20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No Sigma 公司 ; 胰蛋白胨酵母提取物购自 OXOID 公司 ; SephadexG?25 购自 AmershamPharmaciaBiotech 公司 ; 蓝色琼脂糖凝胶购自北京天来生物有限公司 ; 兔

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(8):19~25 截短型胰高血糖素样肽?1 的融合构建与表达高 1 华 1 许崇波李 2 元 (1 大连大学医学院辽宁省生物有机化学重点实验室大连 ) (2 大连帝恩生物工程有限公司大连 ) 摘要为了延长截短型胰高血糖素样肽?1(shortedglucagonlikepeptide?1,sGLP?1) 在血浆中的半衰期, 将 sglp?1 的 C 端与人血清白蛋白 (humanalbumin,hsa) 的 N 端通过 6 个氨基酸的柔性连接子融合在一起, 构建了融合表达菌株 PichiapastorisGS115/sGLP?1?HSA 以 4g/LG418 筛选出来的阳性工程菌株, 经 5L 发酵罐培养, 甲醇诱导 48h, 表达量可达 0.8g/L 培养液经超滤葡聚糖 G?25 除盐蓝色凝胶亲和层析纯化后, 经 HPLC 分析产物纯度达 95%, 回收率达 60% 正常小鼠糖耐量实验和对 GKⅡ 型糖尿病模型鼠的治疗证明 sglp?1/hsa 具有明显的降糖效果, 为获得大量 sglp?1/hsa 融合蛋白进行临床实验研究奠定了基础关键词截短型胰高血糖素样肽?1 Ⅱ 型糖尿病巴斯德毕赤酵母融合表达中图分类号 Q786 胰高血糖素样肽?1(glucagonlikepeptide?1,GLP?1) 是由肠道内分泌细胞 L 细胞分泌的由 30 个氨基酸组成的多肽激素, 通过与胰岛 β 细胞表面的特异性受体结合, 刺激胰岛素分泌, 同时竞争性抑制胰高血糖素受体, 降低胰高血糖素浓度, 使葡萄糖诱导的胰岛素分泌显著增强 [1] GLP?1 的肠促胰岛素作用依赖于葡萄糖浓度, 用其治疗糖尿病不会发生低血糖另外,GLP?1 可以促进 β 细胞新生, 抑制凋亡 GLP?1 在胃肠道可延缓餐后胃排空, 从而延缓肠道葡萄糖的吸收, 同时 GLP?1 还可以从中枢神经系统控制食物的摄取 [2] 由此可见 GLP?1 可从多个生理角度发挥其功能, 是潜在的治疗 Ⅱ 型糖尿病的理想药物但是 GLP?1 在体内的半衰期只有 2~6min, 一方面是由于 GLP?1 极易被二肽激肽酶 Ⅳ(dipeptidylpeptidaseⅣ,DPP?Ⅳ) 降解, 去除 N 端二肽, 从而失去促胰岛素分泌活性 ; 另一方面是由于 GLP?1 分子量小, 在体内很快通过肾脏清除, 极大地限制了其临床的应用 [3] 为克服 GLP?1 半衰期短的缺陷国内外纷纷致力于 GLP?1 的类似物的研究本课题组在对胰高血糖素家族进行多肽序列分析, 发现其家族成员不管是升血糖作用的胰高血糖素收稿日期 : 修回日期 : 国家十一五计划科技重大专项 (2009ZX ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :xcb921@163.com 还是降血糖作用的胰高血糖素样肽?1, 在羧基端都具有一定的同源性, 据此提出了清除受体假说该假说认为羧基端结构与其清除作用有关根据这一理论假说, 化学合成多条 GLP?1 肽链, 将体内活性检测较理想的序列命名为截短型胰高血糖素样肽?1(shorted glucagonlikepeptide?1,sglp?1) sglp?1 特点为 : 一 : 为抵抗清除作用, 将 GLP?1 羧基端 5 个氨基酸残基去掉 ; 二 : 为抵抗二肽激肽酶 Ⅳ 降解作用, 将 GLP?1 第二位丙氨酸替换为甘氨酸经糖尿病模型鼠的治疗两周后不仅血糖恢复正常, 胰岛体积有所增加 [4] 目前该序列已将被授予专利为了进一步延长 sglp?1 的半衰期并将其发展为治疗糖尿病的新型药物, 本研究采用毕赤酵母表达体系, 将 sglp?1 与人血清白蛋白进行融合表达, 通过发酵和纯化条件的优化, 获得了大量具有生物学活性的 sglp?1/hsa, 为今后临床实验研究和新药开发奠定基础 1 材料 1.1 试剂限制性内切酶 EcoRⅠ NotⅠ BamHⅠ SalⅠ T4 DNAligase ExTaq 酶质粒提取试剂盒凝胶回收试剂盒 DNA 片段纯化试剂盒购自 TaKaRa 公司 ;G418 购自

2 20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No Sigma 公司 ; 胰蛋白胨酵母提取物购自 OXOID 公司 ; SephadexG?25 购自 AmershamPharmaciaBiotech 公司 ; 蓝色琼脂糖凝胶购自北京天来生物有限公司 ; 兔抗 GLP?1 抗体购自北京奥博森生物技术有限公司 ; 大鼠胰岛素 (INS) 试剂盒购自美国 ADL 公司 ;BCA 蛋白含量检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司 1.2 载体与菌株 PichiapastorisGS115, 质粒 ppic9k 购自 Invitrogen 公司 ; 大肠杆菌受体菌 JM109 购自 TaKaRa 公司 ; puc18?hsa 由本实验室保存 1.3 仪器和设备 PCR 仪 ( 美国伯乐公司 ); 电穿孔仪 ( 美国伯乐公司 ); 发酵罐 ( 德国贝郎公司,5L); 血糖检测试纸和仪器 ( 美国强生公司 ) 2 方法 2.1 sglp?1 序列设计及拼接根据 sglp?1 序列设计 4 条寡核苷酸片段 5 端引入 EcoRⅠ 位点和信号肽酶 Kex2 的酶切位点 Glu?Lys? Arg;3 端引入柔性连接子序列 GlyGlySerGlyGlySer, 其末尾两个氨基酸 GlySer 中包含 BamHⅠ 位点引物序列见表 1 表 1 拼接 sglp?1 所需引物及序列 Fig.1 ThesequenceofsGLP?1primers 引物引物序列 (5?3 ) sglp?1?f 5?TAGAATTCGAGAAAAGACATGGTGAAG GGACCTTTACCAGTGA?3 sglp?1?r 1 5?TGGCCTTCCAAATAAGAACTTACATCAC TGGTAAA?3 sglp?1?r 2 5?AAGCAATGAATTCCTTGGCAGCTTGGCC TTCCAAA?3 sglp?1?r 3 5?ATGGATCCACCTGAGCCACCCAGCCAAG CAATGAATT?3 PCR 第一轮反应 :sglp?1f,sglp?1r 1 互为模板, 反应条件为 94,10s;55,10s;72,10s;10 个循环后, 72 延伸 7min 第二轮反应: 以第一轮反应产物为模板,sGLP?1?F 和 sglp?1?r 2 为引物进行扩增, 反应条件为 94 预变性 30s, 其余条件均同第一轮反应第三轮反应 : 以第二轮反应产物为模板,sGLP?1?F 和 sglp?1? R 3 为引物进行扩增,94 预变性 30s 后,94,30s; 55,20s;72,20s,30 个循环之后,72 延伸 7min 反应结束后凝胶回收 115bp 片段 2.2 sglp?1/hsa/ppic9k 融合表达载体的构建根据 HSA 序列合成引物 :alb?pf:5?atgaattcgg TGGATCCGATGCACACAAGAGTGAGGTTG?3 ;alb?pr:5?atgcggccgcttaccgccggtaagcctaaggcagctt GAC?3 ; 上游引物 alb?pf 的 5 端引入了 EcoRI 和 BamH I 限制性内切酶位点, 下游引物 alb?pr5 端引入 NotI 限制性内切酶位点和终止子 TAA; 用这对引物扩增 HSA 基因, 获得了 5 端含有 EcoRI 和 BamHI,3 端含有终止子和 NotI 的白蛋白基因序列反应条件为 55 30s; s 经 30 个循环,72 延伸 7min 根据克隆的需要, 将 ppic9k 上 8984bp 位置上的 BamH I 位点进行突变将扩增产物 HSA 纯化后与 ppic9k 分别进行 EcoR I NotⅠ 双酶切, 连接后转入 EcoliJM109 中挑取单菌落,PCR 鉴定后, 提取重组质粒 HSA?PIC9K 备用将所获 sglp?1 目的基因与 HSA? PIC9K 载体分别进行 EcoRⅠ BamH I 双酶切, 连接后电穿孔转化 E.coliJM109 涂于氨苄青霉素平板, 经 PCR 鉴定后, 提取质粒测序 sglp?1/hsa/ppic9k 构建过程 ( 图 1) 2.3 毕赤酵母转化及筛选提取鉴定正确的质粒 sglp?1/hsa/ppic9k 用限制酶 SalⅠ 酶切后回收, 取 2μg 线性化片段与 40μl 感受态毕赤酵母细胞混合, 冰浴 5min 后, 电击转化, 参数为 2.5kV,25μF 电击结束后, 涂于 MD 平板,30 培养至转化子出现将 MD 平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到 G418 浓度分别为 0.5g/L 1g/L 2g/L 3g/L 4g/L 5g/L 的 YPD 平板上 30 培养, 筛选高拷贝转化子 [5] 挑取 G418 抗性高的转化子, 用冻融法裂解菌体释放基因组 DNA, 以信号肽上的测序引物 α?facter primer 和 alb?pr 进行 PCR 鉴定 2.4 诱导表达挑取 PichiapastorisGS115/sGLP?1/HSA 单菌落接种于 50mlYPD 培养基中,28,200r/min 振荡培养过夜, 次日转接入 300mlBMGY 培养基中, 继续培养 24h 作为上罐种子液发酵罐中最初加入 2L 基础培养基 (CaSO 4 2H 2 O0.9g/L,K 2 SO g/L,MgSO 4 15g/L,H 3 PO 4 27ml/ L,KOH4.13g/L, 甘油 35ml/L), 高压灭菌, 冷却后加入 8.8mlPTM [6], 用浓氨水调 ph 值为 5.5, 将种子液接种于发酵罐中培养 16h 左右后, 培养液中甘油耗尽, 以控制恒定的溶氧浓度的方式向培养基中流加甘油溶液 1L(10ml/L PTM,1.34%YNB,50% 甘油 ) 甘油流加完毕 OD 600 增至 500 左右, 开始流加甲醇溶液 0.5L(10ml/LPTM,1.34% YNB,99% 甲醇 ), 同时流加山梨醇溶液 0.25L(60% 山梨醇,40% 水 ) 作为混合碳源进行诱导表达 [7] 此阶段持续

3 2009,29(8) 高华等 : 截短型胰高血糖素样肽?1 的融合构建与表达 21 的时间约 48h 发酵过程始终控制温度在 28, 发酵液 ph 值为 5.5, 以调节搅拌转速和通气量的方式控制发酵液的溶氧为 30% 左右发酵周期为 72h [8] 图 1 重组表达载体 sglp?1/hsa/ppic9k 构建流程 Fig.1 ConstructionmapofrecombinantexpresionvectorsGLP?1/HSA/pPIC9K 2.5 纯化发酵液预处理发酵液离心收集上清液用 300K 超滤膜超滤, 收集滤过液, 再用 5K 滤膜将滤过液体积浓缩至发酵液体积的 1/5 将浓缩后的发酵液进行 Sephadex?G25 柱除盐 : 用 10 倍柱体积的 10mmol/L ph8.0 的磷酸缓冲液平衡 Sephadex?G25 柱后上样, 上样量为柱体积的 1/3, 然后用相同缓冲液淋洗, 收集第一个洗脱峰亲和层析蓝色凝胶中的染料 Cibacronblue 3GA 能够亲和吸附白蛋白, 适合用于发酵液中纯化目的蛋白 [9] 用 ph 值 8.0 的 10 倍柱体积的 10mmol/L 磷酸缓冲液平衡蓝色凝胶柱后, 将除盐后收集液体进样, 用 10mmol/L ph8.0 的磷酸缓冲液漂洗蓝色凝胶柱至基线平稳用含 2mol/LNaCl 的 10mmol/L ph8.0 的磷酸缓冲液洗脱, 收集洗脱峰,5K 超滤膜浓缩后, 冻干保存 2.6 生物活性检测 sglp?1/hsa 体外促进胰岛 β 细胞增殖试验将 BetaTC?3 细胞接种于 96 孔板中, 细胞浓度为个 /ml 分别用含 sglp?1/hsa 和阳性对照药品 GLP?1( nmol/L) 的完全 RPMI 培养液培养, 培养过程中每 12h 补加 sglp?1/hsa 和 GLP?1 使其浓度维持在设定浓度共培养 48h 在各组实验结束前 4h 分别向各孔中加 MTT20μl 待实验结束时将各孔中的培养液吸尽, 加入二甲基亚砜 150μl, 溶解后测 OD 值 sglp?1/hsa 对正常小鼠血糖的影响取体重 18~20g 的 BALB/c 小鼠 30 只, 按血糖水平均衡原则分组 :sglp?1/hsa 高剂量组 (40nmol/kg) 中剂量组 (20nmol/kg) 低剂量组 (10nmol/kg) rhglp?1 组 (10nmol/kg) 盐水对照组皮下注射,15min 后尾静脉取血测定血糖值 sglp?1?hsa 对正常小鼠糖耐量的影响取体重 18~20g 的 BALB/c 小鼠 12 只, 禁食 8h, 按血糖均衡原则分为 3 组 : 盐水对照组重组 GLP?1(rhGLP?1, 天然 GLP?1 第二位 Ala 突变为 Gly) 组和 sglp/hsa 组 3

4 22 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 组均腹腔注射 20% 葡萄糖 0.5ml, 随后各组分别腹腔注射生理盐水 rhglp?1(10nmol/kg) 和 sglp?hsa (10nmol/kg) 于给药 30min 60min 和 120min 后尾静脉采血, 测定血糖值 sglp?1?hsa 在正常大鼠体内的半衰期检测大鼠尾静脉注射 sglp?1?hsa, 剂量为 10nmol/kg 分别选取不同的时间点割尾取血, 使用兔抗人 GLP?1 抗体检测血浆中融合蛋白的含量根据血液中 sglp?1?hsa 的浓度与检测时间绘制曲线计算 sglp?1?hsa 在大鼠体内的半衰期 GKⅡ 糖尿病大鼠体内活性检测 10 周到 12 周雄性 GKⅡ 型糖尿病大鼠, 使用高糖高脂饲料饲养, 按照血糖平均进行分组, 每组 5 只治疗组皮下注射 sglp?1/hsa, 给药剂量为 10nmol/kg, 每天给药 1 次, 持续给药 2 周阳性对照组分别为 rhglp?1 和 sglp?1, 给药方式为皮下注射, 给药剂量 10nmol/kg, 给药体积和时间同 sglp?1/hsa 组阴性对照组为生理盐水给药结束后割尾取血检测血糖和胰岛素水平 2.7 统计学处理所有结果以算术均值 ± 标准差表示, 组间比较采用 t 检验 3 结果 3.1 重组质粒的构建利用质粒 ppic9k 的多克隆位点中的 EcoRⅠ 和 NotⅠ 将 sglp?1 与 HSA 的 cdna 克隆至信号肽下游, 构建融合表达载体 sglp?1/hsa/pic9k EcoRⅠ 和 Not Ⅰ 双酶切后 1057bp 左右有一条带,EcoRⅠ 和 BamHⅠ 双切后 96bp 左右有一条带 ( 图 2), 证明 sglp?1 与 HSA 均正确克隆进 ppic9k 中将 sglp?1/hsa/pic9k 质粒测序, 结果证明 sglp?1 与 HSA 核酸序列与设计序列完全一致, 无碱基突变为了使目的基因整合到毕赤酵母染色体上, 将 sglp?1/hsa/pic9k 使用 SalⅠ 线性化通过电穿孔方法转化 PichiapastorisGS115(His - ) 感受态细胞, 涂布 MD 平板上 SalⅠ 线性化 ppic9k, 转化 GS115, 整合位点在 HIS4, 获得菌株基因型为 His + Mut + 将 MD 平板上所获数百个克隆转至含 G418 的 YPD 平板继续筛选, 得到抗性为 4mg/ml 的工程菌株 1 株 3.2 重组子诱导表达酵母工程菌株的发酵主要分为 3 个阶段 : 第一阶段, 在基础培养基中生长, 培养基的 ph 值和溶氧靠流图 2 重组表达载体 sglp?1/hsa/pic9k 酶切鉴定 Fig.2 IdentificationofplasmidsGLP?1/HSA/PIC9K withdigestionofrestrictionenzymes M1:λ?Hinf IDNAmaker;1:sGLP?1/HSA/PIC9Kdigestdwith EcoRⅠand,NotⅠ;2:sGLP?1/HSA/PIC9Kdigestd withecorⅠandbamhⅠ;m2:dl2000dnamaker 加氨水和提高搅拌速度来控制, 这一阶段约持续 24h, 至基础培养基中的甘油耗尽第二阶段, 流加甘油阶段, 此阶段由于菌体生长迅速靠通入氧气来维持溶氧值第三阶段, 使用甲醇作为碳源进行诱导表达, 在流加甲醇阶段同时流加山梨醇有助于菌体生长 SDS? PAGE 分析显示, 随着诱导时间的增加融合蛋白的表达量也在增加,48h 后达最大值 ( 图 3) 图 3 SDS?PAGE 分析融合蛋白 sglp?1?hsa 的表达 Fig.3 SDS?PAGEanalysisforexpresion fusionproteinsglp?1?hsa M:Proteinmaker;1:Beforeinduction;2~6:InducedsGLP?1/HSA/ GS115with4g/LG418(12,24,28,32,48h,respectively) 3.3 纯化纯化产物经 HPLC(C18,10μm, 西安美联 ) 积分处理结果显示纯度为 95%( 图 4), 使用 BCA 蛋白含量试剂盒对纯化过程中产物定量后计算回收率可达到 60% ( 表 2)

5 2009,29(8) 高华等 : 截短型胰高血糖素样肽?1 的融合构建与表达 23 MTT 法观察 sglp?1/hsa 对 BetaTC?3 细胞增殖的影响, 结果发现 sglp?1/hsa 能明显促进细胞增殖, 但无明显的剂量效应关系, 与阳性对照组无明显差别 ( 图 5) 图 4 HPLC 分析 sglp?1/hsa Fig.4 sglp?1?hsaanalysisedbyhplc 图 5 sglp?1/hsa 促进 TC?3 细胞增殖 ( 注 : 样品组与浓度为 0nmol/L 的细胞对照组比较 p<0.05) 3.4 生物活性检测 Fig.5 sglp?1/hsaimprovebetatc?3celreplication sglp?1/hsa 促进胰岛 β 细胞增殖试验采用表 2 sglp?1/hsa 纯化结果概括 Table2 SummaryofsGLP?1?HSApurification 总蛋白总体积 sglp?1?hsa 回收率过程纯度纯化倍数 g L g 部分总发酵上清 % % 100% 超滤 % % 90% SephadexG? % % 85% Blue?sepharose % % 60% sglp?1/hsa 对正常小鼠血糖的影响对正常小鼠给予不同剂量的 sglp?1/hsa 后,15min 后检测血别, 证明血糖值在正常范围内 sglp?1/hsa 没有降血糖作用 ( 表 3) 糖, 结果发现血糖变化不明显, 与盐水对照组无明显差表 3 GLP?1?HSA 对正常小鼠血糖的影响 Table3 Bloodglucose?loweringefectsofsGLP?1?HSAinhealthyrats 时间血糖 (mmol/l) sglp?1?hsa10nmol/kg sglp?1?hsa20nmol/kg sglp?1?hsa40nmol/kg 盐水对照组给药前 4.59± ± ± ±0.76 给药 15 分钟后 4.18± ± ± ± sglp?1?hsa 对正常小鼠糖耐量的影响腹腔注射葡萄糖后即皮下注射 sglp?1/hsa 和生理盐水, 结果发现给药组在给予葡萄糖后的血清葡萄糖值明显低于盐水对照组 ( 图 6) sglp?1?hsa 在正常大鼠体内的半衰期检测大鼠静脉注射 sglp?1?hsa10nmol/kg 后在不同时间取血, 兔抗 GLP?1 抗体检测血液中 sglp?1/hsa 含量, 绘制曲线 ( 图 7), 计算 sglp?1/hsa 的半衰期为 49.2h sglp?1?hsa 对 GKⅡ 型糖尿病大鼠血糖水平的影响 GKⅡ 型糖尿病大鼠连续皮下注射 sglp?1/hsa (10nmol/kg) sglp?1(10nmol/kg) rhglp?1(10nmol/ kg); 注射体积每只 0.2ml 对照组为同体积的生理盐图 6 sglp?1/hsa 对正常小鼠糖耐量的影响 Fig.6 TheefectofsGLP?HSAonglucose toleranceinhealthymice :p<0.05, :p<0.01

6 24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 图 7 sglp?1/hsa 在大鼠体内的半衰期检测 Fig7detectionhalflifeperiodofsGLP?1/HSAinmice 水, 给药 2 周后 sglp?1/hsa 治疗组血清葡萄糖水平明显低于生理盐水对照组, 给药组血糖均已恢复到正常值范围,sGLP?1?HSA 与 rhglp?1 和 sglp?1 组相比降糖效果有显著性差异 ( 图 8) 各组对 GKⅡ 型糖尿病大鼠胰岛素分泌水平无明显影响 ( 表 4) 图 8 sglp?1/hsa 对 GK Ⅱ 型糖尿病大鼠血糖水平的影响 Fig.8 Bloodglucose?loweringefectsofsGLP?1 ingk ratswithtypeⅡ diabetes :p<0.05, :p<0.01 表 4 sglp?1/hsa 对 GKⅡ 型糖尿病大鼠胰岛素分泌的影响 Table4 TheefectsofsGLP?1/HSAoninsulinin GK ratswithtypeⅡ diabetes 组别胰岛素 (miu/l) sglp?1/hsa 36.51±9.54 rhglp 34.47±7.30 盐水对照 32.66±7.94 ( 表中各组间比较统计学差异不显著,P>0.05) 4 讨论糖尿病是世界性疾病, 对人类健康造成严重威胁国外对 GLP?1 的研究非常重视, 鉴于 GLP?1 体内生理含量低, 多采用化学合成方法制备, 而化学合成方法技术难度大成本高纯化困难而且会造成环境污染本研究使用巴氏毕赤酵母表达系统进行重组表达 sglp? 1/HSA 融合蛋白, 相对于化学合产量高成本低将 sglp?1 与人血清白蛋白进行融合表达目的在于减少肝脏清除作用和肾小球的过滤, 延长其在体内的作用时间 sglp?1/hsa 的基因克隆在信号肽下游, 进行分泌表达在融合基因中 sglp?1 基因的 N 端加入了蛋白酶 Kex2 的酶切位点, 可将信号肽完全切除, 获得正确的 N 端序列本研究采用了体外胰岛 β 细胞模型和正常动物, 遗传性糖尿病模型, 结果表明 sglp?1/hsa 能促胰岛 β 增殖, 体内具有葡萄糖依赖性的促胰岛素释放作用不会发生低血糖现象这对 Ⅱ 型糖尿病的治疗具有重要意义目前世界上在临床上可使用的唯一的胰高血糖素样肽?1 类似物类药物是 Exendin?4, 商品名 BYETTA, 目前在中国正申报临床实验, 尚未上市本研究的 sglp?1/hsa 与 BYETTA 相比具有多方面优势, BYETTA 属于异源肽与人 GLP?1 只有 53% 的同源性, 在人体内易产生抗体 BYETTA 一天注射两次, 且胃肠反应严重, 病人不易接受 sglp?1 长期使用在人体内不会产生抗体, 半衰期长, 生产成本低, 一旦成功上市无论是知识产权还是在技术上, 在国际竞争中均有明显优势参考文献 [1]VelaA,ShahP,BasuR,etal.Efectofglucagonslike peptide1(7?36)amideonglucoseefectivenesandinsulin actionpeoplewithtype2diabetes.diabetes,2000,49(4):611 ~617 [2]WildingJP,SmithD M,GhateiM A,etal.A rolefor glucagons?likepeptide?1inthecentralregulationoffeeding. Nature,1996,379:69~74 [3]MentleinR,GalwitzB,SchmidtW E,DipeptidylpeptidaseⅣ hydrolyses gastric inhibitory polypepetide, glucagons?like peptide?1(7?36)amide,peptidehistidinemethionineandis responsible fortheirdegradation in human serum. EurJ Biochen,1993,214:829~835 [4]LiYuan,ShiChanghong,LvQiujun,etal.GLP?1C?terminal structuresafectitsbloodglucoselowering?function.jpeptsci, 2008,14:777~785 [5]ScorerCA,ClareJJ,McCombieW R,etal.Rapidselection usingg418ofhighcopynumbertransformantsofpichiapastoris

7 2009,29(8) 高华等 : 截短型胰高血糖素样肽?1 的融合构建与表达 25 forhigh?levelforeigngeneexpresion.bio/technology,1994, 12:181~184 [6]ClareJJ,RaymentFB,BalantineSP,etal.High?level expresionoftetanustoxinfragmentcinpichiapastorisstrains containingmultipletandem integrationsofthegene. Bio/ Technology,1991,9(4):455 ~460 [7] 夏杰, 徐殿胜, 陆兵等. 巴氏毕赤酵母 SMD1168 表达人溶菌酶的发酵条件. 华东理工大学报,( 自然科学版 ),2003,29 (4):367~371 XiaJ,XuDS,LuB,etal.JournalofEastChinaUniversityof ScienceandTechnology(NaturalScienceEdition),2003,29 (4):367~371 [8] 刘彦丽, 刘永东, 王艳辉, 等. 毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白高密度培养条件的研究. 北京化工大学学报,2003, 30(4):25~28 LiuY L,Liu Y D,WangY H,etal. JournalofBeijing UniversityofChemicalTechnology(NaturalScienceEdition) 2003,30(4):25~28 [9] 邱荣德, 李士云, 陈俊刚, 等. 重组人血清白蛋白在 Pichia pastoris 中的表达与纯化. 生物化学与生物物理学报,2000, 32(1):59~62 QiuR D,LiS Y,Chen JG,etal. ActaBiochimicaet BiophysicaSinica,2000,32(1):59~62 ConstructionandExpresionofsGLP?1?HSAFusionProtein GAOHua 1 XUChong?bo 1 LIYuan 2 (1KeyLaboratoryofBio?organicChemistryofLiaoningProvince,ColegeofMedicine,DalianUniversity,Dalian ,China) (2DalianD.NBio?engineeringCO.,LTD,Dalian ,China) Abstract ToreducetheclearanceofsGLP?1,sGLP?1?HSAfusionproteinwasconstructedbythefusionof thec?terminusofsglp?1tothen?terminusofhsa viaan6aminoacidslinkerandexpresedinthepichia pastoris.screenthestrainwithresistsnceof4g/lg418.afterfermentationina5lbioreactor,theexpresionof sglp?1?hsawasinducedbymethanol.after48h,theexpresionlevelreached0.8g/l.thesglp?1?hsawas abtainedfolowingaseriesofpurificationstepssuchasultrafiltration,sephadexg?25andblue?sepharose.the purityofthefermentationproductcouldreach95% bymeansofhplc,andthetotalrecoveryyieldcouldreach 60%.ThebiologicalactivityofsGLP?1?HSA ingkⅡ diabetesratandhealthyratsuggestedthattheplasma glucoselevelwassignificantlyloweraftersubcutaneousadministrationofsglp?1?hsa..expresionofsglp?1? HSA fusionproteincanprovidefoudationforabtainingalargerquantityofrecombinantsglp?1?hsa for experimentedandclinicstudies. Keywords Shortedglucagonlikepeptide?1 TypeⅡdiabetes Pichiapastoris Fusionexpresion

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No Sigma 公司 ; 胰蛋白胨 酵母提取物购自 OXOID 公司 ; SephadexG?25 购自 AmershamPharmaciaBiotech 公司 ; 蓝色琼脂糖凝胶购自北京天来生物有限公司 ; 兔

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