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1 Muliti-Color i l Flow Cytometry

2 Some History 分选型流式细胞仪 EPICS ELITE 诞生 独特的石英流动室 小功率空冷激光 - / - Aligned co-linear 3 色分析系统 - FITC, PE and APC 1989 可选择第 5 个 PMT (PMT1=SS) 使 4 色分析成为可能 - FITC, PE, APC and??? 染料技术 1989 Elite 引入门控放大技术, 即可用一个 PMT 接收 2 个光学信号 双激光束分开利用 488 d 可进行 6 色分析

3 Some History ECD 作为第三色引入 488nm 的仪器 4 色分析系统 - FITC, PE, ECD and APC 双激光束重叠 co-linear BD 使用 PerCP 作为第三色荧光 1992 发现了花青苷 (Cyanine) 染料 PE-Cy5 是第一个可用的染料

4 Some History 革命性的 XL 系统诞生 独特的单激光激发 4 色荧光系统 FITC, PE, ECD,? 数字化的流式细胞仪 MCL 自动进样系统 BD 生产双激光 4 色荧光系统 FACSCalibur FITC, PE, PerCP and APC Coulter 收购 Immunotech 提供了 PE-Cy5 染料 率先将 PE-Cy5 染料应用在 XL 系统中, 真正实现单激光激发四色荧光

5 Four Color Analysis: Single Laser System - Why? Because we can. Hardware Expertise Reagent Expertise

6 单激光激发四色荧光的影响因素 光学滤片的设置荧光染料光谱的重叠颜色补偿 利用软件进行全矩阵补偿 PMT 高电压调节 线性 稳定性

7 光路 - 简单的直线光路片 可互换的光学滤 Air-cooled Argon Ion Laser Side Scatter Detector Beam Shaping Lenses 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 575BP FL2 (RD1) 525BP FL1 (FITC) 645DL 550DL 600DL 488DL 488BK High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector

8 4 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5

9 PMT 放大与颜色补偿的相关性 PMT 1 PMT Total Signal = % FL1 = 1500 For true PE signal: FL2-10% FL1 = Total Signal = % FL1 = 4500 For true PE sg signal: FL2-30% FL1 =

10 信号传递 数字化信号传递 (Digital Signal Processing ) 全矩阵颜色补偿

11 独特的数字化信号传递 (DSP) DSP 可提供精确的线性到对数信号的转换, 同时保证更好的线性及稳定性

12 BD 4 Color Dual Laser - Why?

13 BD 4 Color Dual Laser 疑问? 为何采用 PerCP and APC 染料? 荧光强度较弱 荧光灵敏度较低 PerCP 的光稳定性较差 较明显的光谱重叠 需要 立体 双激光激发 需要 时间延迟 电路 光谱重叠 Cross-talk 问题

14 BD 4 Color Dual Laser - 答案! 因为 BD 没有选择 没有特定的 tandem 染料 无 ECD or PC5 DuoCHROME 失败 - 只能以 PerCP 替代 PerCP v PE-Cy5(Pharmingen) - 无任何补充 BD 只可用 APC 和 PerCP 染料 BD 只能用双激光立体光路

15 BD 4 Color Dual Laser - 问题 试剂及硬件设计问题 APC 与 PerCP 有明显的光谱重叠 事实上,PerCp 染料即可被 488nm 激发, 亦可被 633nm 激发 立体 光路系统 双激光激发

16 4 Color Dual Laser (488nm and 635nm) FITC/PE/APC/PerCP PerCP with 488nm excitation PerCP with 635nm excitation

17 BD 4 Color Dual Laser - 问题 存在 试剂及硬件问题 光路设计问题 FL3 及 FL4 收集的效率仍需进行 APC 与 PerCP (FL3-FL4 FL4 & FL4-FL3) FL3) 之间的颜色补偿 PerCP 即可被 488nm 激发, 亦可被 633nm 激发 光谱重叠 Cross-talk 问题粘连细胞

18 BD 4 Color Dual Laser - The Issues 试剂及硬件设计问题 光路设计中的光谱重叠 Cross-talk 不能将 PerCP (635) v PerCP (488) 进行补偿 粘连颗粒 当 What if a bright PerCP +ve in 635nm beam when a dim PerCP -ve in 488nm beam? 表达较弱的到底是阴性还是阳性 这种情况是否会对最终结果有影响 表达较弱的到底是阴性还是性??

19 BD 4 Color Dual Laser - Summary 严重的光谱重叠 立体 双激光激发 更复杂的设计 时间延迟电路 校准的变化 光路系统 无效收集 光谱重叠 Cross-talk 粘连颗粒

20 5 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5/PC7

21 6 Color Dual Laser (Co- linear) FITC/PE/ECD/APC/PC5.5/PC7

22 4 Color Single Laser - Summary 所选的试剂 FITC, PE, ECD and PC5 其他复合染料 PC5.5 and PC7 硬件要求 光路设计简单的设计并平行的荧光检测器 数字化流式细胞仪利用软件进行全矩阵颜色补偿线性及稳定性

23 Four Color Analysis: Single Laser System - Why? Because we can.. Reagent Expertise Hardware Expertise

24 Multi-Color Analysis: Reagent Requirements 多种荧光染料标记的试剂荧光染料的光稳定性高荧光灵敏性低的非特异性结合利用仪器检测时, 发射光谱尽可能分开

25 Common Fluorochromes for 488nm and 633nm Excitation ti Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Phycoerythrin (PE) Allophycocyanin (APC) Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5)

26 Common Fluorochromes for 488nm and 633nm Excitation ti Spectral Separation of Common Fluorochromes

27 Tandem Dye Technology 染料生产的专利技术 增加能量传递效率 减低游离 PE 染料发射光要 亮 染料的光学稳定性完善试剂的专一性

28 Patented Tandem Dye Technology High Emitted Fluorescence Intensity Experimental Design - Objective 直接比较不同荧光染料的 MFI( 平均荧光强度 ) 测定所比较的荧光染料的灵敏度

29 Patented Tandem Dye Technology High Emitted Fluorescence Intensity Experimental Design - Procedure 比较不同荧光标记的 CD8 的荧光 利用与 XL 滤片设置相同的具有双激光的 ELITE 检测采用推荐方法进行淋巴细胞染色采用两种全血溶血方法检测器电压设置标准, 将阴性细胞群位置置于第一个刻度 比较阳性细胞群的 MFI( 平均荧光强度 )

30 Comparison of MFI for CD8 with Q-Prep / ImmunoPrep uo Reagent System CD8-FITC CD8-PE CD8-ECD CD8-PC5 CD8-PerCP CD8-APC PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE

31 Comparison of MFI for CD8 with OptiLyse Reagent System CD8-FITC CD8-PE CD8-ECD CD8-PC5 CD8-PerCP CD8-APC PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE

32 Tandem Dye Technology Photostability t of Dye Fluore escence Int tensity Units 100 Free PE Emission 80 PC5 Emission Free PE Emission ECD Emission Time (min) Exposed to Light

33 Tandem Dye Technology Optimized Otii dr Reagent tf Formulation lti Pre-Formulation Post-Formulation ti Monocyte binding of Cy5

34 Tandem Dye Technology Optimized Reagent Formulation o - Vendor Comparison Coulter Sigma Caltag BD PerCP Pharmingen Dako

35 Reagent Expertise - Summary 多种荧光染料标记的试剂荧光染料的光稳定性高荧光灵敏性低的非特异性结合

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