第 2 期王远航等 :Becn1 通过线粒体凋亡途径参与调控肺癌细胞的凋亡过程引言肺癌 (lungcancer,lc) 是当今社会对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一, 已经成为世界极为关注的公共卫生问题据世界卫生组织下属的国际癌症研究属 (InternationalAgency

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1 第 26 卷第 2 期 2017 年 4 月激光生物学报 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.26No.2 Apr.2017 doi: /j.isn Becn1 通过线粒体凋亡途径参与调控肺癌细胞的凋亡过程王远航, 夏盛源, 张岚 ( 广州医科大学生命科学学院, 广东广州 ) 摘要 : 自噬相关基因 Becn1 在肺癌等多种肿瘤中处于低表达状态, 具有抑制肿瘤发生发展的作用目前, 已有研究发现 Becn1 可以通过自噬途径参与调控肺癌的发生发展过程, 且细胞自噬还与凋亡关系密切但是, Becn1 在调控肺癌发生发展过程中涉及的凋亡过程和相关机制尚未完全阐明本研究选用肺癌细胞系 PC9 和 A549, 建立 Becn1 高表达的肺癌细胞模型, 采用蛋白质免疫共沉淀实验和 GFP BECLIN1 DsRed Mit 荧光共定位实验首次证实了 Becn1 可通过线粒体途径参与调控肺癌细胞的凋亡过程关键词 : 肺癌 ;Becn1; 自噬 ; 线粒体凋亡中图分类号 :Q291 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) Becn1RegulatesCelApoptosisofLungCancerby MitochondrialApoptosisPathway WANGYuanhang,XIAShengyuan,ZHANGLan (GMU GIBHJointSchoolofLifeSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,Guangdong,China) Abstract:AutophagyrelatedgeneBecn1islowexpresioninmanytumors,suchaslungcancer,whichcaninhibitthe occurenceanddevelopmentoftumors.atpresent,it sreportedthatbecn1canregulatetheoccurenceanddevelop mentoflungcancerbyautophagicpathwayandautophagyiscloselyrelatedtoapoptosis,butthemechanism hasnot beenfulyelucidated.inthisstudy,pc9anda549lungcancercellineswereselectedandestablishedthemodelswith highbecn1expresion.theco immunoprecipitationandgfp BECLIN1andDsRed Mitfluorescenceco localizationex perimentswereusedtoconfirmthatbecn1couldregulatecelapoptosisinlungcancerthroughmitochondrialpathway. Keywords:lungcancer;Becn1;autophagy;mitochondrialapoptosis 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 广东省自然科学基金项目 (2016A ); 广州市教育局广州市属高校羊城学者科研项目 (12A010D); 广州市科技计划项目 ( ) 作者简介 : 王远航, 女, 汉族, 黑龙江齐齐哈尔人, 硕士, 研究方向为分子流行病学 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 ) @qq.com 通讯作者 : 张岚, 博士, 副教授, 主要从事肿瘤细胞自噬等方面的研究 ( 电话 ) ;( 电子邮箱 )zhang lan_gzhmu@163.com

2 第 2 期王远航等 :Becn1 通过线粒体凋亡途径参与调控肺癌细胞的凋亡过程引言肺癌 (lungcancer,lc) 是当今社会对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一, 已经成为世界极为关注的公共卫生问题据世界卫生组织下属的国际癌症研究属 (InternationalAgencyforResearchon Cancer,IARC) 最新统计数据显示,2012 年全球肺癌新发病例达 180 万人, 占所有肿瘤发病人数的 12.9%; 肺癌导致的死亡人数达 159 万人, 占全部肿瘤相关死亡人数的 19.4% [1], 肺癌已成为全球发病率和死亡率最高的肿瘤大量流行病学研究结果表明, 环境因素如吸烟空气污染 ; 遗传因素如肿瘤家族史 ; 职业化学毒物暴露如电离辐射等均是影响肺癌发生发展的主要危险因素 [2,3] 在过去的几十年中, 随着对肺癌新治疗靶点研究的不断深入, 肺癌的临床个体化治疗方案已广泛应用 [4], 这说明目前我们已经对肺癌发生发展过程中涉及的生物学机制的认识有了巨大的提升但是, 肺癌的预后依然较差, 其 5 年生存率仅约为 15% [5] 因此, 明确肺癌发生发展过程中的分子机制和途径, 寻找有效的生物标志物是取得更好的治疗效果和预后的关键自噬几乎存在于所有的真核细胞中, 是一种多阶段的溶酶体降解途径, 它可以清除长寿蛋白, 并将受损的细胞器转化为基本的生物分子, 然后再循环回细胞液中, 为 DNA RNA 蛋白质及 ATP 的合成提供核苷酸氨基酸和游离脂肪酸等生物原料 [6] 研究已证实自噬可以促进细胞死亡 [7] 自从 1962 年 Ashford 和 Porter 在电镜下发现自噬过程以来 [8], 自噬相关基因 Becn1 及其表达蛋白 BECLIN1 在自噬过程中发挥的重要生物学作用逐渐被人们所认识 Becn1 编码的蛋白 BECLIN1 是由 450 个氨基酸构成的线性序列, 其蛋白分子量约为 60kDa BECLIN1 是调控自噬的关键蛋白, 它作为自噬信号起始复合物的一个重要组成部分 (PI3K 激酶,BECLIN1 和 p150 蛋白 ), 可以直接通过触发蛋白质的级联反应参与自噬溶酶体的形成 BECLIN1 包括 3 个主要的结构域, 且各自具有不同的功能, 目前研究已经证实肺癌中 Becn1 表达量增加会提高细胞的自噬水平此外, 有研究发现 Becn1 也可通过凋亡途径调节肺癌细胞的死亡过程, 这可能与 BECLIN1 的 BH3 结构域 (BCL 2 同源结构域 ) 有关, 它能够与抗凋亡家族成员 BCL 2 等蛋白结合 [9 11], 形成 BECLIN1 BCL 2 复合物参与调控细胞凋亡过程 [12] 但是, 其涉及的具体过程和机制尚未完全阐明线粒体凋亡途径作为细胞凋亡的主要途径之一, 目前已经成为细胞凋亡相关研究的热点 [13] 研究发现, 各种凋亡刺激信号通过 BH3 only 蛋白引起 BCL 2 BAX 等凋亡相关蛋白移位到线粒体外膜并多聚化, 形成膜通道, 刺激线粒体释放细胞色素 C(CytC) 和 Smac(secondmitochondrial derivedactivatorofcaspase), CytC 通过 Apaf 1 因子的多聚化与胱天蛋白酶 caspas es 9 形成凋亡小体, 导致下游胱天蛋白酶的级联反应而凋亡蛋白抑制因子 (IAP) 和 Smac 通过抑制和促进胱天蛋白酶的级联反应来调控细胞凋亡研究发现, 自噬与凋亡关系密切 [14] 由于相关研究发现 Becn1 既可以参与细胞的自噬过程, 又可以参与细胞的凋亡过程, 因此, 我们猜测肺癌中 Becn1 发挥的促凋亡作用很有可能是通过线粒体凋亡途径完成的本研究旨在阐明自噬相关基因 Becn1 在调控肺癌发生发展过程中涉及的凋亡过程, 探讨 Becn1 是否可以通过自噬和凋亡途径共同参与调控肺癌的发生发展过程, 为肺癌的预防和治疗提供一种新的策略 1 材料与方法 1.1 细胞系人肺癌细胞系 PC9 和 A549 来自广州医科大学分子流行病学实验室 1.2 试剂及仪器胎牛血清 (FBS)(GIBCO),RPMI1640 培养基 (GIBCO), 青霉素链霉素抗生素 ( 国奥生物 ),opti MEM 培养基 (GIBCO),lipofectamine3000Reagent(In vitrogen), 兔抗 BECLIN1 抗体 (CST,No.3495), 鼠抗 BECLIN1 抗体 (abcam,ab114071), 兔抗 BCL 2 抗体 (CST,No.2872), 蛋白质免疫共沉淀试剂盒 (Pierce, No.88804),GFP BECLIN1 质粒 ( 和元生物技术有限公司 ),DsRed Mit 质粒 ( 和元生物技术有限公司 ), 电泳仪 (BIO RED) 及荧光显微镜 (Nikon) 1.3 细胞培养 PC9 和 A549 细胞用含 10%FBS 及 100U/mL 青霉素,100mg/mL 链霉素的 RPMI1640 培养基放在 37,5%CO 2 的培养箱中进行培养, 次日换液细胞汇合度达到 80% 左右时进行传代, 根据不同的实验目的将细胞接种在不同规格的培养皿中 1.4 细胞瞬时转染转染前一天将细胞接种于 6 孔板或共聚焦小皿中, 每孔个细胞, 每孔加入 1mL 含 10%

3 140 激光生物学报第 26 卷 FBS 的 RPMI1640 培养基, 置于 37,5% CO 2 的培养箱中培养过夜实验前 1h 弃去 6 孔板或小皿中的培养液, 每孔加入 1mLOpti MEM 培养基放置于培养箱中向含有 125μLOpti MEM 培养基的 EP 管中加入 Lipofectamine3000 试剂 3.75μL 或 7.5μL, 配制成 A 液用 125μLOpti MEM 培养基稀释待转染的质粒 DNA1μg, 然后加入 P3000 试剂 5μL, 混匀制备 B 液将 B 混合液缓慢加入 A 混合液中, 室温静置孵育 5min, 期间轻敲管壁 2 3 次使液体充分混匀将制备的 DNA 脂质体复合物加入到待转染的细胞培养基中培养 6 8h 后更换含血清的完全培养基, 继续培养 24 48h 收获细胞, 进行后续的细胞功能实验 1.5 GFP BECLIN1 和 DsRed Mit 共定位实验将 GFP BECLIN1 和 DsRed Mit 质粒共转染至 PC9 和 A549 细胞中,24h 后用荧光显微镜实时观察对照组和实验组的肺癌细胞中两种荧光蛋白的定位情况 1.6 蛋白质免疫共沉淀实验裂解细胞去除培养基, 预冷 PBS 洗细胞 5 次, 吸干 PBS 后加入裂解液 (400μL/P100,2 皿 ),4 裂解 30min 后, 细胞刮刮下裂解液, 超声破碎仪破碎细胞,14000 r/min 离心 15min, 去除沉淀注 : 裂解液中添加蛋白酶及磷酸酶抑制剂, 整个步骤在冰上操作孵育蛋白质免疫共沉淀 (IP) 抗体将蛋白分为 3 份取一份 (100μL) 置 -20 保存 (IP), 另外两份 ( 各 400μL) 分别加入 IgG( ) 及目的蛋白抗体 (+)(4μg,1 100), 封口膜封口后置 4 冷库旋转摇床过夜沉淀取出 4 保存的琼脂糖珠, 上下颠倒摇匀后, 快速用剪口枪头取 100μL(50μL/ 样 ),1000r/min, 4 离心 3min, 吸弃上清加入 1mLIPbufer 摇匀后,1000r/min,4 离心 3min, 吸弃上清, 重复清洗两次注 : 珠子容易下沉, 摇匀后应快速吸取加入 50μL( 与 beads 等体积 )IPbufer 混匀珠子, 取 50μL 加入孵育 IP 抗体后的样本中, 室温摇 2h 洗涤取下摇床中 EP 管,2000r/min,4 离心 3.5 min, 去除上清后加入 1mLIPbufer, 清洗 6 8 次, 最后一次洗涤加入与原始蛋白等体积的 IPbufer, 混匀蛋白质免疫印迹 (WB) 实验取 20μL 沉淀, 加入 5μL5xLoadingbufer, 行 WB 实验 ( 即 5% 沉淀 ) 2 结果 2.1 Becn1 通过线粒体途径诱导肺癌细胞凋亡由于 DsRed Mit 是定位在线粒体区域的一段具有红色荧光标记的蛋白, 可以通过检测细胞发生凋亡时 GFP BECLIN1 与 DsRed Mit 荧光蛋白定位的区域进而判断 Becn1 调控肺癌细胞凋亡的途径 [15] 因此, 我们在 PC9 和 A549 细胞中共同转染了 GFP BE CLIN1 和 DsRed Mit 两种质粒, 并且用促凋亡试剂 EBSS 对 PC9 和 A549 细胞进行处理 (treatment 组 ), 利用荧光显微镜实时观察肺癌细胞发生凋亡现象时 GFP BECLIN1 发生点聚集现象的主要区域如图 1 所示, 对照组 (control 组 ) 细胞状态良好时,PC9 和 A549 细胞中 GFP BECLIN1 的绿色荧光分布均匀, 未出现点聚集现象 ; 当诱导 PC9 和 A549 细胞发生凋亡后 (treatment 组 ),GFP BECLIN1 的绿色荧光出现点聚集现象, 并且出现点聚集区域与 DsRed Mit 的红色荧光区域定位大体相同该实验结果说明 Becn1 主要通过线粒体途径调控肺癌细胞的凋亡过程 2.2 BECLIN1/BCL 2 蛋白质免疫共沉淀实验为了探索肺癌细胞中 Becn1 发挥凋亡作用的相关机制, 我们进行 BECLIN1/BCL 2 蛋白质免疫共沉淀实验, 检测 Becn1 过表达后, 表达量上调的 BEC LIN1 蛋白是否影响 BECLIN1 BCL 2 复合物表达量的变化如图 2 所示, 蛋白质免疫共沉淀实验并未发现对照组和实验组的 PC9 及 A549 细胞中 BECLIN1 BCL 2 复合物的结合量有明显差异, 因此, 本实验结果说明肺癌细胞中 Becn1 并不是通过调控 BECLIN1 结合 BCL 2 的方式影响肺癌细胞的凋亡水平 3 讨论肺癌是世界上最常见的肿瘤之一, 研究发现, 影响肺癌治疗效果的主要原因是细胞死亡信号的失调 [16,17] 许多研究者已经证明凋亡信号失调不仅会导致细胞异常增殖, 而且会导致机体对细胞毒性治疗的不敏感性事实上, 在过去十几年间, 利用各种活化抗体增强细胞凋亡的方法已在肺癌的治疗方面取得成效, 肽和小分子可以恢复肿瘤细胞的凋亡机制, 从而触发细胞死亡或使肿瘤细胞对化疗和放疗更加敏感 [18] 目前, 随着肺癌多元模式综合治疗方法的兴起, 肺癌的预后情况有所改善, 但它仍然是导致癌症相关疾病死亡的首要原因

2 Up regulatedbecn1didnotafecttheexpresionlevelsofbeclin1 BCL 2compoundinPC9and A549cellines 肿瘤细胞中自噬水平的改变会导致肿瘤细胞内部发生一系列的生理变化哺乳动物中 Becn1 基因是酵母自噬基因 atg6/vps30 的同系物,

4 第 2 期王远航等 :Becn1 通过线粒体凋亡途径参与调控肺癌细胞的凋亡过程 141 图 1 肺癌细胞凋亡过程中 BECLIN1 与线粒体共定位 Fig.1 Co localizationofbeclin1andmitochondriaduringapoptosisoflungcancercels 图 2 Becn1 上调不影响 PC9 与 A549 细胞系中 BECLIN1 BCL 2 复合物表达水平 Fig.2 Up regulatedbecn1didnotafecttheexpresionlevelsofbeclin1 BCL 2compoundinPC9and A549cellines 肿瘤细胞中自噬水平的改变会导致肿瘤细胞内部发生一系列的生理变化哺乳动物中 Becn1 基因是酵母自噬基因 atg6/vps30 的同系物, 也是参与调控自噬水平的特异性基因, 可翻译表达 BECLIN1 蛋白 BECLIN1 是 PI3K 复合物的组成部分, 参与自噬泡的形成过程 [19,20] 研究结果表明,Becn1 可通过溶酶体降解途径抑制肿瘤的发生发展, 最近研究证实 Becn1 在肺癌组织中呈低表达状态, 能够抑制肺癌的发生发展过程研究发现, 各种凋亡刺激信号可通过 BH3 only 诱导 BCL 2 BAX 等凋亡相关蛋白在线粒体中发挥调控细胞凋亡的作用 BECLIN1 与 BCL 2 家族蛋白结构相似, 都具有 BH3 结构域, 因此我们猜测 Becn1 可能在线粒体中参与调控促肺癌细胞凋亡的作用

5 142 激光生物学报第 26 卷为了验证上述假设, 我们利用 GFP BECLIN1 和 DsRed Mit 共转染实验观察肺癌细胞发生凋亡过程中 Becn1 发挥作用的主要场所, 实验结果证实诱导肺癌细胞发生凋亡后 GFP BECLIN1 的绿色荧光出现点聚集现象, 并且出现点聚集区域与 DsRed Mit 的红色荧光区域定位大体相同说明 Becn1 促进肺癌细胞发生凋亡的过程主要是 BECLIN1 蛋白通过线粒体途径完成的此外, 大量研究证实肿瘤细胞中同时存在细胞自噬和凋亡过程,BCL 2 不仅是一种抗凋亡蛋白, 而且 BCL 2 能与 BECLIN1 通过 BH3 结构域相互作用, 形成 BECLIN1 BCL 2 复合物参与调控细胞生命活动因此, 我们猜测肺癌中 BECLIN1 可能通过和 BCL 2 相互作用从而发挥其促进肺癌细胞凋亡的作用为了阐明肺癌细胞在线粒体凋亡过程中 BEC LIN1 与 BCL 2 的关系, 我们进行了蛋白质免疫共沉淀实验结果发现 Becn1 表达水平上调后, 实验组和对照组相比,PC9 及 A549 细胞中 BECLIN1 BCL 2 复合物的结合量没有明显差异, 这说明肺癌中 BEC LIN1 蛋白进入线粒体区域调控细胞凋亡时, 不是通过结合 BCL 2 的方式, 很可能是与 BAX 等其他凋亡相关蛋白相互作用从而启动凋亡信号, 发挥促细胞凋亡的作用综上所述, 本研究发现在肺癌发展过程中 Becn1 既可以通过自噬途径又可以通过凋亡途径发挥其重要的生物学作用,Becn1 主要是通过线粒体途径参与调控肺癌细胞的凋亡过程, 且这个过程不涉及到 BE CLIN1 与 BCL 2 的结合但是 Becn1 参与调控肺癌细胞线粒体凋亡过程的具体分子机制及两者间的联系尚未知晓, 还有待进一步研究证实参考文献 [1] SIEGELRL,MILLERKD,JEMALA.Cancerstatistics,2016 [J].CACancerJClin,2016,66(1):7 30. [2] MILLSCA,PORTERM M.Tobaccosmoking,motorexhaust fumes,andgeneralairpolutioninrelationtolungcancerinci dence[j].cancerres,1957,17(10): [3] ZHAOJ,SHIX,CASTRANOVAV,etal.Occupationaltoxi cologyofnickelandnickelcompounds[j].jenvironpathol ToxicolOncol,2009,28(3): [4] RAMALINGAM SS,OWONIKOKOTK,KHURIFR.Lung cancer:newbiologicalinsightsandrecenttherapeuticadvances [J].CACancerJClin,2011,61(2): [5] SIEGELR,MAJ,ZOUZ,etal.Cancerstatistics,2014[J]. CACancerJClin,2014,64(1):9 29. [6] KLIONSKY D J.Autophagy:from phenomenologytomolecular understandinginlesthanadecade[j].natrevmolcelbiol, 2007,8(11): [7] 邹争志, 聂培培, 倪艺榕, 等. 硫链丝菌素诱导非小细胞肺癌细胞自噬性死亡 [J]. 激光生物学报,2014,23(1): ZOUZhengzhi,NIEPeipei,NIYirong,etal.Thiostreptonin ducesautophagicceldeathinnon smal cellungcancercels [J].ActaLaserBiolSinica,2014,23(1): [8] ASHFORDTP,PORTERKR.Cytoplasmiccomponentsinhe paticcellysosomes[j].jcelbiol,1962,12(12): [9] ADI HARELS,ERLICH S,SCHMUKLERE,etal.Beclin1 selfasociationisindependentofautophagyinductionbyamino aciddeprivationandrapamycintreatment[j].jcelbiochem, 2010,110(5): [10] NOBLECG,DONG JM,MANSER E,etal.Bcl xland UVRAGcauseamonomer dimerswitchinbeclin1[j].jbiol Chem,2008,283(38): [11] SHICS,KEHRLJH.TRAF6andA20regulatelysine63 linkedubiquitinationofbeclin 1tocontrolTLR4 inducedauto phagy[j].scisignal,2010,3(123):ra42. [12] MAIURIM C,CRIOLLOA,TASDEMIRE,etal.BH3 only proteinsandbh3mimeticsinduceautophagybycompetitively disruptingtheinteractionbetweenbeclin1andbcl 2/Bcl XL [J].Autophagy,2007,3(4): [13] ZHANGL,JIQ,NIZH,etal.Prohibitininducesapoptosisin BGC823gastriccancercelsthroughthemitochondrialpathway [J].AsianPacJCancerPrev,2012,13(8): [14] NAKAHIRAK,HASPELJA,RATHINAMVA,etal.Auto phagyproteinsregulateinnateimmuneresponsesbyinhibiting thereleaseofmitochondrialdnamediatedbythenalp3in flammasome[j].natimmunol,2011,12(3): [15] 刘镭, 邢达, 陈同生, 等. 利用荧光探针 DsRed Mit 的细胞凋亡形态学研究 [J]. 激光生物学报,2006,15(3): LIUL,XINGD,CHENGTS,etal.Morphologicalresearchof celapoptosisbydsred Mitopticalprobe[J].ActaLaserBiol Sinica,2006,15(3): [16] PLATIJ,BUCURO,KHOSRAVI FARR.Apoptoticcelsig nalingin cancerprogresion and therapy[j]. IntegrBiol (Camb),2011,3(4): [17] MORETTIL,ATTIAA,KIM KW,etal.Crostalkbetween Bak/BaxandmTORsignalingregulatesradiation inducedauto phagy[j].autophagy,2007,3(2): [18] YOULERJ,STRASSERA.TheBCL 2proteinfamily:oppo singactivitiesthatmediateceldeath[j].natrevmolcel Biol,2008,9(1): [19] FUJIWARAN,USUIT,OHAMAT,etal.RegulationofBec lin1proteinphosphorylationandautophagybyproteinphospha tase2a (PP2A) and death asociated protein kinase 3 (DAPK3) [J]. J Biol Chem, 2016, 291 (20): [20] WANGJ.Beclin1bridgesautophagy,apoptosisanddiferenti ation[j].autophagy,2008,4(7):

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