2016,32(6) 梁果义等 : 重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究 227 泌表达胰岛素的基因, 然而由于该基因自身的一些特点, 多数研究表达胰岛素的量均较低现在已有

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瓦世林
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1 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 2016, 32(6): 重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究梁果义1 甘一迪1 刘晓航1 蔡祥胜2 1. 北京双鹭药业股份有限公司北京南方医科大学生物治疗研究所广州摘要为了提高胰岛素在酵母的分泌表达效率首先合成了胰岛素原基因并在其序列的 N 端引入了一段引导肽构建成 ppiczα-a-pro-ins 重组分泌型表达载体将表达载体线性化处理后电击转化毕赤酵母 GSll5 感受态细胞筛选获得分泌型高表达工程菌株重组蛋白的表达水平为 300 mg/l 占分泌总蛋白的 40 左右该结果表达明引导肽的存在对于在毕赤酵母中高效表达胰岛素的基因至关重要关键词胰岛素毕赤酵母高效表达引导肽 DOI /j.cnki.biotech.bull Study on the Highly Secreted Expression of the Recombinant Insulin in Pichia pastoris LIANG Guo-yi1 GAN Yi-di1 LIU Xiao-hang1 CAI Xiang-sheng2 1. Beijing SL Pharmaceutical Co. Ltd. Beijing Institute of Biotherapy of Southern Medical University Guangzhou Abstract: In order to improve the efficiency of insulin secretion expression in yeast firstly the pro-insulin gene was synthesized and a recombinant secreted expression vector ppiczα-a-pro-ins was constructed by inserting a leader peptide to N-end of the gene s sequence. Linearized expression vector was transformed into the competent cells of Pichia pastoris GSll5. A strain with highly secreted expression of the insulin was screened by which the secreted recombinant protein expression level was 300 mg/l accounting for about 40% of the total secreted protein. This result revealed that the leader peptide is crucial to the gene of highly expressing insulin in P. pastoris. Key words: insulin Pichia pastoris highly expression leader peptide 糖尿病是一种全身性慢性疾病病因复杂并例如可对表达的蛋白进行翻译后加工与修饰具发症多治愈率低成为国际医学的一大难题被有强的可控的醇氧化酶基因强启动子表达载体是世界卫生组织称为不死的癌症胰岛素是治疗糖尿整合在染色体上糖基化程度低使其所分泌的糖蛋病最基础最有效的药物也是 FDA 批准的第一白的免疫原性较低利于临床应用等目前在毕赤个用于人类的基因重组药物目前胰岛素作为重酵母中已有许多基因成功的实现了高效表达如破组蛋白产品主要有两条途径获得一条途径是在伤风毒素基因在毕赤酵母中表达后其产量达 12 大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体通过溶解和 g/l 2 而来源于人的人血清蛋白基因经表达后其复性等过程获得胰岛素另外一条途径是通过酵母产量达 10 g/l 3 然而仍有些蛋白的表达水平较低表达系统分泌表达可溶性的胰岛素前体进入培甚至表达出来没有活性因此我们还需进一步研养液 1 毕赤酵母 Pichia pastoris 表达系统许多优点究提高外源蛋白在其体内的表达近年来也有很多学者研究利用毕赤酵母来分收稿日期作者简介梁果义男研究生研究方向生物医药 guoyi_liang@163.com

2 2016,32(6) 梁果义等 : 重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究 227 泌表达胰岛素的基因, 然而由于该基因自身的一些特点, 多数研究表达胰岛素的量均较低现在已有一些研究通过优化表达核的启动子拷贝数对宿主菌进行改良优化培养条件等方法来提高胰岛素的表达量 [4] 尽管这些方法可以在一定程度上提高其表达量, 但是现有的文献报到, 其表达量较低 [5,6] 早在 1996 年,Kjeldsen 等在酿酒酵母中表达完整的人胰岛素原 cdna 基因时, 发现胰岛素原蛋白大部分累积在胞内而不能分泌到胞外, 而将编码胰岛素原 cdna 分子中的 β 链中的第 30 位氨基酸去除, 并接上短的 C 肽链, 且与酿酒酵母的 α 交配因子前导肽相融合, 则可以有效的提高单链胰岛素原的分 [7,8] 泌表达量在此基础上,Kjeldsen 等也在毕赤酵母中成功的表达胰岛素原基因, 且在前导肽与外源蛋白之间引入一段间隔肽 EEAEAEAEPK, 这样在前导肽的引导下, 表达的胰岛素原可以正确的折叠, 形成正确的二硫键以及提高其分泌表达 [9] 量刘海峰等利用毕赤酵母表达人胰岛素原基因时, 在胰岛素原基因的 N 末端引入同样的一段间隔肽 EEAEAEAEPK, 发现虽然其可以提高目的蛋白的表达量, 但间隔肽中多个酶切位点造成胰岛素原蛋白 N 末端的不均一性利用间隔肽还可促进其 [10] 它的基因如 S- 腺苷甲硫氨酸合成酶基因和植酸 [11] 酶基因等在毕赤酵母中的分泌表达胰岛素工程菌的表达量一直是困扰胰岛素制备的一个难题, 本研究结合前人研究的基础, 重新设计胰岛素酵母表达的方式采用 ppiczαa 载体, 在分泌信号肽和胰岛素原之间引入一段间隔肽, 构建载体转化酵母受体菌 GS115, 利用 zeocin 抗性筛选高拷贝重组子, 表达验证来获得高表达胰岛素的酵母工程菌种 1 材料与方法 1.1 材料菌株与载体大肠杆菌 (Escherichia coli) TOP10 感受态细胞购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司, 毕赤酵母菌株 GS115 由本实验室保存 ; 大肠杆菌 - 毕赤酵母穿梭质粒载体 ppiczα-a 由本实验室保存试剂 T4 DNA 连接酶限制性内切酶 (Xho I 和 NotI) PfuDNA 聚合酶 dntp 及 DNA Maker (DL2000) 均购自大连 TaKaRa 公司 ; 博来霉素 (Zeocin) 购自 Invitrogen 公司, 胰蛋白胨 (Trypsin) 和酵母提取物 (Yeast extract), 英国 Oxoid 公司 ; 质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自美国 Omega 公司其他化学试剂均为国产分析纯, 购自北京化学试剂公司培养基 (1)LB 培养基 :1.0% 胰蛋白胨,0.5% 酵母提取物,1.0% NaCl, 调节 ph 值至 7.0( 固体培养基含 1.5% 琼脂 ) (2)YPG 培养基 :2.0% 胰蛋白胨,1% 酵母提取物,2% 甘油 ( 固体培养基含 1.5% 琼脂 ) (3) 完全培养基 YPD :2.0% 胰蛋白胨,1% 酵母提取物,2% 葡萄糖 (4) 诱导表达培养基 BMGY :2.0% 胰蛋白胨,1% 酵母提取物, 1.34%YNB,2% 甘油,10 mmol/l 磷酸钾 (ph6.0) 生物素 %( 无菌过滤加入 ) (5) 诱导表达培养基 BMMY :2.0% 胰蛋白胨,1% 酵母提取物, 1.34%YNB,0.5% 甲醇,10 mmol/l 磷酸钾 (ph6.0) 生物素 %( 无菌过滤加入 ) 1.2 方法胰岛素原的 cdna 序列的合成及酵母表达重组载体的构建在参阅文献以及前期相关研究的基础之上, 充分考虑到目的蛋白的分泌表达酶切纯化回收等各个环节, 确定其引导肽的序列为 EEAEAEAKR, 根据 Codon Usage database( kazusa.or.jp/codon/)p. Pastoris 密码子使用偏好性数据, 设计甘精胰岛素原类似物核苷酸序列, 在序列后面设计两个 TAA 终止密码子序列, 并在序列 5' 端和 3' 端分别设计 Xho I(CTCGAG) 和 Not I (GCGGCCGC) 限制性酶切位点具体序列为 CTCG AGAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTAAGAGA TTCGTCAACCAGCACTTGTGCGGTTCTCACTTGGTTG AGGCCTTGTACTTGGTCTGTGGTGAGCGTGGTTTCTT CTACACCCCAAAGACCAGACGTGGTATCGTTGAGC AGTGTTGCACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAGTTGG AGAACTACTGTGGTTAATAAGCGGCCGC 委托生金维智生物科技有限公司对本公司设计完整的 cdna 序列进行全基因合成, 并将上述全基因合成的 cdna 插入 PUC57 质粒, 构建重组质粒

3 228 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6 PUC- Pro-INS 用限制性内切酶 Xho I 和 Not I 酶切 acid TCA 沉淀配制试剂液 50% 的 TCA 加入 0.2% 利用质粒胶回收试剂盒回收目的基因片段并保存的去氧胆酸钠取 25% 的试剂液与 75% 的培养基然后将目的基因连入表达载体 ppiczα-a 离心上清液体积比混合均匀在冰块上放置重组酵母菌株的转化和诱导表达 min 离心 g 20 min 倒去上清液毕赤酵母感受态细胞的制备挑取毕赤酵用 10% 的 TCA 悬浮离心条件同上倒去上清母 GS115 单菌落接种到装有 5 ml YPD 培养基的 50 液用冷丙酮 -20 再悬浮离心条件同上 ml 三角瓶中 r/min 培养过夜取 5 ml 用吹风机吹干沉淀用 SDS buffer 溶解浓缩进行电过夜菌液到 100 mlypd 中 r/min 培养泳或 HPLC 检测 OD600= 收菌将 50 ml 菌液移入离心管 g 离心 5 min 无菌彻底去掉上清用 10 ml 1mol/L D-Sorbitol 悬浮菌体 g 离心 5 min 无菌去掉上清用 10 ml1mol/l D-Sorbitol 悬浮菌体 g 离心 5 min 反复 5 次用 μl 1 mol/l D-Sorbitol 悬浮菌体冰水浴备用毕赤酵母的电转化取 80 μl 酵母感受态细胞菌液至预冷的 0.2 cm 电转杯中加入线性化的质粒 20 μl 浓缩质粒混匀置冰上 5 min 或 -20 放置 1 min 将电转杯放入电转仪中电转电压结果 2.1 酵母阳性转化子的筛选将转化有胰岛素表达核的重组毕赤酵母分别点在含 100 μg/ml 300 μg/ml 600 μg/ml Zeocin 的 YPD 平板上进行培养来筛选整合有高拷贝表达核的重组子平板结果见图 1 从图 1 可以明显发现有些酵母的基因组中可能整合了多个拷贝的基因表达核可能会高效表达胰岛素的基因 A B 2.0 kv 电击时间 5 ms 立即加入 1 ml 预冷无菌 1 mol/l 的 D-Sorbitol 静止 60 min 取 200 μl 菌液涂布 MD 板平放 30 烘箱 min 再倒放培养 3-5 d 筛选毕赤酵母多拷贝重组子用无菌牙签随机挑取在 YPG-Zeocin 平板上生长较快的微量毕赤酵母重组子到含不同 Zeocin 浓度 300 μg/ml 600 A 300 μg/ml Zeocin 筛选平板 B 600 μg/ml Zeocin 筛选平板 μg/ml 的固体平板上同一重组子在不同 Zeocin 图1 转化子抗性平板筛选的结果浓度的固体平板上编相同的号码根据整合的外源基因的拷贝数与 Zeocin 抗性大小之间的计量依赖关挑选整合有高拷贝的 8 株转化子进行摇瓶诱系可推断仅在低浓度 Zeocin 平板上长出来的细胞导表达培养并检测其表达胰岛素的量蛋白质电为低拷贝重组子在高浓度 Zeocin 平板上长出来的泳结果见图 2 从图 2 中可以发现胰岛素可以被高细胞为高拷贝重组子恒温箱设置为 30 静置培效诱导分泌表达到胞外重组蛋白的表达水平最高养 3-5 d 每日检查不同 Zeocin 浓度平板出现的菌落可以达到到 300 mg/l 占分泌总蛋白的 40 左右毕赤酵母重组子的诱导表达摇瓶筛选分文献报道 12 没有加前导肽的毕赤酵母转化子中别在含 100 μg/ml 300 μg/ml 600 μg/ml Zeocin 的胰岛素获得的最高分泌表达量仅为 32 mg/l 在胰导 YPD 平板上挑取不同拷贝数的重组子菌落接种于素前体的 N 端加上前导肽后可以提高其表达量约 100 ml BMGY 培养液的 ml 摇瓶中 30 摇为 10 倍床培养约 h 至 OD600 为 2-6 时无菌条件下 2.2 工程菌诱导表达蛋白的质谱测定更换等体积的 BMMY 培养液进行诱导 28 继续培将表达的胰岛素前体从 SDS-PAGE 电泳中切下养 120 h 每隔 24 h 补加终浓度为 0.5% 的甲醇诱后进行色谱纯化从色谱图图 3 中可以发现该导结束离心后上清液用三氯乙酸 Trichloroacetic 蛋白出峰的保留时间约为 14.9 min 纯度为 100%

4 梁果义等重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究 2016,32(6) 䈡ሬ ሩ 的多肽如果用常规方法构建单拷贝基因的重组质粒则目的基因在细胞中的表达量很低无法体现基因工程产量高的优势其原因是表达产物的分子太小在细胞中不稳定容易被宿主蛋白酶降解因此建立一套适合小分子肽表达的体系以实现㜠ዋ 毕赤酵母作为目前应用最成功的一种外源基因真核表达系统可以高效分泌表达外源基因然而 1-8 高拷贝重组子图2 小分子多肽在体外的高效表达极为重要许多基因由于基因自身的性质很难在该表达系统蛋白质电泳结果中得到高效表达其中胰岛素就是其中的一个例子将获得的重组胰岛素前体进行质谱测定其分子量为有研究通过提高胰岛素基因表达核的拷贝数优化 7.08 kd 与其理论分子量 7.08 kd 基本一致该结发酵条件启动子等方法可以提高其分泌表达量果初步表明表达的重组蛋白质为胰岛素前体在此但是其表达量依然很低本研究发现在其 N 端融合基础上对目标条带进行一级质谱检测图 4 选一种前导肽可以提高其分泌表达量也再次表明取信号强度较好的两个肽段进行二级质谱并搜索蛋白质 N 端的序列和其在毕赤酵母中的分泌表达密 Mascot 数据库分析表明检测的蛋白质为胰岛素前切相关但到目前为止仍还不清楚为什么这段前体中的蛋白质片段从而证明胰岛素原在毕赤酵母导肽能大幅度提高胰岛素前体表达量的原因另外中成功实现表达关于其应用的普遍性也需要进一步的研究优化发酵条件提高酵母的产量实现目的多肽的高表达用发酵罐高密度培养能大量提高表达 1000 量这是因为在发酵罐中溶解氧水平通气量 PH 搅拌速度营养补给等方面更容易得到优化有 500 机体能高密度生长也可获得目标产物更高效的表达分泌表达可稳定表达产物减少蛋白水解酶作用图 min 回收样品 HPLC 色谱图结论本研究构建了 ppiczα-a-pro-ins 重组载体将 A.7089 Components 表达载体转化毕赤酵母 GSll5 利用 Zeocin 抗生素筛选高抗重组菌株重组子甲醇诱导表达筛选获得高表达菌种基本上与其 Zeocin 浓度呈正相关蛋白的表达水平最高可达 300 mg/l 占分泌总蛋白的 40 左右获得的重组胰岛素前体分子量为图4 3 步提高分泌表达量 4 10 min 对已经筛选出来的菌株通过优化发酵条件可进一 kd 与其理论分子量一致质谱检测结果参考文献讨论利用基因重组技术在体外大量制备活性多肽是目前生物制品研究的热点之一对于许多分子较小 1 Baeshen NA, Baeshen MN, Sheikh A, et al. Cell factories for insulin production Ｊ. Microb Cell Fact, 2014, Clare JJ, Rayment FB, Ballantine SP, et al. High-level expression

5 230 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6 of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene[j]. Biotechnology(N Y), 1991, 9 : [3] 崔蕴霞, 明文玉, 银巍, 等. 人重组白蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 [J]. 微生物学报, 2001, 41(2): [4] 马银鹏, 王玉文, 党阿丽, 等. 毕赤酵母表达系统研究进展 [J]. 黑龙江科学, 2013, 9 : [5]Kjeldsen T, Brandt J, Andersen AS, et al. A removable spacer peptide in an alpha-factor-leader/insulin precursor fusion protein improves processing and concomitant yield of the insulin precursor in Saccharomyces cerevisiae[j]. Gene, 1996, 170 : [6]Kjeldsen T, Hach M, Balschmidt P, et al. Prepro-leaders lacking N-linked glycosylation for secretory expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae[j]. Protein Expr Purif, 1998, 14 : [7]Kjeldsen T, Pettersson AF, Hach M. Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[j]. Biotechnol Appl Biochem, 1999, 29(Pt 1): [8]Kjeldsen T. Yeast secretory expression of insulin precursors[j]. Appl Microbiol Biotechnol, 2000, 54 : [9] 刘海峰, 周祥山, 庞甲佩, 等. 毕赤酵母表达人胰岛素前体的纯化和 N 末端不均一性分析 [J]. 华东理工大学学报 : 自然科学版, 2013, 39(5): [10] 秦秀林, 钱江潮, 储炬. 利用间隔肽促进 S- 腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达 [J]. 生物技术通报, 2013(6): [11] 熊爱生, 彭日荷, 李贤, 等. 信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响 [J]. 生物化学与生物物理学报, 2003, 35(2): [12] 何尧声. 重组人胰岛素在毕赤酵母中的分泌表达 [D]. 海口 : 海南大学, ( 责任编辑李楠 )

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