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煊蓝
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1 研究论文药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (7): 孕期酒精暴露对小鼠视皮质神经元树突棘和突触的影响崔占军 1, 赵凯冰 2, 文曙光 1, 张俊士 1, 于东明 1, 邓锦波 1* (1. 河南大学医学院神经生物学研究所, 河南开封 ; 2. 开封大学医学部, 河南开封 ) 摘要 : 探讨孕期酒精接触对子鼠 (P0 P30) 视皮质神经元树突棘和突触的影响及其长时程效应从妊娠第 5 天 (E5) 开始用酒精灌胃直至子鼠出生, 建立 FAS 动物模型采用 DiI 散射的方法标记视皮质锥体细胞树突棘, 利用透射电子显微镜观察突触的超微结构结果显示, 孕期酒精暴露能够诱导子鼠视皮质锥体细胞树突棘的密度降低长度增加 ; 同时突触超微结构也出现一定的改变 ( 如突触小泡减少突触间隙变窄和突触后致密区增厚等 ) 酒精暴露可导致树突棘和突触超微结构的改变, 该变化具有剂量依赖性和长时程效应关键词 : 树突棘 ; 突触 ; 视皮质 ; 透射电子显微镜 ; DiI 散射中图分类号 : R749.6 文献标识码 : A 文章编号 : (2010) Effects of alcohol exposure during pregnancy on dendritic spine and synapse of visual cortex in filial mice CUI Zhan-jun 1, ZHAO Kai-bing 2, WEN Shu-guang 1, ZHANG Jun-shi 1, YU Dong-ming 1, DENG Jin-bo 1* (1. Institute of Neurobiology of Medical College of Henan University, Kaifeng ; 2. Medical College of Kaifeng University, Kaifeng , China) Abstract: The prenatal ethanol exposure induced the alterations of dendritic spine and synapse in visual cortex and their long-term effect would be investigated in mice from P0 to P30. Pregnant mice were intubated ethanol daily from E5 through the pup s birth to establish mode of prenatal alcohol abuse. The dendritic spines of pyramidal cells in visual cortex of pups were labeled with DiI diolistic assay, and the synaptic ultrastructure was observed under transmission electron microscope. Prenatal alcohol exposure was associated with a significant decrease in the number of dendritic spines of pyramidal neurons in the visual cortex and an increase in their mean length; ultrastructural changes were also observed, with decreased numbers of synaptic vesicles, narrowing of the synaptic cleft and thickening of the postsynaptic density compared to controls. Prenatal alcohol exposure is associated with long-term changes in dendritic spines and synaptic ultrastructure. The changes were dosedependent with long term effect even at postnatal 30. Key words: dendritic spine; synapse; visual cortex; transmission electron microscope; DiI diotistic 目前, 酒精滥用和酒精依赖已成为当今影响人类健康的重要因素之一, 酒精的毒性可造成饮用者本身神经系统心血管系统和免疫系统的损害, 甚至收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( , ); 河南省科技厅国际合作项目 ( ); 河南省教育厅项目 ( ); 河南省国际科技合作重点项目计划资助项目 ( ); 河南大学自然科学基础研究项目 (2008YBZR033). * 通讯作者 Tel / Fax: , jinbo_deng@henu.edu.cn [1, 有致癌作用 2] 酒精对小鼠神经系统损伤最敏感的时期是突触发生期到妊娠末期以及出生后两周这一段时间 [3], 在人类是从孕期一直延续到出生后的数年因此孕期饮酒或含酒精饮料, 酒精可通过胎盘影响胎儿的发育, 严重者可引发胎儿酒精综合征 (fetal alcohol syndrome, FAS) [3, 4] FAS 最有害的症状是神经行为障碍, 包括儿童期的多动症学习能力低下, 甚至成年后的精神病和抑郁症等 [5] 从逻辑上讲, 行为学的改变必定有相应的物质基础关于 FAS 发生的

2 834 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (7): [6, 物质基础人们做了各方面的探索 7], 其中酒精相关的皮质异常主要有以下几种情况 : 神经元凋亡 [8 10] 神经元减少和树突的改变 [11 14] 由于树突棘和突触在学习和记忆中具有特殊的作用, 它们的病理改变已经成为当前酒精毒理研究的热点尽管已经有酒精暴露可诱导突触和树突棘的改变的报道, 但该研究也有不完善的地方, 某些结论还不是很确定例如, 慢性酒精暴露对突触的超微结构是否有影响还存在争议 [15 17], 而其对树突棘的影响, 不同的学者的观点也不尽相同, 一种观点认为慢性酒精暴露可导致树突棘数目减少 [18 21] ; 另一种观点则认为慢性酒精暴露对树突棘数目没有影响 [22 24] ; 还有一种观点认为慢性酒精暴露可导致树突棘数目增加 [25] 为了更好地理解出生前酒精暴露对突触和树突棘发育的影响, 作者利用 DiI 散射和透射电子显微镜技术, 分析了 P0 P30 出生前酒精暴露小鼠视皮质中树突棘和突触的超微结构, 及其长时程效应结果显示酒精组视皮质锥体神经元与对照组比较, 树突棘密度减少, 长度增加 ; 突触间隙变窄, 突触小泡减少这些变化在出生后 P0 P7 P14 和 P30 呈剂量依赖性和长时程效应该研究将提供更多的细节去理解出生前酒精暴露如何通过树突棘和突触的改变损害婴儿及儿童的中枢神经系统, 为酒精毒性所导致的相关神经系统疾病的发病机制提供新的依据, 对于控制胎儿酒精综合征发生降低智力低下儿童出生率, 提高我国人口素质具有重要社会意义材料与方法实验动物和标本收集 FAS 模型的建立和血液酒精浓度的测量 C57BL/6J 小鼠, 2~3 月龄, 雌鼠 20~30 g, 雄鼠 25~30 g, 购自郑州大学实验动物中心 ( 合格证号 : SCXK ( 京 ) ) 常年室温在 22~25 相对湿度 60%~70% 环境下饲养定期消毒, 房间面积 50 m 2 按自然昼夜节律采光, 自由进食和饮水雌性 C57BL/6J 小鼠 30 只, 随机分为 3 组 : 1 对照组 (control group), 用蒸馏水代替酒精 (4.0 g kg 1 d 1 ); 2 酒精低剂量组 (low EtOH treatment), 每日灌胃酒精量 2.0 g kg 1 ; 3 酒精高剂量组 (high EtOH treatment), 每日灌胃酒精量 4.0 g kg 1 雌雄 C57BL/6J 小鼠 (1 1) 放在一起进行交配, 次晨 8 点检查阴道栓塞, 并将发现栓塞之日称为 E0 (Embryonic), 定为妊娠的开始由于从当天开始胃饲酒精将毫不例外引起完全性流产, 故胃饲酒精从妊娠的第 5 天开始, 用蒸馏水配置成乙醇溶液, 酒精浓度 25% 在进行灌胃之前, 每天同一时间怀孕母鼠禁食和水 4 h, 灌胃一直持续到小鼠出生灌胃期间, 实验组和对照组在 E10 和 E15 两个时间点, 于灌胃后 2 h 用剪刀剪怀孕母鼠的尾巴, 用肝素化血细胞比容管收集血液 10 μl, 进行高速离心, 可得到血浆约 5 μl, 用 ANALOX 型 GL5 分析仪进行血酒精浓度测量测量结果 : 高剂量酒精组 BAC ( 血液酒精浓度, blood alcohol concentration) 为 300~500 mg dl 1, 低剂量酒精组 BAC 在 150~300 mg dl 1, 对照组为 0 mg dl 1 标本收集不同分组的子鼠共计收集 240 只, P0 P7 P14 和 P30 各时间点不少于 15 只, 实际用于统计的为 12 只, 每只动物选择 5 个神经元, 每个神经元选择 1 个树突进行分析各组小鼠均经腹腔注射戊巴比妥钠作全身麻醉 (0.04 g kg 1, ip), 开胸后, 用 4% 多聚甲醛 ( 用 ph 7.2, 0.1 mol L 1 PB 配制 ) 25 ml 做心脏灌流固定取脑后, 再于 4% 多聚甲醛中继续浸泡固定 1~2 d (4 ) 然后, 用振荡切片机选择视皮质的冠状位进行切片, 片厚 50 µm, 切片保存在 0.1 mol L 1 PB 中备用 DiI 散射标记锥体细胞及其树突棘参照邓锦波 [26, 27] 等的方法, 利用 DiI 散射标记树突棘将需要标记的切片放入 6 孔培养板内, 每孔 1~3 片, 放到培养孔中央, 切片之间尽量靠紧, 以便 DiI (Sigma) 可以较为集中地散射到切片上吸掉培养孔中的缓冲液, 使切片处于欲干未干状态将 DiI- 金颗粒弹头放置于基因枪内, 在氦气 (150~180 P.S.i.) 驱动下, 将 Dil- 金颗粒散射到切片表面在荧光解剖显微镜下检查 DiI 标记密度, 如果 DiI 密度太低, 可以再散射一次, 直至 DiI 密度达到要求为止经过 DiI 散射后的切片用 0.1 mol L 1 PB 漂洗 3 次后, 保留于 0.1 mol L 1 PB 中, 置于 4 冰箱内孵育 12~24 h 即可孵育后的切片用 Dapi ( ) 进行衬染, 最后用 PB 配制的 65% 甘油封片, 荧光显微镜下检查结果图像采集一般的切片可利用荧光显微镜 (BX61, Olympus, 日本 ) 和罗丹明激发光进行图像采集质量较高的切片则利用激光共聚焦显微镜 (FV1000, Olympus, 日本 ), 选用 60 油镜进行观察和图像采集操作时首先将载有样品的玻片固定在显微镜载物台上, 在视皮质不同视野选择锥体细胞进行激光扫描荧光双标记的脑片在用共聚焦激光扫描显微镜进行断层扫描时, 选择 xyz 扫描方式, 双通道同

崔占军等: 孕期酒精暴露对小鼠视皮质神经元树突棘和突触的影响 835 步连续断层扫描 (Dapi 的激发波长约为 356 nm, DiI 常作为突触后成分与投射来的轴突共同构成完整的的激发波长约为 543 nm), 其中 DiI 标记的树突棘还突触连接 [14], 因此树突棘的数量及其发育则能够从要选用 4 倍变焦放大, z 轴步距一般为 0.

3 崔占军等: 孕期酒精暴露对小鼠视皮质神经元树突棘和突触的影响 835 步连续断层扫描 (Dapi 的激发波长约为 356 nm, DiI 常作为突触后成分与投射来的轴突共同构成完整的的激发波长约为 543 nm), 其中 DiI 标记的树突棘还突触连接 [14], 因此树突棘的数量及其发育则能够从要选用 4 倍变焦放大, z 轴步距一般为 0.5 μm, 扫描图一个侧面反映出突触发育的信息选择 P0 P30 视皮像存储为 pixel 类型因为激光扫描共聚焦质 V VI 层的锥体细胞侧树突的树突棘和丝状伪足作显微镜含有图像处理系统及自动摄像装置, 所以把为研究的靶点在具体操作过程中, 首先利用 Dapi 所有扫描图像存入计算机硬盘内, 分析时重新读出衬染以确认视皮质 V VI 层 (图 1a), 然后利用 DiI 散即可射标记该区域的神经细胞和神经胶质细胞可以根据电镜标本的制作与观察按常规电镜标本制作 DiI 染色所显示出来的细胞的形态特征来区别这两种过程进行, 选取 3 组中各出生时点 (P0 P7 P14 细胞, 锥体细胞的胞体呈巨大的三角形, 它们有着较 P30) 的子鼠, 1% 异戊巴比妥麻醉, 4% 多聚甲醛进长的轴突顶树突和几支侧树突以及基树突, 因此能行经心灌流术取出脑组织, 将视皮质部分修剪成够被准确识别 (图 1b) 在 P0 这一时间点上的视皮质 0.3 cm 0.2 cm 0.2 cm 组织块, 4% 戊二醛浸泡, 前锥体细胞侧树突表面光滑, 带有一些稀疏的念珠状固定 2 4 h PB (0.1 mol L 1, ph 7.2) 冲洗干净后, 的膨体这种膨体在树突的根部要比树突的尖部大, 1% 锇酸浸泡, 后固定约 1 h PB 冲洗干净, 再经系在有些念珠状的膨体上还发出丝状伪足或树突的分列丙酮梯度脱水, Epon812 浸脂, 树脂包埋, 按 37 支; 而在 P3 这一时间点上, 树突则变长, 膨体数量也 (3 h) 45 (6 h) 和 63 (24 h) 进行聚合, 制成电增多, 并且有不同长度的丝状伪足从膨体上发出, 提镜标本 70 nm 超薄切片, 常规醋酸双氧釉和枸橼酸示与前期相比有丝状伪足的增生和树突分支的增加; 铅染色, 透射电子显微镜观察各组突触的超微结构甚至到 P7 时还可以看到一些丝状伪足从膨体上过度统计学处理选择视皮质第 V 和 VI 层锥体细生长, 但同时可观察到一些丝状伪足直接从树突上胞的侧树突上的树突棘作为测量的靶部位[13] 测量时从靠近胞体的第一个树突棘算起, 以便消除由于树突棘位置的不同所引起的差异, 因此没有与胞体连接的游离的树突将不纳入数据分析分析树突棘时主要选用 2 个参数, ① 树突棘的密度, 树突棘的密度 = 一条树突上树突棘的数量/树突的长度; ② 树突棘的长度, 树突棘的长度=一条树突上树突棘的总长度/树突棘的数量分析突触的超微结构也选用 2 个参数, ① 突触间隙的宽度, 突触间隙的宽度 = 一个突触间隙不同部位宽度的总和/测量部位的总和; ② 突触小泡的数量, 突触小泡的数量 = 一个突触前体中突触小泡的数量/该突触前体的面积在做统计学检验时, 首先进行横向比较, 即研究剂量依赖性, 分低剂量酒精组高剂量酒精组和对照组; 然后再做纵向比较, 即研究长时程效应, 每组取 P0 P7 P14 和 P30 等 4 个时间点子鼠作为研究对象各统计参数按照处理因素和时间点记录于 Excel 表中, 树突棘的密度和长度采用单因素方差分析 q 检验, 突触间隙的宽度和突触小泡的数量采用独立样本 T 检验结果以 x ± s 表示, P < 0.05 为有统计学意义结果 1 树突棘的正常发育树突棘是神经元树突上的功能性突起结构, 通 Figure 1 Pyramidal cells in visual cortex and the development of dendritic spine by confocal laser scanning microscopy. a: Visual cortex (P14) with DiI (red) diolistic assay and Dapi counterstaining. The visual cortex is laminated with layer I VI. Hippocampus (hip) locates under the neocortex. b: A pyramidal cell in layer V of visual cortex. The apical, lateral and basilar dendrites can be recognized. c h: The development of dendritic spine from P0 to P30. The dendritic spines developed from none to being and from few to many, but their length shortened with increase of age. Bar = 200 µm in (a), 30 µm in (b), 6 µm in (c h)

4 836 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (7): 发出的现象 ; P10 时可以清楚地观察到丝状伪足分化为树突棘 ; 到 P14 时树突膨体几乎消失, 随着树突棘的数量进一步增加, 在树突的某些部位会出现树突棘密度疏密不均的现象 ; 然而, P30 时树突棘会变短密度增加, 并且树突棘分布比较均匀以上的结果显示, 随着子鼠出生后的发育, 树突棘的数量逐渐增多, 长度则逐渐缩短, 分布逐渐均匀 2 孕期酒精暴露所致的树突棘的变化酒精暴露组树突棘的发育规律与对照组是相似的, 随着年龄的增加, 树突棘的数量逐渐增多, 长度则逐渐缩短但在同一年龄段, 酒精暴露组与对照组的树突棘的密度和长度之间有明显差异例如 : 在 P0 这一时间点上视皮质树突棘的密度为 : 酒精高剂量组是 0.13 个 /µm; 酒精低剂量组是 0.18 个 /µm; 对照组是 0.21 个 /µm, 3 组之间有明显差异 (P < 0.01) 停饲酒精后, 以上的改变是否还要持续一段时间呢? 或者说酒精对神经元发育的影响是否具有长时程效应呢? 答案是肯定的, 因为作者发现这些改变在出生后发育中的 P7 P14 P30 各时间点上同样具有剂量依赖性和长时程效应 ( 表 1 和图 2); 与树突棘密度变化相似, 孕期酒精暴露亦可导致树突棘的长度的改变, 即 : 酒精暴露可导致树突棘长度增加, 并呈剂量依赖性和长时程效应 ( 表 1) 表 1 为 P0 P7 P14 和 P30 各时间点不同处理组之间树突棘的密度和平均长度的测量数据各组之间采用单因素方差分析 q 检验, 酒精暴露组与对照组之间比较, 差异有显著意义, 呈剂量依赖性虽然子鼠出生后, 酒精暴露也随之停止, 但在 P7 P14 和 P30 各时间点, 酒精组树突棘密度仍比对照组低, 树突棘长度也比对照组长, 提示酒精可诱导树突及树突棘发育迟缓, 并具有长时程效应 3 孕期酒精暴露和突触超微结构突触是神经元间信息传递的特化结构, 是神经系统可塑性变化最敏感的部位, 由突触前膜突触间隙和突触后膜组成突触前膜含有大量的突触囊泡, 与神经递质的释放密切相关 ; 突触后膜主要为突触后致密物质, 含有丰富的微管蛋白肌动蛋白神经 Table 1 Alterations of dendritic spine length and density following prenatal ethanol exposure Group No. of animals No. of dendrites Density of dendritic spine (spines/μm ) Length of dendritic spine/μm P0 Control ± ± 0.58 M-EtOH ± 0.04 * 2.89 ± 0.67 ** H-EtOH ± 0.03 ** 3.35 ± 1.09 ** P7 Control ± ± 0.37 M-EtOH ± 0.10 * 2.04 ± 0.46 H-EtOH ± 0.08 ** 2.56 ± 0.50 ** P14 Control ± ± 0.25 M-EtOH ± 0.13 ** 1.84 ± 0.31 H-EtOH ± 0.11 ** 2.08 ± 0.84 ** P30 Control ± ± 0.26 M-EtOH ± 0.16 ** 1.72 ± 0.36 * H-EtOH ± 0.16 ** 1.77 ± 0.27 ** M-EtOH: Moderate EtOH treatment (2.0 g kg 1 ); H-EtOH: High EtOH treatment (4.0 g kg 1 ). x ± s. Statistical analysis employed one way ANOVA q tests. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs control group; P < 0.05, P < 0.01 vs M-EtOH group Figure 2 The comparison of the development of dendritic spine of visual cortex in different ages after prenatal ethanol exposure by confocal laser scanning microscopy. a d: Control group; e h: Low EtOH treatment (2.0 g kg 1 ); i l: High EtOH treatment (4.0 g kg 1 ). The density of spines in treatment group was obviously lower than that of control in a dose-dependent manner, but their length was longer than control in a dose-dependent manner. Scale bar is 6 μm

崔占军等 : 孕期酒精暴露对小鼠视皮质神经元树突棘和突触的影响 837 丝蛋白及各种酶和兴奋性谷氨酸受体等 [28] ; 突触间隙内含有大量的分解神经递质的降解酶在突触发育过程中, P7 之前视皮质中突触发育不完全, 突触小泡极少 ; P7 之后开始出现典型的突触结构, 并随着子鼠日龄的增加, 突触之间的连接部位趋于明显, 突触小泡数量逐渐增多 [29] 作者主要测量了 P7 P14

05, 图 3) Figure 3 The comparison of the ultrastructure between H-EtOH treatment (4.0 g kg 1 ) and control group in different ages by electron microscopy.

c, d: The comparison of the ultrastructure between EtOH treatment and control group in postnatal day 14, the number of synaptic vesicles decreased, and the synaptic cleft is unclear; e, f: The

5 崔占军等 : 孕期酒精暴露对小鼠视皮质神经元树突棘和突触的影响 837 丝蛋白及各种酶和兴奋性谷氨酸受体等 [28] ; 突触间隙内含有大量的分解神经递质的降解酶在突触发育过程中, P7 之前视皮质中突触发育不完全, 突触小泡极少 ; P7 之后开始出现典型的突触结构, 并随着子鼠日龄的增加, 突触之间的连接部位趋于明显, 突触小泡数量逐渐增多 [29] 作者主要测量了 P7 P14 和 P30 共 3 个时间点的酒精高剂量组和对照组的突触小泡的数量和突触间隙的宽度, 数据见表 2 结果显示孕期酒精暴露组与对照组相比较, 突触前体中突触小泡数量减少突触间隙变窄, 突触后致密区增厚, 部分或完全遮盖了突触间隙 (P<0.05, 图 3) Figure 3 The comparison of the ultrastructure between H-EtOH treatment (4.0 g kg 1 ) and control group in different ages by electron microscopy. a, b: The comparison of the ultrastructure between EtOH treatment and control group in postnatal day 7, the number of synaptic vesicles decreased, and the synaptic narrowed as well in EtOH treatment; c, d: The comparison of the ultrastructure between EtOH treatment and control group in postnatal day 14, the number of synaptic vesicles decreased, and the synaptic cleft is unclear; e, f: The comparison of the ultrastructure between EtOH treatment and control group in postnatal day 30, the number of synaptic vesicles decreased, the synaptic narrowed and the synaptic cleft is unclear as well in EtOH treatment. Scale bar is 0.33 μm 讨论酒精作为一种潜在的致畸因子, 可以自由通过胎盘, 进入胎儿的血液循环, 对胎儿正常的生长发育造成较为严重的影响, 甚至导致胎儿酒精综合征 (FAS) 的发生在大脑发育过程中, 酒精对神经元树突棘的密度形态以及神经元之间的连接结构突 Table 2 Changes of synaptic ultrastructure following prenatal ethanol exposure Group No. of synapses Width of synaptic cleft /nm Number of synaptic vesicles (vesicles/μm 2 ) P7 Control ± ± H-EtOH ± 2.25 ** ± ** P14 Control ± ± H-EtOH ± 3.24 ** ± ** P30 Control ± ± H-EtOH ± 2.27 ** ± ** H-EtOH: High EtOH treatment (4.0 g kg 1 ). x ± s. vs control group ** P < 0.01 触的影响, 不同的学者的观点也不尽相同产生这些 [18 25] 观点上差异的一个可能的原因是 : 早期的研究者观察树突棘时大多采用 Golgi 神经元染色法作为显示中枢神经元和神经胶质细胞的染色方法, Golgi 染色技术广泛应用于神经解剖学研究领域, 它可以显示神经元的全貌, 因此多用来研究树突结构的变化, 而且可以较好地保持细胞的细微结构, 长期以来备受神经科学工作者的青睐但是, 由于该方法使用火棉胶包埋需数天的时间, 同时组织在乙醚酒精火棉胶等溶液中较长时间浸泡火棉胶块的长时间氯仿硬化, 使银染物质丢失, 着色神经元数量不恒定使其所得结果不稳定由此导致早期的研究结果出现很大的差异鉴于 Golgi 染色技术的上述缺点, 作者利用 DiI 散射技术标记神经元和神经胶质细胞 DiI 散射标记是利用基因枪在氦气压力的驱动下将包被有 DiI 的金颗粒射入脑片的神经元或神经胶质细胞表面, 因为金颗粒直径小, 仅为 1 μm, 属于单细胞标记 ; 金颗粒表面的 DiI 将沿着神经细胞脂质双层扩散, 从而达到对单个细胞标记的目的由于包被在金颗粒表面的 DiI 量很少, 消除了 DiI 示踪植入部位周围非常强的背景, 这是该法显示优良细微结构的原因 [27] 因此 DiI 散射技术可以象 Golgi 染色法一样具有非特异性标记神经元和神经胶质细胞等优点, 既能用作对固定脑片的标记, 又能用作对培养的活体脑片标记, 同时大大简化了染色步骤 [26, 30], 效果令人满意在作者的研究中, 选择怀孕 5 天的母鼠对其喂饲酒精直至子鼠出生, 建立 FAS 模型以模拟嗜酒的孕妇的饮酒习惯观察视皮质 V-VI 层锥体细胞的树突棘和突触所发生的某些病理性改变结果显示, 酒精暴露后树突棘的长度变长, 密度降低, 这些改变具有剂量依赖性和长时程效应一般情况下, 树突棘的发育趋势是从早期的长的树突棘或丝状伪足向晚期的

6 838 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (7): 短的树突棘过度, 从稀疏向稠密过度 [29] 因此, 结果所提示的树突棘的密度降低和长度变长都是树突棘发育延迟的表现树突棘密度的降低, 意味着它们所能接受的突触前终末数量的减少, 从而使视皮质中形成的突触数量相应减少, 导致神经元之间的联系减弱为了代偿由于突触减少所导致的神经元之间的功能联系减弱, 树突棘的形态发生相应的改变, 由短粗变得细长, 以此来主动搜寻突触前体 [30 33], 以期最大限度地增加突触形成的可能性, 增加神经元之间的联系, 因此推测树突棘变长是对突触形成不足的一种代偿机制 [34] 作者还研究了孕期酒精暴露对突触超微结构的影响, 主要表现为突触小泡减少和突触间隙变窄, 这些超微结构的改变同样也体现了突触发育的延迟在突触正常发育过程中突触前体中的突触小泡的增多和突触间隙增宽是突触成熟的主 [29, 要标志 35], 因此较少的突触小泡和较窄的突触间隙可认为是突触发育不成熟的表现突触前体中突触小泡数量减少, 则由其所携带的神经递质的量也相应减少, 进入突触间隙的神经递质的量也会相应减少, 使得神经冲动在突触部位的传递减弱另外, 突触间隙内含有大量分解神经递质的降解酶, 突触间隙越宽, 神经递质在突触间隙内由突触前成分向突触后成分传递过程中被降解的量就会越多孕期酒精暴露所表现出的突触间隙变窄, 使得进入突触间隙内的神经递质被降解的量减少, 从而使得本来由于突触数量减少和突触前体中突触小泡数量减少所引起的突触功能的减退得到一定程度的代偿此外作者还观察到突触后致密区增厚, 以至于部分或完全遮盖了突触间隙, 这一改变的病理意义有待进一步探讨综上所述, 孕期酒精暴露能够导致视皮质锥体细胞树突棘的数量减少和长度增加以及突触前体中的突触小泡减少和突触间隙变窄此结果提示 : 孕期酒精暴露会导致神经元发育过程中, 树突棘及其所形成的突触发育延迟和功能减退, 并具有长时程效应, 这可能是形成 FAS 患者精神发育迟滞智力低下的原因之一 References [1] Fillmore MT. Drug abuse as a problem of impaired control: current approaches and findings [J]. Behav Cogn Neurosci Rev, 2003, 2: [2] Frank J, Witte K, Schrodl W, et al. Chronic alcoholism causes deleterious conditioning of innate immunity [J]. Alcohol Alcohol, 2004, 39: [3] Ikonomidou C, Bittigau P, Ishimaru MJ, et al. Ethanol induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome [J]. Science, 2000, 287: [4] Mukherjee RA, Hollins S, Abou-Saleh MT, et al. Low level alcohol consumption and the fetus [J]. BMJ, 2005, 330: [5] Sampson PD, Streissguth AP, Bookstein FL, et al. On categorizations in analyses of alcohol teratogenesis [J]. Environ Health Perspect, 2000, 108: [6] Whitcher LT, Klintsova AY. Postnatal binge-like alcohol exposure reduces spine density without affecting dendritic morphology in rat mpfc [J]. Synapse, 2008, 62: [7] González-Burgos I, Alejandre-Gómez M, Olvera-Cortés ME, et al. Prenatal-through-postnatal exposure to moderate levels of ethanol leads to damage on the hippocampal CA1 field of juvenile rats: a stereology and Golgi study [J]. Neurosci Res, 2006, 56: [8] Han JY, Joo Y, Kim YS, et al. Ethanol induces cell death by activating caspase-3 in the rat cerebral cortex [J]. Mol Cells, 2005, 20: [9] Young C, Roth KA, Klocke BJ, et al. Role of caspase-3 in ethanol-induced developmental neurodegeneration [J]. Neurobiol Dis, 2005, 20: [10] Jiang Q, Hu Y, Deng J, et al. Prenatal alcohol exposure and the neuroapoptosis with long-term effect in visual cortex of mice [J]. Alcohol Alcohol, 2007, 42: [11] Stoltenburg-Didinger G, Spohr HL. Fetal alcohol syndrome and mental retardation: spine distribution of pyramidal cells in prenatal alcohol-exposed rat cerebral cortex; a Golgi study [J]. Brain Res, 1983, 313: [12] Pentney RV, Cotter JR, Abel EL. Quantitative measures of mature neuronal morphology after in utero ethanol exposure [J]. Neurobehav Toxicol Teratol, 1984, 6: [13] Qiang M, Wang MW, Elberger AJ. Second trimester prenatal alcohol exposure alters development of rat corpus callosum [J]. Neurotoxicol Teratol, 2002, 24: [14] Deng J, Elberger AJ. Corpus callosum and visual cortex of mice with deletion of the NMDA-NR1 receptor. II. Attenuation of prenatal alcohol exposure effects [J]. Brain Res Dev Brain Res, 2003, 144: [15] Lolova I, Lolov V, Petkov VV, et al. Changes in the synapses of rat hippocampus following pre- and postnatal alcohol exposure [J]. Anat Anz, 1989, 169: [16] Hoff SF. Synaptogenesis in the hippocampal dentate gyrus: effects of in utero ethanol exposure [J]. Brain Res Bull, 1988,

7 崔占军等 : 孕期酒精暴露对小鼠视皮质神经元树突棘和突触的影响 : [17] Lancaster F, Delaney C, Samorajski T. Synaptic density of caudate-putamen and visual cortex following exposure to ethanol in utero [J]. Int J Dev Neurosci, 1989, 7: [18] Ferrer I, Fabregues I, Rairiz J, et al. Decreased numbers of dendritic spines on cortical pyramidal neurons in human chronic alcoholism [J]. Neurosci Lett, 1986, 69: [19] Lescaudron L, Jaffard R, Verna A. Modifications in number and morphology of dendritic spines resulting from chronic ethanol consumption and withdrawal: a Golgi study in the mouse anterior and posterior hippocampus [J]. Exp Neurol, 1989, 106: [20] Tavares MA, Paula-Barbosa MM, Gray EG. Dendritic spine plasticity and chronic alcoholism in rats [J]. Neurosci Lett, 1983, 42: [21] Walker DW, Hunter BE, Abraham WC. Neuroanatomical and functional deficits subsequent to chronic ethanol administration in animals [J]. Alcohol Clin Exp Res, 1981, 5: [22] Cadete-Leite A, Alves MC, Paula-Barbosa MM, et al. Quantitative analysis of basal dendrites of prefrontal pyramidal cells after chronic alcohol consumption and withdrawal in the adult rat [J]. Alcohol, 1990, 25: [23] Cadete-Leite A, Tavares MA, Uylings HB, et al. Granule cell loss and dendritic regrowth in the hippocampal dentate gyrus of the rat after chronic alcohol consumption [J]. Brain Res, 1988, 473: [24] Lescaudron L, Verna A. Effects of chronic ethanol consumption on pyramidal neurons of the mouse dorsal and ventral hippocampus: a quantitative histological analysis [J]. Exp Brain Res, 1985, 58: [25] Ferrer I, Galofre E, Fabregues I, et al. Effects of chronic ethanol consumption beginning at adolescence: increased numbers of dendritic spines on cortical pyramidal cells in the adulthood [J]. Acta Neuropathol, 1989, 78: [26] Gan WB, Grutzendler J, Wong WT, et al. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations [J]. Neuron, 2000, 27: [27] Deng JB, Yu DM, Wu P. Introduction of DiI diolistic assay to label the nervous cell and glia [J]. Acta Anat Sin ( 解剖学杂志 ), 2006, 37: [28] Thiel G, Synapsin I. Synapsin II, and synaptophysin: marker proteins of synaptic vesicles [J]. Brain Pathol, 1993, 3: [29] Li MS, Cui ZJ, Deng JB, et al. Synaptogenesis in the developing mouse visual cortex [J]. Brain Res Bull, 2010, 81: [30] Benediktsson AM, Schachtele SJ, Green SH, et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures [J]. J Neurosci Methods, 2005, 141: [31] Yuste R, Bonhoeffer T. Morphological changes in dendritic spines associated with long-term synaptic plasticity [J]. Annu Rev Neurosci, 2001, 24: [32] Nimchinsky EA, Sabatini BL, Svoboda K. Structure and function of dendritic spines [J]. Annu Rev Physiol, 2002, 64: [33] Deng J, Dunaevsky A. Dynamics of dendritic spines and their afferent terminals: spines are more motile than presynaptic boutons [J]. Dev Biol, 2005, 277: [34] Wenisch S, Fortmann B, Steinmetz T, et al. 3-D confocal laser scanning microscopy used in morphometric analysis of rat Purkinje cell dendritic spines after chronic ethanol consumption [J]. Anat Histol Embryol, 1998, 27: [35] Ahmari SE, Smith SJ. Knowing a nascent synapse when you see it [J]. Neuron, 2002, 34:

21 13 D / 2 10 ig ig 10 d 1. 0 g kg /2 2 β- 5 g kg g kg mg kg - 1 ig ig 24 h 5% 1 2% CMC-Na 2. 5 ml 30

21 13 D / 2 10 ig ig 10 d 1. 0 g kg /2 2 β- 5 g kg g kg mg kg - 1 ig ig 24 h 5% 1 2% CMC-Na 2. 5 ml 30 21 13 1 2 1* 2 1. 430065 2. 445000 20 10 5 g kg - 1 5 mg kg - 1 ig 10 d ig HE 1 TFF1 TFF1 P < 0. 01 P < 0. 01 P < 0. 01 P < 0. 05 R285. 5 doi 10. 13422 /j. cnki. syfjx. 2015130100 A 1005-9903 2015 13-0100-05