分离, 从而抑制 MAC 形成, 使宿主细胞免于受补体的损伤 阵发性夜间血红蛋白 尿 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH) 患者由于编码 N 酷葡糖肢转移酶的 PlG-A 基因突变, 不能合成 GPl 锚, 使红细胞缺乏 DAF 和 ms9 ' 导致自身红细胞对补体介导的洛 解敏感 ( 三 ) 补体受体缺陷红细胞表面 CRl 表达减少, 可致循环免疫复合物清除障碍, 从 而发生某些自身免疫病 ( 如 SlE )o 所菊一一口继发性免疫缺陷病一继发性免疫缺陷病主要发生于出生后较晚时期许多因素可以影响细胞免疫和体液免疫, 导致免疫功能低下 常见的引起继发性免疫缺陷的因素包括 :1 营养不良 : 是引起继发性免疫缺陷最常见的原因 蛋白质 脂肪 维生素和微量元素摄入不足可影响免疫细胞的成熟, 降低机体对微生物的免疫应答 2 感染 : 如 HN 可直接感染 ω'4+ T 细胞, 并在其中增殖 此外, 多种病毒 ( 如麻彦病毒 巨细胞病毒 风彦病毒和 EB 病毒 ) 结核杆菌或忏257 第十九章免疫缺陷及AIDS病毒果不能获得匹配的同胞供者, 可取一半同型的父母骨髓作移植, 移植前必须去除父母骨髓

265 258 第三篇临床免疫学检验麻风杆菌 原虫或蠕虫感染均可导致免疫缺陷 3 药物 : 免疫抑制剂 ( 激素 环抱菌素 A) 抗癌药物等可杀死或灭活淋巴细胞 放射治疗也有同样的作用 4 肿瘤 : 恶性肿瘤特别是淋巴组织的恶性肿瘤常可进行性的抑制患者的免疫功能 如霍奇金 (Hodgki 日 ) 病患者细胞免疫功能缺陷, 对结核杆菌 布氏杆菌 隐球菌和带状癌彦病毒易感 ; 慢性淋巴细胞白血病患者 B 细胞增殖受损 此外, 手术 创伤 烧伤和脾切除等均可引起继发性免疫缺陷 第四币 获得性免疫缺陷综合征 获得性免疫缺陷综合征 (acquired immunodeficiency syn 世 orne, AIDS) 又称艾滋病, 是一种由人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HN) 引起的继发性免疫缺陷综合征 该病主要通过性接触和体液传播, 病毒主要侵犯和破坏辅助性 T 淋巴细胞 (CD4 + ), 使机体细胞免疫功能缺陷, 特征是严重免疫缺陷, 并以细胞免疫缺陷为主, 可导致条件性感染 恶性病变和神经损害, 而无免疫异常的既往史 一. 理论基础此病是由人类免疫缺陷病毒感染所致, 它是一种 RNA 病毒, 属逆转录病毒科, 慢病毒亚科 HN 能产生逆转录酶, 能将胞质内病毒 RNA 逆转录为 DNA, 并整合到宿主细胞核内, 在核内变为宿主细胞 DNA 的一部分 这种整合的病毒基因与正常细胞基因一起复制, 结果原先受感染的细胞的所有后代细胞均含有病毒基因 己发现有两型, HN-I 和 HN-2 o HN-I 是从欧洲和美洲的艾滋病患者身上分离的病毒毒株的总称, HN-2 是从西非的艾滋病患者分离所得 HN-I 又可分为 9 个亚型 (A~ 1) 及 0 亚型, 0 亚型与 HN-I 其他亚型氨基酸同源性为 55% ~70%, 故有些学者将它归为 亚群, 而 A~I 亚型归为 M 亚群 HN-2 分为 A 和 B 两个亚型, 毒力较弱, 引起艾滋病病程较长, 症状较轻 引起全球艾滋病流行的病原主要是 HN-I 型 HN 有一个核蛋白核心, 外包含有病毒糖蛋白的类脂双层膜 核心由两个单链基因组 RNA 分子组成, 包括 3 个结构基因和 6 个调节基因 结构基因有以下三个基因组成 : (~) 核心蛋白 (gag) 基因它能指导合成非糖基化蛋白前体, 随后被 pol 基因编码的一种水解蛋白酶裂解为四部分 (P7, P9 PI8 P24), p7 p9 相当于内膜蛋白, PI8 为基质蛋白,P2 4 为核心蛋白 ( 二 ) 聚合酶 (pol) 基因它可编码以下三种酶 :1 逆转录酶, 参与病毒卧也逆转录为 DNA 以及 DNA 环化 病毒基因的整合 ;2 蛋白酶, 参与上述的病毒非糖基化蛋白前体的水解 ;3 核酸内切酶, 参与病毒复制 ( 三 ) 包膜 ( evn) 基因它能编码糖蛋白前体 (gpi60), 然后该蛋白被切割成 gp4i 的跨膜蛋白以及与之共价键结合的外膜蛋白 (gpi20) 包膜蛋白的结构决定了病毒的细胞嗜性, 包膜蛋白上具有与 CD4 受体结合的位点, 此结合点位于病毒 gpi20 的竣基端第 4 保守部分 ( 氨基酸 413~437, 413 是关键 ), 而这一区段正好是 HN-I 和 HN-2 的同源序列区, 提示两者均具有相似的细胞嗜性, 而所有具有 ω4 细胞膜结构的细胞均可成为 HN 攻击对象, 如辅助性 T 淋巴细胞 巨噬细胞等 当 HN 与细胞表面受体结合后, 在一种称为融合蛋白的辅助因子帮助下才能进入细胞, 并将核心蛋白和两条病毒卧也注入胞质

266 链 DNA 为模板, 在 DNA 聚合酶的作用下, 合成双链 DNA, 即所谓原病毒 (provirus), 经环化 后转移至胞核内, 并整合至感染细胞染色体的 DNA 中, 在这以后, 病毒可以呈潜伏状态 当在某些因素 ( 如感染其他病毒 ) 作用下, 受 HN-1 感染的 ωj 细胞被活化, 其 DNA 转 录成卧屿, 并翻译产生蛋白质, 随后在细胞膜上包装为新的病毒颗粒, 并以芽生形式释 出, 再感染其他 CD4 + 细胞 原先被 HN 感染的细胞形成合胞体而死亡 经过反复感染, 患者的 CD4 + 细胞明显减少 此外, 还可由于以下一些原因使 CD4 + 细胞减少 : 诸如受感染 细胞通过其细胞表面 gp120 和未感染的细胞表面的 m4 + 受体结合而融合成多核巨细胞, 使免疫系统受到损伤 ;HN 感染干细胞使 CD4 + 细胞产生减少 ; 通过自身免疫机制使未感 染的与病毒起交叉反应的 ωj 细胞受到破坏 由于 CD4 + 细胞的锐减, 患者的细胞免疫 严重缺陷 人类免疫缺陷病毒除感染 CD4 + 细胞外, 尚可侵犯机体的其他细胞, 包括单核 巨噬 细胞系 B 细胞 郎格罕细胞 脑内的星形细胞和神经胶质细胞以及毛细血管的内皮细胞, 使其他免疫功能也明显受损, 从而导致危及生命的各种条件性感染和肿瘤发生 二. 检验项目 (~) 特异性检测 针对病原体 H 凹的检验, 主要为血清抗 HN 抗体的检测, 必要时 检测病毒抗原或病毒核酸, 此外还有病毒的分离培养 1. 病原体直接检查 主要有以下三种检查方法 : (1) 显微镜检查 电镜形态观察, 此项检查需特殊设备和具有专门技能的研究人员, 仅用于实验室研究 (2) 抗原检测 检测由核心蛋白白 4 组成的循环 HN 抗原 一般用酶免疫法 (EIA) 检 测, 阳性检出率较低, 可能与 HN 是一种慢病毒有关, 因为在细胞内繁殖水平较低, 所释 放抗原量较少, 或在抗体产生后所形成的抗原抗体复合物阻碍了抗原检测 (3) 核酸的检测 采用逆转录酶 多聚酶链反应 (RT- PeR) 法检测 HNmRNA, 对该 病做出诊断 由于 HN 存在明显的异质性, 因此选取病毒基因种的高保守区用于扩增 常用的两对引物, 一对是 SK38 和 SK39, 另一对 SK145 和 SK101( 表 19-2) 表 19-2 人类免疫缺陷病毒扩增的引物 NA 为引物, 病毒内存在的逆转录酶以病毒 RNA 为模板反转录成单链时也 再以单 259 第病毒以由 十九章免疫缺陷及AIDS引物名称 序 要 Ij SK38 SK39 SK145 SKI0l ATAAτDCAα 士 TATI 汇 CAGrAα::AGAAAT TIτGGrCCITGTC 口 ATCYC 巳 AGAATGC AGrGGGGGGACATCAAGCAGC 巳 Aτ'GCAAAT GCTATGTCAGπ αxtτggitcic 2. 分离培养和鉴定从感染者外周血单个核细胞进行 HN 分离 最常用的方法为共培养, 即从正常人外周血分离单个核细胞, 加入植物血凝素等有丝分裂原, 共同培养, 经一段时间后, HN 可在共培养条件下增殖 确定 HN 感染最重要的依据无疑是从被检者体内分离出 H 凹, 但是病毒分离需在特定的实验室内进行, 费用昂贵且时间长, 一般不宜作为常规诊断 3. 人类免疫缺陷病毒抗体检测有胶乳凝集法 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 斑点金

267 260 第三篇临床免疫学检验免疫渗透法 (DIGFA) 和免疫印迹法 ( IBr) 四种 前三种是筛查试验, 后一种是确诊试验 这些实验方法各有其优缺点, 试剂中最重要的是采用 HN 抗原种类 ( 灭活的 HN 抗原 通过分子克隆技术所制备的重组蛋白 合成多肤抗原 ), 对试验的敏感性和特异性影响较大 目前多采用能同时检测 HN-l 和 HN-2 的第三代试剂盒, 即将 HN-l gp120 HN-l gp-41 区的抗原决定簇及 HN-2 包膜跨膜蛋白表型, 结合在各种载体上所建立的方法 (1) 乳胶凝集法这是一种间接凝集试验, 所用的载体是一种聚苯乙烯胶乳颗粒, 这种颗粒带负电荷, 可物理性吸附蛋白分子 这种致敏的胶乳颗粒与血清的 HN 抗体反应时, 由于抗体至少是二价, 一个抗体分子可结合 2 个胶乳颗粒, 这样相互联结成聚集体, 形成肉眼可见的凝集 由于这种致敏的胶乳颗粒上所结合的抗原蛋白质分子有时会脱落, 往往使试验的敏感性降低 为避免此缺点己制备成带有竣基基团的胶乳颗粒, 这种胶乳试剂所交联的抗原蛋白质不易脱落使稳定性改善, 保存期长 胶乳凝集法分试管法和玻片法两种, 试管法指在试管中进行凝集试验, 即先用缓冲液将受检标本在试管中作倍比稀释, 然后加入吸附抗原的致敏胶乳颗粒, 经一定时间反应后, 从胶乳凝集程度判定结果 玻片法指在玻片上分别将一滴受检标本和一滴致敏胶乳试剂充分混匀后, 在几分钟内观察结果, 此法操作简便 快速, 临床上较多采用此法作为艾滋病筛选试验 间接法 此法将 HN-l 和 HN-2 抗原蛋白质吸附在国相载体聚苯乙烯或聚氯乙烯板 小孔表面形成固相抗原, 形成固相抗原抗体复合物, 经洗涤使固相载体上只留下特异性抗 (2)ELISA 法 是目前临床检验中应用较广的酶免疫测定方法, 因用于测定抗体称为 体, 再加入酶标抗人 IgG 抗体与固相载体上的特异性抗体结合, 固相载体上的酶会催化最后加入的底物, 从而产生有色的物质, 颜色的深浅与相应抗体量成正比 (3) 斑点金免疫渗透法 (dot imnunogold filtration assay, DIGFA) 又名滴金免疫测定法 ( 简称滴金法 ) 此法以有微孔膜的硝酸纤维素膜为载体吸附上述的 HN-l 和 HN-2 抗原蛋白质, 当滴加待测标本后, 标本中所含的抗体与结合在膜上的 HN-l 和 HN-2 抗原相结合, 不被以后滴加的洗涤液所清除, 因肢体金本身呈红色, 阳性反应即在中央显 示红色斑点 此法操作简便 迅速, 己作为艾滋病筛查的主要手段 (4) 免疫印迹法 (i mr 丑 unoblotting test, IBr) 也称酶联免疫电转移印迹法 (enz)'l 耻 linked imnunoelectrotransfer blotlir 毯, EITB), 此法分三步 : 第一步为 SDS 聚丙烯酷肢凝胶电泳 (SDS- PAGE), 将灭活的 HN 抗原经 SDS 处理使其带负电荷, 在聚丙烯酷肢凝胶中从阴极 向阳极泳动, 分子量越小, 泳动速度越快 ; 第二步为电转移, 将在凝胶中己经分离的条带经 通电转移至硝酸纤维素薄膜上 ; 第三步为酶免疫显色定位, 将上述带有蛋白质条带的硝酸 纤维素薄膜纵向切成小条, 依次与待测标本和酶标抗人免疫球蛋白作用 当待测标本中 存在 HN 抗体, 就会与成区带 1 式的 HN 抗原结合, 经洗涤去除杂蛋白后又与酶标抗人免 疫球蛋白结合, 再经第二次洗涤去除游离的酶标抗体, 当加入能形成不洛性显色物的酶反 应底物, 就会使区带染色 常用的底物为 3, 3' 二氨基联苯肢 ( 呈棕色 ) 和 4 氯 1 苯 酷 ( 呈蓝紫色 ) 阳性反应的条带清晰可见, 并可根据 SDS- PAGE 时加入的分子量标准, 确定显色条带的分子量 ( 二 ) 非特异性检测指不直接针对病原体 HN 的检测, 主要是能反映患者细胞免 疫 体液免疫和免疫调节的检测方法 包括 T 淋巴细胞及其亚群 皮肤迟发型过敏反应

268 261 第十九章表 T 细胞增殖反应 自然杀伤细胞功能 免疫球蛋白 免疫复合物 α1 胸腺素和比微球蛋白检测等 二. 临床实践 (~) 诊断 1. 临床表现一般可分为以下三个阶段 : (1) 无症状病毒携带者 (asymptomatic carrier, AC) 是指感染 HN4~6 个星期, 产生抗 体前后出现类似于单核细胞增多症的症状, 表现为发热 不适 皮彦 关节痛及全身淋巴结病, 接着在 1~3 个月内出现血清学抗体阳性 随后上述表现消失 ( 淋巴结病除外 ), 患者为抗体阳性的无症状带病毒状态 (2) 艾滋病相关症候群 (AIDS related complex, ARC) 上述无症状病毒携带者又经过一 年左右, 出现持续性的全身淋巴结肿 体重减轻 间歇热 不适 嗜睡 慢性腹泻 直肠月 In 湿捷 淋巴细胞减少 白细胞减少 鹅口疮 ( 口腔念珠菌病 ), 患者还可出现一系列自身免疫 性疾病症状, 其中主要的是血小板减少 血清中可查到抗血小板抗体 抗核抗体 抗红细 胞抗体和抗心磷脂抗体, 有系统性红斑狼疮 (SLE) 样免疫异常, 可能是由于感染 HN 导致 淋巴细胞监视紊乱 (3) 获得性免疫缺陷综合征 人体感染 HN 后一般经过 5~6 年, 或更长时间, 经过 AC 和 ARC 阶段发展为 AlI 疤, 此时出现机会感染和合并恶性肿瘤, 其主要症状见表 起病因素 1. 念珠菌感染 2. 隐性球菌感染 3 阴性球菌袍子症 4 巨细胞病毒感染 5 单纯痛珍病毒感染 6. Kaposi 肉瘤 7. 原发性脑淋巴瘤 8. 淋巴性间质性脑炎 获得性免疫缺陷综合征的有关症状有关症状肺以外器官炎症连续 1 个月以上, 伴有眼泻出生 1 个月以上婴幼儿, 肝 牌 淋巴组织以外器官组织炎症持续 1 个月以上, 粘膜和皮肤呈溃殇, 或出生后 1 个月并发支气管炎 肺炎和食道炎 AIDS病毒食道 呼吸道 支气管或肺炎症 免疫缺陷及9 非定性厌氧菌症 非结核, 在肺 皮肤和颈部或肺门以外淋巴结出现, 播散全身 10. 卡氏囊虫病 1 1. 进行性脑白质症 12. 弓浆虫属脑症 球袍子真菌病 15. HN 脑症 16. 组织胞浆菌病 17. 袍子球虫感染 18. 非霍奇金淋巴瘤 19. 结核 20. 沙门菌血症 21. HN 消耗性综合征 出生 1 个月后出现未满 13 岁, 由嗜血杆菌及链球菌引起的败血症 肺炎 髓膜炎和骨关节炎或中耳炎, 及在皮肤粘膜以外部位, 有 2 年或 2 年以上在肺 颈部或肺门淋巴结部位, 或播及全身 HN 痴呆 AIDS 痴呆和 HN 亚急性脑炎在肺 颈部或肺门淋巴结部位, 或播及全身持续 1 个月 1 复泻小淋巴细胞瘤或免疫母淋巴瘤播散到一个以上肺外组织并非由伤寒杆菌引起, 反复发作全身衰弱极度萎靡 注 :AIDS 发病 5 年内, 死亡率超过 90% 吸毒的黑人卖淫者,AIDS 在发病 3 年之后几乎没有存活者

269 262 第三篇临床免疫学检验2. 实验室检查获得性免疫缺陷综合征有以下特征 :1 HN 抗体呈现阳性 2 CD3 + 细胞特别是 ωj 细胞减少明显, CD8+ 细胞正常或增多, J J 比值由正常的 2 倒转为 <1 皮肤 j 旦发型超敏反应减弱或消失, 淋巴细胞对各种丝裂原的增殖反应性降低 自然 杀伤细胞功能降低 3 免疫调节紊乱, 包括多克隆 γ 物 α1 胸腺素和民微球蛋白增高 球蛋白血症 循环中出现免疫复合 3. 诊断 根据 WHO 的规定, 对 AIDS 可疑者应检查 HN-l 抗体, 根据检测结果分为 抗体阳性 抗体阴性和无法确定为阳性还是阴性三组 其标准是 : 若用 ELISA 法 滴金法 或乳胶凝集法检查, 未检出 HN-l 抗体者, 为抗体阴性 ; 上述检查抗体阳性, 而用免疫印 迹法检查也为阳性者, 测定为抗体阳性 ; 若仅以上几种方法检查为阳性, 即使多次重复呈 相同结果, 但用免疫印迹法却为阴性, 测定为抗体不能明确者 (l) HN-l 抗体阳性组 若与表 19-3 所列 21 项指标符合, 即可确诊为 AIDS; 未满 15 个月婴儿, 若 HN-l 抗体阳性, 其母亲患 AIDS, 婴儿淋巴细胞减少, m4 + 细胞减少, J J 比值 <1 可确诊为 AIDS ;'if 21 项指标皆为阴性, 或 1, 斗, 6, 8, 9, 10 和 12 的指标为 阴性, 可排除 AIDSo (2) 抗体阴性组 需检查患者有否其他免疫缺陷病, 有者可排除 AIDS; 若没有其他免 疫缺陷病, 又有肺炎者可确诊为 AIDS; 当没有其他免疫缺陷病因, 又没有肺炎者, 应继续 按表 19-3 检查, 若 1~12 项标准完全不符合, 应排除 AIDS; 若在这 12 项指标中, 有一项 符合, 应进一步检查患者外周血 ωj 细胞数, ωj 细胞 < 中 10 8 L 为 AIDS 病 ; 若 ωj 细 胞正常或基本正常, 即 >4 X 10 8 L 者应排除 AIDS o (3) 抗体阴阳性不能明确组 检查患者是否有其他免疫缺陷病, 有者可排除 AIDS; 7G 者应按表 19-3 检查前 12 项指标, 12 项标准中若无一符合者, 可排除 AIDS; 12 项指标中 有一项以上符合者也可诊断为 AIDS o 诊断婴儿 H 凹的感染者, 需应用核酸检测, 因为这些婴儿通常可从胎盘获得母亲的 IgG 型抗 HN 抗体, 使血清呈阳性反应 经核酸检测证实约 20% 感染 HN o ( 二 ) 鉴别诊断 获得性免疫缺陷综合征因病毒侵犯或破坏辅助性细胞等免疫活性细 胞, { 吏感染者免疫功能特别是细胞免疫严重缺陷, 需与其他因素引起的免疫缺陷相鉴别 1. 免疫组织和免疫器官障碍 1 原发性血液淋巴系统的恶性肿瘤 : 恶性淋巴瘤 白 血病和骨髓瘤 ;2 免疫组织和器官受损 : 其他癌肿浸润 转移累及免疫组织和器官, 或者由 于化疗和放疗损伤了免疫组织和器官 ;3 脾切除 : 可因外伤或其他手术引起脾破裂, 以及 施行脾切除治疗一些疾病如 n 静脉高压 特发性血小板减少性紫癫 获得性洛血性贫血 等 2. 营养不良 严重的蛋白质 热量营养不良, 特别在儿童易使免疫功能低下, 患者 最易发生细胞免疫缺陷, 循环淋巴细胞数量减少, 对植物血凝素反应降低, 而 B 细胞所受 影响较小, 因饥饿而死亡的儿童尸检中可发现胸腺萎缩 维生素和微量元素的缺乏都能 明显降低机体的免疫功能 : 维生素 C 缺乏会使细胞免疫功能降低 ; 维生素 B6 缺乏影响胸 腺上皮发育, 使血清中的胸腺因子水平下降 ; 缺铁则 T 细胞数量下降, 细胞免疫功能受损, 白细胞杀菌能力和吞噬活性降低, 血清 Ig( 王和胁 f 水平显著下降 ; 缺辞者的胸腺 脾脏和淋巴结可减重 20% ~40%, 细胞免疫缺陷尤为明显 ; 晒缺乏影响 k 或抗体产生 ; 惶缺乏则

270 AIDS病毒5. 免疫抑制药物 使机体的粒细胞增殖受影响粒细胞数量和功能下降 3. 免疫细胞和免疫活性因子渗漏皮肤性疾病 ( 如创伤和烧伤 ) 肠胃道疾病 血管 淋巴病 肾病均可因免疫活性细胞或免疫活性因子从体内大量丢失而导致免疫缺陷病 如先天性肠淋巴管扩张症, 病理上所有的患者均有小肠的淋巴管扩张, 造成淋巴细胞和蛋 白质从胃肠道大量丢失, 由于淋巴细胞减少使患者出现严重的细胞缺陷 患者虽因肠道 丢失各类免疫球蛋白, 引起严重的低丙种球蛋白血症,{E! 患者对与抗原剌激的反应是正常 的 肾病综合征时 IgG 由基底膜漏出, 会产生选择性 IgG 降低 4. 感染感染和免疫相互影响 一方面, 患免疫缺陷病者易感染 ; 另一方面, 感染又 造成机体的免疫功能进一步降低, 故免疫缺陷和感染互为因果 细菌感染时细菌毒素抑 制淋巴器官和淋巴细胞的发育, 影响单核 巨噬细胞系统, 降低中性粒细胞数量 脑膜炎 双球菌 淋球菌和链球菌能产生 19A 分解酶, 破坏和分解 19A 类抗体, 在体外 3 7'C 条件下, 24 小时内就可使 90% 的 19A 类扩 L 体失活 病毒感染主要影响细胞免疫和非特异性免疫, 降低迟发型皮肤反应 (PPD 反应 ) 吞噬功能和中性粒细胞的杀菌活性, 但对血清 k 含量 影响不明显 病毒感染影响免疫的途径有 :1 病毒在细胞内复制, 影响和破坏淋巴细胞 单核 巨噬细胞 胸腺细胞和骨髓干细胞 2 产生淋巴细胞毒素或淋巴细胞毒活性的抗 体, 主要针对 T 淋巴细胞 所有血清中存在淋巴细胞毒活性抗体的患者其淋巴细胞数减 少 263 第(1) 肾上腺皮质激素它能降低淋巴细胞数量, 抑制淋巴细胞和吞噬细胞的功能 服 用氢化可的松 100 r 鸣, 4~6 小时后淋巴细胞降低 23, f 亭药 24 小时后 T 细胞逐渐恢复正 常 促肾上腺皮质激素 (AI 口日 ) 也能降低 T 细胞数 (2) 其他免疫抑制剂生物因素中的抗淋巴细胞血请或淋巴细胞免疫球蛋白 抗 ω3 抗体 抗 C 口抗体 抗细胞因子及其受体的抗体等, 化学因素中包括环抱素 A 硫代瞟岭 (6 琉基瞟岭 琉哩瞟岭 ) ; 院化剂 ( 环磷酷胶 丙丁酸氨芥 氨芥 白消安 ) 抗代谢类药物 (5 氟尿唔院 阿糖胞昔 ) 以及治疗癌肿的药物 ( 长春新碱 大剂量甲肢蝶岭 ) 均可干扰核酸 和蛋白质合成而使免疫功能降低 此外有些抗生素类药也可直接抑制免疫 ( 表 19-4) 表 19-4 抗生素抑制免疫的效应机制 十九章免疫缺陷及淋巴细胞转化 抗体产生 吞噬 杀菌 趋化型 甲氧节肢 H 密庭 ( 刊 1P) 氯霉素 四环素 磺胶类药物 庆大霉素 横肢甲基异口密庭 ( 部忆 ) τ 孔 1p 部 1z 多西环素 丁胶卡那霉素 妥布霉素 利福平 两性霉素 B 庆大霉素 丁胶卡那霉素 两性霉素 B 多西环素 四环素 四环素 多西环素 多西环素 利福平 头子包菌素 两性霉素 B 氯霉素 林可霉素 映喃妥英 利福平 甲硝瞠

271 264 第三篇临床免疫学检验( 三 ) 疗效评价和预后监测目前尚无有效治疗 AIDS 的措施和药物 近年来一些学者用基因工程技术重组 gp120, 用以封闭 CD4 分子, 以预防 HN 感染 ωj 细胞 ; 或以抗 ω4 抗体封闭 HN 包膜上的 gp120 使之丧失结合 ωj 细胞的能力, 以阻止 HN 感染 CD4 + 细胞 虽然从理论上令人鼓舞, 但应用前景仍不乐观, 有待进一步研究 在治疗过程中动 态检测 CD4 值 P24 抗原和应用 RT-PCR 法检测 HN 的基因可评定疗效 参号文献 1 温加登, 史密斯, 贝内特主编. 西氏内科学. 邵循道主译. 第 19 版. 西安 : 西安世界图书出版公司, 1995: 第 3 卷 746~760 2 赵武述, 陈仁, 下志强主编. 现代临床免疫学第 1 版北京 : 人民军医出版社, ~363 3 Robert Berkow.τbe Merk Mamua1. 16th Ed.New York:Merck & Co, 1NC.Rabway, ~ Savitsky K, Bar - shim A, Gilad S, et a!. A single Ataxia Telangiectasia gene with a produtct similar to pi - 3 ki nasc.science, 1995, 268:1 749~ Derry JMJ.Ochs HD, Francke U. Lsolation of a novel gene mutated in Wiskott - Aldrich syndrcme. Cell.1994, 78: 636~644 6 Aruffo A. Farrington M. Hollenbangh D, et al.τbe CD4Ol igand, 即 39, is defective in activated T cells from pa - tients with X - linked hyper - I 必 1 syndrαne.cell, 1993, 72 :291 ~300

272 所一一十章免疫增殖性疾病常见的免疫增殖性疾病 第二十章 免疫增殖性疾病 述旺M4Aql 忏口免疫增殖性疾病 (imnunoproliferative disease, IPD) 是指免疫器官 免疫组织或免疫细胞 菊265 第的异常增生所致的疾病, 主要是由于免疫系统受剌激后反应异常, 引起淋巴细胞克隆异常增殖, 而造成免疫系统肿瘤性或非肿瘤性的增殖, 从而引起免疫球蛋白质和量的变化以及免疫功能异常的一类疾病 也有人将此类疾病称作免疫系统肿瘤, 当这种肿瘤发生于淋巴组织或器官时称作淋巴瘤 (lymphoma), 而如果以血液中免疫细胞的异常增多为特征则称作白血病 (l eukemia) 以前对它们的分类和研究主要是基于细胞的形态和相关的临床表现, 由于不同淋巴细胞群之间存在不同的表面标志, 现在对免疫增殖性疾病有了更加深入的了解 白血病性免疫增殖病主要指急性淋巴细胞性白血病 (acute 1 只刊 phocyte leukemia, ALL), 慢性淋巴细胞性白血病 (chronic lymphocyte leukemia, ell) 和毛细胞白血病 (hair cellleukemia) 淋巴瘤包括霍奇金病( Hodgkin' s disease, HD) 和非霍奇金淋巴瘤 (non Hodgki 日, s Lymphoma, NI-IIJ 年世界卫生组织下属的国际血液学家和肿瘤学家临床咨询委员会将淋巴瘤划入白血病的范畴, 分为 TNK 细胞瘤 B 细胞瘤和霍奇金病, 其中, T 和 B 细胞瘤又可以分作前体或淋巴母细胞瘤和成熟 ( 外周 )T 和 B 细胞瘤 上述免疫增殖性疾病多数属于血液病学的范畴, 本章重点讨论与免疫学检验密切相关的免疫增殖病, 即 B 淋巴细胞异常增殖或其他导致免疫球蛋白异常的疾病 B 细胞受抗原剌激后, 增殖分化为浆细胞, 浆细胞具有产生和分泌免疫球蛋白的功能, 一株浆细胞只能产生一种化学结 构和免疫学特性完全相同的免疫球蛋白, 称为单克隆免疫球蛋白 正常情况下, 人体内的浆细胞包含成千上万株, 可以合成和分泌成千上万种化学结构和免疫学特性均不同的多克隆免疫球蛋白 人体内虽然只有 IgG 19A 胁 1,1gD 和 19E 五类免疫球蛋白, 但是每一类免疫球蛋白均包含多种既相似又有差别的多克隆免疫球蛋白 第二币 临床上将浆细胞病分成两类 : 一类是单克隆浆细胞恶性增殖, 分泌大量单克隆免疫球 蛋白, 引起一系列的病理改变并产生相应的临床症状, 称为恶性浆细胞病, 又称作单克隆 内种球蛋白病, 包括多发性骨髓瘤 巨球蛋白血症 重链病等一些疾病 患者血清中出现 大量理化性质均一的单克隆丙种球蛋白, 这种异常的免疫球蛋白称 M 蛋白 ( monoclonal protei 日 )0 M 蛋白可以是 IgG 19A 胁 1,1gD 或 IgE 五类免疫球蛋白中的任何一类, 也可以是 κ 入中的任何一型 ; 可以是完整的免疫球蛋白分子, 也可以是单纯的游离重链或者轻链 M 蛋白与正常免疫球蛋白相比虽然结构相似但是没有抗体活性 另一类是单克隆浆细 胞的良性或反应性增殖, 其临床症状及病理生理改变主要与原发病有关, 而不是由浆细胞

273 266 第三篇临床免疫学检验增殖或其分泌的免疫球蛋白引起的 这类疾病可以继发于多种慢性炎症 ( 如结核 胆道感染 骨髓炎 亚急性, 心内膜炎等 ) 自身免疫性疾病( 如系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎 硬皮病 结节性多动脉炎 重症肌无力等 ) 病毒感染 慢性肝病( 慢性活动性肝炎 肝硬化 ) 等疾病 一. 多发性骨髓瘤骨髓瘤是骨髓的原发恶性肿瘤, 起源于骨髓的原始网状组织, 偶发于髓外组织 病灶一般多发, 同时发生于多处骨悟, 每个骨中又可有多个病灶, 单发的甚为少见, 故又被称为多发性骨髓瘤 (multiple myeloma, 岛 1) 多发性骨髓瘤是单株浆细胞在骨髓中恶性增殖的恶性肿瘤, 是免疫增殖病中最常见的一种类型, 其特征为骨髓浆细胞瘤和一株完整性的单克隆免疫球蛋白 (IgG 19A 胁 1,IgD 或 19E) 或 Bence - Jones 蛋白过度增生 1873 年 Rutzky 首先报道并命名该病, 1900 年 Wr 国 lt 证实其瘤细胞为浆细胞, 所以又称作浆细胞骨髓瘤 (plasma cell myeloma) 0 多发性骨髓瘤是一种恶性肿瘤, 预后不良 患者早期可无症状, 仅表现为血沉增快或 M 蛋白血症 轻链蛋白尿等 由于肿瘤性浆细胞为单克隆性, 故其所产生的免疫球蛋白为均一的 类型相同的单克隆免疫球蛋白, 具有相同的重链和轻链 浆细胞除合成完全的免疫球蛋白外, 也可合成过多的轻链或重链 有时肿瘤性浆细胞只合成轻链或重链而没有完整的免疫球蛋白, 这种游离的单克隆性 κ 或 γ 轻链称为 Bence Jones 蛋白, 分子小, 可通过肾由尿排出 骨髓瘤细胞浸润骨髓及软组织, 并产生大量单克隆球蛋白或轻链或重链 也偶有骨髓瘤细胞不能分泌球蛋白及轻链 骨髓瘤好发于红骨髓丰富的骨中, 常见于扁骨如颅骨 脊柱 骨盆及肋骨等处, 晚期, 长骨如脏骨及股骨亦可受累 发病率估计为 (2~3) 10 万, 男女比例为 1. 6: 1, 大多患者年龄 >40 岁, 黑人患者是白人的 2 倍 本病呈进行性, 但适当的治疗可延长生存期并改善生活的质量 约 60% 患者经治疗其客观征象有改善, 有疗效的病人的中位存活期为 2.5~3 年, 只有很少数的病例存活期限可以达到 10 年 预期寿命的长短与诊断时病变的范围 支持疗法是否恰当以及对化疗的反应有关 骨髓移植可以较现有的一些方法更能有效的延长患者的生命 诊断时血清或尿中 M 蛋白含量高 比微球蛋白量高 弥散性的骨病损 高钙血症 贫血以及肾功能衰竭都是预后不良的征兆 (~) 发病机制本病发病机制至今尚未阐明, 可能与一下因素有关 : 1. 造血干细胞异常有人认为多发性骨髓瘤属早期干细胞病, 在患者的骨髓及外周血中存在骨髓瘤祖细胞, 经适当剌激后, 可以分化为骨髓瘤细胞, 提示骨髓瘤起病于造血干细胞阶段 2. 免疫调节异常患者 T 细胞总数和 ωj T 细胞减少, J T 细胞相对较多, ωj ms + 比值降低, 并与病情的进展相关 ; 患者正常 B 细胞数量减少, 功能受到抑制, 存在异 常的前 B 细胞, B 细胞成熟受阻 3. 细胞因子异常多发性骨髓瘤患者血洁白介素 6(IL-6) 含量明显增高, 并与病情相关 ; 骨髓体外培养显示, 骨髓瘤细胞可以白发增殖, 瘤细胞分泌的 1L-6 明显高于正常人骨髓体外培养 1L-6 是正常浆细胞分化和维持岛 f 细胞生存和促进其生长的一种重要细胞因子 另外,ω1-CSF 与 1L- 3 可以剌激骨髓瘤细胞分泌 1L-6, 低剂量 IFN α 和 1NF 可以诱导骨髓瘤细胞分泌 1L-6, 但高剂量 IFN α 则抑制骨髓瘤细胞的增殖 0 4. 遗传学改变骨髓瘤患者常出现染色体异常改变, 其中以 1 号染色体异常最多

274 第一一十章见, 另外还发现存在 ras 基因的突变 约 25% 岛创细胞中可检出 16q23 位点 c - maf 基因高表达 c-maf 基因与 Jun fosnf- IL- 6 等均属碱性拉链转录因子家族成员, 该家族成员参与细胞增殖 分化以及对 IL-6 应答 岛似的发生与 14q32 位点面 1 基因 llq13 位点 cyclindl 基因 4p16.3 位点 FGFR3 基因和 16q23 位点的 c-maf 基因有关, 也涉及其他染色体上的断裂易位以及癌基因和抑癌基因, 特别是 13q14Rb 抑癌基因 5. 其他除以上因素外, 有资料报道病毒感染 环境因素 化学物质及电离辐射等因素在骨髓瘤的发病过程中也可能发挥一定的作用 ( 二 ) 临床表现 1. 瘤细胞增生浸润的表现由于骨髓瘤细胞的大量增殖, 影响了正常的骨髓造血功能, 导致贫血 由于骨髓瘤细胞大量增生 浸润和破坏骨组织, 引起骨酷系统发生骨质疏松和洛骨性病变, 引起骨痛 病理性骨折 一般累及中轴骨髓及长骨近段, 常发生骨折的部位如脊柱胸腰段 锁骨 肋骨等, 也可发生多部位骨折 法国 Giuliani 等指出 : 骨组织的基质细胞和成骨细胞可产生两种蛋白骨保护素 (osteoprotegerin, OPG) 及其配体 (OPGL), 因 L 促进破骨细胞的分化和活性, 而 OPG 抑制这些过程 ; 骨髓瘤细胞影响骨髓中这两种蛋白的生理平衡, 是发生洛骨性病变的根本所在 2.M 蛋白血症的表现由于单克隆免疫球蛋白增高, 正常免疫球蛋白的分泌受到抑 制, 机体抵抗力降低, 伴发免疫缺陷, 容易发生继发感染 感染是常见的初发症状, 也是常见的死亡原因之一 另外, 大量的 M 蛋白导致血液粘稠度增加, 出现高粘滞综合征, 表现为紫癫 鼻出血 头晕 头痛 耳鸣 视力模糊与障碍 倦怠 jg 钝 记忆力减迟 共济失调 精神混乱甚至意识丧失 3. 肾脏损害 M 蛋白在肾小管的沉积 淀粉样变性等常引起肾脏功能障碍 出现 Bence - Jones 蛋白尿的患者, 肾脏损害最常见, 可能是 Bence - Jones 蛋白对肾小管的毒性作用或在酸性条件下沉积所致 与感染一样, 肾功能衰竭既可以是本病的初发表现, 也是主要死亡原因之一 4. 其他表现如贫血及骨髓瘤细胞髓外浸润的表现, 神经系统可出现神经根痛 截瘫 脑神经瘫痪 多发性神经病 另外有淀粉样变表现, 如关节肿胀畸形以及腕管综合征等 ( 三 ) 诊断与临床分期 1. 诊断骨髓中异常浆细胞比例超过 10% 或病变活检处有异常浆细胞浸润是诊断 免疫增殖性疾病267 多发性骨髓瘤的首要条件 结合以下任何一项或一项以上就可以初步确立诊断 :1 血清蛋白电泳出现 M 带或免疫球蛋白升高 ( 常大于 30 gi L), 可以是五种免疫球蛋白中的任何一种 大约有 80% 的病例血清蛋白电泳可显示出一均匀的高而窄的 M 峰, 其移动于钓到慢 γ 区的任何部位 ; 其余 20% 的病人只合成游离的单克隆轻链 (Bence - Jones 蛋白 ), 其血清蛋白电泳图显示出低丙种球蛋白血症而无 MI 峰 然而几乎所有伴轻链的骨髓瘤患者在浓缩尿液的蛋白质电泳图上均可显示出同质性的 M 峰, 用单个特异性抗血清进行的免疫电泳或免疫固定法检查, 无论是在血清里还是尿里都可验明 M 峰的免疫球蛋白型 2 尿 Bence - Jones 蛋白阳性或电泳出现 M 蛋白, 尿的化学纸条检查并不能可靠地检测出本周蛋白, 热试验常导致误诊, 而愤基水杨酸和甲苯愤酸则是有效的检测试剂 显著的白蛋白尿在骨髓瘤中罕见, 其存在提示并存淀粉样变性或轻链沉着性病变 3 典型的溶

275 268 第三篇临床免疫学检验骨性损害, X 射线检查可显示典型的凿孔状洛骨性病损或弥漫性的骨质疏松症 成骨细胞的病损罕见, 因而放射线核素骨扫描通常无助于诊断, 磁共振检查对早期病人预测疗效是有帮助的 在诊断过程中应注意排除转移性骨肿瘤的可能, 并应与慢性炎症或感染以及结缔组织疾病所致的反应性浆细胞增多相鉴别 必要时可作轻链测定或轻链的免疫组织化学染色, 有助于判断浆细胞是否为克隆性 2. 临床分期最常用的是 Durie - Salmon 分期系统 : 第 I 期瘤细胞数 <0.6 X m 2, 且符合以下各项标准 :1 血红蛋白 >100 g Lo 2 血清钙正常 <3.0 mmol Lo 3 骨髓 X 线正常 ( 积分 ) 或只有孤立性洛骨损害 4 血清 M 蛋白水平低, IgG< 50 g L, 19A< 30 gil, 尿轻链蛋白 <4g/24 ho 第 H 期瘤细胞数 (0.6 ~ 1. 2) X m 2, 其他各项标准既不符合 I 期, 也不符合田期 第四期瘤细胞数 >1. 2 X 迁, 且符合以下一项或多项标准 :1 血红蛋白 <85 gl 2 血清钙增高 >3.0 mmol Lo 3 广泛的溶骨损害 ( 积分 3) 4 血清 M 蛋白水平升高, IgG>70 gil, 也 A>50 gil, 尿轻链蛋白 >12g24ho 每期根据肾功能变化, 又分 A B 两种亚型 :A 型 : 肾功能正常, 血清肌酣 <176.8 vmol/lob 型 : 肾功能损害, 血清肌酣 >176.8 vmol/lo 各种骨髓瘤体内细胞总数, 可以根据下列公式计数 : I 后骨髓瘤 ( 口 X m 2 计 ) n 二 X 骨损害.059 X Hb 值 X 血清 M 成分值 X 血清钙值 X 尿 M 成分值其他骨髓瘤 ( 口 X m 2 计 ) 口二 X 骨损害.058 X Hb 值 X 血清 M 成分值 X 血清钙值 X 尿 M 成分值 细胞的总重量大约等于 1kgo 骨髓损害的积分 : 正常 0 分, 骨质疏松 1 分, 骨损害 2 分, 广泛骨髓破坏及明显骨折 3 分 二. 巨球蛋白血症巨球蛋白血症 (mac1 鸣 lobulinemia) 也称原发性或 Waldenstrom's 球蛋白血症, 是一种浆细胞恶性病, 主要是伴有血清胁 f 增加的 B 淋巴细胞异常增生, 1944 年由瑞典生物化学家 Waldenstrom 首先报道 该病临床表现与淋巴瘤相似, 主要表现为淋巴结 肝脾肿大 反复感染等, 由于患者血清中含有大量的高分子无免疫活性的胁 1 球蛋白, 导致出现高粘滞综合征的症状 当临床表现以心肺功能异常为主时是由于血浆容量的增加造成循环的损害所致 对寒冷过敏或雷诺现象可能与冷球蛋白或冷凝集素有关 在多数浆细胞病诊断之前可偶然出现血清总蛋白升高或贫血 如果血清蛋白电泳时出现一个典型的 M 峰, 经免疫电泳或免疫固定电泳证明为胁 1, 可确诊本病 中度贫血, 显著的红细胞钱串形成和血沉增快是其典型的表现 白细胞减少, 淋巴细胞相对增多, 偶见血小板减少 可能存在冷球蛋白, 类风湿因子或冷凝集素, 若存在后者, 抗球蛋白直接试验 ( 仕 x:mbs 试验 ) 通常为阳性 多种凝血和血小板功能异常的现象可发生 如果存在冷球蛋白或血液粘滞性显著增高时, 常规血液检查结果可能有误差 半数患者的正常免疫球蛋白降低

276 第一一十章对浓缩尿液进行免疫电泳检查常可显示单克隆轻链 ( 通常为时, 但肉眼可见的 Bence Jones 蛋白尿并不常见 骨 X 射线检查可显示骨质疏松症, 但洛骨性损害罕见 骨髓象可见浆细胞 淋巴细胞及浆细胞样淋巴细胞有程度不等的增加 此外, 淋巴结活检常被认为是弥漫性分化好的浆细胞性或淋巴细胞性淋巴瘤 本病 23 的患者发生高粘滞综合征, 高粘滞综合征的症状包括疲劳 虚弱 皮肤和粘膜出血 视力障碍 头痛以及各种各样的其他的神经症状 高粘滞综合征病人血洁的相对粘滞度通常 >4.0( 正常为 1. 4~ 1. 8), 其胁 f 多呈五聚体, 分子量可以达到 900 凶 'a, 沉降系数为 19 S, 也有更大的聚合物达 27 S 以至 31 S, 这更加重了血液粘度, 少数患者也有为 7S 单体的 眼底可见到酷似香肠状视网膜静脉, 则可诊断为高粘滞综合征 视网膜出血 渗出 微动脉瘤和视神经乳头水肿则表明疾病己到晚期 二. 重链病重链病是一组肿瘤性的浆细胞病, 由于浆细胞发生突变并异常增殖, 合成功能发生障碍, 只产生免疫球蛋白的重链或只产生有缺陷而不能与轻链结合的重链, 这样致使血清和尿中出现大量游离的无免疫功能的重链, 称为重链病 (heavy chain disease), 其特征为单克隆免疫球蛋白重链过度产生 目前己报道了 α γ μ 或 8 四种重链病, E: 重链病还有待发现, 其中 8 极为罕见 大多数浆细胞增生性疾病, 其 M 蛋白在结构上与正常的抗体分子相似 相反, 重链病产生的是不完全性单克隆免疫球蛋白 ( 实际上是副蛋白 ) 异常的淋巴细胞或浆细胞分泌各种各样的重链成分 (α γ μ 或的, 而不分泌轻链 大多数重链蛋白是其正常分子结构的相应部分的碎片, 且有长度不等的内源性缺失, 这些缺失可能是结构上的突变造成的 其临床表现与多发性骨髓瘤和淋巴瘤相比, 似乎更像淋巴瘤 (~)1gA 重链 (α 链 ) 病这是最常见的一种重链病, 1968 年 Seligman 首先报道, 被 WHO 命名为免疫增生性小肠病 ( 肠型 ), 后又发现肺型, 1O ~30 岁患者常见 肠型较多见, 表现为腹痛 慢性腹泻 吸收不良 体重明显减低等, 地理分布集中于中东, 而且与地中海淋巴瘤或免疫增生性小肠疾病有密切关系 其临床症状非常一致 : 几乎所有病人都有弥 免疫增殖性疾病269 漫性的腹部淋巴瘤和吸收不良综合征 组织病理学检查可见小肠固有层绒毛的萎缩以及淋巴细胞 浆细胞或免疫母细胞的大量浸润 ; 细胞浸润可能是多态性的, 从组织病理学的标准来看恶性程度并不明显 肠系膜淋巴结可能显示类似淋巴浆细胞浸润, 但外周淋巴结 骨髓 肝和脾通常不受侵犯 骨 X 线检查未见洛骨性病损 α 重链病免疫学主要特征是血洁和尿中出现低浓度的 α 类游离重链 ; 血清蛋白电泳可能不出现孤立的 M 峰, 常在 α2 与日区出现一条宽带或 γ 组分减少 免疫化学诊断需在免疫电泳上检测到只与抗 I 队 抗血清而不与抗轻链抗血清起反应的异常成分, 该异常蛋白常存在于肠道分泌物中, 并可在浓缩尿中检出 本周蛋白阴性 ( 二 )IgG 重链 (γ 链 ) 病 1964 年 Frankli 日首先报道, 己见 100 多例 患者主要是老年男性, 儿童仅有几例 中位存活期约 1 年, 范围从数月到 5 年以上 死亡原因常为细菌感染或进展为癌肿 与之有关的慢性病包括类风湿关节炎 干燥综合征 系统性红斑狼疮 结核 重症肌无力 嗜酸细胞增多综合征 自身免疫性洛血性贫血以及甲状腺炎 其临床表现酷似恶性淋巴瘤, 通常有淋巴结肿大和肝脾肿大 ; 发热 反复感染以及正常免疫球蛋白水平降低的现象亦可见到 ; 常见贫血 白细胞减少 血小板减少 嗜酸细胞增多以及外周

277 270 第三篇临床免疫学检验血中出现不典型的淋巴细胞或浆细胞 诊断的依据是免疫电泳或免疫固定电泳法检查 : 在血清和尿中检出游离的单克隆 γ 类游离重链, 多为 γ1 和元, 但无 Bence - Jones 蛋白 50% 患者的单克隆血清成分 ( 常表现为宽而不均一 ) 超过 10 g L, 24 小时尿蛋白超过 1 g 的病人亦占 50% 外周血中可见异常淋巴细胞或浆细胞, 正常免疫球蛋白水平降低 骨髓和淋巴结的组织病理学表现多变 骨 X 线检查洛骨性病损罕见 淀粉样沉着在尸检中罕见 ( 三 ) 胁 f 重链 (μ 链 ) 病 1970 年由 Ballard 首先报道, 本病少见 临床上常表现为病程漫长的慢性淋巴细胞性白血病或其他淋巴细胞增殖性疾病的征象 患者主要是内脏 ( 脾 肝 腹部淋巴结 ) 受侵犯, 但几乎没有外周淋巴结病变 23 的病人骨髓中出现特征性含有空泡的浆细胞, 这是真正的病理依据 (pa 出 ognomonic) 本周蛋白尿 (κ 型 ) 见于 10% ~15% 患者, 病理性骨折以及淀粉样变性都可能发生 常规血清蛋白电泳通常是正常或 显示低丙球蛋白血症, 可见 α1~α2 区域的升高 如果发现迅速移动的一种血清成分, 该成分可与抗 μ 链的抗血清起反应, 但不与抗轻链的抗血清起反应, 可作出诊断 游离 μ 链在尿中罕见 尽管单克隆 κ 链和 μ 链可由同一细胞合戚, 但二者在结构上是不会联接的, 其原因不明, 但可能是由于异常的重链内在缺陷所致 ( 四 )1gD 重链 ((j 链 ) 病本病极为罕见, 其临床表现与多发性骨髓瘤相似 骨髓浆细胞明显增多及颅骨洛骨性病损 在血清蛋白电泳中证实有小 M 成分, 该成分可与单一特异性抗 19D 的抗血清起反应, 而不与抗重链或抗轻链的其他抗血清起反应 无蛋白尿 四. 良性单克隆免疫球蛋白病良性单克隆免疫球蛋白病 (benign monoclonal gammapathy, BMG) 是指血中出现单克隆免疫球蛋白 (M 蛋白 ) 又不伴有浆细胞恶性增殖的一类疾病 许多病例表现为良性, 然而有 25% 的患者在 20 年后可进展为 B 细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤, 此时才出现临床症状, 因此又称为意义未定的单克隆免疫球蛋白病 (monoclonal gammapathy of undetermined significa 口 ce, MGUS) 其病因及发病机制尚不明确, 少数病例最终发展成多发性骨髓瘤, 也可以发展成其他疾病, 如多发性肠息肉 随年龄的增长, 良性单克隆免疫球蛋白病的发生率增高 本病一般无症状或体征, 血清 M 蛋白水平一般不高, 一般不超过 30 g L( 1gG), 不呈进行性增加 ; 分类以 19G 型多见, 约占 54% ~74%, 其次为 19A 型, 占 12% ~30%, 胁 f 型约占 11 % ~20%, IgD IgE 型少见 临床上不伴发淋巴细胞恶性增生的症状, 不出现骨损害和贫血等 骨髓中浆细胞数不超过骨髓细胞总数的 10%, 且形态正常 仅少数患者有可能转变为恶性病, 如血中或尿中出现 Bence - Jones 蛋白, 则很可能是一个危险信号, 很可能将发展成多发性骨髓瘤 良性与恶性单克隆免疫球蛋白病的鉴别见表 20-1 良性单克隆免疫球蛋白病是一种良性疾病, 但有时也可发展成多发性骨髓瘤等恶性疾病, 因此需要长期追踪观察 五. 冷球蛋白血症冷球蛋白 ( cryoglobulin) 是指温度低于 3 7'C 时易白发形成沉淀 加温后又可溶解的免疫球蛋白, 不包括冷纤维蛋白原 C 反应蛋白与白蛋白的复合物和肝素沉淀蛋白等一类具有类似特性的血清蛋白质 当血中含有冷球蛋白时便称为冷球蛋白血症, 这种病理状态多继发于某些原发性疾病 : 例如感染 系统性红斑狼疮 (SLE) Sj gren 综合征 天癌疮 类

278 271 第3 型 :1 I 型为单克隆型, 约占总数的 25%, 主要是胁 f 类, 偶有性疾病冷球蛋白血症可分为 肉瘤 麻风等 尽管抗原抗体各不相同, 但是冷球蛋白血症的共同的皮肤改变为四肢末端的发纯 紫癫 坏死 雷诺现象 表 20-1 恶性与良性单克隆免疫球蛋白病的鉴别诊断 症状贫血骨损害骨髓象 M 蛋白 (g L) IgG IgA 胁 f 正常 Ig 游离轻链 恶性单克隆免疫球蛋白病几乎都出现溶骨性损害很普遍浆细胞 >15%, 形态正常或异常随病情进展升高 >30 >15 >15 显著降低常出现在血清和尿中,κλ 异常 良性单克隆免疫球蛋白病一般无, 但可因其他疾病而伴发不常见浆细胞 <10%, 形态一般正常保持稳定 <20 <15 <15 正常或轻度降低一般呈阴性,κλ 正常 IgG, 罕有!gA Ej 戈 Bence - Jones 蛋白 0 多伴发于多发性骨髓瘤 原发性巨球蛋白血症或慢性淋巴性白血病, 实质上是一种特殊类型的 M 蛋白血症 2 H 型为混合单克隆型, 约占总数的 25%, 其冷球蛋白是具有抗自身 IgG 活性的单克隆免疫球蛋白, 主要是胁 1( 类风湿因子 ), 偶有 IgG 或!gA o 这些冷球蛋白常与自身 IgG Fe 段上的抗原决定簇相结合, 呈 IgG- Iβf 复合物状态 多伴发于类风湿性关节炎 干燥综合征 淋巴增殖疾病和慢性感染等, 也有少数的白发性混合冷球蛋白血症 3 田型为混合多克隆型, 约占总数的 50%, 其冷球蛋白为多克隆 多类型的免疫球蛋白混合物, 例如胁川剧或者胁 1 IgG!gA 等 常伴发于以下疾病 : 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎 干燥综合征 传染性单核细胞增多症 巨细胞病毒感染 病毒性肝炎 链球菌感染后, 心内膜炎 麻风 黑热病等 本症临床表现多变, 主要涉及冷球蛋白类型, 除原发疾病的临床表现外, 部分病例 (50% 的 I 型和 15% 的 H 型和田型患者 ) 可无症状, 其他患者常有因为冷球蛋白遇冷沉淀所引起的高血粘度 红细胞凝集 血栓形成等病理现象 常见症状包括雷诺现象 ( 即寒冷性肢端紫纬 ) 皮肤紫癫 坏死 由殇 寒冷性草麻彦 关节痛 感觉麻木等, 深部血管受累时可引起肾 脑 肝和脾等器官损害 所菊一一口免疫增殖性疾病的实验室检测一免疫增殖性疾病的实验室诊断主要依靠血液学和免疫学手段其中免疫学检测尤为重要 免疫学检测在免疫增殖病中的应用目的主要有 : 一是确定诊断, 主要是利用免疫学技术确定有无克隆性增殖的标志, 如 M 蛋白鉴定 ( 醋纤膜电泳 免疫电泳 免疫固定电泳等 ) 外周血淋巴细胞某些免疫表型分析等; 二是为了监测病情 判断预后和转归, 如免疫球蛋白定量 IL- 6 民微球蛋白测定等 免疫球蛋白的多数分析测定技术都可用于内种球蛋白病的检测 当临床上考虑为多发性骨髓瘤 巨球蛋白血症或其他浆细胞恶变疾病时, 首先应该做血清蛋白区带电泳, 如果发现有异常球蛋白区带, 继而进行免疫球蛋白测定与免疫电泳, 作进一步定量分析和免疫球蛋白分类鉴定 注意作追踪观察, 以助病情 忏一一十章免疫增殖

279 272 第三篇临床免疫学检验疗效的了解和预后的推断 良性或继发患者往往是在体检或其他检查中进行血清蛋白区带电泳而发现的 当疑为 J 令球蛋白血症或轻链病时, 均应进行冷球蛋白测定或 Bence Jones 蛋白测定加以证实 一. 免疫球蛋白定量测定免疫球蛋白定量测定较常用的方法有单向扩散法与免疫浊度法, 前者较为简便, 后者更为准确迅速 单向扩散法由于影响因素较多 结果准确性较差及方法的灵敏度较低等原因, 现在己经很少采用 恶性单克隆丙种球蛋白病常呈现某一类内种球蛋白的显著增高, 大多在 30 g L 以上 ; 而正常的免疫球蛋白, 包括与 M 蛋白同类的内种球蛋白的含量则显著降低 在良性内种球蛋白病的血清标本中, M 蛋白的升高幅度一般不象恶性内种球蛋白病那么高, 多在 20 g L 以下 ;M 蛋白以外的免疫球蛋白含量一般仍在正常范围之内 如在单向扩散试验中出现双固状沉淀环, 则标本中可能存在某种免疫球蛋白片段的 M 蛋白 多克隆丙种球蛋白病患者的血清中常有多种类型的免疫球蛋白水平同时升高, 每类上升的幅度不太大,{E! 总的内种球蛋白水平增加比较明显 免疫球蛋白的定量检测, 有时会由于不同实验室所用抗血清特异性的差异而造成 M 蛋白定量结果的不同, 特别在使用某一株 M 蛋白制备的抗血清检测其他患者的 M 蛋白时 如能配合区带电泳光密度扫描, 常可纠正这种误差 进行免疫球蛋白的定量检测, 不仅有助于内种球蛋白病的诊断, 而且对内种球蛋白病的良 恶性鉴别具有一定的帮助 如做动态观察, 对内种球蛋白病的病情和疗效的判断有一定的价值 M 蛋白含量的多少常可反映病情的轻重, 尤其对同一患者, M 蛋白含量明显增高常提示病情恶化 经有效治疗后, M 蛋白含量逐渐下降, 而正常免疫球蛋白的含量则由降低趋向正常 二. 血清蛋白区带电泳蛋白质为两性电解质, 在不同 ph 洛液中带不同的电荷, 从而在直流电场中能够泳动, 这就是蛋白质的电泳现象 1937 年瑞典化学家 Tiselius 首先建立了蛋白质的界面电泳技术, 并成功地将血清蛋白质分成几个组分 从此以后, 随着电泳技术的不断发展, 蛋白电泳成为蛋白质化学研究和临床实验诊断中必不可少的重要方法 目前电泳方法可分为自由界面电泳和区带电泳两大类 分析血清蛋白质各个组分变化最简单的方法就是血清蛋白电泳, 采用醋酸纤维素薄膜或琼脂糖凝胶作为电泳的支持介质, 正常人血清蛋白电泳能产生 5 条或 6 条区带 ( 图 20-1) 正常参考值:Al b 为 57% ~68%, α1 为 1. 0%~5.7%, 问为 4.9% ~1 1. 2%, 自为 7%~13%, γ 为 9.8% ~18.2% 采用淀粉胶或聚丙烯酷肢凝胶作为电泳的支持介质, 由于它们的分子筛效应, 其分辨率大大超过醋酸纤维素薄膜或琼脂糖凝胶, 血清蛋白电泳能产生 25 条以上的区带 有关调查显示, 现在各临床实验室血清蛋白电泳主要采用的是醋酸纤维素薄膜或琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酷肢凝胶电泳的结果复杂, 难以解释, 除特别的目的外恨少用于临床 通过与正常的电泳图谱进行比较分析, 很容易发现患者电泳图谱含有一个狭窄而浓缩的集中条带, 即 M 区带 ( 图 20-2), 经扫描显示为一高尖的蛋白峰 高 宽之比常大于 (2: 1) J; 这是由于 M 蛋白的化学结构高度均一, 因而其电泳迁移率十分一致 如果将这些区带电泳图谱进行扫描, 还可计算出异常蛋白的含量和百分比 这种 M 区带较多见于 γ 或自区, 偶见于 α 区 M 区带的电泳位置可大致反应出免疫球蛋白的类型, IgG 型多位

280 273 第一十章白蛋白 疫增殖性疾病+ 于 α 区至 γ 慢区,lgA 型多位于 γ1 与日区, 胁 f 型多位于自 2 或 γ 区,IgD 型多位于自或 γ 区 白蛋白 l z 正常血清区带电泳及扫描图 国同 间回国同国国嗣国同罔同R国同川U国国同凶自同自同阿川UM阿川UB同川US同川U6回阿U2向国U7川]旦国491图 20-1 免图 20-2 M 蛋白电泳图及扫描图 ( 图 20-3) 但是区带电泳不能完全确定免疫球蛋白的类型, 最终确定还需用特异性抗 体进行鉴定 轻链病时 M 蛋白呈淡染区带, 常位于自或 α 区, 需与尿中 Bence - Jones 蛋白 检测或尿蛋白电泳联合观察 在某些情况下还可以出现假的狭窄区带, 易与 M 蛋白混淆, 应注意区别 例如洛血 标本中血红蛋白形成的自位区带 陈旧血清中聚合 IgG 形成的近原位的窄区带以及由类 风湿因子形成的位于 γ 区中间的细区带都容易与 M 区带相混淆, 遇到这些可疑情况时, 应进一步做免疫电泳等分析加以区别 非分泌型骨髓瘤患者血清蛋白区带电泳常不能检出单克隆丙种球蛋白的 M 区带, 往 往呈现低丙种球蛋白血症的特征, 临床上却存在浆细胞骨髓瘤的表现 为明确诊断需对 患者骨髓中恶性浆细胞进行表面免疫荧光染色分析, 或提取其恶性浆细胞经洛解后再行 免疫球蛋白分析 多克隆丙种球蛋白病是临床上更为常见的一类疾病, 其病因与单克隆 丙种球蛋白病明显不同, 是受一些抗原剌激引起多株细胞过度免疫应答的结果, 因此, 血 清蛋白电泳图谱是在 γ 区域呈现着色深浓 宽阔而不匀的区带, 扫描图上显示一宽大蛋白 峰, 易与 M 蛋白相区别 多克隆丙种球蛋白病中免疫球蛋白的升高谱型大多无特异性, 一般以 IgG 升高为多, 可伴 19A 或助 f 升高, 也可 19A 或助 f 单独升高 低丙种球蛋白血 症则表现为 γ 区的缺失 结缔组织中多克隆丙种球蛋白增高有随疾病严重程度而升高的 一

281 274 第三篇临床免疫学检验白蛋白 19D Gamma 19M 白蛋白 19G 峰 + 图 20-3 各型 M 蛋白对应电泳位置示意图 趋势, 而肝病中的增高程度也可用来估计肝损伤的程度 二. 免疫电泳免疫电泳 (immunoelectrophoresis, IEP) 为区带电泳与免疫双向扩散的结合, 是由 Grabar 和 Williams ( 1953) 首先报道的 方法是先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂或琼脂糖板上进行电泳, 使其分离成不同的区带, 然后与电泳方向平行在两侧 开槽加入抗血清 置室温或 3 7'C 使两者扩散, 各区带蛋白在相应位置与抗体反应形成弧形沉淀线 根据各蛋白所处的电泳位置, 可分为白蛋白区 球蛋白 α1 区 α2 区 自区和 γ 区 根据沉淀弧的形状 位置和量的变化, 可以知道病人血清中何种成分增多 何种成分减少或消失 该方法具有简单易行 样品用量少 特异性高和分辨率强等优点, 但由于免疫扩散需要时间较长, 观察结果需要一定的经验, 目前主要用于 M 蛋白的分类和鉴定 M 蛋白与相应抗体发生反应所出现的沉淀弧较为特殊, 较普通沉淀弧宽, 凸出呈弓形, 不难辨认 如果待测血清标本与某型免疫球蛋白重链及轻链抗血清产生相同迁移度的特殊沉淀弧, 提示存在单克隆丙种球蛋白 (M 蛋白 ), 此现象多见于 IgG 19A 或胁 f 型多发性骨髓瘤或原发性巨蛋白血症等 在同一抗轻链血清的反应中, 同时出现二条毗邻的特殊沉淀弧, 则可能是除 M 蛋白以外还存在游离轻链, 偶尔也可见两种 M 蛋白, 此时应进一步测定尿中的 Bence - Jones 蛋白 如果患者血清仅与其中一种抗轻链抗血清产生一种特殊的沉淀弧, 而其他 5 种抗重链抗血清均不产生此种特殊的沉淀弧, 则可能是轻链病 若患者血清只与 IgG 19A 或胁 f 中的一种抗重链血清产生一特殊沉淀弧, 但在两型抗轻链血清中无相应位置的沉淀弧出现, 血清标本经 2 疏基乙醇还原处理后, 仍无改变, 提示可能是重链病, 需进一步测定其分子量 如果免疫电泳仍不能完全进行 M 蛋白的分类

282 275 免疫增殖性疾病 鉴定, 可应用免疫固定电泳作为补充, 以便进一步鉴定 四. 免疫固定电泳免疫固定电泳 (imr 丑 unofixation electrophoresis,!fe) 是 Alper 和 Johnso 日 (1 969) 推荐的一项有实用价值的电泳加沉淀反应的技术, 可用于各种蛋白质的鉴定 该法原理类似免疫电泳, 将同一份标本点在载体的六个不同的位置, 通过电泳, 根据蛋白质所带电荷及分子量的不同将其分开 然后将 γ α μ κ 和入的抗血清分别加入到五条电泳区带中, 蛋白固定液则加到参考电泳区带中, 经孵育后, 若有相应的抗原存在, 抗原与对应抗体直接发生沉淀反应, 形成的复合物嵌于国相支持物中 将未结合的游离抗原或抗体洗去, 则出现被结合固定的某种蛋白 经过染色后, 电泳参考区带和发生沉淀反应的区带内的蛋白质着色, 从而对 M 蛋白进行分类和鉴定 ( 图 20-4) 必要时还可加抗 Fab 抗 Fc 等特殊抗血洁, 区 ELP G A M K L ELP G A M K L Sen 皿 1 S 町 um2 图 20-4 免疫固定电泳图谱 带电泳支持物选用滤纸 醋纤膜 琼脂或聚丙烯酷肢皆可 免疫固定电泳结合了蛋白质电泳的高分辨率和抗原抗体反应的特异性, 为基因蛋白研究提供了强有力的分析工具 在许多实验室免疫固定电泳技术己经取代了传统的免疫电泳技术, 成为单克隆抗体定性和分型的首选方法, 该方法具有检测周期短 敏感性高 分辨清晰和结果易于分析等优点 如果利用单个抗重链血清 (γ α 及川 单一的抗游离及结合轻链 κ 和入的抗血清进行反应, 根据有无阳性反应来识别是否出现单克隆组分 如果用于尿液检测, 可以快速检测和识别 Bence - Jones 蛋白 ( 图 20-5) 五. 免疫印迹技术免疫印迹 ( imrnunoblotting) 又称蛋白质印迹 (Western blotting), 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法 该法是在凝胶电泳和国相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术 将含有目标蛋白 ( 抗原 ) 的样品首先用 SDS 聚丙烯酷肢凝胶电泳 (SDS- PAGE) 或非变性电泳 (Native - PAGE) 等分离后, 通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其他膜的表面, 然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测 由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和国相免疫测定的高特异性和敏感性, 其优点是方法简便 标本可长期保存 结果便于比较, 故广泛应用于分子生物学等领域, 成为免疫学 微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法 免疫印迹技术在 M 蛋白的鉴定中更

283 276 第三篇临床免疫学检验ELP GAM K L K free L free EchJSample 3 ELF ] 国同闺附阁 EZ.E.E j GAM K L 网阔 ii K E 回 Ech.fSa 皿 pie 4 L free EEl EchJSample 1 EchJSample 2 翩翩 已 ELP GAM K L K Hbre L lib 四 ELP GAM K L K 1i 四 L libre 图 20-5 Bence - Jones 蛋白电泳图谱敏感, 如在 B 淋巴细胞 CLL 时, 用免疫电泳只能在 15% 左右患者血清中检出 M 蛋白 ; 而用免疫印迹技术, 则自旨在 80% 左右的患者血清中检出 M 蛋白, 故在临床上高度怀疑为 B 细胞克隆性增殖, 而其他办法又不能确定时, 可采用此技术 六, Bence - Jones 蛋白的检测 Bence - Jones 蛋白即尿中游离的免疫球蛋白轻链, 其检测对轻链病的诊断是必不可少的项目, 并对多发性骨髓瘤 原发性巨球蛋白病 重链病等疾病的诊断 鉴别和预后判断均有一定帮助 正常时在组合免疫球蛋白时, 常可伴少量过剩的游离轻链, 由于轻链的相对分子量较小, 仅 2 万左右, 经肾小球滤出后, 80% 重吸收, 另有 10% 在肾小管降解, 10% 随尿排出, 因此正常尿中含量约 4μg ml, 每 24 小时总量也不会超过 2 ruga 而在 60% ~ 80% 骨髓瘤患者, 由于制造单克隆 k 的瘤细胞能合成较多的轻链, 因此能从尿中测得 常用的检测 Bence - Jones 蛋白的方法有化学法和免疫学法两种 Bence - Jones 蛋白在 ph5.0 的条件下, 加热至 50~60'C 时出现沉淀, 继续加热至 90'C 后又重新洛解 根据这种理化性质, 又将其称为凝洛蛋白, 故可根据这一特点, 用化学方法进行检测 这种加热沉淀法简便易行, 但敏感度较低, 也不能确定轻链的型别, 仅有 30% ~40% 的骨髓瘤患者呈阳性反应 免疫学方法是利用抗 κ 和入型轻链抗血清进行免疫电泳分析 为提高检出率, 尿标本宜先用聚乙二醇通过透析膜浓缩 游离轻链往往与其中一型的抗血清起反应, 在日 γ 区附近形成一条致密的弓形沉淀弧 有时轻链还含有其他蛋白, 要注意识别 如多克隆免疫球蛋白常同时与 κ 和入两型抗轻链血清形成沉淀弧, 而单克隆免疫球蛋白 (M 蛋白 ) 虽只与其中一型抗轻链血清反应, 但也与某一型重链抗血清产生一位置相同的沉淀弧, 通过观察分析可作出正确判断 也可采用抗 κ 和抗入特异性抗血清借助单扩散法或速率散

284 一一十章射 f 虫度法定量测定血样或尿样标本中的 κ 和入轻链的量, 并计算两者的比值, 正常标本 κ: 入约为 1. 8: 1; 骨髓瘤时两者比值发生变化 轻链病患者尿中可测得 Bence - Jones 蛋白, 但由于其分子量较小, 易迅速自肾排出, 故血中反而呈阴性, 检测时应该注意 七. 冷球蛋白的检测冷球蛋白是血清中的一种特殊蛋白质, 在 4'e 时白发沉淀, 加温至 3 7'e 时又可洛解, 故常利用这种可逆性冷沉淀的特性对其进行测定 取患者外周血, 分离出血清置 4'e 冰箱中, 一般在 24~72 h 出现沉淀, 若 1 周仍不出现沉淀者方可判断为阴性 如形成沉淀, 再置 3 7'e 温育使其复洛, 也可将冷沉淀物离心洗涤后做定性与定量分析 进行冷球蛋白研究和检测时, 必须注意以下事项 :1 部分单克隆冷球蛋白可在低于 w'e 时发生沉淀, 故标本采集时必须将注射器和容器预温, 离心及整个操作过程中也都要注意保温 ;2 部分冷球蛋白在冷的条件下可迅速沉淀, 但有一些则需数天, 因此, 这些血清需在 4'e 下放置 1 周 ;3 大部分正常人血清也含有多克隆冷球蛋白, 但通常是在 80 同时 以下 ;4 冷纤维蛋白原 C 反应蛋白 性, 实验时应加以区别 白蛋白复合物和肝素沉淀蛋白等也具有冷沉淀特 参号文献 277 第1 Nicola Giuliani, Regis Bataille, Cristina Mancini, et a1. Myeloma cells induce imbalance in the osteoprotegerin osteo 性疾病protegerin ligand system in the human bone marrow environment. Bl d, 2001, 98: ~ NL Harris, ES Jaffe, J Diebold, et a1.the World Health Organization Classification of Neoplasms of the Hematopoietic and Lymphoid Tissues: Rep 口,tt of the Clinical Advisory Ccmmittee Meeting - Airlie House, Virginia, November, 1997.τhe Hematol 唱 y Journal (2000)1, 53~66 3 Ia 址 v L, Atanasova G, Praskova M, et al. Bacterial lit 口 I 旧.lysaccharide induces proliferation of IL dependent plasmacytoma cells by MAPK pathway activation. Immunobiology, 2004, 208(5) :445~54 4 Wendy Cozen, Parkash S.Gill, Sue Ann Ingles, et a!' IL - 6 levels and genotype are associated with risk of young adult Hodgkin lymphoma. B1 d, 2004, 103:3 216~ S. Barille - Nion, B. Barlogie, R.Bataille, et a1. Advances in Biology and Therapy of Multiple Myelcma.Hematol 唱 T, 2003, (1) :248~278 6 孔宪涛, 侯健. 多发性骨髓瘤发病机制及免疫诊断研究进展. 上海医学,1994, 17 (1) :51 ~ 54 7 田虹 多发性骨髓瘤相关染色体和基因研究进展 国外医学遗传学分册, 2003, 26 (3) :182 ~ Brousset P, Meggetto F, Attal M, et a1. Kaposi' s sarccma associated herpesvirus infection and multiple myelαna.sc ience, 1997, 278: 1972 ~ 赵武述, 陈仁, 下志强. 现代临床免疫学. 北京 : 人民军医出版社, 沈霞. 临床免疫学与免疫学检验新技术 北京 : 人民军医出版社, Joan Blade.Transplantation for multiple myeloma: who,when, h 口 woften? BLCDD, 2003; 102, (10) :3 469~ Helen Chapel, Mansel Haeney, and Siraj Misbah et a!' Essentials of Clinical Immunology. IDN 口 JN: Blackwell Science LτD, 4th Edition (1999) 13 Gabriel Virella. Intr 口 duction to Medical Immunology.NEW YORK: MARCEL DEKKER,!NC.4th Edition (1997) 14 Richard A. Goldsby, τhα 口 as J.Kindt, Barbara A.Osbome, et a1.immunology.new YORK: W.H.Freeman & Co.5th edition(2003) 免疫增殖

285 三篇临床免疫学检验第二十一章 器官移植及其免疫学检验 所菊278 第口器官移植及移植免疫概论将一个个体的细胞 组织或器官用手术或其他方法, 移植到自己体内或另一个体的某一部位, 统称移植术 19 世纪初己有各种组织或器官移植的动物实验的报道, 临床也开始进行皮肤和角膜移植 20 世纪以来, 细胞 粘膜 脂肪 筋膜 软骨 骨 肌腊 肌 血管 淋巴管 综合组织移植和各种器官移植, 包括单一 两个联合和多器官联合移植都陆续开展 现在国际上通用的移植 ( 田口 splantatio 川这个名字就是指器官移植, 因为当今 " 移植学 " 的概念, 己经包括了细胞移植 组织移植和器官移植本身在内 器官移植是现代临床医学科学发展最快的学科之一, 其产生 应用和发展带动和促进了免疫学 药理学 遗传学和分子生物学等一系列基础学科的发展 而这些基础学科的研究进展反过来又促进了器官移植的更深入全面和有效地应用于临床治疗患各种器官终末性疾病病人 可以说, 现今除了头颅和脊髓不能移植外, 全身各器官组织均可通过移植进行置换, 甚至多个器官可同时进行联合移植, 使许多以往认为的 " 不泊之症 " 得以根泊, 为挽救器官功能衰竭患者的生命做出了巨大贡献 从有文字记载的人类历史中, 器官移植可以追溯到公元前几百年 据说中国名医扁鹊曾将两位年轻人的心脏互换, 大概可以算是人类史上的首例同种心脏移植 类似的记载也可以在西方宗教传说中找到 如一位死亡的黑人角斗士的腿被移植到了一位白人基督教徒身上, 治愈了后者坏瘟的左腿, 这就是有名的 " 黑腿的奇迹 " 传说 上面讲的只是神话故事传说而己, 在外科史上最早的关于器官移植正式的记载见于公元 2 世纪希腊医学教科书对公元 1 世纪印度外科医生 Sushruta 用自体皮肤移植做鼻再成型手术的描述 但是直到 20 世纪初, 器官移植才进入实质性的发展阶段 1902 年维也纳的 Ul lman 进行了狗肾的白体 同种异体和异种移植实验 1905 年 Carrell,1aboulay Guthrie 等对血管吻合技术进行研究, 改进并完善了肾血管吻合技术, 并进行了一系列带血管的实体器官移植狗肾移植的研究 : 狗的自体肾移植可维持良好的功能, 而同种异体肾移植则总是在移植后 1 周左右被排斥 1aboulay 甚至试验了将猪和山羊肾移植于人 由于 Carrell 在血管外科方面的研究成果对外科手术学进展贡献极大, 1912 年他被授于诺贝尔医学和生理学奖 1906 年第一例人类角膜移植获得成功, 并成为临床眼科的一项治疗方法 1933 年乌克兰外科医生 Voronoy 施行了第一例人同种异体尸肾移植, 但失败了 1947 年, Hurne 将肾移植于病人手臂血管上, 获得了短期有功能存活, 使得这位急性肾衰病人得以生存 此后, 世界各地进行了一百余例肾移植, 均因当时对于术后的免疫排斥反应还没有足够的认识和处理而宣告失败 直到 1954 年 12 月, 美国外科医生 Murray 成功地施行同卵双生姐妹之间的肾移植获得长期生存, 此后许多同种异基因肾移植也获得成功 至 1963 年秋, 全球共有 30 例同系 ( 孪生子间 ) 肾移植 从此, 肾移植成为定型的外科手术用于临床治疗慢忏

286 第一一十一章性肾功能衰竭, 正式掀开了现代医学器官移植的篇章 目前, 肾移植己是临床治疗晚期肾功能衰竭的主要手段 1956 年美国医生 Thomas 第一次给一位白血病患者进行骨髓移植获得成功 目前, 异基因骨髓移植在临床上己经成为许多疾病, 包括遗传病 血液系统疾病及放射病等的重要治疗方法 Murray 和 Thomas 的工作标志着器官移植在临床上己经成为治疗疾病的重要手段, 对医学的发展具有重要的意义 为表彰他们的贡献,1990 年 他们被授予诺贝尔医学奖 在 20 世纪 50 年代后期, 随着肾移植的临床应用, 外科医生对其他脏器移植手术也相继展开探索研究 在一系列动物实验基础上,1959 年底, 美国的 Lillehei 施行了首例同种异体膜腺移植 ;1963 年, 美国的 Starzl 施行了首例同种异体原位肝移植, Hardy 施行了肺移植 ;1964 年, Hardy 施行了首例黑猩猩到人的异种心脏移植 ;1965 年南非的 Barnard 成功地施行了人同种异体原位心脏移植 20 世纪 60 年代中后期, 曾有 6 个单位试验性地开展过人的小肠移植,{E! 均以失败而告终, 使这一研究此后停顿了近 20 年 20 世纪 70 年代, 美国的 Reitz 成功地施行了人同种异体原位心肺联合移植 在 20 世纪 60 年代至 20 世纪 70 年代, 骨髓 膜岛细胞 角膜等组织细胞移植也相继开展 至此, 除大脑和小肠移植未能成功外, 人体大多器官组织己经可以经过手术移植置换 目前, 全球进行的各种器官移植己经接近一百万例, 其中肾移植占 65% 骨髓移植占 12% 肝脏移植占 11% 心脏移植占 7% 20 世纪 60 年代末, 哈佛大学医学院的一个医学委员会提出了 " 脑死亡 " 的概念 : 即人大脑皮质的不可逆损伤即为死亡, 改变了几千年来以呼吸心跳停止为死亡的观念 这个新概念迅速被西方许多国家所接受并予以法律化, 这样就为器官移植获取良好质量的供体器官提供了根本保证 到 20 世纪 80 年代初, 新型器官保存液体的研制成功使供体器官切取后至移植手术完成之间的时间大大延长, 增加了手术的安全系数, 并有利于供体器官远距离的运送 比如肾脏可保存 36 至 48 小时, 膜腺和肝脏可以保存 12 至 24 小时, 心脏可以保存 6 小时 由于交通工具的发展, 通过超音速飞机可以跨国 跨洲际运送供体器官 欧洲和北美均成立了供体器官分配协调机构, 通过电脑网络几分钟内就可确定某个供体的最佳接受者, 最经济有效地利用了有限的体供器官 我国器官移植研究起步较晚, 新中国成立之前, 我国在这一领域的研究尚属空白 在以吴阶平 表法祖等教授为代表的我国老一辈外科学家的倡导及推动下, 我国在 20 世纪 50 年代末期开始了器官移植的实验研究 1960 年, 吴阶平教授率先在国内开展了临床肾移植, 开辟了我国临床器官移植的先坷, 这一阶段属于我国器官移植的起步阶段 由于十 器官移植及其免疫学检验279 年动乱, 器官移植研究受到严重冲击, 直到 20 世纪 70 年代末期, 受国外器官移植疗效提高的鼓舞, 我国曾掀起一个全国性的器官移植高潮 肾 肝 肺 心脏等器官的移植得以全面开展, 然而因为免疫抑制剂的局限, 加上脑死亡概念仍未被接受, 以及经验分散, 技术力量薄弱等因素, 所以这一阶段的总体疗效仍不理想 其结果是除肾 角膜等移植以外, 临床大器官移植陷入低谷 而在此期间, 随着新一代免疫抑制剂的问世, 国际上器官移植出现了突破性飞跃, 涌现了一大批有良好生活质量的长期存活群, 我国器官移植与先进国家的差距进一步加大 直到 20 世纪 90 年代, 我国的器官移植才出现复苏的迹象, 其主要标志是 : 心脏 肝脏 肺 膜腺 J 肠移植陆续得以开展; 移植疗效明显提高 ; 移植指征 手术方式及免疫抑制剂等逐渐与国外先进水平接轨 我国的器官移植进入了一个新的发展时期 据统计, 目前我国己开展了 33 种临床同种异体器官或组织移植, 包括肾 肝 心 肺

287 280 第三篇临床免疫学检验小肠 膜肾联合 肝肾联合 心肺联合 腹部多器官联合 肾上腺 辜丸 卵巢 胸腺 甲 1 文旁腺 关节 脾 J 夷岛细胞 肝细胞 脾细胞 骨髓 角膜等, 并在胚胎器官移植 脾移植 膜岛移植等方面形成了我国自己的特色或优势 近年来, 我国的器官移植有了很大的发展, 从 1995 年到 1999 年, 共进行了 例肾移植, 180 例肝移植, 3 例膜腺移植, 31 例膜肾联合移植, 36 例心脏移植, 11 例肺移植, 3 例, 心肺联合移植 20 世纪 50 年代中期以前的动物和人的各种器官组织移植均以失败告终的最主要原因即在免疫排斥反应 尽管个别医生提出个体间可能有不容性因素导致移植失败的疑问和猜想, 但那时人们对免疫排斥反应尚无认识 移植免疫 (transplantation immunity) 就是研究器官 组织移植时所出现的免疫排斥现象的一门科学 虽然器官移植的实验性研究在 20 世纪初就开展了, 但是直到 20 世纪 40 年代英国学者 Medawar 应用动物进行皮肤移植时, 才初步肯定了移植排斥 (transplantation rejectio 川现象本质上是一种免疫应答 其根据为 : 首先有致敏期, 移植排斥反应的发生需经历一个致敏阶段, 即初次移植的皮片在受者体内 1 周后开始出现排斥现象, 经过 10 天左右, 皮片脱落, 称初次排斥现象 ; 其次有免疫记忆和特异性, 受者对供者皮片经第一次排斥后, 再次移植同一供者皮片时, 表现为加速排斥反应, 称再次排斥现象, 表明具有免疫记忆, 若采用另一供者皮片, 则仍出现初次排斥现象, 表明排斥反应具有特异性 他提出了经典的免疫耐受模式, 这一理论对器官移植免 疫学产生了深远的影响 20 世纪 60 年代后期起, 由于 HlA 配型技术和免疫抑制药物的应用, 使临床器官移植成功率大幅度提高 除肾移植和骨髓移植外, 肝 膜 心 肺及心肺联合移植也都相继在临床开展 20 世纪 80 年代以后, 由于环抱素 A 及 FK 等高效免疫抑制的临床应用, 进一步提高了移植器官的存活率, 使临床器官移植进入了一个新的阶段 提供移植物 ( 即健康组织或器官 ) 者, 称为供者 (donor), 接受移植物者称为受者 (recip ient) 或宿主 (host), 被移植的部分称为移植物 (transplant graft) 根据供 受者之间遗传背景的差异, 一般将组织器官移植分为 : 自体移植 (autologous transplantatio 川, 是将自身的组织移植于白体的另一部位, 如烧伤后的皮肤移植, 或用于整容等, 这种移植不发生排斥反应, 若无细菌感染, 移植物可终身存活 ; 同系移植 (syngeneic transplantatio 川是指遗传基因型完全相同 (i s 唱 eneic) 或基本近似 (syngeneic) 的个体间的移植, 例如单卵双生之间的移植, 或同种动物多次交配而形成的近交系动物 (i 日 bred animal) 间的移植, 其移植效果与自体移植相同, 一般不会发生排斥反应 ; 同种异体移植 (allogeneic transplantation), 是指同种内遗传基因不同的个体间的移植, 临床上进行的器官移植就是指同种异基因移植, 其供者与受者之间的遗传基因型不同或不完全相同, 因此常出现移植排斥反应, 其排斥反应的强弱取决于供 受者之间遗传背景差异的程度, 差异越大, 排斥反应越强烈 ; 异种移植 (xeno - transplantatlon 或 xenogeneic transplantatio 川是指不同种属个体间的移植, 由于异种动物间遗传背景差异甚大, 尤其在非协调性 (d 凹 ordant) 的动物种属间, 体内可能存在抗对方组织细胞成分的天然抗体, 移植后可能产生严重的排斥反应, 包括超急性排斥反应, 故此类移植目前尚无长期存活的报道 根据移植物的位置分为原位移植和异位移植 : 如果移植后, 移植物被放置在原来的解剖位置, 称为原位移植 (orthotopic transplantation) ; 如果移植物被放置在其他位置, 则称为异位移植 (heterotopic transplantation) 移植物的种类有支架组织移植( 包括角膜 骨酷 软骨 肌!J7t 及血管等组织, 其中以角膜和软骨的移植效果最好, 若无感染基本

288 281 第学检验器官移植排斥反应的机制 可长期保留 ) 和生命组织或器官移植 ( 包括皮肤 各种脏器等, 它们成为人类的主要移植物 ) 从器官移植的发展来看, 外科学先于免疫学几乎近 40 年, 然而只有当免疫学觉醒, 并加入移植研究行列以后, 移植医学才作为一门独立的学科逐渐形成 移植免疫学虽然是一 n 新兴的学科, 但由于移植免疫学在移植医学中具有极其重要的地位, 因此关于移植免疫的研究极为活跃, 发展极其迅速 随着组织配型技术的不断完善 器官保存技术的逐步成熟以及免疫抑制剂的联合用药和个体化原则的确立, 移植物自旨在宿主体内长期存活并维持良好的功能, 同种异体移植物的近期和远期存活率都有了显著提高 器官移植作为一 n 尖端的科学, 必将有更加广阔的发展前景, 更广泛的应用到临床医疗中 第二币 移植排斥 (transplantation rejectio 川一般指受者免疫系统识别移植抗原后产生免疫应答, 进而破坏移植物的过程 同种移植中出现的排斥反应称为同种反应 ( auoreactio 川, 引起排斥反应的抗原称同种抗原 ( auoantigen), 受者 T 细胞对同种抗原的识别称同种识别 (auo - recognitio 日 ) 引起移植免疫应答的抗原称为移植抗原, 又称组织相容性抗原, 是移植排斥的分子基础 根据抗原性的强弱及引起移植排斥反应的强度, 组织相容性抗原又可以分为主要组织相容性抗原 (major histocompatibility antigen, MBA) 和次要组织相容性抗原 (minor histocompatibility antigen, r 世 {) 两大类 主要组织相容性抗原是引起移植排斥的主要抗原, 它在不同的动物中有不同的命名 人的主要组织相容性抗原为人类白细胞抗原 (human lew 王 ocyte antigen, HlA) 0 小鼠的主要组织相容性抗原称为 H-2 抗原, 狗为 DL A, 鸡为 B 系统, 大鼠为 H-1 系统, 黑猩猩为 CHlA 等 编码主要组织相容性抗原的基因称为主要组织相容性基因复合体 ( 岛 1HC) 一. 同种移植排斥的机制 (~) 移植排斥理论 1. 单向移植排斥理论 (one - way parad 眼叫免疫功能正常的个体, 接受异体组织器官后, 如果不经任何免疫抑制处理, 将立即发生宿主免疫系统对移植器官的排斥反应, 即宿主抗移植物反应 (host versus graft reactio 日, I-NGR), 导致植入的器官被排斥 ( 图 21-1) 在机体的免疫功能严重缺损时, 如果植入的异体组织器官中又含有大量的免疫活性细胞 ( 如骨髓 胸腺等 ) 的情况下, 宿主无力排斥植入的组织器官, 但是宿主的组织相容性抗原可以活化植入器官中的免疫活性细胞 ( 主要是 T 细胞 ), 这些 T 细胞可以产生针对宿主组织细胞的免疫应答, 导致宿主全身性的组织损伤, 即移植物抗宿主病 (graft versus host disease, GVHD), 严重的 GVHD 常导致宿主死亡 这就是所谓 " 单向移植排斥理论 " 但是, 由于临床上的器官移植是在应用免疫抑制剂的情况下进行的, 所以上述理论不能完全反映临床器官移植条件下的移植排斥的规律 2. 双向移植排斥理论 (two - way paradigm) 微嵌合体现象 :Starzl 等在对长期存活的肝 肾移植受者组织进行研究后发现, 这些患者的皮肤 淋巴结 骨髓和胸腺等多种器官中含有供者来源的细胞 取仍然存活的供者血淋巴细胞与这些接受其器官移植受者的淋巴细胞在体外进行岛仕 R 和 α 仕检查, 结果均无反应, 说明这些器官移植长期存活者己对供 一一十一章器官移植及其免疫

289 验宿主 TH 细胞 三篇临床免疫学检且,A I 类 抗原 图 21-1 皿 A li 类抗原 移植排斥反应机制示意图 者的组织抗原产生了耐受, Starzl 把这种现象称为微嵌合状态 (m 川 ochimecr 四川 O 微嵌合 现象的发现对传统的移植排斥理论提出了挑战 根据上述临床发现, 1993 年前后, Starzl 提出了他的 " 双向移植排斥理论 ", 其主要观点 是 :1 带血管的器官移植一旦血流接通后, 即发生细胞迁移 (cell imn 昨 atlo 川, 移植物中的 过客细胞会进入受者体内并分布在全身各组织, 受者的白细胞也会进入移植物内 但在 强有力的免疫抑制的情况下, 宿主的免疫系统既然不能排斥供者的器官, 当然也不能完全 " 消灭 " 从移植物中迁出的过客细胞 ; 同样, 移植物中的过客细胞也不能引起 GVHD o 在骨 髓移植情况下, 受者体内也有残存的白细胞, 在严格的免疫抑制控制下, 植入的骨髓不能 完全消灭这些残存的受者的细胞, 而这些受者白细胞也不能排斥供者的骨髓细胞, 只是在 不同的移植类型中, 二者的强度不同, 并最终形成二者共存的现象 2 Starzl 认为, 在器官 移植早期, 宿主的免疫细胞就会被移植物中的过客细胞上的组织相容性抗原激活并增殖 ; 同样, 过客细胞迁出器官后, 也会被宿主的组织相容性抗原激活并增殖 但是在持续的免 疫抑制剂作用下, 这种相互免疫应答就会由于诱发各种免疫调节机制, 最终达到一种无反明d儿 飞问l昏282 第L h

290 第一一十一章应性状态, 形成供 受体白细胞共存的微嵌合状态 3 微嵌合状态长期存在可导致受者对 供者器官的移植耐受 供者过客白细胞, 在宿主体内长期存在, 就可以通过某种方式, 促 进移植物的长期存活, 即导致免疫耐受状态 具有过客细胞越多的器官 ( 如肝 ), 其移出的 细胞也越多, 因此更容易形成供 受体嵌合状态 ; 也更易于形成移植耐受, 而长期存活 4 微嵌合体与免疫耐受的理论认为, 表达低密度的岛但 C 分子和无 B7 分子表达的不成熟 的树突状细胞 ( 配 ) 是一种耐受性的树突状细胞, 它在微嵌合体形成的耐受中起主要作用 为解释供体白细胞长达 20 多年的寿命, Starzl 后来又提出过客细胞中存在造血干细胞, 它在微嵌合体的长期存在中起很重要的作用 由于照射小鼠甚至可不输骨髓, 仅通过心脏移植就可促进造血功能重建, 说明过客细胞中有相当高比例的造血干细胞 ( 二 ) 引起同种移植排斥的抗原组织相容性 ( histocompatibil 町 ) 是指不同的个体间进行组织或器官移植时, 供者和受者双方相互接受的程度 引起移植排斥的抗原称为移植抗原 (transplantation antigen), 即组织相容性抗原, 是移植排斥反应的分子基础 其中, 能引 起较强排斥反应的组织相容性抗原称为主要组织相容性抗原 ( 岛 1H C 抗原 ) ; 引起较弱排斥 反应的组织相容性抗原称为次要组织相容性抗原 (r 址 1 抗原 ) 移植成败的关键即取决于 供 受者之间组织相容性抗原是否一致或相近 1. 主要组织相容性抗原人类的主要组织相容性抗原称为人类白细胞抗原, 其中与 移植排斥有关的主要为 HlA- I 类和 HlA - II 类抗原 o HlA- I 类抗原广泛表达于一切有核细胞表面,HlA- II 类抗原主要表达在活化的 Mφ B 细胞 树突状细胞等抗原提呈细 胞 血管内皮细胞及活化的 T 细胞表面 在群体中,HlA 等位基因及其产物具有高度多态性, 故在随机人群中很难找到 HlA 基因型或表型完全相同的供者和受者 在岛 1H C I 类不相容的同种器官移植中 CDs + 细胞毒 T 细胞 (Tc) 易被激活, 作用突出 ; 而在岛 1HC II 类 不相容的移植或综合性岛 1HC - I, II 类不相容的移植中, J 细胞和淋巴因子激活的非 特异性效应细胞具有突出作用 ωj 细胞如 T 辅助细胞在体液性排斥损伤中起重要作 用 ωj 细胞毒 T 细胞受岛 1HC I 类限制机制的约束, 其 TCR 与移植物表面的岛 1HC I 类 分子抗原复合物结合形成立 :R-MHC I 多肤复合物导致细胞毒 T 细胞的激活 Tc 细胞直接与移植物细胞接触, 通过一系列的免疫反应机制 ( 如穿孔素的释放 ) 引起移植物细 胞洛解 抑制性 T 细胞 (Ts) 也属 ωj 细胞, 其在诱导移植免疫耐受机制中起一定作用 器官移植及其免疫学检验283 大部分辅助性 T 细胞是 ωj 细胞, 通过 MHC II 类分子识别抗原, 多数抗原递呈细胞如树突状细胞 巨噬细胞也属 ωj 细胞, TH 受体与移植物的 MHC II 类抗原形成复合物, 在巨噬细胞释放的 IL-l 的影响下被活化, 对 B 细胞产生辅助作用, 促进体液免疫, 引起体液性的排斥损伤 ; 另一方面活化的 TH 细胞可以可通过释放 IL-2 等淋巴因子加强细胞性的移植排斥损伤 2. 次要组织相容性抗原虽然主要组织相容性抗原在移植排斥反应中起重要作用, 但大量实验及临床验证发现即使岛任 -IC 完全配合时, 仍然会发生排斥反应, 但这种排斥反应的强度轻, 速度慢, 提示个体问另外存在着一些抗原参与了排斥反应, 这类抗原称为次要组织相容性抗原 次要组织相容性抗原一般仅引起较弱的排斥反应, 但某些次要组织相容性抗原的组合能引起强而迅速的排斥反应 次要组织相容性抗原包括非 AID 血型抗原及性染色体相关抗原 例如男性 Y 染色体上有编码次要组织相容性抗原的基因, 称

291 284 第三篇临床免疫学检验为 H-Y 基因, 女性受者可针对男性供者 H-Y 抗原产生排斥反应 另外, 在不使用免疫抑制剂的情况下, 即使主要组织相容性抗原完全相同的同胞兄弟姐妹间进行移植, 仍会发生移植排斥反应, 这种排斥反应就是由次要组织相容性抗原所引起 由于组织配型技术的改进, 在主要组织相容性抗原引起的排斥反应基本被控制后, 次要组织相容性抗原引起的排斥反应将引起人们的关注 3. 红细胞血型抗原 AID 血型抗原不仅存在于红细胞表面也广泛存在于除中枢神经系统外的各种组织细胞表面, 并可分布于体液及分泌液中 在 AID 血型不相容的移植中, 若移植物的抗 A 抗 B E! 戈抗 AB 抗体滴度高, 则可以出现急性的体液免疫反应的排斥损伤 ; 另一方面移植物中的 A B 抗原可剌激受体引起洛血性贫血和血小板减少 此外, 更常见的是受体内血液循环中抗 A 或 ( 和 ) 抗 B 抗体与表达于移植物毛细血管内皮的 A 或 ( 和 )B 抗原结合介导移植物损伤 这种抗原抗体复合物引起一系列的补体反应, 补体系统被激活后, 可在靶细胞表面形成攻膜复合体, 导致移植物血管内皮细胞损伤, 移植物微循环内血栓形成, 炎性细胞浸润 由于破坏的血小板可以释放许多化学趋化因子以及缩血管物质 ( 如血栓素 A2), 引起微循环血管强烈收缩, 进一步加大移植物的损伤 有关 AID 与 HlA 在移植中的关系一般认为这两个抗原系统使受者及供者产生免疫应答的机理是完全独立的 4. 组织特异性抗原组织特异性抗原是指特异性地表达于某一器官 组织 细胞上 的抗原, 是独立于 HlA AID 抗原系统之外的另一种抗原系统 组织特异性抗原亦有多 态性, 广泛分布于全身的所有组织中 现在, 组织特异性抗原在移植排斥中的作用越来越 受到重视, 然而对组织特异性抗原的研究远没有 HlA 抗原系统深入, 主要是因为研究组织特异性抗原的技术上的困难所致 首先是分离纯化某一组织细胞的因难性, 其次是它在组织上的有限表达和分布不利于获得针对它的特异性抗体, 从而使用于研究组织特异性抗原的相应抗体来源有限 同种不同组织器官的组织特异性抗原不同, 移植后发生排 斥反应的强度亦各异 皮肤移植引起的排斥反应最强, 其次为肾, 肝脏移植物较易成活 血管内皮细胞 (vascular endothelial cell, VEC ) 表达特异性 VEC 抗原, 处于移植物实质细胞与含有免疫细胞的受体血液之间这使 VEC 在急性和慢性排斥反应中起关键性作用 另外, 还存在肾特异性抗原 肝特异性抗原 心特异性抗原等, 它们在相应的器官移植中也可以产生重要的作用 5. 其他内皮糖蛋白除了血型抗原外, 血管内皮还表达其他糖蛋白, 其中有些成为移植排斥反应的靶抗原针对这些抗原的在移植前己经存在的抗体引起初次血管性器官移植排斥恨罕见 此外, 在岛任 -IC 相配和血型相合的肾移植受者可检出抗内皮糖蛋白抗体, 这说明移植可产生诱导性抗体 ( 指移植后, 移植物的抗原在受者体内诱导产生的抗体 ) 然而目前尚未证实这些诱导性抗体在移植物排斥中起任何作用 6. 种特异性糖蛋白血管内皮细胞表达一些与血型抗原类同的具有种特异性的糖蛋白 几乎所有的动物个体均存在抗其他种的血管内皮糖蛋白的天然抗体 与血管型糖蛋白情况相似, 这些天然抗体是由于血管内皮糖蛋白与环境中病原体存在交叉反应性而产生的 这些抗原及针对这些抗原的天然抗体的存在使异种移植存在很大的困难 除了种缘很近的异种移植供 受者的组合其余的几乎所有的形式的异种移植供受者组合的初 次血管性器官移植的超急性排斥均由针对这些种特异性血管内皮糖蛋白的抗原 抗体

292 第一一十一章反应引起的 ( 三 ) 移植排斥反应的过程移植排斥反应的发生过程类似于机体对微生物产生的特异性免疫应答, 不同之处在于受者淋巴细胞识别的抗原称为移植抗原 动物实验证明 : 移植后 1 周左右, 初次移植的皮肤开始出现排斥现象, 10 天左右皮片脱落, 称初次排斥 ; 发 生初次排斥后再移植同一供者的皮片, 术后 6~8 天皮片脱落, 称再次排斥 ; 在发生初次排 斥后, 若再次移植的是第三供者的皮片, 则出现初次排斥 上述实验依据表明, 移植排斥反应具有特异性免疫应答的基本特点 : 即特异性 记忆性和区分 " 自己 " 与 " 非己 " 的特点 l. T 细胞的同种识别途径发生移植排斥反应时, 尤其是急性排斥反应早期, 移植物中常出现单个核细胞 ( 主要是 T 细胞 ) 浸润 先天无胸腺小鼠 ( 裸鼠 ) 体内无成熟 T 细胞, 其接受同种或异种移植后不发生排斥反应, 表明 T 细胞在移植排斥过程中起核心作用 移植术后, 受者和移植物内的可移动细胞能相互流动 (immigration), 其中以 APC 和淋巴细 胞的移动最为重要, 这是移植抗原被特异性 直接和间接两条途径识别移植物上的同种异型岛 1H T 细胞识别的前提 受者 T 细胞的 1C R 通过 C 抗原 (1) 直接识别途径 (d 盯 ct recognition) 受者 T 细胞 1CR 特异性识别供者 APe 所提呈 的同种异型岛 1H C 抗原, 既可识别完整的同种异型岛但 C 分子天然结构, 也可识别同种异型 岛任 -IC 分子抗原肤复合物, 即过路白细胞表面的岛任 -I C II 类分子或岛任 -I C II 类分子抗原 肤复合物可直接被受者的 m4 + 别方式与免疫应答的岛 1H C 细胞识别, 无需经过受者 APe 处理 学者们对这种直接识 限制性的矛盾有不同的解释, 其中一种解释是 : 同种异型的 岛 1HC II 类分子供者抗原肤可能模拟受者岛 1H CII 类分子抗原肤的结构, 因而发生了交 叉识别或交叉反应, 而同种异型岛 1H C 分子天然结构可以看作是外来抗原, 通过间接的抗 原提呈途径被 T 细胞识别 直接识别途径的特点是速度快 强度大, 在急性排斥反应中起 主要作用 参与直接识别的 T 细胞约占 T 细胞总数的 1%~ 1O%, 被称为同种反应性 T 细胞 ( allo - reactive T cell), 它们对免疫抑制药 ( 如环抱素 ) 比较敏感 (2) 间接识别途径 (i 日 direct recognitio 日 ) 受者 APe 对供者岛 1HC 抗原进行加工 处理, 以岛 1HC II 类分子抗原肤复合物的形式提呈给受者 T 细胞, 使之活化, 引起排斥反应 间接途径有赖于受者的 APe 对同种异型抗原进行加工 处理, 其所引起的排斥反应出现 较晚 参与间接识别的 T 细胞约占 T 细胞总数的 O. O1 %~O.l%, 由于此种 T 细胞须识别 与自身岛 1HC 分子结合的移植抗原才能产生免疫应答, 故又被称为自身岛任 -IC 限制性 T 细 胞 (self 岛任 -IC - restricted T cell), 间接识别途径对免疫抑制药相对不敏感 2. 移植排斥反应的细胞基础参与同种移植排斥反应的细胞主要包括受者 B 细胞 '4+ T 细胞和 CDs+T 细胞 NK 细胞及移植物内的过客白细胞 器官移植及其免疫学检验285 (1)T 淋巴细胞在器官移植过程中 B 细胞产生的重要的抗体包括直接针对供者血型抗原或岛任 -IC 抗原的抗体, 针对血型的抗体是自然产生的, 而针对岛 1HC 抗原的抗体则是在经过其他个体的岛 1HC 抗原剌激后产生的 ( 如娃振 输血或移植等 )0 B 细胞在移植过程中的作用很大程度上取决于针对供者的抗体产生的时间 : 如果在移植时己经存在, 则可能引起超急性排斥反应 ; 如果在移植后短时间内产生, 则可能引起急性血管排斥反应 ; 如果在移植后几周至几个月产生, 则可以引起慢性排斥反应 在同种移植排斥反应中, 受者 '4+ T 细胞 (TH ) 和 CDs + T 细胞 (OL) 所起的作用不同 : '4+ T 细胞主要识别 MHCII 类分子与 APe 所提呈的抗原的复合物 ;ω's+t 细胞主要识别阳 C I 类分子与 APe 所提呈的抗原

293 286 第三篇临床免疫学检验的复合物 几乎所有体细胞均表达岛 1HC I 类分子, 它们主要由 ωj T 细胞识别 活化的 CD4 +T 细胞可产生 IL-2 IFN - /,,1NF α 等作用于淋巴细胞 Mφ 等, 引起 j 旦发型超敏反应 J T 细胞可产生细胞因子并作用于口 L, 产生细胞毒效应, 损伤移植物 (2) 过客白细胞 (passenger 1eukocyte ) 是指在移植物血管内或组织中携带的供者白细胞, 其中主要是树突状细胞 ( dendritic cell, 配 ) 过客白细胞在体内具有抗原递呈功能, 使受者 T 细胞可以直接识别供者同种抗原 移植术后, 过客白细胞可从移植物中迁移出来并进入受者体内, 通过直接途径, 将供者移植抗原提呈给受者 T 细胞, 从而引起移植排斥反应 组织培养可以导致过客白细胞的丧失, 移植前培养甲状腺组织数天可以预防甲状腺组织移植物的排斥反应 (3)NK 细胞人 NK 细胞表达杀伤细胞抑制受体 (killer cell inhabit receptor, KlR) 0 KlR 与自身组织细胞表达的岛任 -IC I 类分子或岛任 -IC I 类分子自身抗原肤复合物结合, 产生负调节信号, 抑制 NK 细胞的杀伤活性 移植术后, 因受者 NK 细胞的 KlR 不能识别移植物细胞表面的异型岛 1HC 抗原, 可通过胞浆内 T 细胞产生的多种细胞因子使 NK 细胞活化, 产生杀伤作用, 参与对移植物的排斥 3. 免疫分子在同种移植排斥反应中的作用细胞因子 粘附分子和抗体等免疫分子均参与同种移植排斥反应的发生 活化的 TH 细胞分泌的 IL- 2 IFN γ 可激活 CIL 和 NK 细胞, 通过细胞介导的细胞毒作用 (cell mediated c )'toto 泪 city, (MC) 损伤移植物 活化的 TH 细胞产生 IL-4 IL-5, 促使 B 细胞活化 增殖并分化为浆细胞, 分泌免疫球蛋白, 发挥 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 (AI 汇 C) 和补体依赖的细胞毒作用 (complement depen dent c )'toto 泪 city, IT 汇 ) 破坏移植物, 主要损伤血管内皮细胞 活化的 TH 细胞分泌的 m γ 和 1NF-~ 能激活巨噬细胞, 通过介导炎症反应而参与排斥 另外, 急性排斥反应中同种反应性 T 细胞高表达细胞间粘附分子 l (lcam- 1) 血管细胞粘附分子 l(vc 丛 1-1) 等, 参与 T 细胞活化 归巢 二. 移植排斥反应的类型移植排斥反应包括宿主抗移植物反应 (HVGR) 和移植物抗宿主反应 (G 吁 -[R) 两大类 前者见于一般器官移植, 后者主要发生在骨髓移植或其他免疫细胞移植 (~) 宿主抗移植物反应宿主抗移植物反应 (host versus graft reactive, HVGR) 即实质脏器移植所发生的排斥反应, 是宿主体内致敏的免疫效应细胞和抗体对移植物进行攻击, 导致移植物被排斥 各类器官移植排斥反应发生的免疫效应机制基本相同, 根据排斥反应发生的时间 强度及病理学改变及其机制, 可分为超急性排斥 急性排斥和慢性排斥反应 1. 超急性排斥反应 (hyperacute rej ection) 超急性排斥反应是在移植物血液循环恢复后数分钟至数小时 ( 也可在 24~48 小时 ) 内发生的排斥反应, 由体液免疫介导 其原因是 : 受者体内预先存在抗供者同种异型抗原 ( 如 HLA 抗原 ABO 血型抗原 血小板抗原等 ) 的抗体, 可见于反复输血 多次娃振 长期血液透析和再次移植的个体, 也可由于移植抗原与病原微生物具有共同抗原所致 移植术后, 抗体与移植物细胞表面相应抗原结合, 激活补体, 导致血管通透性增强, 中性粒细胞和血小板聚集, 纤维蛋白沉积, 血管内凝血和血栓形成 其组织病理学特点是 : 早期引起毛细血管内大量中性粒细胞聚集, 小动脉血栓形

294 第一一十一章戚, 继之出现缺血 变性 坏死 尽管超急性排斥反应可以引起严重的后果, 但是可以通过在移植前检测受者体内存在的抗供者抗体而避免尽管如此超急性排斥反应仍是许多潜在的器官移植受者接受器官移植的一大障碍, 因为他们体内含有太多针对同种异型岛 1HC 抗原的抗体 但是肝移植则不存在这种现象 2. 急性血管排斥反应 (acute vascular rej ectio 日 ) 急性血管排斥反应, 也称急性体液排斥反应 (acute humoral rej ectio 日 ), 是一种非常少见的移植排斥反应, 常发生在移植术后几周内 在急性血管排斥反应中, 受损伤的组织主要为移植物血管, 其主要的病理改变是 : 血管炎症及栓塞 ; 血管内纤维蛋白的沉积和血小板的聚集 ; 血管内皮细胞肿胀 坏死 ; 血管壁内中性粒细胞及淋巴细胞浸润 其发生机制可能是 :1 体液免疫应答 : 接受移植术后受者体内在短时间内产生针对移植物血管内皮细胞岛 1H C 抗原的 Ig G 类抗体, 通过激活补体而导致细胞损伤 ;2 细胞免疫应答 : 移植物内皮细胞表面的同种抗原激活 T 细胞直接杀伤或分泌细胞因子激活炎性细胞, 引起内皮细胞的坏死, CIL 可直接杀伤靶细胞, 造成移植物血管内皮损伤 与超急性排斥反应不同, 当血管内皮细胞受到突然的攻击以后, 可以导致 血管内皮细胞的激活, 这种激活依赖于一些新的基因 ( 特别是 NF - KB) 的转录和新的蛋 白质的合戚, 包括几种炎性细胞因子和粘附分子 由于这种排斥反应需要受者快速产生 针对供者抗原的抗体, 而实际上许多抗体是在移植后数月甚至数年后才产生的, 因此, 临 床上这种排斥反应是非常少见的 不像超急性排斥反应那样一旦发生很难逆转, 急性血管排斥反应发生后, 可以通过血浆置换的方法取出其中的抗供者的抗体, 并利用药物 ( 如环磷酷肢 ) 抑制 B 细胞的应答等措施来治疗 3. 急性排斥反应 (acute rej ectio 川急性排斥反应是同种移植术后最常见的排斥反应, 多发生在移植后数天至 3 个月内 发生急性排斥反应的快慢和轻重, 与供者组织相容性抗原差异程度 免疫抑制剂使用情况及受者免疫功能状态以及诱发因素 ( 如感染等 ) 有关 以肾移植为例, 临床上主要表现为发热 全身不适 少尿或无尿 尿素氨升高 肾功能急剧减退等, 主要病理改变为肾间质炎 血栓形成, 内皮细胞肿胀增生 坏死, 肾间质水肿及单个核细胞浸润 若早期应用免疫抑制剂急性排斥反应多可缓解 急性排斥反应以细胞免疫为主, '4+ T 细胞介导 j 旦发型超敏反应是主要的损伤机制 受者 T 细胞直接识 器官移植及其免疫学检验287 别供者 APe 表面同种异型岛但 C 抗原发生激活和增殖并通过不同效应机制损伤移植物 ;ω'8+ CIL 细胞可以直接杀伤表达异型抗原的移植物细胞 ; 活化的 Mφ 对靶细胞的直接或间接杀伤作用 NK 细胞的 AI 汇 C 作用等也参与急性排斥反应的组织损伤过程 4. 慢性排斥反应 (chronic rejectio 川慢性排斥反应指移植器官或组织的形态和功能逐渐退化的排斥反应, 至少发生于移植术后 3 个月, 持续 6 个月以上, 并有特征性的组织学和影像学变化 导致慢性排斥的危险因素主要可分为两大类 : 同种抗原依赖性因素和同种抗原非依赖性因素 前者指由于组织相容性的差异所导致的对同种抗原的免疫应答, 与目 A 配型, 免疫抑制程度, 急性排斥的时间 次数及程度等相关, 这类因素引起的免疫损伤是慢性排斥的根本原因 ; 后者包括移植物缺血时间, 缺血再灌注损伤, 供受体大小匹配程度, 移植物功能恢复延迟, 感染 高血压 高脂血症和药物毒副作用等, 这类因素可大大加重慢性排斥的程度, 使移植物的功能进一步恶化, 其本身是否能导致慢性排斥尚不清楚 因此, 慢性排斥是对移植物不可逆性免疫和非免疫损伤的总和 有人提出, 由于慢性排斥引起的多种细胞 ( 如多形核白细胞 单核细胞 血小板等 ) 趋向于附着在血管内皮受

295 288 第三篇临床免疫学检验损部位, 这些激活的血细胞向内皮细胞所释放的血小板源性生长因子 (PI 兀 F) 及细胞表面的粘附分子是介导细胞粘附的主要因素 受损的内皮被血小板和纤维蛋白所覆盖, 最后导致血管内增生性损伤或纤维化, 造成器官组织结构破坏及功能丧失 慢性排斥反应的另一病理特征是血管平滑肌细胞增生, 导致移植物血管破坏 肾移植引起的慢性排斥反应, 其主要临床表现为肾功能降低 持续蛋白尿和高血压等慢性肾炎样症状 其主要病理改变为 : 单核细胞 中性粒细胞或血小板粘附于移植肾血管内皮损伤部位, 导致内膜纤维组织增生 小动脉管腔狭窄甚至闭塞, 有时可见多发性梗死灶, 肾间质中有单核细胞浸润 应用免疫抑制药不能治疗慢性排斥反应 ( 二 ) 移植物抗宿主反应如果免疫攻击方向是由移植物针对宿主, 即移植物中的免疫细胞对宿主的组织抗原产生免疫应答并引起组织损伤, 则称为移植物抗宿主反应 (graft versus host reaction, GVHR) 0 GVHR 的发生需要一些特定的条件 :1 宿主与移植物之间的组织相容性不合 ;2 移植物中必需含有足够数量的免疫活性细胞 ;3 宿主处于免疫无能或免疫功能严重缺损状态 GVHR 主要见于骨髓移植后 ; 此外, 脾脏 胸腺移植时, 以及免疫缺陷的新生儿接受输血时, 也可发生不同程度的移植物抗宿主反应 其发生原因是 : 受者免疫功能严重低下, 移植物中含大量免疫活性细胞, 供 受者问组织相容性抗原不符等 GVHR 最常发生于同种骨髓移植术后, 由此造成对宿主的损伤称为移植物抗宿主病 (graft versus host disease, GVHD), 其主要临床的表现是炎症性疾病, 病人可出现皮彦 腹泻 肺炎等 除岛 1HCI 类和 H 类抗原不符外, 次要组织相容性抗原 ( 时 1 抗原 ) 不符也可导致 GVHDo 一旦发生移植物抗宿主反应, 一般均难以逆转, 不仅导致移植失败, 而且还能给受者造成严重后果 骨髓移植物中成熟 T 细胞是介导 GVHR 的主要效应细胞 供者 CD4 +T 细胞识别宿主组织相容性抗原, 发生活化 增殖 分化, 产生 IL- 2 IFN - 'Y,1NF α 等细胞因子, 进一步激 igf CIL Mφ NK 细胞, 直接或间接杀伤宿主靶细胞 另外, T 细胞产生的多种细胞因子可诱导生成淋巴因子激活的杀伤细胞 (l ymphokine activited killer cell, lak), 因其可不受岛 1HC 限制而直接杀伤靶细胞, 被认为是引起 G 吁恒的重要因素 免疫抑制剂对 GVHR 的治疗效果不佳 二. 免疫抑制治疗移植物长期存活的关键是选择与受体组织相容性抗原高度一致的供体, 但是由于主要组织相容性抗原及其他相关抗原系统的复杂性及多样性, 以及用于移植的器官 组织和细胞主要来源于同种尸体或活亲属供者, 除自体移植和同卵双生子间的移植外, 移植术后难以避免发生免疫排斥反应, 因此能否预防和控制排斥反应成为器官移植成功的关键因素 为了预防和治疗排斥反应, 使移植物得以长期存活, 必须采取免疫抑制的措施 防治移植排斥反应的主要原则包括正确合理的组织配型 移植排斥反应的免疫监测及移植受者免疫功能的监测等 有关组织配型技术以及移植排斥反应的免疫监测将在稍后部分进行讨论, 本节简要介绍免疫抑制治疗的概况 (~) 免疫抑制剂的应用化学免疫抑制剂在器官移植排斥反应的预防和治疗中起到了关键作用 免疫抑制剂的每一个新的进展都推动了临床器官移植的发展, 然而并没有达到满意的效果 常用的免疫抑制剂有以下几种 : 1. 化学性免疫抑制剂临床上常用者为 : 环抱素 A( cyclosporin A, CsA) 糖皮质激素

296 第一一十一章硫瞠口票岭 (azathioprine) 环磷酷肢且 506 挠悉等 其中, 联合使用 CsA 糖皮质激素 硫瞠瞟岭可增强抗排斥疗效 环抱素 A 是 1972 年瑞士山德士药厂从真菌属 Tolypocladium inflatum gams 提取出来的, 初始目的是筛选一种抗真菌的新药 1976 年, &rel 等首次报告环抱素 A 具有免疫抑制作用 1978 年, CaIne 等首先试用于临床肾移植和骨髓移植的病例 随后, 环抱素 A 得以广泛应用, 明显延长各种同种移植物存活, 大大地推动了各种类型的器官移植的迅速发展, 使器官移植进入了一个划时代的新时期 CsA 的作用机制为 : 在免疫应答早期, T 细胞在接受抗原剌激后, 环抱素 A 能选择性抑制特异性 m 卧也转录 1L- 2, 因此, 有效抑制了 TH 细胞活化和分泌细胞因子, 特别是 1L -2 IFN γ 等细胞因子, 也就抑制了 T 细胞的增殖和分化, 使移植排斥反应中的效应细胞不能被激活 Pr, 咱 af(tacroiimus, FK506, 普乐可复 ) 是 1984 年日本藤泽 (Fujisawa) 制药公司在筛选天然免疫抑制剂时, 从 - 株土壤真茵 ( 怡 S 甘 e 叩 pt 阳 Oαm 丑 1) 职 3 种大环内固醋旨抗生素 O 它有极其强的免疫抑制作用, 当时实验研究命名为 FK506, 现正式命名为 Tacrolimus, 注册商品名为 Prl 咱 af ( 普乐可复 ) 它是继环抱素 A 以后发现的一种新的强效免疫抑制剂 经实验研究和临床初步试用, 其效果可以与环抱素 A 相媲美, 而且免 疫抑制有效剂量远比环抱素 A 小 自 1993 年以来, 己先后在日本 美国 英国 德国和法国等 10 余个国家批准正式上市 PI 鸣 raf 抑制淋巴因子的产生, 抑制 1L -1 日 1L- 2 1L- 3, 1L -4 1L -6 1L -7,1L -8 和 IFN γ 的表达, 抑制 T 细胞受同种抗原的剌激后的激活和增殖, 抑制细胞毒 T 淋巴细胞的产生, 抑制 T 辅助细胞依赖性 B 细胞的增殖作用, 并能抑制特异性 T 辅助细胞增殖作用的激发反应 因此, 对导致移植物排斥反应的因素产生特异性及有效性的抑制作用 挠悉 (Cellcept), 通用名称霉盼酸醋 ( 岛 1ycophenoIate rmfetil, 吗替麦考盼醋, 简称鸟也 1F), 是一种新型的免疫抑制剂, 是霉盼酸仙也 PA) 的 2 乙基因旨类衍生物 其活性成份为次黄瞟岭 5' 磷酸脱氢酶抑制剂霉盼酸 后者则是三磷酸鸟昔 (GIP) 合成的限速酶 由于激活的 T B 淋巴细胞的增殖高度依赖于瞟岭的合成途径, 而其他细胞则可通过替代途径增殖, 因此, 霉酷酸醋可选择性抑制淋巴细胞的增殖 除此之外, 挠悉尚可抑制新血管的形成 抗体的产生及淋巴细胞表面糖蛋白分子 ( 如粘附因子 ) 的表达 它能有效地预防和治疗移植术后的急性排斥反应, 减少了 50% 的急性排斥的发生率, 并且对耐激素和耐 AIG ALG 的难治性排斥和血管性排斥也有 " 救治性治疗 " 的效果, 可能有减少 " 慢性排斥反应 " 的作用 FIY720 是近几年新开发的一种免疫抑制剂, 它是由中药冬虫夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分 ISP- I 改造而成的, 化学结构为 2 - amino [2 - (4 - octylphenyl) ] -1, 3 propanediol hydrochloride, 相对分子质量为 FIY720 是强大的淋巴细胞免疫调节剂, 高选择性作用于外周淋巴细胞, 可阻断 T 淋巴细胞粘附因子与淋巴结内皮细胞发生作用 既 器官移植及其免疫学检验289 不减少外周单核细胞 粒细胞及红细胞的数目, 也不损伤淋巴细胞对机体病毒感染后的活 化 增殖和免疫记忆功能, 不抑制混合淋巴细胞反应的细胞增殖, 也不抑制 1C R 和 LFA-L VIA - 4, CD.zs 的协同剌激纯化 T 细胞引起的增殖, 这与传统的免疫抑制剂形成鲜明的对比 与环抱素 A 和 FK506 等目前临床上广泛应用的免疫抑制剂不同, FIY720 作用机制独特, 免 疫抑制效果更为强大, 毒副作用小 低剂量 FIY720 可抑制 CsA 诱发的癌症进展, 而高剂量 可诱导癌细胞凋亡 结果提示 :FIY720 和 CsA 联合应用, 不但对抑制同种移植排斥反应具

297 290 第三篇临床免疫学检验口有协同作用, 而且可以减少移植受者癌症发生率 FIY720 作为调亡诱导剂有着其特殊的作用, 它有可能成为治疗慢性移植物排斥的有效药物 有报道 :FIY720 田期临床中有一过性 无症状, 心动过缓及个别死亡病例出现 ( 原因不明 ) 最新资料显示: FIY720 的中间代谢物与 SIPr 结合, 可诱导淋巴细胞 " 归巢 "; 同时亦可激活位于心肌和心血管内膜上的 SIPr, 从而导致心肌肥大 这一发现在 FIY720 的临床应用前景上投下了阴影 糖皮质激素的药理作用是诱导 ii5 化的 T 细胞凋亡, 降低 APe 的功能及岛 1HC 表达 硫哩日票口令可抑制次黄日票口令核昔酸代谢, 干扰 DNA 合戚, 从而抑制 T 淋巴细胞增殖 2. 生物性免疫抑制剂临床上己使用的生物性免疫抑制剂及其作用机制为 :1 抗淋巴细胞球蛋白 (ALC) 或抗胸腺细胞球蛋白 (A1G) : 抗淋巴细胞抗体通过对淋巴细胞的抑制或 " 纠正 ", 可以建立免疫耐受, 达到阻滞宿主对移植物的排斥反应或控制移植物抗宿主病发生的目的 抗淋巴细胞抗体具有良好的免疫抑制作用, 可以防治排斥反应, 延长同种异体移植物存活时间 2 抗某些免疫细胞膜分子抗体 ( 如抗 CD3 抗体 抗 ω4 抗体等 ), 其作用原理是与相应靶抗原结合后, 通过补体依赖的细胞毒作用杀伤淋巴细胞或胸腺细胞, 抑制排斥反应 3 某些融合蛋白, 如抗 CD4s 抗体草麻毒素融合蛋白可杀伤过客白细胞 ;IL- 2 白喉毒素融合蛋白能特异杀伤表达 IL-2 受体的活化 T 细胞 ;CIlA4 -Ig 融合蛋白可阻断 B7 与 CD28 结合, 抑制 T 细胞活化 4 反义寡核昔酸 (antisence oligonucleotide) 可阻断相应细胞因子或粘附分子的表达 人源化抗 CDs2 单克隆抗体 (Campathl H) 可清除外周血 B T 细胞, 而不作用于干细胞, 可用于免疫耐受的诱导 威斯康星大学报告了 15 例活体和 5 例尸肾移植的结果, 在移植日和术后第 1 天应用 Campathl H 诱导, 术后仅用雷帕霉素单一免疫抑制剂, 己随访 4~16 个月, 结果在移植后 1~2 个月时, 有 3 例发生排斥反应, 而 2 个月后不再有排斥的病例 另一组 15 例活体肾移植研究也得到类似的结果 3. 中草药某些中草药 ( 如雷公藤 冬虫夏草等 ) 己用于抗移植排斥反应 据报道, 雷公藤多前与硫哇瞟岭的免疫抑制作用类似, 却无肝肾毒性 ( 二 ) 放射线照射放射线照射治疗包括移植物放射线照射和受者淋巴组织放射线照射 临床器官移植的早期就采用了移植物放射线照射, 其目的是改变免疫应答 放射治疗有三种不同的方法 :1 移植后短期内移植物放射线照射作为预防性免疫抑制 ;2 更常用的是移植物放射线照射作为抗排斥反应的辅助措施 ;3 移植前移植物体外放射线照射, 改变移植器官的免疫原性 骨髓移植前用大剂量放射线照射受者淋巴结, 使其完全丧失对移植物的排斥能力 ( 三 ) 输血效应由于担心受者被阻 A 抗原及其他抗原致敏发生超急排斥, 所以多年来曾禁止给移植受者输血 后来发现, 移植前接受输血的病人, 肾移植存活时间可明显延长 20 世纪 80 年代, 进一步的临床实验研究证明了这种观察结果 此后, 在许多移植中心都采取了预输血的方案 输血的这种作用的机制还不是很清楚, 一般认为可能是 :1 输血可活化 Ts 细胞 ;2 输血可产生封闭抗体 ;3 输血可产生抗 T 细胞的独特型抗体, 阻断 T 细胞识别抗原 确切机制尚有待进一步阐明 一一一免疫应答有一个重要特征就是在自然条件下对自身抗原无反应, 这就是所谓的自身忏所菊移植免疫耐受

298 第一一十一章耐受, 自身耐受对一个个体的生存是至关重要的 在器官移植领域, 免疫耐受也是人们非 常关心的一个问题, 由于免疫耐受的存在, 使人们可以通过某种方式使机体免疫系统将某 些外来抗原识别为 " 自身 " 抗原 ( 如供者的抗原 ), 从而避免长期使用免疫抑制剂 由于免 疫抑制药物本身的毒性, 以及应用免疫抑制药物后患者免疫功能长期低下, 容易导致感染, 长期使用免疫抑制剂来防止移植排斥反应可以产生许多严重的副作用, 所以解决移植排斥的根本方法, 是诱导供 受体间的免疫耐受 移植耐受的定义 : 器官移植受体在不应用或停用免疫抑制剂的条件下, 对移植的异体器官特异性地不产生免疫排斥, 而使其获得长期存活 这一概念的含义还包括 : 防止急慢性排斥, 延长移植物存活, 对来自相同供者的移植物不产生免疫应答, 但对来自第三者的移植物仍保持排斥能力 在进行器官移植后如何诱导成年个体间的免疫耐受具有重要的实际意义 一. 移植耐受的机制移植耐受的机制在很大程度上与免疫系统的自身耐受的机制相似 现在经过证实的有以下几种 (~) 克隆丢失学说诱导自身耐受的最重要机制是针对自身抗原反应的淋巴细胞克 隆在其发育的早期阶段就丢失了 例如 B 细胞, 这个过程发生在 B 细胞在骨髓中成熟的 阶段, 而 T 细胞则是发生在它们在胸腺中遇到一些携带自身抗原的骨髓起源的细胞群时 T 细胞在胸腺中的成熟过程分为 3 个阶段 :1 克隆扩增 ;2 阳 / 阴性选择 ;3 禁闭或消灭针 对自身抗原起强反应的克隆 克隆丢失过程仅在胚胎和新生期发生, 即 ωj CDJ 向 '4- CDs + 或 CD4 + i 转变的过程中 也就是说, 只有在这一特定的时期引入移植物抗 原, 才会诱导出将来对于该移植物的特异性耐受 ( 即获得性耐受 ), 所以这一机理临床器官 移植实践价值不大 ( 二 ) 克隆删除学说 TCR 与抗原肤和 MHC 的反应诱发一系列信号, 导致各种 T 细胞 功能活化,{E! TCR 的高度亲和性以及 TCR 和抗原肤的重复反应能够使胸腺和外周血 T 细 胞衰竭, 在白细胞介素 2(IL-2) 作用下进入细胞周期的 T 细胞首次接触抗原后容易发生 活化诱导 T 细胞死亡 (activation - induced cell death, ACID) 0 抗原和 ii5 化 T 细胞再次接触 后诱发的细胞凋亡由 Fas 和肿瘤坏死因子介导, 这种自杀性调节机制在免疫反应中控制 器官移植及其免疫学检验291 外周活化 T 细胞的数量 在这个过程中, FasL 和活化的 T 细胞表达的 Fas 起关键作用 FasL 是属于肿瘤坏死因子 (1NF) 家族的一种细胞表面分子 它的受体 Fas( c095, Apo - 1) 属于吁吁受体家族, 在其胞浆区内含有个 " 死亡 " 区, 可以传导凋亡信号,Fas 在造血细胞表面表达, 也在其他组织如肝 胸腺 心脏和肾脏表达 FasL 主要在活化的 T 细胞表面表达, 也在免疫特赦器官或部位表达, 如辜丸和眼前房 当表达 Fas 的激活 T 细胞与表达 FasL 的其他细胞结合, 该激活 T 细胞将被启动调亡 Fas 和 FasL 参与免疫反应中剌激抗原清除后的 " 关闭反应 " 和 T 细胞介导的细胞毒性 另一种引起外周克隆删除的机制是所谓的 VEID 现象, 其基本理论为 : 's+t 细胞用自己的抗原持异性受体和 CDs 分子识别出 VEID 细胞表面的岛任 -[C- I 类分子及抗原复合物, 并与之结合, 另一方面,VEID 表面的 ω8 分子则与 CDs+T 细胞表面阳 C- I 分子中的问功能区相结合, 从而导致 CDs+T 细胞被禁闭或清除 简言之,VEID 现象即一种特异细胞抗原提呈细胞 (VEID 细胞 ) 被 T 细胞识别时, 它给 T 细胞传递的是一种灭活信息而非活化信号 VEID~ 词的含义是 " 否决 " 的意思, 也就是说 "VEID 细胞 " 有杀死企图杀伤它们的细胞的能力

299 292 第三篇临床免疫学检验( 三 ) 克隆无能 (colonal anergy) 这也是移植耐受最重要的一种机制 克隆无能是指 T 细胞在通过 T 细胞受体 (1CR) 识别岛但 C 抗原肤复合物并与之结合的过程中, 不能从 抗原提旦细胞 (APe) 获得足够的共剌激信号, 从而进入特异性的无反应状态 也就是双信号启动理论, 通过控制共剌激信号的传递, 即可造成耐受状态 克隆无能可以在缺乏共剌激信号时的抗原识别过程中产生, 无反应 T 细胞最引人注目的特点是 : 一旦产生无能, 该细胞将不能在今后对完整的活化信号起反应, 因为受抗原剌激后不能产生 IL-2 由于没有 IL- 2, T 细胞就不能增殖和分化成为效应细胞 根据这一理论设置免疫耐受诱导治疗手段比较现实, 因为这种治疗将不受个体年龄 手术时机以及特定供者的限制 ( 四 ) 抑制细胞的抑制作用在某些情况下抗原特异性抑制细胞可以抑制免疫系统对这种抗原的破坏作用, 尽管有很多实验证实和支持抑制细胞 (Ts) 的存在, 但很少有人真正克隆出 Ts 细胞株 虽然其具体过程还不十分清楚, 一些细胞因子可能起了重要作用 有些情况下虽然不能检测到针对某种抗原的抗原特异性抑制细胞, 但是针对这种抗原的抗原特异性 T 细胞可能通过替代的信号传导机制而不对这些抗原产生应答 抑制性细胞常常在能长期维持同种异体移植物有功能存活的动物体内发现 ( >50 天 ), 可能抑制细胞对于维持长时间的耐受至关重要 在维持阶段, 从胸腺产生的原始同种异体反应性细胞必需被抑制, 从而防止了移植物排斥 另外, 在移植免疫应答的过程中, TH1 型细胞因子 ( 主 要是 IL-2 和 IFN γ 等 ) 参与介导排斥反应的发生, 而 TH2 型细胞因子 ( 如 IL-4 和 IL- lo 等 ) 可拮抗 TH1 型细胞的作用并抑制 CIL 的功能, 从而诱导移植耐受 ( 五 ) 免疫赦免区 (imnunolog 比 ally privileged site) 指机体接受同种或异种移植后不发 生或仅发生轻微排斥反应的部位 这些特殊的解剖部位包括胸腺 角膜 眼前房 软骨 脑 胎盘滋养层 内分泌腺等 其不易发生排斥反应的机制可能是 :1 这些部位与血液循 环和淋巴循环相对隔绝, 有些部位还有特殊的屏障结构, 故淋巴细胞和抗体不易进入 ;2 某些组织 ( 如软骨 ) 抗原性较弱, 不易发生排斥反应 ;3 某些赦免区组织细胞高表达 Fas L, 同种异体反应性 T 细胞进入该部位并被激活后, 可高表达 Fas 抗原, 从而通过 Fas FasL 途 径使激活的特异性 T 细胞凋亡 (apoptosis), 导致对移植物的耐受 ( 六 ) 免疫偏向 (imr 丑 une deviatio 日 ) 器官移植后的排斥反应主要由能够产生炎症性细 胞因子的 TH1 细胞参与 在体外和体内实验中, 通过使 TH1 细胞向 TH2 细胞转化, 可以导致 免疫耐受状态, 在己经发生免疫耐受的个体, 也存在 TH2 细胞占优势的状态 ( 七 ) 母胎耐受胎儿可视为一种特殊的同种移植物 胎儿不被排斥的原因在于母体对其产生了免疫耐受, 可能的机制为 :1 胎儿组织相容性抗原长期剌激母体淋巴细胞, 使其兴奋性下降, 剌激阔升高 ;2 胎盘滋养层有屏障作用, 阻挡母体淋巴细胞进入胎儿体内 ; 3 滋养层细胞不表达经典的目 AI 类和团 All 类抗原, 但表达非经典的目 A-G 抗原, 后者通过与滋养层局部的 NK 细胞和 CIL 表面的 KlR 结合, 启动抑制信号, 抑制效应细胞的细胞毒作用, 从而形成娃振免疫耐受 二. 移植耐受的诱导 最著名的诱导移植耐受的策略是 1953 年 Medawar 与他的同事们在将供者的细胞注 入怀孕的小鼠子宫以后, 其后代可以接受供者的皮肤移植物而不需要另外应用免疫抑制 剂 迄今, 移植免疫学家己经成功地在多种实验性免疫功能健全的成年动物模型中建立

300 第一一十一章移植耐受 其基本策略是在短期使用非特异性免疫抑制剂的基础上使移植受者暴露于供者同种抗原 与同种抗原遭遇的 T 细胞可以进入三种完全不同的状态 :1" 无知 ", T 细胞根本不能识别这套同种抗原, 对以后的同种抗原的剌激也不会产生反应 ;3 敏感化, T 细胞变得敏感, 对同一套同种抗原的再剌激发生排斥性反应 ;7 耐受, T 细胞对同一套同种抗原的再剌激表现出无反应 T 细胞对以上三种状态的趋向取决于多种因素, 其中包括抗原提旦的途径 抗原提呈的形式和受者的免疫状态 移植耐受诱导的原则是 : 在免疫抑制剂改变受者免疫功能状态的前提下, 控制同种抗原提呈的途径和形式, 使 T 细胞走向耐受 目前用于移植耐受诱导的方法有多种, 但都具有共同特点, 即在应用移植供体细胞或抗原诱导耐受的同时, 都要制造一个短期的 可以恢复的 一定深度的免疫抑制状态 在耐受原注入途径上, 除腹腔 尾静脉注射等传统方法外, 近几年又发现 n 静脉注射 胸腺内注射 口服抗原都是有效的诱导免疫耐受途径 应用以上方法己成功的在鼠类 兔 猪 狗 猴等多种动物体内诱导了对供者移植物的特异性耐受 (~) 用照射的方法诱导耐受 1. 全淋巴照射 (ILl) 小鼠经全淋巴照射后输入大量异基因骨髓, 可形成不同程度的嵌合体 由于异基因骨髓在受体内分化 发育, 并经过胸腺的选择, 可以导致耐受的产生 所以嵌合体的水平越高, 移植物存活时间越长 这种模式己应用于临床肾移植, 可减少免 疫抑制剂的用量 在某些研究中, 诱导免疫耐受后, 甚至在完全撤除免疫抑制剂后, 机体 对供体的 MLR 和细胞毒作用仍十分低下, 移植物不被排斥 2. 紫外线照射 用紫外线照射小鼠, 同时在照射部位涂布抗原, 可以灭 ii5 抗原提呈 细胞的抗原提呈功能, 使其对相应抗原的细胞免疫反应下降 ; 膜岛移植前, 将供体的血液 用紫外线照射后输给受体, 可诱导免疫耐受, 使以后植入的 1 夷岛长期存活 ; 异基因骨髓移 植前经紫外线照射也可以降低 GVHR o 紫外线照射除对 APe 的作用外, 还可诱导 Ts 细胞 活性, 抑制免疫应答 ( 二 ) 药物诱导耐受 在过度免疫抑制的状态下, 供 受者之间不能进行必要的反应和 " 对话 ", 对诱导免疫耐受不利 合理应用免疫抑制剂的剂型和用药方案, 在适度抑制免疫 系统的同时, 又为免疫耐受的产生创造条件, 是今后器官移植免疫的一个研究方向 1. 环磷酷肢诱导耐受 利用从静脉注射供体脾细胞, 48 小时后腹腔注射环磷酷肢的 方法, 可诱导 H-2 不同的受体小鼠产生不完全耐受 其表现为 : 对供体细胞的特异性免 疫应答降低, 混合淋巴细胞反应和细胞毒性淋巴细胞活性明显抑制, j 旦发性超敏反应也明 器官移植及其免疫学检验293 显降低, 并可接受供体来源的肿瘤细胞而不被排斥, 但对供体的皮肤移植物仍会排斥, 只是排斥期延长 在 H-2 相同而只有次要组织相容性抗原不同的品系间, 这种方法则可诱导完全耐受 在上述模型基础上, 将骨髓细胞和脾细胞的耐受原再合并使用环磷酷服 和抗胸腺细胞血洁, 则可在 H-2 完全不同的品系小鼠间诱导完全的移植耐受, 表现为耐 受小鼠对供体鼠各种同种异型的特异反应消失, 移植的皮肤可以长期存活而不受排斥 这类耐受产生的主要机制是克隆清除 2. 环抱素 A 诱导的耐受对家兔的肾移植研究发现, 短期应用环抱素 A 并进行肾移植后 6 个月, 无关第三者的皮肤可被迅速排斥, 而来自肾移植供者的皮肤可以稳定植活 狗和猴肾移植中也获得相似的结果 环抱素 A 诱导的耐受大多为诱导 Ts 细胞 ( 三 ) 抗体诱导耐受通过动物实验己经发现, 针对 T 细胞表面辅助分子 粘附分子及

301 294 第三篇临床免疫学检验TCR 的单克隆抗体, 有利于免疫耐受的诱导,{E! 尚缺乏对其在临床应用方面的评价 1. 抗淋巴细胞血清 (ALS) 诱导耐受注射 ALS 的小鼠, 在皮肤移植后 1 周, 静脉输注供体来源的骨髓, 在受体小鼠体内可检出供体来源的血细胞, 即形成微量骨髓嵌合体 这样, 与供体抗原反应的 T 细胞将在胸腺中被阴性选择去除, 形成对供体组织的免疫耐受, 表现为同种异型反应性消失, 移植供体皮肤不被排斥等 目前, 用抗淋巴细胞球蛋白 (ALC) 进行骨髓输入己应用于临床肾移植中 2. 抗 T 细胞单克隆抗体诱导耐受抗 ω4 单克隆抗体被广泛应用于实验性免疫耐受的诱导 用抗 ω4 单抗处理 pα 大鼠, 移植组织不相容的 PVG RTla 大鼠的心脏, 获得 长期存活 停止注射抗体后, CD4 +T 细胞群逐渐恢复, 但供体心脏不被排斥, 这时移植新 的 PVG Rfla 移植物也可长期存活, 而移植无关大鼠的心脏则迅速被排斥 3. 抗独特型 Od) 抗体抗 T 细胞抗原受体 (TCR) 的独特型抗体可诱导对移植抗原的耐受, 这方面的实验研究己有报道, 但人体应用尚未见报道 4. 抗粘附分子的抗体粘附分子是免疫细胞活化所必需的细胞表面分子 近来的研究证明, 用抗粘附分子的单克隆抗体可阻断免疫细胞活化, 延长移植物的存活, 并导致免疫耐受的产生 ( 四 ) 分子生物学技术与移植耐受近年来, 有多种转基因技术用于耐受诱导的研究, 如转主要组织相容性基因诱导移植耐受 ; 转细胞毒 T 细胞抗原 19( cytotoxic T lymphocyte antigen 4 - irm 丑 unoglobuli 口,CIlA4 -lg) 基因封闭 T 细胞活化的共剌激信号诱导耐受 ; 转抑制性细胞因子 (interleukin - 10, IL - 10;transforming growth factor ~1' 1GF~l ) 基因, 利用该类因子的免疫抑制活性, 调节 TH1 TH2 的平衡诱导移植耐受 ; 转 FasL 基因诱导受体内供体特异性免疫细胞凋亡诱导耐受 基因治疗是临床上治疗各种疾病的一个发展方向, 而通过基因治疗手段诱导移植耐受则是移植免疫研究的一个热点问题 基因治疗在器官移植中的应用具有其独特的优势 : 可在体外对移植物进行基因修饰, 可以直接针对供受体问岛 1HC 差异 抑制性细胞因子 供剌激分子的表达等进行修饰, 从而通过基因治疗的手段对免疫系统进行调控, 诱导移植耐受, 抑制移植排斥反应的发生 ( 五 ) 器官移植后的微嵌合状态微嵌合状态 (rni crochimerisr 旧是指接受同种实体器官移植的受者体内可检测到供者来源的细胞或遗传物质 ( 如 HlA 分子 ), 同时移植的器官内很多细胞 ( 如巨噬细胞 ) 被宿主细胞所代替, 形成一种相互嵌合的状态 同样, 在骨髓移植的受者体内除了含有大量供者来源的骨髓细胞外, 还含有宿主白细胞, 这种现象即被称为嵌合 Starzl 认为嵌合可以导致移植物的长期存活, 但这仅是一种假说, 其发生机制尚未完全阐明 对嵌合现象的深入研究, 可能对免疫耐受的诱导提供启示 移植耐受的研究己经取得了许多重要进展 近来研究证明, 不但未成熟的 T 细胞在胸腺内可经程序性死亡途径导致克隆排除, 成熟的 T 细胞也可经此途径导致克隆排除, 因此, 移植耐受的研究必将对器官移植排斥的最终解决作出贡献 由于机体免疫系统是一个十分复杂的系统, 供受者 HlA 存在高度多态性, 很难找到同一种可以通用的致耐受源, 因此, 很难依靠单一的方法成功地诱导免疫耐受, 只能针对每一受者的不同情况, 制定特定的诱导方案 另外, 在临床上即使对一些长期存活并己经产生耐受的病例, 仍要通过多种方法对受者

302 295 第学检验组织配型与器官移植 的免疫状态进行综合评价, 证实免疫耐受的有效性以后, 才可以停用免疫抑制剂 第四币 一. 移植物选择标准移植物选择是移植能否成功的关键因素之一, 选择的标准可归纳为以下几类 : (~) 一般情况 1 移植物本身必须是健康细胞 组织或器官, 在形态和功能上都没有异常发现 ;2 供者无传染病 ( 尤其是艾滋病和肝炎等 ) 或相关感染 无代谢病和恶性肿瘤 ( 原发性脑肿瘤除外 ), 全身重要器官的功能正常 ;3 供者与受者的年龄应相仿, 尤其供者应小于受者, 但在生命器官移植时, 供者年龄最好在 1O ~50 岁之间 ;4 供者器官与受区的大小应相接近, 尤其在心 肝 肺等原位移植中, 供者与受者体重相差不能过于悬殊, 否则就植入困难或者不适应 ( 二 )AID 血型相容一般临床输血的 AID 选配原则也适用于移植, 0 型受者只接受 型移植物 ;A 型受者接受 A 型或 0 型 ;B 型受者接受 B 型或 0 型 ;AB 型受者接受范围较广 一般情况下, 不管是活体移植物还是尸体移植物, 血型不相容就不应该进行移植 ( 三 )HlA 相容性供者与受者之间 HlA 相同的位点越多, 相容性就越好, 长期存活的可能性就越大 但是临床移植的绝大多数是同种移植, 在非直系血缘关系的人群中, 几乎不可能发现且 A 完全相同者 ; 只要能发现 1~2 个目 A 位点相同, 就比 HlA 完全不相同者之间的移植成功率大得多 如果有可能, 移植物的供者最好是近亲 ( 例如父母 子女或同胞兄弟姊妹等 ) 的健康志愿者, 这样可以在移植前对双方较全面的检测和交叉配合试验, 还可能有选择的余地 如果等待尸体器官, 检测且 A 的困难性增加, 选择的机会也少 随着医学科学的不断进步,HlA 的分型方法也有了很大的改变 除了经典的血清学方法外, 细胞学分型法及基因分型法等技术也逐渐受到推广, 特别是分子生物学技术在目 A 分型中的应用, 使实验室对 HlA 分型结果的质量和效率都有了很大的提高 二.HlA 血清学分型技术在 HlA 研究的初期, 常用血清学方法进行 HlA 分型 因 A-A B C DR 或因主位点的抗原来用血清方法进行检测, 称为 SD 抗原 (serologically defined antigen), 其检测方法早期常采用白细胞凝集试验 细胞毒试验 血小板补体结合试验 抗人球蛋白混合凝集试验 抗人球蛋白消耗试验等方法, 目前普遍采用微量补体依赖的细胞毒 (complement dependent cytoto 监肌 CI 汇 ) 试验 其基本原理是 : 淋巴细胞表面具有 HlA 抗原, 当 HlA 特异性抗体 (Ig( 王或胁 与淋巴细胞膜上的相应的目 A 抗原结合以后, 可以激活补体, 在补体的作用下, 引起细胞膜的破损, 细胞死亡 ; 由于细胞膜破损, 膜的通透性增加, 染料可以进入细胞内部而使细胞着色, 通过着色细胞的数目判断抗原抗体反应的强度 (~) 细胞分离检测活体可取外周血直接分离 ; 检测尸体时取淋巴结或脾脏, 制成单个细胞悬液并洗涤后再进行分离 检测 HlAI 类抗原时, 将淋巴细胞用 Hank' s 洛液稀释后, 用淋巴细胞分离液分离, 取单个核细胞层的细胞即可应用, 因为该层细胞都表达 I 类抗原 ; 但检测 HlA -DR 和团主等 H 类抗原时, 就需要进一步分离纯度较高的 B 细胞 ( 纯度达 80% 以上 ), 因为 H 类抗原只分布在 B 细胞上 B 淋巴细胞的分离常采用尼龙棉柱法 绵羊红细胞玫瑰花环法 F(ab')2 法 免疫磁珠法等方法 细胞悬液中 B 淋巴细胞的含量 一一十一章器官移植及其免疫

303 296 第41 % ~80% 临床免疫学检和活力是试验成败的关键, 一般要求 B 淋巴细胞的比例大于 60%, 阴性对照中死细胞不超过 10% ~20% ( 二 ) 美国国家卫生研究院 (NIH) 的标准方法将一系列己知特异性的标准分型血清 (l μl 孔 ) 按设计好的方案加到 72 孔或 60 孔专用反应板中 ( 如暂时不用可以冰冻保存 ) ; 加入待检淋巴细胞 2000 个 1 ILl 孔, 置 22 土 2'C 孵育 30 mi 口让抗体与抗原结合 ; 加入补体 ( 多为家兔混合血清 )5μ1, 置 22 土 2'C 孵育 60 mi 口 ; 每孔加入 5% 伊红 2~3μ1, 使死细胞着色 ;3~5 min 后每孔加 12% 福尔马林 8 ILl 固定细胞 ; 待细胞全部沉淀后用相差显微镜或倒置显微镜观察结果 某孔的着色细胞超过 50 个即为阳性反应, 说明被检细胞的 HlA 型与该孔所加抗体相一致, 否则为不一致 使用相差显微镜观察, 死亡的细胞由于伊红进入细胞被染色而呈灰黑色, 无折光性, 细胞肿胀, 体积变大 ; 活淋巴细胞因不被染色而明亮, 折光性强 如果使用荧光液染色, 在荧光显微镜下, 乙酷乙酸竣基荧光素 ( carbox, 丁 (fluorescein diacetate, CFDA) 与细胞膜结合, 使 i 舌细胞呈绿色 ; 澳化乙链 (ethidium bromide, EB) 可以通过被破坏的细胞膜进入细胞内与 DNA 结合, 而使死亡的细胞呈红色 根据死亡细胞的百分比可以反映抗原抗体反应的强度, 目前常采用 NIHi 己分法 ( 表 21-1) : 表 21-1 HlA 分型 NIH 法记分标准 死细胞 记 分 意义 ~10% 阴性 未试验或无法读数 三篇11 % ~20% 2 21%~40% 4 >80% 8 验6 阴性可疑 阳性可疑 阳性反应 强阳性反应 ( 三 ) 分型血清试验用的标准抗血清必须从经产妇 ( 尤其多产妇 ) 的血清中筛选, 胎盘 液或其他体液也可应用 ; 也可通过人工免疫献血员的方法得到 筛选的方法也用补体依赖 的细胞毒试验, 只是将己知与待检互换 筛选的抗血清必须经过特异性鉴定与国际上的标 准分型血清进行对比 II 类抗血清筛选后还必须用混合血小板将其中可能含有的 I 类抗体吸 收去, 因试验用的 B 细胞上也有 I 类扩 L 原 现在, 己经有针对 HlA 抗原的单克隆抗体应用于 临床上 HlA 的分型 目 A 分型血清的质量主要是通过血清的特异性程度和血清的强度进 行评价 另外, 有些血洁, 如母胎免疫产生的 HlA 抗血清中大部分为多价, 须经过处理以后 才能应用, 常用稀释法 吸收法等方法, 有时也可以采用不同个体的混合血洁, 这样既可以减 少假阳性反应, 而且由于抗体的协同作用, 又增强了血清的反应强度 ( 囚 )HlA 定型板己有商品化的目 A 定型板, 将 HlA 定型血清预先加到专用的反 应板上冰冻保存, 试验时只须加入待检细胞及其他试剂即可 定型板中抗血洁的种类要 覆盖本民族或本地区 80% 以上的抗原, 其中高频抗原每种抗血清 3 份以上, 低频抗原每 种抗血清 2 份以上 定型血清板须经几个实验室认可或有关部门核准后才能销售和使 用, 现在国内所做的定型板多限于目 AI 类抗原的检测 二.HlA 细胞法分型试验 四 λd 和 DP 位点的抗原须用细胞学分型法进行鉴定, 所以又称 ill 抗原 (lympho cyte defined antigen), 其鉴定方法普遍采用混合淋巴细胞培养 (mixed lymphocyte culture,

304 第一一十一章岛仕 C), 也称混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte reaction, MlR) 0 测定 HlA-D 抗原时, 以被检者淋巴细胞为反应细胞, 以 HlA-D 纯合子分型细胞 (homozygous typing cell, HIe) 为剌激细胞, 进行混合淋巴细胞培养 鉴定 HlA -DP 抗原时, 以被检者淋巴细胞为剌激细胞, 以预先接触抗原的分型淋巴细胞 (primed lymphocyte typir 毯, PLT) 为反应细胞, 进行混合培养, 通过测定淋巴细胞在识别非己抗原后发生的增生反应来分析型别, 两种方法分别称为纯合子分型细胞试验和预敏淋巴细胞分型试验 (~) 混合淋巴细胞培养将分离的反应细胞 ( 通常是患者的淋巴细胞 ) 与剌激细胞 ( 通常是供者或己知的标准淋巴细胞 ) 配制成 1 X 10 6 rnl 浓度的悬液, 各加 0.2 rnl 到反应管中, 放置 3 7'C 和 5%ω2 环境下培养 5~6 天 培养结束后进行涂片染色, 观察并计数转 化的淋巴细胞, 计算淋巴细胞转化率 ; 也可在培养结束前 5~12 小时加入 3 H - T( 岖, 收获后 用液体闪烁仪计数细胞的放射性 试验结果的常用表示方式是剌激指数 (SO 转化细胞的形态比较大, 有清晰的核仁, 核质细致正在松, 胞浆偏蓝色, 边缘清楚, 如果细胞核旦分裂状, 也属于转化细胞 未转化细胞体积较小, 核致密, 胞浆量少 一般计数 500 个细胞, 用下列公式计算转化率 转化率二转化细胞数计数细胞总数 X 100% 自身对照转化率一般 <5% 岛仕 C 分为双向法和单向法 双向岛仕 C 是采用未经处理的两个个体的淋巴细胞, 两种细胞都有应答能力, 可以互为剌激细胞和反应细胞, 试验结果是两种细胞反应之和 Sl 二 2X 试验管 cpm (A 对照 cpm+b 对照 cpm) 单向岛仕 C 是将剌激细胞用丝裂霉素 C(mito 町 ycin C) 或 X 线照射先行灭 j 舌, 但细胞的抗原性保持不变, 因此可作为剌激细胞而不能作为反应细胞, 试验结果是待检测细胞的反应, 使于结果分析 Sl 二试验管 cpr 卫自身对照 cpr 丑双向 MLC 只能反映两种细胞间 ill 抗原的差别, 结果比较模糊, 也不能做 ill 抗原的分型 单向 MLC 能分别测出每一方淋巴细胞的剌激强度和应答强度, 但淋巴细胞须预先处理, 使其失去增殖能力, 较双向岛仕 C 麻烦, 但可以用来进行且 D-D 和 DP 位点的分型 器官移植及其免疫学检验297 试验 ( 二 )HIe 试验 HIe 是指细胞内一对同源染色体上两个 HlA 单倍型完全相同, 所以该位点在细胞表面只表达一种抗原 将一组 HIe 经处理灭活后作为剌激细胞, 与待检细胞做单向岛仕 C 如果待检细胞与剌激细胞的 LD 不同, 就会发生反应, 如果相同便不反应, 所以试验又称为阴性分型法 当 Sl~2 时可认为待检细胞与该管 HIe 的 LD 抗原相同 本法的缺点是 HIe 难以得到, 而且培养时间长 (5~6 天 ), 在尸体器官移植时不能应用 由于 HlA-D 座位上的等位基因很多, 具有高度的多态性, 因此寻找 HIe 比较困难 近亲婚配的子女中,HIe 发生的机会比无血缘关系的婚配中要多, 因此可从近亲婚配的子代中寻找 HIe ( 三 )PLT 试验本方法需事先准备分型细胞 : 选择只有一个单倍型相同的两个体 a b 和 a c( 这在双亲与子女之间不难做到 ), 取前者的淋巴细胞处理后作剌激细胞, 取后者的淋巴细胞作反应细胞 ; 将两者进行单向混合培养, 至第 10 天便可得到针对 b 单倍型有特异性免疫应答能力的预致敏分型细胞 (PIL) 依此类推, 可以制备出一系列能识别各种

305 298 第三篇临床免疫学检验己知 ill 抗原的一套 PIL, 这些处于休止状态的致敏记忆细胞可在液氮中长期保存备用 进行 PLT 试验时, 需将待检淋巴细胞处理成剌激细胞, 而 PIL 为反应细胞 如果待检 细胞的 LD 抗原与 PIL 预先识别的特异性相同, 则 PIL 会迅速出现反应 ( 二次应答 ), 如不 同则不出现快速反应, 所以本法又称为阳性分型法 PLT 法克服了 HIe 法试验周期长的 缺点, 在 24 小时内即可报出结果 ;PIL 比 HIe 容易得到, 但真正做起来也复杂 与 HIe 法相比, PLT 法更适用于研究 HlA -D 复合物, 而且还有可能检出未知的 HlA 基因产物 四.HlA 抗原单克隆抗体分型试验 由于标准血清学分型技术被引入微量淋巴细胞分型技术, 大大的推动了且 A 研究中 的应用 目前, 血清学分型技术仍是 HlA -I 类抗原分型的主要方法 但是, 由于血清学 分型方法存在标准抗血清的筛选技术比较复杂 存在较多较强的交叉反应 标准血清存在 很大的批间差异以及血清学分型板的运输和保存需要较高条件等缺陷, 限制了其应用 20 世纪 80 年代末期, Terasaki 等研制出了 HlA 单克隆抗体来代替标准抗血清, 并在 1992 年, 使 HlA 单克隆抗体配型板试剂投入商品化, 大大改善了 HlA 配型试剂的质量 该方 法不仅简化了操作步骤, 而且每一块配型板均附有一份反应记录表, 将阳性反应结果的读 数填到相应的空格内, 然后根据每一批试剂的反应格局判断表, 判度相应的抗原 五. 基因配型技术 不管是 CI 汇试验还是 MLC 方法, 都必须以受检者的淋巴细胞作为检测标本, 这就大大地限制了检测方法的应用范围, 而且还存在抗体来源困难 细胞培养周期过长等缺点 1985 年美国 Cetus 公司发明了体外基因扩增技术聚合酶链反应技术 (polymerase chain reaction, PCR), 其原理见图 21-2 该技术为分子生物学技术在 HlA 研究中的应用提供了 技术保障, 使 HlA 的检测进入了 DNA 分型阶段 时也分型法是利用 Pe R 技术将标本中的少量目的时也大量扩增, 然后再进行产物鉴定的方法, 特点是灵敏度高, 试剂来源容易, 应用范围广, 陈旧的或微量的标本都可进行检测, 在移植医学 法医学和其他方面都有广阔的前途 经过十几年的发展, DNA 分型法常用的技术有以下几种 : (~) 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 ( 盯 12) 技术的基本原理是 : 根据 HlA 核昔酸碱基序列的不同, 而在不同部位存在多个酶切位点, 利用一组限制性内切酶酶切基因 DNA 或 PeR 扩增产物, 形成各种大小不等的 DNA 片段 ; 通过 SCJUthern Blot 将印迹转移至尼龙膜上, 然后与 HlA 基因做基因特异的 cdna 探针杂交, 从杂交片段格局中分析与抗原特异性相对应的特异杂交片段, 从而分辨同种异型基因位, 指定 HlA 等位基因 由于不同等位基因的限制性酶切位点分布和不同等位基因的碱基序列不同, 产生了数量和长度均不同的酶切片断, 从而产生不同的 DNA 带型, 由此可借以鉴定 HlA 基因的特异性 PCR-RLFP 是结合 PCR 技术对 RFLP 分型方法进行改进的技术, 其原理是目的基因片段经配 R 扩增后, 采用等位基因特异的限制性内切酶对扩增产物进行酶切, 通过分析电泳图谱获得 HlA 基因多态性结果 该方法是一种敏感 特异的 HlA 基因分型法, 理论上可以精确识别单个碱基不同的 DNA 序列, 可以用于点突变的检测, 该法的缺点是无法检出多态性位点与酶切位点不符的等位基因 ; 对于高度多态性等位基因, 其酶切片段长度接近, 电泳图谱很难精确辨认 ; 且该法只适合于小样本量的检测 ; 另外检测时间较长, 不适用于尸体移植快速配型的需要 ( 二 ) 聚合酶链反应寡核昔酸探针杂交聚合酶链反应寡核昔酸杂交 (PCR - S'D) 技

306 299 第十一章重复循环 学检验图 待扩增区 - 寻 物 1 53 引物 2 - 加入寻 辑 ri 和寻 物 2 循环 1 2 日热到 95 度解链冷却到 ω 度退火 3' ;:ru 5' 3' 加入四回南 T 叫酶延 伸寻 物 I I I I s,24 俨 5' 加热型 d95 解链.l1l 冷却到 ω 退火 I I I, J J I 循 ~2 z 主 加入.d NTPs 和 T 叫酶延伸引物 口 E 一 III 一 / 经过 n 个循环, 设计区域被扩增 2' 倍 j IlI ll lillllllllll [ I I I, 一一21-2 配 R 原理示意图 术的基本原理是利用 PeR 技术, 以位点间或组间特异引物来扩增目的基因, 然后将其产 物转移到固相载体上, 再利用序列特异性的寡核昔酸探针, 通过 SCJUthern Blot 杂交技术进 行扩增片段的鉴定 探针可采用同位素或非放射性物质如地高辛 生物素 过氧化物酶等 标记, 经放射自显影 显色或化学发光检测结果 如果探针与样本 DNA 结合, 出现阳性结 果 ; 反之, 探针在洗膜过程中被洗脱, 出现阴性结果 应用一系列探针可检测出样本 DNA HlA 等位基因的特异性 配 R-SSG 分型可分为两种类型 :1 正向杂交 : 将样品 DNA PeR 产物固定于杂交膜上, 使各种 SSG 探针与之杂交 ;2 反向杂交 : 将非标 i 己的 SSG 探针固定 于杂交膜上, 然后与标 i 己的配 R 产物杂交, 用一次杂交反应就确定了 per 产物的等位基 因类型, 较正向杂交法更为简便 由于 HlA- I 类抗原的等位基因较 HlA - II 类抗原的 等位基因复杂的多, 所需探针的数量庞大, 目前, 临床上主要用于 HlA - II 类抗原的分型 该方法结果精确可靠, 样本需要量甚微, 易于普及, 分型结果的灵敏性和特异性均优于血 清学和细胞学分型法, 是目前应用最普遍的基因分型技术之一, 尤其适合大样本的筛查 ; 但是由于检测时间较长, 也不适于尸体移植 ( 三 ) 序列特异性引物聚合酶链反应序列特异性引物聚合酶链反应 (PeR - SSP) 是 临床和基础研究中应用较多的 HlA 基因分型方法, 其基本原理是根据目 A 各等位基因 的核昔酸序列, 设计的一套针对每一等位基因特异性的 (allele - spec 出 c) 或组特异性的 (group - spec 出 c) 引物, 即序列特异性引物 (SSP), SSP 只能与某一等位基因特异性片段的 碱基序列互补性结合, 通过 PeR 特异性扩增该基因片段, 从而达到分析 HlA 多态性的目 器官移植及其免疫

307 300 第三篇临床免疫学检验的 通常 PCR-SSP 采用基因组时也保守序列作对照组, 配 R 产物经电泳分离及紫外透射分析阳性扩增产物的片段大小来确认不同的等位基因 如果相应的基因是纯合子, 则产生一条与特异性引物相对应的条带 ; 如果是杂合子, 则产生两条与特异性引物相对应的条带 扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定, 进而根据特异性产物条带的有无直接进行 HlA 基因分型 该方法具有简捷 快速 高特异性 高分辨率等特点 PCR - SSP 分型不仅能分辨全部血清学 HlA 特异性, 而且可根据临床及研究需要设计不同的引物, 从而获得低分辨率 ( 同血清学分型 ) 中分辨率( 可检定部分基因型 ) 高分辨率( 几乎检定全部基因型 ) 的目 A 基因分型结果 联合应用低分辨率和高分辨率的目 A-II 类 PCR SSP 分型, 可为临床同胞兄弟姐妹之间及无血缘关系的骨髓移植供受者之间提供可靠的配型结果 与其他 HlA 基因分型方法相比,Pe R - SSP 避免了杂交 酶切等步骤, 结果直观, 便于分析, 具有简便省时 所需样本量少 特异性高 技术条件易掌握等特点, 是最先应用于临床的 HlA 基因分型技术, 尤其适合于尸体器官移植的快速配型试验 但由于一些影响因素, 配 R-SSP 亦可能面临分型困难 ( 四 ) 聚合酶链反应单链构象多态性分析聚合酶链反应单链构象多态性分析 (PCR - sc 口 ) 技术的原理是在完成目的 DNA 的配 R 扩增后, 进行单链 DNA 多态性分析的一种新方法 在不含变性剂的中性聚丙烯酷肢凝胶中电泳时, 单链时也因碱基顺序不 同, 甚至单个碱基的差别, 所形成的构象不同, 泳动速度也不同 ; 通过配 R 扩增包括发生单个碱基改变部位及其两侧的 DNA 片段, 变性后进行 SSCP 分析 从理论上讲可分辨出单个碱基的改变, 有效地检出点突变和 DNA 的多态性, 有利于发现新的等位基因 但是, 由于该法影响因素较多, 技术条件不易掌握, 一般临床应用较少, 主要用于 HlA 微观多态性的研究或在其他分型方法难以分析时的分型手段 ( 五 ) 配 R 指纹图分型法 PCR 指纹图分型法 (PeR - fi 鸣 er pnntl 鸣 ) 的原理是由于同质双链和异质双链之间的分子构象不同, 因此, 在非变性聚丙烯酷肢凝胶电泳时, 它们的迁移率各不相同, 从而获得单倍体特异的电泳带格局, 即 PeR 指纹 PeR 指纹法适用于快速的同种异型 DRDW 配型 利用配 R 指纹图分型法作 DNA 交叉配型试验可为移植病人和无关 f 共体提供快速 准确的配型 混合两个不同个体基因组时也, 将其 PeR 指纹与各自的配 R 指纹比较, 如果它们的格局完全一致, 则 DRDW 型别相同, 反之, 则有额外电泳带形成 PeR 指纹图己初步应用于法医学鉴定和骨髓移植中, 作为大器官移植配型的一种补充, 具有定的临床意义, 但目前尚不能替代 HlA 基因配型 ( 六 )DNA 序列测定时也序列测定是利用 DNA 聚合酶在模板的指导下, 在引物的 3' 丑基端按照碱基互补的原则合成一条与模板链互补的 DNA 链 ; 通过在单核昔酸中掺入一定量的 2'3' 双脱氧核昔酸作为 DNA 聚合酶的底物, 由于 2'3' 双脱氧核昔酸没有 3' 丑基, DNA 链不能延伸, 酶促合戚在此位点终止 通过控制反应中特定单脱氧核昔酸与双脱氧核昔酸的比例, 得到一系列特定双脱氧核昔酸结尾的长短不一的 DNA 片段 利用放射性同位素标记其中的一种脱氧核昔酸, 产物经过聚丙烯酷肢凝胶电泳, 将仅差一个核昔酸的 DNA 片段分开, 再经过放射自显影, 读出 DNA 序列 该方法是目前且 A 基因分型的最可靠 最准确和最彻底的方法, 但由于测序技术操作繁琐, 反应时间长, 在临床上作为器官移植配型的手段有较大难度 ( 七 ) 基因芯片技术基因芯片是 20 世纪 90 年代发展起来的一项前沿生物新技术,

308 第一一十一章它将标准的核酸杂交与改进的高密度时也矩阵技术结合起来, 被誉为现代分子生物学的一项革命性的研究工具 基因芯片是将 cdna 或寡核昔酸固定于玻璃片 纤维膜 塑料等国相介质上形成生物分子点阵, 一块芯片上可以固定几千甚至上万种基因特异的 cdna 或寡核昔酸, 可对两组或两组以上不同来源的 m 卧也转录差异进行分析, 通过计算杂交信号的比值和统计分析, 可以获得差异表达基因的信息, 同时还可以用聚类分析法研究在功能或表达调控上具有相关性的基因, 最终为研究基因的功能和基因遗传网络提供有利手段 基因芯片诞生不久, 便被用于目 A 分型 由于杂交是平行的, 故在同一芯片上可一次同时分析多条不同的靶 DNA 序列, 其结果经扫描后用计算机软件分析 该方法可一次进行大量靶基因的杂交探测, 具有快速 高效 高通量分析生物信息的特点 目前己用于探测新的基因 监测大量基因的表达 检测基因的多态性和突变及基因组克隆作图等 虽然基因芯片用于目 A 分型刚刚起步, 尚有许多问题需要解决, 但是由于该法具有其他方法无可比拟的优势, 因此可以预见 : 随着技术的不断改进, 它必将成为高效 特异 快速 HlA 分型的新方法 六. 交叉配合试验传统的交叉配合 ( cross matchi 鸣 ) 试验是检测受者体内是否存在抗供者的特异性抗体, 现在可同时检测受者对供者 ill 抗原的相容程度 不管是否己经进行过各种目 A 分型试 验, 交叉配合试验对选择移植物都有一定的参考价值 (~) 微量细胞毒试验用供者的淋巴细胞作靶细胞, 与受者的血清进行 α 兀 ; 出现阳性反应说明受者体内含有抗供者的特异性抗体, 移植后很有可能发生超急排斥反应 若要明确受者的抗体是抗 HlA- I 类抗原还是抗且 A-II 类抗原, 可以将供者的淋巴细胞进一步分离出较纯的 T 细胞和 B 细胞分别进行检测 ; 若要排除患者自身抗体的影响, 可以用患者自己的细胞与自己的血清进行试验作为对照 交叉配合试验是移植前必须做的一个检验项目, 对一些曾经接触过移植抗原的受者, 例如多次接受输血者 经产妇 有不成功移植史或接受过血液透析治疗者, 尤其要进行审慎的检验 ( 二 ) 流式细胞仪检测将供者淋巴细胞与受者的血清共同孵育后, 用荧光标 i 己的抗人免疫球蛋白对结合有抗体的细胞染色, 在流式细胞仪上进行荧光标记测定 该法比微量细胞毒法的灵敏度高 100 倍, 有条件的单位可以优先考虑使用 ( 三 ) 混合淋巴细胞培养将供者与受者的淋巴细胞做双向混合培养, 或者灭活供者的淋巴细胞做单向混合培养, 细胞反应的程度与供受者相容的程度呈负相关 如果它 器官移植及其免疫学检验301 们的组织相容性配合, 则相互剌激作用很小, 细胞无明显增殖 ; 如它们的组织相容性不配 合, 则相互剌激使细胞活化并产生增殖 ( 四 ) 细胞介导的淋巴细胞毒试验检测受者对移植物可能发生的细胞介导的淋巴细 胞毒作用 (cell - mediated lymphocytotoxicity, α 仕 ) 0 将受者淋巴细胞与灭活的供者淋巴细 胞做常规单向 MLC, 收获致敏的受者淋巴细胞后, 再与 51 Cr 标 i 己的 PHA 剌激的供者淋巴 细胞做 α 仕试验 ;51 Cr 释放的程度与供 七.HlA 抗体的检测 受者相容程度呈负相关 早先人们发现器官移植受者体内预存的循环抗体是诱发超急性排斥反应的主要原因 之一 近年来的研究显示 : 虽然这些循环抗体包括 IgG 19A 和胁 f 类抗体, 也可能存在一 些自身抗体, 但是影响移植物的存活和排斥反应的抗体主要是 IgG 抗体, 其中主要是

309 302 第三篇临床免疫学检验HlA- I 类和 HlA- II 类 IgG 抗体, 这类抗体统称为群体反应性抗体 (panel reactive anti body, PRA) 这些抗体产生的原因主要有术前输血 娃振史和移植史, 其检测方法有补体依赖性细胞毒法 酶联免疫吸附测定法以及流式细胞术等多种方法 其中, 流式细胞仪法包括普通流式细胞仪法和免疫磁珠流式细胞仪法, 酶联免疫吸附测定法包括美国 Sar 眩目 at 公司的检测 HlA- I 类抗体的 PRA- SfAT 技术和美国 One Lambda 公司推出的检测 HlA I 类 HlA - II 类抗体的方法, 分别是菜姆 i~ 混合抗原板 (Lambda antigen tray mix, ra1m) 和菜姆德抗原板 (Lambda antigen tray, rat) 在这些方法中, 免疫磁珠流式细胞仪法是检测且 A-I 类抗体的最佳方法 ; 而同时检测且 A-I 类和团 A-II 类抗体, 应用免疫磁珠流式细胞仪法和 ra1 飞法具有同样高的敏感性 ; 如果确定抗体的特异性, ELISA 法, 特别是 rat 法是最理想的方法 PRA> lo% 为阳性, PRA 阳性的受者, 移植物的存活率明显低于抗体阴性的受者 ; 临床肾移植一般以 PRA 值 30% ~40% 作为一个可否移植的界线 ; 一般认为 PRA>80% 的阳性受者, 是移植的禁忌症, 除非找到目 A 相配的供体 通过检测受者体内 HlA 抗体的水平和性质, 可以协助选择移植器官与移植手术的时机 对于抗体阳性的受者, 需通过一定的治疗改善机体的免疫状态, 可先对患者进行血浆置换 免疫吸附和诱导免疫耐受等来降低体液中的 HlA 抗体水平, 待抗体降到允许的范围后再考虑进行移植手术, 可进一步增加移植成功的机会 在移植后监测且 λ 抗体的水平, 有助于判断 机体的免疫状态, 准确判断患者体内预存的 HlA 抗体特异性, 客观反映患者的致敏状态, 协助调整免疫治疗的方案及指导免疫抑制剂的应用, 指导临床医生预防排斥反应的发生 器官移植及移植排斥反应的实验室监测 随着器官移植技术的不断发展, 同种异体移植己经成为人们普遍可以接受的一种治 疗手段 由于免疫抑制剂的应用, 使移植物的存活率显著提高, 但移植排斥反应和感染等 并发症仍是一个难题, 因此对这些病人进行实验室监测至关重要 移植排斥反应的临床 判断主要依靠症状和体征 移植物功能状态及实验室检测等综合指标 超急排斥很容易 诊断, 急性排斥和 G 吁虫的临床表现较明显, 慢性排斥多无典型临床表现 移植器官的功 能测定根据移植物不同而异, 多需做大量的生化测定和血液学指标, 某些辅助检查 ( 例如 B 型超声和彩色多普勒等 ) 对了解移植器官的形态 血管通畅性和血流量等也有一定的帮 助 免疫学监测是在排斥反应发生之前检查受者体内参与反应的免疫细胞及某些免疫分 子的变化, 对判断患者是否会出现排斥反应有重要的参考意义 免疫抑制剂血药浓度的 测定可以有效指导免疫抑制剂的应用, 避免毒副反应的发生 一. 免疫学监测 许多因素可以影响器官移植受者的免疫状态, 进而影响移植物的功能 对移植后受 者的免疫状态进行监测, 不但有助于早期诊断排斥及预测其转归, 还能够指导免疫抑制剂 的应用 目前, 用于移植后免疫监测的方法较多, 这些方法从不同的侧面检测受者体内的 某一免疫指标, 以期反映机体整个免疫系统的功能 免疫抑制剂具有许多副作用, 长期使 用可导致严重的后果, 一些受者甚至因为药物的副作用死亡而移植器官功能良好 要解 决这个问题, 也必须能够准确地评价和方便地监测受者的免疫状态, 根据免疫状态来调整 免疫抑制剂的用量 由于发生移植排斥反应后都伴有移植器官功能的损害, 另外发生移忏所菊五口

310 第一一十一章植排斥反应时机体处于一种应激状态, 因此, 移植排斥反应的监测应从两个方面进行 : 一方面是监测移植器官的功能及移植器官特异的成分 ; 另一方面, 检测相关的一些细胞因子 急性时相蛋白和免疫活性细胞的激活与增殖 由于感染也可以引起细胞因子 急性时相蛋白及免疫活性细胞等的改变, 因此在分析异常结果时, 要注意进行区别对待 针对不同的移植器官, 诊断移植排斥反应所涉及的检验项目也要区别对待, 在此只列出一些常用的检验项目 另外, 这些检验项目仅能提供一些参考, 移植排斥反应诊断的金标准是移植物活检及组织病理学检查 在器官移植后监测机体的免疫状态, 对提高移植器官的长期存活是十分关键的 (~) 外周血 T 细胞计数 T 淋巴细胞是参与免疫应答的主要细胞, 许多免疫抑制剂通过影响 T 细胞而发挥作用 根据外周血 T 细胞表型的不同, 可以将 T 淋巴细胞分成不同的亚群, 而不同亚群的 T 细胞具有不同的功能 对 T 细胞表型进行检测, 能较好的反映 体内的免疫状态 用单克隆抗体免疫荧光法或流式细胞仪测定 T 细胞及其亚群, J J 比值 ( J 和 ωj 分别代表 T 辅助细胞和 T 抑制细胞亚和 CD4+ CDs+ 比值是重要 的免疫状态监测指标, 中国人正常值范围为 o. 98~ 在急性排斥的病人中, 在急性排 斥的临床症状出现前 1~5 天, T 细胞总数和 CD4 + CD s + 比值升高, 可以协助诊断 若比值 明显降低, 提示机体处在过度抑制状态, 免疫抑制剂用量过大, 容易发生严重的感染 巨 细胞病毒感染时比值降低 各家报道的比值不同, 一般认为当比值大于 1.2 时, 预示急性 排斥即将发生 ; 比值小于 1.08 则感染的可能性很大 如果能进行动态监测, 对急性排斥 和感染的鉴别诊断会有重要价值 另外, 淋巴细胞转化试验对测定 T 细胞总数和功能状 态也有一定意义 m2~ 及团 A-DR+ 分别是 T 淋巴细胞早期和晚期激活的标志, 检测激 活的 T 细胞比检测静止的 T 细胞更有意义 通过酶联免疫斑点法 (ELISA- SKIT) 或流式 细胞术监测 T 辅助细胞 (helper T cell, TH ) 的功能, 有助于评价受者抗感染的能力 TH1 细 胞亚群可以产生并分泌 IL-2 IFNγ 和 1NF- ~ 等细胞因子, 而 TH2 细胞亚群则可以产生 和分泌 IL-4 IL-5, IL-6 IL- lo 和 IL-13 等细胞因子 TH1 细胞通过其所分泌的细胞 因子促进细胞免疫功能, TH2 细胞则通过相应的细胞因子促进体液免疫功能 器官移植及其免疫学检验303 ( 二 ) 杀伤细胞活性测定移植后因免疫抑制剂的应用, 杀伤细胞的活性受抑制, 但在急性排斥前会明显增高 取供者淋巴细胞灭活后作为剌激细胞, 分离患者淋巴细胞作反应细胞, 将两种细胞混合直接做 α 伍, 测得的结果是 Tc 细胞和 NK 细胞共同作用的结果, 进行动态监测的意义更大一些 ( 三 ) 血清 IL-2R 测定 T 细胞激活后可释出 IL- 2R, 在急性排斥和病毒感染时 1 2R 的血清含量升高, 以巨细胞病毒感染时增高最明显 如肾移植后发生急性排斥时, 患者血清和尿液中白细胞介素 2 受体的水平会升高, 使用相应抗体可以定量测定 环抱霉素 A 肾毒性的肾功能减退时血清肌团干值增高, 而且 2R 明显降低 血清肌酣值和 1 2R 同时增高对急性排斥的诊断有意义 但个体问血清 IL-2R 的含量差别显著, 无公认的诊断标准, 限制了它的临床应用, 动态测定可克服这一缺点 ( 四 ) 抗供者团 A 抗体的检测利用交叉配合试验检测患者血清中是否存在抗供者团 A 的抗体, 抗体的存在预示着排斥反应的可能性 一般认为抗供者 HLA 抗体的存在是影响移植物长期存活的一个危险指征 在产生抗体的患者中, 发生急性排斥反应的比例

311 304 第三篇临床免疫学检验高于无抗体产生的患者 检测 HlA 抗体有助于评估预期的存活时间 肾移植术后受者可产生 HlA 抗体, 在产生抗体的患者中, 发生急性排斥反应的比例高于无抗体产生的患者 检测 HlA 抗体有助于评估预期的存活时间 ( 五 ) 检测可洛性目 A 抗原可洛性 HlA 抗原 (soluble human leukocyte antigen, 简称 shla) 是存在于人类血液 尿液 淋巴液 乳汁等体液中的 HlA 分子 shla 的测定方法有 : 微量淋巴细胞毒抑制试验 酶联免疫吸附试验 ( 包括双抗体夹心法和竞争抑制法 ) 放射性同位素标记抗体法以及细胞 ELISA 抑制法 流式细胞仪抑制法 单向等电聚焦电泳法 凝胶过滤法和免疫沉淀法等 通过测定器官移植病人血清 s 且 A-I 水平发现 : 接受器官移植的病人血清 shla- I 水平在移植术后, 尤其是在发生急性排斥反应之前明显增高, 并随移植时间和移植排斥反应发生与否而呈动态变化 关于这方面的报道, 最早是由 Tsuji 等在对 10 例骨髓移植病人血清 s 且 A-I 水平进行研究时发现的, 他们发现在移植物抗宿主反应发生时血清 shla- I 水平升高, 并被其他学者的研究所证实 因 Wnes 等利用 ELISA 法对几种器官移植病人发生移植排斥反应期间血清 shla - I 水平进行了动态监测, 结果发现在移植后的前 10 天内, 大多数移植病人表现出很低的基础 shla - I 值, 并且比术前结果要低, 以后逐渐升高, 并逐渐高于术前 shla- I 值, 发生移植排斥反应的患者 s 团 A-I 水平明显高于未发生移植排斥反应的患者 在肺移植病人, 发生排斥反应 时, 支气管肺泡灌洗液中 shla- I 水平也升高 由于观测到一些肝脏移植病人产生耐受现象, 考虑可能是供者肝脏分泌的可洛性耐受原的作用, 另一方面发现了 HlA 的片断以可洛性的形式存在, 因此, 关于 shla- I 与免疫耐受的关系的研究引起了人们的广泛关注 现在己经清楚这种关系不能用总的 shla - I 来阐明, 因而区分供者器官产生的 shla- I 与受者器官产生的 shla- I 是十分必要的 另一项研究是关于 5 例肾移植和 8 例同时接受肾脏和膜腺移植的患者, 他们均是 HlA-A2 阴性, 供者是 HlA-A2 阳性, 结果检测到了且 A- A2 随排斥反应的发生而升高, 但是没有检测到供者 s 且 A-I 持续出现 后来的研究表明, 在这些受者体内检测不到供者 shla- I 是由于技术因素 其他一些研究也证实血 i 青 shla- I 水平升高与心脏 肝脏 肾脏和膜腺移植排斥反应的发生有关 因此, 供者 shla- I 可以作为监测移植排斥反应的一个有效工具 ( 六 ) 检测细胞因子水平移植术后, 宿主免疫系统将移植物识别为异物, 激活巨噬细胞, 并释放 IL-1, 诱导同种异体特异性抗原的淋巴细胞转化成效应细胞, 释放 IL- 2 和 IL-4 等细胞因子, 后者可以激活细胞毒性 T 细胞 自然杀伤细胞 浆细胞等 检测血清中细胞因子水平的变化, 有可能预告将发生急性排斥反应或移植物抗宿主病 在移植免疫反应中, T 淋巴细胞一旦被启动, 会引起一些细胞因子的释放, 细胞因子再激活其他免疫细胞, 并导致排斥反应 其他与急性排斥或移植物抗宿主病有关的细胞因子还有白细胞介素 6 肿瘤坏死因子及干扰素等 {E! 应注意, 细胞因子水平的升高不具有特异性, 在患者感染时也会引起细胞因子水平的升高 ( 七 ) 嵌合体的检测在长期存活的尸肾移植患者中, 可观察到供者细胞与受者细胞同时并存的嵌合体, 这种嵌合状态可以长期维持 使用由也扩增技术检测且 A 基因, 己成功地鉴定出这类嵌合体 这个技术很敏感, 在供者和受者细胞比例为 1: 时, 仍能区分供者和受者的 HlA 基因, 使用的检测材料可以是外周血 皮肤和肾活检的冷冻切片标本 二. 免疫抑制剂血药浓度的监测

312 第一一十一章为了预防移植排斥反应的发生, 移植受者将终生接受免疫抑制剂治疗 最理想的免疫抑制剂是能干扰免疫活性细胞的功能和代谢, 阻断或延缓移植排斥反应, 而不影响机体免疫系统对病原体的抗感染免疫应答, 遗憾的是目前没有这样的药物 目前所用的免疫抑制剂, 应用范围比较狭窄, 并且均具有一定的毒副作用 为了保证移植术后免疫抑制治疗的有效性, 提高移植物长期存活率, 应定期检测免疫抑制剂血药浓度及机体的免疫状态 只有这样, 才能实现药物应用的个体化, 使免疫抑制剂能最大限度的抑制排斥反应的发生而副作用降至最低, 从而提高移植器官的长期存活率 ( 一 ) 环抱素浓度监测环抱素浓度的检测方法有放射免疫法 (RIA) 荧光偏振免疫 法 (FPIA) 和高效液相色谱法 (HPLC)a RIA 法因存在放射性污染 需防护设备以及放射性废物的处理等缺点, 现己少用 ;FPIA 法仪器价格昂贵, 试药完全依赖进口 ;HPLC 法样品处理步骤较简便 灵敏度高 准确性较好, 价格相对合理, 对患者全血 CsA 药物浓度监测有较强实用性 移植术后前几周中, 应多次监测其血药浓度, 达到预期的治疗浓度后, 可适当减少监测次数 但是, 在发生排斥反应 感染 肝肾功能障碍及其他异常改变时, 应及时调整治疗方案, 并增加监测血药浓度的次数 ( 二 )FK506 的监测目前测定全血 FK506 浓度的方法有 : 受体结合法 生物学测定法 高效液相法 (HPLC) 微粒子酶免疫测定法(microparticleenzyme imnunoassay, 阻 IA) 及酶联免疫吸附法 (ELISA) a 不同的方法提取的过程不同, 对代谢物的识别也不一样, 因此所得的结果也不相同, 不应相互比较 常规 HPLC 法因 FK506 分子中没有发色团或紫外吸收结构, 灵敏度较差 HPLCMSMS 法或 HPLCMS 法则具备所需要的灵敏度, 是目前最精确 灵敏度最高且特异性好的 FK506 血药浓度测定方法, 但由于仪器昂贵 操作繁杂亦不适合常规监测 岛 1E IA 法自动化程度高 操作简便 快速, 最低检测浓度为 1. 5μg L, 所用仪器为 Abbott 公司开发的岛位及专用试剂盒, 具有极高的灵敏度 特异性和稳定性及反应速度快等优点, 但戚本较高 与岛 1E IA 法比较, ELISA 法具有灵敏度高 取样量小 (50μ1) 不需萃取, 仪器及试剂戚本低等特点 ELISA 法使用单克隆抗体, 较为简便, 在 4 小时内就可完成, 准确性和敏感性都较高, 检测底限可达 0.3 鸣 ml, 测定原理是竞争性酶联免疫测定法 用小鼠抗 FK506 单克隆抗体加羊抗小鼠单克隆抗体, 用辣根过氧化物酶 FK506 与羊抗小鼠 IgG 进行竞争性结合, 根据辣根过氧化物酶 FK506 与羊抗小鼠 Ig( 王的结合量进行比色, 绘制标准曲线, 读出 FK506 的含量 FK506 的毒副作用包括肾毒性 胃肠道 神经系统和糖代谢异常等, 由于 FK506 通过肠道吸收, 在发生腹泻时, 对其血药浓度 器官移植及其免疫学检验305 有较大的影响 由于其血药浓度与剂量的相关性较低, 药代动力学参数在不同病人间的差异较大 另外, 其有效治疗范围较窄, 在服药过程中, 应定期监测 FK506 血药浓度, 并在发生排斥反应 腹泻 肝肾功能异常等情况时, 及时进行监测, 指导用药 ( 三 ) 挠悉的血药浓度检测岛他 1F 被血浆醋酶代谢为具有药理活性的产物霉酣酸 (1\ 也 PA), 平均生物利用度为 94% 在肝脏, MPA 经过葡萄糖醒酸化代谢为稳定的 无药理活性的葡萄糖醒酸昔 (MPAG) 高效液相法 (HPLC) 分析血浆中的阳 1F 及 MPA 和 MPAG, 用来探测的紫外线波长为 254 皿丑, 血浆中 MPA 和 MPAG 的限定值分别是 0.10 r 鸣 L 和 4.00rr 毡 La 二. 感染指标的监测由于免疫抑制剂的应用, 使移植受者的免疫功能处于抑制状态, 极易导致各种细菌 病毒 真菌及寄生虫的感染 感染是移植术后最常见的并发症和死亡的原因之一, 其中肺

313 306 第三篇临床免疫学检验部感染是最主要的感染并发症 采取积极有效的预防措施, 加强感染的监测, 是预防和减少感染发生的关键 (~) 细菌和真菌感染的监测术后早期是细菌感染的高发期, 主要好发于呼吸道 泌尿道 血液 皮肤 手术切口及移植物周围, 其中以败血症和肺部感染的死亡率最高 器官移植术后除了最常见的肺部感染外, 其他如尿路 纵阳 伤口 口腔 月工周的细菌感染亦多见, 且感染易造成败血症及广泛播散 感染多发生于手术后第 1 个月, 故术后 2 周内要密切观察出现的相应临床症状 监测的方法主要是对患者及时进行血 痰 咽拭子 胆汁及中段尿等的细菌培养 不同部位感染的细菌语有较大区别 : 呼吸道感染以革兰阴性细菌较多, 主要致病菌为铜绿假单抱菌 鲍蔓洛血不动杆菌 大肠埃希菌及嗜麦芽窄食单 f 包菌等, 也有革兰氏阳性细菌感染, 如金黄色葡萄球菌 ; 在胆道以粪肠球菌 肺炎克雷伯杆菌为主, 多为条件致病菌 ; 泌尿系感染以革兰氏阴性细菌为主, 如大肠埃希菌 产气杆菌 副大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单 f 包菌 白色葡萄球菌等 ; 伤口感染常见的致病菌主要是革兰氏阴性杆菌, 其他为葡萄球菌和肠球菌等 结核杆菌感染在器官移植受者也很常见, 明显高于正常人群的感染率 不同移植中心报道的不同器官移植后感染的细菌语有很大差别, 可能与抗生素的应用使致病细菌谱发生了改变有关 在移植前及移植后应进行多次 多部位多种样本的细菌培养, 提高细菌感染的检出率, 并通过药敏结果, 指导抗感染治疗 器官移植患者发生真菌侵袭和感染的菌种较多, 概括起来, 移植后发生真菌感染主要分为两大类 : 一类为播散性原发感染, 病原体为一种导致地域性系统性真菌病的真菌, 如组织胞浆病 球甩子菌病 芽生菌病 副球甩子菌病 ; 另一类为条件致病真菌感染, 如曲霉 念珠菌 新型隐球菌, 通常是在医院感染, 并且表现为侵袭性真菌病 这些条件致病真菌在正常宿主一般不引起侵袭性感染 条件致病真菌感染中念珠菌和曲霉感染占移植后真菌感染 >80% 移植后头两个月最易发生真菌感染, 80% 的移植后真菌感染发生在这一时段, 死亡率达 30% ~100% 真菌感染的发生与移植术和移植脏器的类型 患者移植前基础疾病病情 移植后全身状况以及真菌的种类密切相关 传统的真菌镜检和培养仍是确诊移植后真菌感染的重要手段 如果怀疑发生真菌感染, 应立即尽可能多次 多途径采集多种标本同时进行培养, 如鼻腔分泌物 日因腔分泌物 创口分泌物 痰 尿 粪 骨髓 血液 脑脊液等 一次培养阴性不能排除真菌感染的可能 除真菌培养法外, 诸如免疫学检测 PeR 技术等对某些深部真菌病的早期诊断也具有重要价值 ( 二 ) 病毒感染的监测器官移植受者病毒感染发生的几率也很高, 其中主要是巨细胞病毒感染, 也有乙型肝炎病毒 内型肝炎病毒以及 EB 病毒 单纯癌彦病毒等的感染 传统诊断 αw 感染的方法有病毒分离培养 ELISA 法或免疫荧光法检测 αw 胁 f 和 α1v- IgG 抗体 α1v - PP65 抗原血症试验 定性配 R 检测 α1v- DNA 及实时 per 定量检测 α1v -DNA 等 研究显示, 供者及受者本身的术前状态对受者术后是否发生病毒感染至关重要 术前应对供 受者进行系统的病毒检测, 高危病人应给予特殊处理, 如进行抗病毒治疗, 从而减少术后病毒感染的发生, 提高移植病人的长期存活率 EB 病毒的实验室诊断归纳起来有三类 : 病毒分离与培养 在病变组织中检出病毒组分和血清中检出抗 EB 病毒特异性抗体 病毒分离培养可取患者的唾液 咽洗液或外周血细胞及肿瘤细胞等接种人脐血淋巴细胞, 通过转化淋巴细胞的效率来确定 EB 病毒的量 此法耗时长, 常达数周以上, 需要特殊的组织培养条件, 故难以常规采用 在病变组织中检出

314 307 第学检验参号文献 病毒组分包括通过 per 等分子生物学方法检测 EBV 时也及应用免疫荧光法检测病毒抗 原 抗 EB 病毒特异性抗体的检测是我国目前较常用的方法, 包括针对 EB 病毒核心抗原的 抗体, 针对病毒膜抗原的助 f 抗体的存在及恢复期患者抗病毒膜抗原助 f 效价 4 倍升高等 目前 EB 病毒血清学诊断的常用方法为间接免疫荧光法和酶联免疫法 1 William E.Pau 1. Fundamentallmmunol 唱 T.5th edition. Lippincott Williams & Wilkins Publishers, (August 2003) 2 F.T.Rapaport.A Half - Century Retrospective of 1Tansplantation.1Tansplantation Proceedings 1999, 31 (1 2) :15 ~ 49 3 夏穗生. 我国肾外大器官移植的进展中华器官移植杂志 1999, 20: 67 ~ 69 4 夏穗生. 世界临床肝移植进展. 中华器官移植杂志.1996, 17: 145~ 黄洁夫. 我国器官移植的发展现状及对策. 中华外科杂志.1999, 37(9)535~537 6 MATAS AI. Chronic r 可 ection - definition and correlates. Clin Transplant.1994, 8(2) : 162 ~ 王会贤.CsA 和日 {5 06 作用机制的研究进展. 国外医学免疫学分册.1994, 17(5) :236~239 8 Manikkam Suthanthiran, Terry B.Strαn Renal Transplantation.N Engl J Med.1994, 331: 365~ 苑学礼, 谢蜀生, 郭应禄器官移植耐受的研究进展. 中华泌尿外科杂志.1998, 19 (1 2) : 755~ 顾晓. 慢性排斥与移植耐受国外医学免疫学分册 2000, 23 (3) :182~ Matthews, Je 险 ey B, Ramos, Eleanor & Bluestone, Jeffrey A. Clinical Trials of Transplant Tolerance: Slow But Steady progress. American Journal of Transplantation, 2003, 3( 7), 794~ D::>ng, Victor M., Womer, Karl L.& Sayegh, Mohamed H.Transplantation tolerance: The concept and its applicabil ity.pediatric Transplantation.1999, 3 (3) :181 ~ Jiang, Shuiping & Lechler, Robert 1. Re 刷 latory T Cells in the Control of Transplantation Tolerance and AutoimmunitY.American Journal of τransplantation 2003, 3 (5) : 516~ Chiffoleau, Elise, Walsh, Patrick T.&τurka. Laurence Apoptosis and transplantation tolerance.lmmunological Re VIe 啊, 2003, 193(1) :124~ Shapir 口, A.M.James, Na 叫, Sulaiman A. et a!' Clinical islet transplant: current and fut 旧 e directions towards toler ance.lmmunological Reviews, 2003, 196 (1) : 219~ Jordan F, McWhinnie AI, Turner S, et a!' Comparison of HIλDRB1 叽 )ing by DNA - RFLP, PeR - S' 讪 and PCR - SSP methods and their application in providing matched unrelated donors for bone marrow transplantation. T issue Antigens, 1995, 45(2) : 103~ Zetterquist H, Bengtsson M, Backstrom G, et al. Report from the HIλclass II typing by PCR - SSP Multicentre Study. Eur J lmmuno 段时 t, 1997, 24 (3) :191 ~ Pursall MC, Clay 1M, Bidwell JL. Combined PeR - heteroduplex and PCR - S' 汇 P analysis for matching of HIλ A, - Band - C allotypes in marrow transplantation.eur J lmmunogenet, 1996, 23 (1) :41 ~ 王长印, 邹雄, 李桂琴.sHlA - I 研究进展. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 2 悦, 23(2) :74~75 20 洪微, 温海, 廖万清. 器官移植后真菌感染的预防中华医院感染学杂志, 2003, 13(9) : 898~ 邹雄, 张利宁分子免疫学与临床济南 : 山东科学技术出版社, Gouarin, S., Vabret, A., Gault, E., Petitjean, J., Regeasse, A., de Ligny, B.Hurault, Freymu 巾, F. Quantitative analysis 0 一一十一章器官移植及其免疫

315 旺M4Aql 忏口三篇临床免疫学检验第二十二章 肿瘤免疫 述 肿瘤免疫学 (tumor imnunol 叩 ) 是研究肿瘤的免疫原性 机体的免疫功能与肿瘤发生 发展的相互关系 机体对肿瘤的免疫应答和抗肿瘤的效应机制以及肿瘤的免疫诊断和防 治的科学 所菊308 第20 世纪 50 年代, 随着纯种小鼠的培育成功, 科学家们才以确切的实验结果证实了化 学致癌剂甲基惠 ( methylcholanthrene, MCA) 诱发小鼠发生的肉瘤所表达的移植排斥抗原是 肿瘤特异性的 随后, 在其他致癌因素导致的肿瘤中亦证实了肿瘤抗原的存在, 并证明所 诱导的机体免疫应答具有抗肿瘤作用, 从而使免疫学在肿瘤的诊断和治疗中引起了重视 20 世纪 60 年代以后, 大量的体外实验证明肿瘤患者的淋巴细胞 巨噬细胞和细胞毒性抗 体等均具有抗肿瘤效应 20 世纪 70 年代, 单克隆抗体在生物学领域中广泛应用, 大大推 动了肿瘤免疫的诊断和肿瘤治疗的发展 特别是近 20 年来, 分子生物学和免疫学技术的 迅速发展和交叉渗透, 在肿瘤抗原的特性分析 岛 1HC 分子结构和功能 T 细胞对岛 1HC 分子 提呈肿瘤抗原肤的识别 肿瘤特异性 T 细胞的 1CR 语等方面的研究相继取得进展, 深入阐述了机体抗肿瘤的细胞分子免疫学机制 同时基因工程抗体和抗独特型抗体的制备应用 抗体相联物的导向治疗 构建肿瘤细胞 DNA 文库寻找肿瘤抗原基因 采用自身血清筛选肿瘤抗原 (serological analysis of recombinantly expressed clones, SEREX) 等一系列新技术的 应用, 使对机体体液免疫的抗肿瘤作用有了更深入的认识 此外, 多种细胞因子对机体免 疫功能的调节和抗肿瘤的增强作用, 也从不同的角度推动了肿瘤免疫的发展, 把肿瘤的免 疫诊断和免疫防治提高到一个新的水平 第二币 肿瘤发生的诱因及生成 一. 肿瘤发生的诱因肿瘤是机体自身细胞在各种内外致癌因素作用下发生恶性转化产生的 正常细胞恶变是由多种不同原因造成的, 因病因特性决定了免疫系统是否能有效控制肿瘤细胞的生长 转化可以由随机突变或基因重排白发产生也可由化学 物理或病毒致癌物诱发产生 (~) 化学因素学者们于 18 世纪发现烟囱清扫工有极高的阴囊癌发病率, 首次提出了由化学致癌物可以诱发肿瘤这一学说 己经证实在阴囊皱相处滞留的焦油与肿瘤之间有明显的相关性 煤烟和焦泊中多环芳香碳氢化合物是己被发现的其中一类主要的致癌物 实验证明在上皮细胞上涂布焦油可以诱发肿瘤 第二类主要的致癌物为芳香肢, 是因观察到在使用苯肢燃料的工人中膀肮癌高发率后被发现 化学致癌物诱发肿瘤转化的

316 机制主要反映了这些复合物的诱发活性 ( 二 ) 物理因素物理致癌物诱发肿瘤是在 19 世纪末发现 X 射线及其放射性后得到证实的 电离辐射直接损伤细胞 DNA, 导致突变 染色体断裂和异常重排 另一物理致癌物如紫外线辐射可诱发身体暴露于阳光的部位发生皮肤癌 特别是着色性干皮病患 者, 由于对紫外线诱发的 DNA 损伤的修复机制存在的缺陷, 其皮肤癌发病率更高 ( 三 ) 病毒因素由于病毒基因导入而诱发细胞发生转化, 表达可被免疫系统所识别 的新的病毒相关抗原, 所以病毒性致癌物质在肿瘤免疫中具有特殊意义 依据完整病毒 携带的基因信息不同, 致癌病毒可以被分为 DNA 型和卧也型 I.DNA 病毒具有潜在致癌性的 DNA 病毒 ( 包括乳头瘤病毒 痛彦病毒 腺病毒 ) 感染的多数细胞, 能表达所有的病毒基因并辅助病毒复制, 这种复制常导致细胞洛解 而在非洛细胞的病毒感染中, 病毒时也整合入宿主基因组, 病毒基因部分表达, 不形成洛细胞的病毒颗粒, 而由整合的病毒直接启动宿主基因或者转录的病毒卧也异常拼接, 合成促进转化的新蛋白导致细胞转化 现己发现几种人类 DNA 病毒具有潜在致癌性, 并与恶性肿瘤有关 如 :EB 病毒与淋巴瘤 霍奇金病 鼻咽癌相关人类乳头瘤病毒与宫颈癌 皮肤癌相关, 乙型肝炎病毒与原发性肝癌相关等 2.RNA 病毒致癌 RNA 病毒含有称作反转录酶的多聚酶相关基因, 使病毒 RNA 成 为可整合入宿主基因组的 DNA 转录模板 因其与正常基因信息从 DNA 转到 RNA 的转录方向相反, 这些病毒常被称为反转录病毒 首次在鸡肿瘤中发现的卧也肿瘤病毒与许多物种自然发生的大量癌肿有关 这类病毒中, 某些含有能引起直接转化的致癌基因, 某些则能够激活宿主基因物质 许多反转录病毒由己感染宿主向正常宿主水平传播, 引起宿主对肿瘤产生抗性, 部分原因是暴露于病毒环境中的宿主对病毒相关抗原产生免疫应答, 因而获得了对病毒的抵抗力 ( 四 ) 原癌基因的激活随着分子生物学的发展, 现己在正常细胞基因组中发现许多 第一一十一一章肿瘤免疫309 病毒原癌基因类似基因 许多原癌基因在正常细胞生长和发育过程中发挥重要作用, 但在某种活化状态下亦可使正常细胞发生转化 细胞的转化方式主要有以下几种 :1 突变 : 如干扰调节蛋白的转录或影响蛋白活性的突变 ;2 易位 : 指原癌基因靠近活化的细胞癌基因, 如在 B 细胞肿瘤中所发现的 c 町 yc 原癌基因移至靠近免疫球蛋白 V 区基因的位置 ; 3 插入 : 可增加表达的活化启动子的插入, 一般在缓慢转化的反转录病毒整合后发生 原癌基因能编码各种产物包括膜受体 自分泌生长因子 细胞周期循环和基因表达的调控因子等, 其中某些由正常蛋白突变而来的产物, 使人们可以用免疫学方法分离检测肿瘤细胞, 并利用免疫靶向攻击清除肿瘤细胞 二. 肿瘤生成从实验上看, 导致肿瘤生成需起始 促进及进展三个阶段 起始阶段指由于化学 物理或生物学因素所导致的 DNA 改变使得细胞基因型具有了恶化潜能 这些 " 起始细胞 " 从组织学上看是正常的, 但其组成上倾向于恶性转化 促进阶段包括细胞内遗传信息的表达发生改变的过程 进展阶段指己建立的肿瘤克隆演化形成肿瘤异质性和多种表型 ( 包括侵袭性 耐药性 转移潜能等 ) 的过程 因此, 肿瘤是多步骤一系列过程的最后阶段, 可能要发展相当长的时期 在正常机体内它的发生 发展和行为由退行性遗传程序所驱使, 并受微环境 ( 包括激素微环境 血管供应及免疫等 ) 的影响 肿瘤细胞具有与人体正常

317 忏口三篇临床免疫学检验肿瘤特异性抗原第细胞不同的一些共性, 这些共同特性总结见表 表 22-1 肿瘤细胞的共同特性 1. 瘤细胞不受调控正常细胞生长和组织修复的信号调节 2. 肿瘤细胞无需外源性生长信号刺激亦可自主生长 3. 肿瘤细胞可突破正常组织边界向周围侵袭性生长 4. 肿瘤细胞经血液 淋巴通道可转移至远处器官继续生长 5. 肿瘤细胞多起源于单克隆细胞, 随肿块土曾大, 基因型和表型异质性可能有所变化 6 肿瘤细胞其膜表面抗原表型不同于未转化的正常组织细胞 一一一肿瘤抗原 所菊310 所谓肿瘤抗原是指细胞癌变过程中出现的新抗原及过度表达的抗原物质的总称 按 肿瘤抗原与肿瘤的关系, 可把肿瘤抗原分为肿瘤特异性抗原 (tumor specific antigen, 1SA) 和肿瘤相关抗原 (tumor associated antigen, TAA) 两大类见 ( 表 22-2)0 1SA 是指肿瘤细胞 所特有的, 不存在于正常组织细胞上的抗原 1SA 可在近交系小鼠通过肿瘤移植排斥反 应实验而证实, 故又被称为肿瘤特异性移植抗原 (tumor spec 出 c transplantation ant 皑白 1, 1STA) 或肿瘤排斥抗原 (tumor 叫时 tion antigen,1ra) 0 TAA 是指并非肿瘤细胞所特有, 也可存在于正常组织细胞特别是胚胎组织上的抗原, 因而在肿瘤细胞和正常组织之间, TAA 只显示量的变化 表 22-2 肿瘤抗原分类 类 别 抗原的来源或特性 化学和物理致癌因素诱发肿瘤表达的蛋白 病毒诱发肿瘤表达的蛋白 癌基因和突变型抑癌基因编码的异常蛋白 静止基因激活后表达蛋白 肿瘤相关抗原 胚胎性蛋白 高表达的癌基因编码蛋白 分化蛋白 过量或异常表达的糖月旨和糖蛋白 一. 肿瘤特异性抗原肿瘤特异性抗原 ( tumor specific antige 口,1SA) 是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原 (~) 化学和物理致癌因素诱发的肿瘤抗原化学致癌剂 ( 如甲基胆草 氨基偶氨染料和二乙基亚硝服等 ) 或物理因素诱发的肿瘤抗原的特点是特异性高而抗原性弱, 常表现出明显的个体特异性, 即用同一化学致癌剂或同一物理方法如紫外线 X 射线等诱发的肿瘤, 在不同的宿主体内, 甚至在同一宿主不同部位, 各具有互不相同的抗原性 每个肿瘤的抗原间很少出现交叉反应这种特点为该类肿瘤的免疫学诊断和治疗带来了极大的困