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岸乐
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1 第 39 卷第 4 期 2018 年 8 月同济大学学报 ( 医学版 ) JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE) Vol 39 No 4 Aug doi: / j 基础研究苦参碱通过 P38 通路调节 H2AX 磷酸化抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移赵淑婷, 雷蕾, 程静新 ( 同济大学附属东方医院妇产科, 上海 ) 摘要目的探讨苦参碱对宫颈癌细胞增殖凋亡迁移的影响及其可能的分子机制方法不同浓度苦参碱作用于宫颈癌细胞, 通过 CCK8 法,EdU 法流式细胞术 Transwell 实验划痕实验检测细胞的增殖凋亡迁移能力利用 Western 印迹法检测苦参碱对 H2AX 磷酸化蛋白 ( 即 γh2ax) P38 磷酸化蛋白 ( 即 pp38) 水平的影响通过干扰 H2AX(Ser139) 位点的磷酸化, 检测苦参碱对宫颈癌细胞增殖迁移的影响通过干扰 P38 磷酸化, 检测苦参碱对 H2AX 磷酸化的影响结果苦参碱对宫颈癌细胞体外增殖具有显著抑制作用 ( P<0 05), 且呈药物浓度依赖性 ; 苦参碱显著提高细胞凋亡率, 而对迁移能力具有显著抑制作用 (P<0 05); 苦参碱能够显著促进 γh2ax 及 pp38 蛋白的表达 (P<0 05), 且呈浓度依赖性 H2AX( Ser139) 位点的磷酸化是苦参碱发挥抑增殖和迁移的作用位点苦参碱通过 P38 通路调控 H2AX(Ser139) 位点的磷酸化结论苦参碱抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移, 诱导细胞凋亡, 可能是通过调控 P38 通路使 H2AX(Ser139) 位点磷酸化发挥对宫颈癌的抑癌作用关键词苦参碱 ; 宫颈癌 ; 增殖 ; P38; H2AX 基因中图分类号 R711 文献标志码 A 文章编号 (2018) Matrine inhibits proliferation and migration of cervical cancer cells through H2AX phosphorylation regulated by P38 signaling pathway ZHAO Shu ting, LEI Lei, CHENG Jing xin ( Dept. of Obstetrics and Gynecology, East Hospital, Tongji University, Shanghai , China) Abstract Objective To investigate the effects of matrine on the proliferation and migration of cervical cancer cells and the underlying mechanisms. Methods CCK 8 assay, EdU assay, Transwell assay and wound healing assay were applied to examine the proliferation, apoptosis and migration of cervical cancer SiHa and C33A cells. Western blotting was applied to detect the expression of H2AX and P38 in cervical cancer cells. CCK8 and Transwell assay were used to detect the effect of matrine on the cell proliferation and migration by interfering with H2AX phosphorylation. Western blot was used to detect the H2AX phosphorylation by interfering with P38 phosphorylation. Results Matrine suppressed the proliferation(p<0 05), induced apoptosis and inhibited the migration of cervical cancer cells(p<0 05). Further investigation discovered that matrine significantly induced the phosphorylation of the H2AX and P38 in a dose dependent manner ( P < 0 05). Matrine inhibited proliferation and migration by phosphorylation of H2AX ( Ser139) site. Matrine regulated phosphorylation of H2AX 22 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 作者简介 : 赵淑婷 (1990 ), 女, 硕士研究生.E mail: zhaoshuting2015@ 163.com 通信作者 : 程静新.E mail: @ 163.com

2 第 4 期赵淑婷等 : 苦参碱通过 P38 通路调节 H2AX 磷酸化抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移 ( Ser139 ) site through the P38 pathway. Conclusion Matrine can inhibit cervical cancer cell proliferation and migration in vitro and this action may be related to P38 signaling pathway and phosphorylation of H2AX ( Ser139) site. Key words matrine; cervical cancer; proliferation; P38; H2AX 宫颈癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一, 且发病率逐年增高 [1] 即使在早期宫颈癌根治性切除术后, 仍大约有 20% ~ 30% 的患者复发 [2 3] 化疗广泛用于治疗复发或转移性疾病 [4] 苦参碱是一种从豆科槐属植物中提取的生物碱, 具有利尿抗病原体抗肝炎病毒等作用, 且无明显的毒性作用 [5 7] [8 10] 既往研究表明, 苦参碱可能是通过抑制癌细胞增殖诱导细胞凋亡和细胞自噬而对胃癌乳腺癌非小细胞肺癌和胰腺癌等发挥抗肿瘤作用其抗肿瘤作用极其复杂, 涉及对细胞增殖凋亡及周期的影响本研究旨在探讨苦参碱对宫颈癌细胞生长和转移的抑制作用与 H2AX 是否相关 1 材料与方法 1 1 主要试剂苦参碱 ( 分析纯 ) 购自上海源叶公司, 磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline, PBS) 购自美国 Corning 公司 ;Lipofectamine TM 3000 购自美国 Invitrogen 公司 ; Cell Counting Kit 8(CCK8) 试剂盒购自日本同仁公司 ; Cell Light EdU Apollo 567 In Vitro Imaging Kit 购自广州锐博公司 ; 细胞凋亡与坏死检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,Annexin V FITC 试剂盒 Transwell 小室购自美国 BD 公司 ; 鼠单克隆抗体 β actin 购自美国 Proteintech 公司 ; 兔单克隆抗体 H2AX P38 抗鼠 IgG 及抗兔 IgG 二抗购自英国 Abcam 公司 1 2 细胞系人宫颈癌 SiHa C33A 细胞购自中国科学院上海细胞库 SiHa 细胞用含有 10% 血清的 DMEM 培养液培养 ;C33A 细胞用含有 10% 血清的 MEM 培养液培养以上细胞置于 37,5% CO 2 饱和湿度下贴壁培养, 根据细胞生长状况 1 ~ 2 d 换液一次 1 3 方法 CCK8 试验将对数生长期细胞按 / 孔接种于 96 孔板, 贴壁后更换不同浓度苦参碱 (0 ~ 2 mg / ml) 培养基, 于 h 后按照 CCK8 说明书配制 CCK8 溶液, 在培养箱中温育 2 h, 用酶标仪测定 450 nm 处吸光度值 (A 450 ) EdU 法将个宫颈癌细胞接种于 96 孔板, 贴壁后更换培养基,24 h 后按 EdU 试剂盒说明配置溶液, 试剂 A 液孵育 2 h,4% 多聚甲醛固定, 甘氨酸脱色, 渗透剂孵育 Apollo 反应溶液避光室温孵育后 Hoechst33342 反应液避光室温孵育, 于荧光显微镜下观察流式细胞术将细胞种于 6 孔板培养 12 h 后, 更换正常及含 0 5 mg / ml 苦参碱的培养基, 作用 24 h 后的细胞, 用预冷 PBS 充分洗涤细胞 3 次, 按照 Annexin V FITC 试剂盒说明书配置溶液, 细胞用 195 μl 结合缓冲液和 5 μl Annexin V FITC 室温避光孵育 10 min, 然后加入 10 μl 碘化丙啶室温避光孵育 10 min, 上机检测细胞凋亡率细胞凋亡与坏死检测将个宫颈癌细胞接种于 6 孔板, 贴壁后更换不同浓度苦参碱培养基, 作用 24 h 后, 先加入 Hoechst33342 染液 4 避光孵育 30 min, 再加入碘化丙啶染液 4 避光孵育 30 min 进行双标记染色, 于荧光显微镜下观察细胞迁移试验在 Transwell 小室中加入 200 μl( 个 / ml) 不同处理后的无血清细胞悬液, 底部加入 600 μl 含 10% 血清的培养液置于 37 培养箱中孵育 24 h, 将小室置于 4% 多聚甲醛溶液中固定后结晶紫染色,PBS 轻轻冲洗小室, 用棉棒将室顶细胞轻轻擦去, 晾干后于倒置显微镜观察, 随机取 3 个视野进行拍照, 统计细胞迁移率划痕实验将细胞以每孔密度接种于 6 孔板中, 待细胞贴壁长满后时用 10 μl 枪头垂直划一条直线, PBS 冲洗去除划下细胞, 更换含 ( mg / ml) 苦参碱的无血清的培养基, 放入 37 培养箱中培养, 用倒置显微镜下分别在 0 24 h 拍照 Western 印迹法检测干预后的细胞经预冷 PBS 漂洗后, 用 RIPA 裂解液处理后轻轻刮下细胞, 冰上反应 30 min 后超声并离心获得各组细胞总蛋 23

第３９卷同济大学学报医学版白ＢＣＡ法检测蛋白浓度与５ＳＤＳ蛋白上样缓冲２２白ＳＤＳＰＡＧＥ分离并转膜后用５脱脂牛奶封闭１ｈ化丙啶双染实验评估苦参碱对宫颈癌细胞凋亡形二抗１１００００室温孵育１ｈ进行ＥＣＬ反应利降低出现亮蓝色核染色质固缩染色体碎裂固缩溶液混合１００下变性８ｍｉｎ每孔上样３０ μｇ蛋苦参碱对

3 第３９卷同济大学学报医学版白ＢＣＡ法检测蛋白浓度与５ＳＤＳ蛋白上样缓冲２２白ＳＤＳＰＡＧＥ分离并转膜后用５脱脂牛奶封闭１ｈ化丙啶双染实验评估苦参碱对宫颈癌细胞凋亡形二抗１１００００室温孵育１ｈ进行ＥＣＬ反应利降低出现亮蓝色核染色质固缩染色体碎裂固缩溶液混合１００下变性８ｍｉｎ每孔上样３０ μｇ蛋苦参碱对ＳｉＨａＣ３３Ａ细胞凋亡的影响通过细胞凋亡与坏死检测Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２和碘后加入相应一抗１１０００４孵育过夜随后加入态的影响结果显示苦参碱作用后的细胞密度明显用ＩｍａｇｅＪ软件分析蛋白条带的细胞被染成亮蓝色或淡红色通过流式细胞术１４检测结果显示苦参碱诱导细胞凋亡率升高差异有统计学处理采用ＳＰＳＳ１７０统计软件进行统计分析所有数据均以ｘ±ｓ表示两组间比较采用ｔ检验多组之间的检验采用单因素方差分析Ｐ００５为差异有统计学意义Ｐ００５见图２２３苦参碱对ＳｉＨａＣ３３Ａ细胞迁移的影响通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验与划痕实验检测苦参碱对统计学意义宫颈癌迁移能力的影响Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验结果显示２较正常对照组苦参碱作用后的宫颈癌细胞的穿膜结２１果苦参碱对ＳｉＨａＣ３３Ａ细胞增殖的影响ＣＣＫ８法检测００２５０５１０２０ｍｇｍｌ苦参碱诱导２４４８７２ｈ后对宫颈癌细胞ＳｉＨａＣ３３Ａ细胞增殖的影响相同作用时间下抑制作用随苦参碱浓度的升高而增强相同浓度下抑制作用随苦数量均减少差异有统计学意义Ｐ００５划痕实验结果显示处理２４ｈ时正常对照组细胞划痕宽度大于苦参碱作用后的宫颈癌细胞即迁移能力受到显著抑制差异有统计学意义Ｐ００５见图３２４苦参碱对ＳｉＨａＣ３３Ａ细胞Ｈ２ＡＸＰ３８表达的影响通过Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测苦参碱对 γｈ２ａｘ参碱作用时间的延长而增强在苦参碱浓度高于ｐｐ３８蛋白水平的影响结果显示苦参碱随着药物浓０５ｍｇｍｌ时差异有统计学意义Ｐ００５ＥｄＵ度增高 γｈ２ａｘｐｐ３８的表达显著增高即Ｈ２ＡＸ实验结果显示１ｍｇｍｌ苦参碱作用后细胞的增殖Ｐ３８磷酸化水平随着苦参碱浓度增高而增加差异受到抑制差异有统计学意义Ｐ００５见图１有统计学意义Ｐ００５见图４Ｆｉｇ１图１苦参碱对宫颈癌细胞ＳｉＨａＣ３３Ａ增殖的影响ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍａｔｒｉｎｅｏｎＳｉＨａａｎｄＣ３３ＡｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＡＣＣＫ８实验检测不同时间点不同苦参碱对宫颈癌细胞增殖的影响ＢＥｄＵ法检测苦参碱对宫颈癌细胞增殖的影响与对照组相比Ｐ００５２４

4 第４期赵淑婷等苦参碱通过Ｐ３８通路调节Ｈ２ＡＸ磷酸化抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移图２苦参碱对宫颈癌细胞ＳｉＨａＣ３３Ａ凋亡的影响Ｆｉｇ２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍａｔｒｉｎｅｏｎＳｉＨａａｎｄＣ３３ＡｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓＡ细胞凋亡实验对宫颈癌细胞凋亡的检测Ｂ流式细胞术对宫颈癌细胞凋亡的检测与对照组相比Ｐ００５Ｆｉｇ３图３苦参碱对宫颈癌细胞ＳｉＨａＣ３３Ａ侵袭和迁移的影响ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍａｔｒｉｎｅｏｎｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＳｉＨａａｎｄＣ３３ＡｃｅｌｌｓＡ宫颈癌细胞侵袭能力Ｂ宫颈癌细胞迁移能力与对照组相比Ｐ００５２５

第３９卷同济大学学报医学版Ｆｉｇ４２５图４苦参碱对宫颈癌细胞ＳｉＨａＣ３３Ａ中Ｈ２ＡＸ基因表达的影响ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍａｔｒｉｎｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨ２ＡＸｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ与０ｍｇｍｌ苦参碱组相比Ｐ００５Ｈ２ＡＸ

低苦参碱对宫颈癌细胞的抑增殖抑迁移的作用差碱检测Ｈ２ＡＸ的磷酸化不同对宫颈癌细胞增殖Ｆｉｇ５异有统计学意义Ｐ００５见图５图５Ｈ２ＡＸ磷酸化对苦参碱作用的宫颈癌细胞增殖迁移的影响ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＨ２ＡＸｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄ

信号通路对宫颈癌细胞Ｈ２ＡＸ磷酸化的影响在宫颈癌细胞ＳｉＨａ中加入Ｐ３８磷酸激酶抑制剂ＳＢ２０２１９０通过Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测Ｐ３８磷酸化被抑制后对 γｈ２ａｘｐｐ３８表达的影响结果显示加入抑制剂后Ｐ３８信号磷酸化通路被抑制同时Ｈ２ＡＸ磷酸化水平也随之降低

5 第３９卷同济大学学报医学版Ｆｉｇ４２５图４苦参碱对宫颈癌细胞ＳｉＨａＣ３３Ａ中Ｈ２ＡＸ基因表达的影响ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍａｔｒｉｎｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨ２ＡＸｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ与０ｍｇｍｌ苦参碱组相比Ｐ００５Ｈ２ＡＸ磷酸化对苦参碱作用的宫颈癌细胞增迁移的影响结果显示与Ｈ２ＡＸｗｔ组相比苦参碱对Ｈ２ＡＸ１３９ｍ组宫颈癌细胞的增殖抑制程度减殖迁移的影响在宫颈癌细胞ＳｉＨａ中稳转Ｈ２ＡＸｗｔ和Ｈ２ＡＸ低迁移率明显增强即Ｈ２ＡＸ磷酸化的阻断可降１３９ｍ含有Ｓｅｒ１３９突变以阻断磷酸化后加入苦参低苦参碱对宫颈癌细胞的抑增殖抑迁移的作用差碱检测Ｈ２ＡＸ的磷酸化不同对宫颈癌细胞增殖Ｆｉｇ５异有统计学意义Ｐ００５见图５图５Ｈ２ＡＸ磷酸化对苦参碱作用的宫颈癌细胞增殖迁移的影响ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＨ２ＡＸｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓＡＣＣＫ８法检测苦参碱在Ｈ２ＡＸ不同磷酸化下对宫颈癌细胞４８ｈ增殖的抑制率的影响ＢＴｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测苦参碱在Ｈ２ＡＸ不同磷酸化下对宫颈癌细胞迁移的影响与Ｈ２ＡＸｗｔ组相比Ｐ００５２６苦参碱通过Ｐ３８信号通路对宫颈癌细胞Ｈ２ＡＸ磷酸化的影响在宫颈癌细胞ＳｉＨａ中加入Ｐ３８磷酸激酶抑制剂ＳＢ２０２１９０通过Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测Ｐ３８磷酸化被抑制后对 γｈ２ａｘｐｐ３８表达的影响结果显示加入抑制剂后Ｐ３８信号磷酸化通路被抑制同时Ｈ２ＡＸ磷酸化水平也随之降低差异有统计学意义Ｐ００５见图６图６苦参碱通过Ｐ３８信号通路对宫颈癌细胞Ｈ２ＡＸ磷酸化的影响Ｆｉｇ６ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＭａｔｒｉｎｅｏｎｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆＨ２ＡＸｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈＰ３８ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ与苦参碱组相比Ｐ００５２６

6 第 4 期赵淑婷等 : 苦参碱通过 P38 通路调节 H2AX 磷酸化抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移 3 讨论苦参碱对多种肿瘤有抑制作用, 且毒副作用较小, 是一种应用于临床的高效低毒的新型抗肿瘤 [8,11] 药既往研究表明, 苦参碱在病毒性肝炎心律失常皮肤炎症等的治疗中广泛应用, 且与标准疗法联合应用能显著改善癌症患者的生活质量和预后, 显示其作为抗癌药物的潜力然而, 其对肿瘤抑制作用的具体机制目前还不明确, 尤其是在宫颈癌中在本实验中, 探究不同浓度苦参碱对人宫颈癌细胞系 SiHa 和 C33A 细胞功能的影响, 及与 P38 / H2AX 基因表达的相关性, 以期揭示苦参碱对宫颈癌抑癌作用的机制肿瘤细胞的增殖能力与肿瘤的恶性程度密切相关本研究验证了苦参碱对宫颈癌细胞增殖的抑制, 苦参碱对宫颈癌 SiHa 和 C33A 细胞的增殖显著抑制, 且呈剂量依赖肿瘤的发生发展不仅与细胞的增殖分化有关, 还与细胞的凋亡障碍有密切关系, 细胞凋亡是维持机体自身稳态所必须的生理性细胞自杀过程, 苦参碱在肝细胞癌中可通过凋亡诱导因子的核转位而产生的细胞凋亡, 本研究发现在宫颈癌中, 苦参碱可促进细胞凋亡迁移和侵袭是评价宫颈癌预后的重要指标并提示治疗后效果, 迁移能力强的细胞更具有复发和转移的潜能 [12] 本实验通过 Transwell 实验和划痕实验检测苦参碱对宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力的影响, 发现苦参碱在宫颈癌中显著抑制细胞的迁移能力这一结果与前列腺癌的低迁移率一致 [5], 进一步验证了苦参碱对宫颈癌细胞迁移的抑制作用 [13] ; 通过 CCK8 EdU 等实验技术, 针对细胞的增殖凋亡转移等多角度综合证明苦参碱对宫颈癌的抑增殖促凋亡抑转移等抗肿瘤作用 [14 15] 关于苦参碱对肿瘤抑制作用的机制研究认为, 抑制作用可能与 mir 21/ PTEN / Akt 通路 AKT / GSK3β / β Catenin 等通路相关本研究通过苦参碱作用于宫颈癌细胞, 证明苦参碱随浓度增加可梯度增加 γh2ax pp38 的表达, 提示苦参碱的抑癌作用可能与 H2AX 相关 H2AX 属于编码组蛋白 H2A 家族, 参与细胞的增殖和 DNA 的修复 [16] DNA 损伤可导致增殖失控和驱动恶性肿瘤的形成 H2AX 在 Ser139 位点发生磷酸化进而调控细胞增殖细胞凋亡 DNA 的修复中起重要作用在真核细胞中, 生物物理及化学因素等可使 DNA 损伤而形成 [17] γh2ax 在越来越多的证据表明,γH2AX 参与多种人类恶性肿瘤的凋亡过程中 H2AX 磷酸化可由 ATM ATR 和 DNA PKcs 催化 [18] [19 20] 研究报道,H2AX 的磷酸化可通过 P38 丝裂原活化蛋白激酶途径调控细胞的凋亡在本研究中发现, 苦参碱抑制宫颈癌增殖迁移时,γH2AX pp38 的表达增加, 提示苦参碱可能是通过诱导 H2AX 磷酸化进而发挥作用为证明 H2AX 是通过磷酸化激活发挥作用, 通过抑制 H2AX 的磷酸化发现苦参碱对增殖迁移的抑制作用解除为探究 γh2ax 的作用通路, 通过阻断 H2AX 上游基因 P38 的磷酸化, 结果证实 P38 磷酸化的阻断可抑制 γh2ax 的表达综上所述, 本研究发现苦参碱能够有效抑制宫颈癌 SiHa / C33A 细胞的增殖迁移, 诱导细胞凋亡, 并证实苦参碱通过 P38 信号通路使 H2AX(Ser139) 位点磷酸化发挥抑增殖抑迁移作用本研究下一步将继续阐述苦参碱有无其他通路调控 H2AX 的表达, 为宫颈癌辅助治疗的临床前和临床评价奠定基础参考文献 [ 1 ] JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics[j]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2): [ 2 ] FRIEDLANDER M, GROGAN M. Guidelines for the treatment of recurrent and metastatic cervical cancer [ J]. Oncologist, 2002,7(4): [ 3 ] ROTMAN M, SEDLIS A, PIEDMONTE M R, et al. A phase Ⅲ randomized trial of postoperative pelvic ir radiation in stage IB cervical carcinoma with poor prog nostic features: follow up of a gynecologic oncology group study[j]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006,65 (1): [ 4 ] SCATCHARD K, FORREST J L, FLUBACHER M, et al. Chemotherapy for metastatic and recurrent cervical cancer[j]. Cochrane Database Syst Rev, 2012,10: D6469. [ 5 ] HUANG H, DU T, XU G, et al. Matrine suppresses invasion of castration resistant prostate cancer cells by downregulating MMP 2/ 9 via NF κb signaling path way[j]. Int J Oncol, 2017,50(2):

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12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot