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1 BD FACSCalibur GLP 应用培训 内容安排 BDB HIV Fang Chen Ph.D 认识流式细胞仪 认识流式细胞仪 什么是流式细胞术流式细胞术的定义 流式细胞仪的特点 流式细胞仪就是测量染色细胞标记物荧光强度的分析仪 认识流式细胞仪 流式细胞术能够提供的信息 : 相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 染色细胞的相对荧光强度 认识流式细胞仪 BD 公司 BD 公司于 1897 年在纽约创立的, 现位居美国 500 强 1973 年 BD 推出世界第一台流式细胞仪 FACS I (Fluorescence Activated Cell Sorter) 市场占有率 : 全球 75%, 中国 70%, 中国 CDC 90% 以上 1

2 认识流式细胞仪 BD 公司 CD4 检测领域 - 完善强大的产品线 BD 公司流式细胞仪分为二大类 : 临床型 (Clinic) 科研型 (Research) CD4 检测 - 设立全球范围的检测标准 BD CD4 检测的黄金标准! 认识流式细胞仪 FACSCalibur BD FACSCalibur 最经典的流式细胞仪 双激光 (488nm,635nm) 六参数 自动进样装机 ( 可选 ) 认识流式细胞仪 FACSCalibur BD FACSCalibur 的组成 液流系统引导和聚焦细胞以供检测 光学系统发射和收集光信号 电子系统将光信号转化为电子信号, 数字化, 传到计算机 2

3 液流系统 鞘液 样本流 压力系统 流动室 液流系统 流动室要点 : 经常使用, 定时清洗维护 ( 很重要 ) 光学系统 激发系统 : 激光器 一系列用以聚焦引导光路的棱镜 光学收集系统 : 一系列的光收集镜用以收集光信号 一系列的反射镜和透镜用以将一定范围波长的光信号引导到相应的收集系统 光学系统 两种信号,6 个参数 FSC 散射光信号 FL1 FL2 FL3 FL4 荧光信号 光学系统 光学系统 携带有不同荧光染料的细胞通过激光激发, 产生不同的荧光信号 Incident Light Source FSC FSC( 前向角散射光 ) 代表细胞大小 ( 侧向角散射光 ) 代表细胞粒度 3

4 电子系统 认识流式细胞仪 总结 将光学信号转换成电子信号 FL2 Photon In Parameter FL1 FL2 FL3 PMT Power Supply Levels Volts Voltage In Signal Out LIN LOG LOG Voltage Pulses FL1 FL2 FL3 Data Proce ssor FSC FL1 FSC FL1 FL2 FL3 认识流式细胞仪 读懂散点图 认识流式细胞仪 读懂散点图 人外周全血经过红细胞裂解后 CD3,CD19 双荧光染色 小测验 CD19 单阳性细胞 CD3 单阳性细胞 1. 流式细胞仪由哪几部分组成 2. 下图中 1-3 分别代表什么细胞 FSC 1 2 4

5 什么是 CD4 细胞 为什么检测 CD4 细胞 如何检测 淋巴细胞细胞分化 (Lymphocyte Differentiation) T 细胞 ( 细胞免疫 ) B 细胞 ( 体液免疫 ) CD(Cluster of differentiation) 血细胞表面的分化抗原, 是我们进行分型的依据 不同的淋巴细胞中的 CD 分子标记不同 : 淋巴细胞为 CD45 强阳性 T 淋巴细胞 (CD3 + ) B 淋巴细胞 (CD19 + ) 和 NK 细胞 (CD /CD3 - ) CD 分子是免疫分型的重要依据 CD19 根据 CD4 CD8 的表达不同,T 淋巴细胞可分为 : T Helper Cell, 即 CD4 细胞 (CD3 + CD4 + ) T Cytotoxic Cell, 即 CD8 细胞 (CD3 + CD8 + ) 5

6 CD4 细胞是 HIV 病毒的主要攻击对象 CD4 细胞数量与病程紧密相关 CD4/CD8 细胞比值的意义 CD4/CD8 比值升高 : 自身免疫性疾病如类风湿性关节炎 SLE 等 CD4/CD8 比值降低 : 病毒感染 恶性肿瘤 再生障碍性贫血等 HIV 感染病人的一个重要监测指标 如何用流式细胞仪检测相应的特定细胞? 第一步 : 确定待测细胞的特征 CD# CD45 CD3 CD4 CD8 CD19 CD16,56 特异性白细胞 T 淋巴细胞 T 辅助细胞 T 抑制细胞 B 细胞 NK 细胞 第二步 : 确定钓鱼的鱼饵 ( 抗体 ) 特定抗原 特异性抗体 试剂的选择 试剂 CD4/CD8/CD3 CD3/CD4/CD45 抗原 单克隆抗体 用途 成人 儿童 (<5ys) 淋巴细胞 T 淋巴细胞 CD4 细胞 CD8 细胞 优势 CD4/CD8 细胞数比值精确 能计算出 CD4/CD45 比值 6

7 第三步 : 使得结合抗体的细胞得以检测 将荧光素标记在抗体上 标记上不同荧光单克隆抗体的 T 细胞亚群 T C CD3 CD8 T CD3 T H CD3 CD4 双荧光染色散点图分析 CD4 细胞检测流式检测流程回顾 CD8 PE CD4 FITC 了解软件和试剂 了解软件和试剂 系统和软件 MacPro 工作站 BD FACStation Software for Mac OSX V ( 集成 BD INIT,CellQuest Pro,FACSComp) MultiSET HLA-B27 CBA ModFit 3.2 7

8 了解软件和试剂 CD4 细胞检测中需要用到的两款软件 FACSComp MultiSET 使用 FACSComp 软件进行 BD FACSCalibur 仪器质量控制 准备 Calibrite beads 设置 FACSComp 软件 调节 PMT 电压 调节补偿 灵敏度检测 优化软件自动完成, 无需人为调节! BD FACSComp Report FACSComp 没有通过怎么办? FSC 没有通过 : 原因 :1. 由于仪器的管路没有清洗干净 2. 使用的鞘液杂质太多 3. 校准品失效 4. 仪器故障措施 :1. 用蒸馏水高速运行仪器 10 分钟 -30 分钟 2. 过滤鞘液 3. 使用新的校准品 4. 致电 BD 工程师 FACSComp 没有通过怎么办? 没有通过 : 原因 :1. 没有找到噪音峰 2. 校准品失效 3. 仪器故障措施 :1. 重复进行 FACSComp 2. 更换校准品 3. 致电 BD 工程师 FACSComp 没有通过怎么办? 荧光通道没有通过 : 原因 :1. 校准品失效 2. 仪器故障措施 :1. 更换校准品 2. 致电 BD 工程师 8

9 用 Multiset 软件和绝对计数管检测分析 CD4 细胞 移液器的校准, 反向加样方法 TriTEST 三色试剂的选择 :CD4/CD8/CD3, CD3/CD4/CD45 完成溶血后免洗的实验步骤 绝对计数管的使用 TruCOUNT 管绝对计数原理 TruCOUNT 管中预先加有准确定量的 Beads, 每批 TruCOUNT 管的 Beads 含量一致 样本与 beads 充分混合, 同时检测 ; 通过如下公式计算各细胞亚群绝对值 : 细胞获取数 Beads 总量细胞 / L= Beads 获取数样本量 使用免洗技术, 溶血后直接上机检测标本 操作简便, 绝对计数结果的重复性好 TruCOUNT 管绝对计数原理 举例 : 微球 : 100 个样本量 : 50ul 获取细胞 : 200 个获取微球 : 50 个 实验样本制备 两个 15 分钟 每 ul 血液含有细胞数目 =? 52 使用 Multiset 软件检测分析数据 Multiset 软件设置 输入样本和实验信息 获取数据 手动设门调整 ( 如有需要 ) 软件检测原理 以 CD3 或者 CD45 所在的荧光通道设定阈值, 去除血标本中碎片等干扰 由 CD3 或者 CD45/ 点图设定淋巴细胞门或者 T 淋巴细胞门 在相应的荧光点图上预设 Attractor, 由 Attractor 自动找到细胞亚群 由软件根据计数微球自动计算每一种细胞群体的数量, 并给出结果 9

10 何时需要进行手动设门? 当细胞群体的位置出现变动时, 软件无法正确圈定细胞, 出现门的偏移或者错误时, 我们需要人工调整门的位置 4 色试剂 内容安排 实际操作 开机, 关机程序 Mac OS 的使用 样品制备 FACSComp 使用 MultiSET 软件的使用 ( 包括手动设门 ) 仪器的清洗维护 BD FACSCalibur 开机程序 打开仪器电源打开计算机电源向鞘液筒中加入足够的鞘液清空废液检查气泡 BD FACSCalibur 关机程序 日常清洗程序 次氯酸清洗 蒸馏水清洗 关闭电脑 关闭流式细胞仪 10

11 常见问题分析 1.RUN 灯呈现橙色可能原因 : 仪器刚刚打开, 没有预热好压力开关没有打开鞘液箱的盖子没有拧紧上样管有裂缝 RUN 灯有故障仪器压力系统故障 常见问题分析 2. 检测不到细胞 : 原因 : 管路堵塞压力系统故障是否加载检测条件 常见问题分析 3. 结果普遍偏高 ( 获取微球数量少于 1000 个 ) 原因 : 计数管故障仪器噪音信号大 ( 加大阈值 ) 检测条件不合适 常见问题分析 3. 细胞图形不稳定, 飘动 原因 : 液路阀故障 流式细胞仪在线课堂 Thanks! 11

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