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1 ICS C47 YY 中华人民共和国医药行业标准 YY/T XXXXX XXXX 清洗消毒器湿热消毒效果的验证方法 Verification method for demonstrating disinfection efficacy of washer disinfectors 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 ( 征求意见稿 ) ( 本稿完成日期 : ) XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施 国家食品药品监督管理总局 发布

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3 目 次 前言... II 1 范围 规范性引用文件 术语和定义 试验材料 试验设备 试验器具 试验菌种的准备 消毒效果测试指示物的准备 染菌载体的准备 针对不同用途的试验要求 消毒效果验证 屎肠球菌耐热性的确定 实验室安全... 6 附录 A( 规范性附录 ) 培养基和试剂... 7 参考文献... 9 I

4 前 言 本标准按照 GB/T 的规定进行编制 本标准的技术内容参考了 ISO/TS :2005 附录 G 用于外科器械 玻璃器具和麻醉设备的清洁效果测试指示物 ( 英文版 ) 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由国家食品药品监督管理总局提出 本标准由全国消毒技术与设备标准化技术委员 (SAC/TC 200) 会归口 本标准起草单位 : 本标准主要起草人 : 本标准于 201 年首次发布 II

5 清洗消毒器湿热消毒效果的验证方法 1 范围 本标准规定了对用于外科器械和麻醉设备等医疗器械进行湿热消毒的清洗消毒器的消毒效果的测试指示物和试验方法 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本文件 中华人民共和国药典 (2010 年版 ) 二部 消毒技术规范 ( 中华人民共和国卫生部出版,2002 版 ) GB/T 开槽圆柱头螺钉 GB 8599 大型蒸汽灭菌器技术要求自动控制型 YY 0646 小型蒸汽灭菌器自动控制型 GB 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 标准菌株 type culture strain/reference strain 由国内或国外菌种保藏机构提供的 遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株 3.2 标准储备菌株 stocking culture strain/reference stocks 由标准菌株经过复苏并在适宜的培养基中生长后得到的培养物 3.3 工作菌株 subculture strain/working cultures 由标准储备菌株经传代得到的培养物 3.4 染菌载体 carrier covered by test microorganism 试验微生物的支持物 1

6 4 试验材料 4.1 染菌载体 不锈钢螺钉, 规格符合 GB/T M6 20 橡胶软管, 内径 :6mm, 管壁厚度 :2mm, 无热原, 冷轧 4.2 消毒效果测试指示物 去纤维蛋白羊血 ( 参照制造商说明 ) 小麦泥 蛋黄液 5 试验设备 试验用设备包括但不仅限于以下设备 : a) 二级生物安全柜 b) 蒸汽灭菌器, 符合 GB 8599 或 YY0646 的要求 c) 恒温培养箱 : 温度恒定在 (36±1) d) 恒温水浴箱 / 水浴槽 e) 旋涡式振荡器 / 旋涡混匀器 f) 集热式磁力搅拌器 g) 纯水系统 h) 电子加热板 i) 微量移液器 :10μL 20μL 100μL 200μL 1000μL 和配套一次性塑料吸头 j) 生物光学显微镜 k) 冰箱 : 温度能保持在 2 ~10 l) ph 计 :25 时标示 ph 值精确至 0.01pH 单位 m) 电子天平 : 分辨力 0.001g n) 秒表 o) 超声波清洗器 p) 玻璃干燥皿 : 干燥剂为变色硅胶或无水氯化钙 6 试验器具 试验用器具包括但不仅限于以下器具 : a) 无菌移液管 :10mL 5mL 和 1mL b) 无菌锥形瓶 :500mL 250mL 和 150mL c) 无菌培养皿 : 玻璃或聚苯乙烯制, 直径为 90mm 至 100mm d) 无菌试管 : 约 20mm 250mm e) 量筒 :500mL 250 和 100mL f) 接种环 g) 酒精灯 h) 玻棒 2

7 i) 载玻片 j) 试管架 7 试验菌种的准备 7.1 试验菌种屎肠球菌 [E.faecium (ATCC 6057)] 7.2 菌种复苏取标准菌株冻干管, 在无菌操作下打开, 加入适量营养肉汤培养基, 轻柔吹吸数次, 使菌种融化分散 取含 5.0mL~10.0mL 营养肉汤培养基试管, 滴入少许菌种悬液, 置 (36±1) 恒温培养箱内培养 18h~ 24h, 即为标准储备菌株 必要时, 实验室应对标准储备菌株的特性和纯度进行确认 注 : 标准储备菌株的保存方法可参考 中华人民共和国药典 (2010 年版 ) 二部 7.3 菌种分离用接种环取上述第一代培养物, 接种于营养琼脂培养基平板上, 置 (36±1) 恒温培养箱内培养 18h~24h 7.4 菌种纯化挑取上述第二代培养物中的典型菌落, 接种于营养琼脂培养基斜面试管内, 置 (36±1) 恒温培养箱内培养 18h~24h, 即为第三代培养物 7.5 菌种保存及转种将上述斜面试管贮存于冰箱内 (4 ~8 ), 作为工作菌株, 保存期不超过一个月, 每个月应传代一次, 传代次数需严格控制, 不得超过 5 代, 以防止过度传代增加菌种变异的风险 必要时, 实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认 7.6 菌悬液制备用接种环挑取工作菌株, 划线接种在胰蛋白胨 - 大豆琼脂 (TSA) 培养基斜面上, 置 (36±1) 恒温培养箱内培养 18h~24h; 用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL~5.0mL 的 0.03mol/L 磷酸盐缓冲液, 加入上述新鲜培养物试管中, 反复吹吸, 洗下菌苔 将洗下的菌液移至另一试管中, 用旋涡振荡器混匀后, 用 0.03mol/ L 磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度 如需制备 100ml 消毒效果测试指示物, 至少准备 12 支斜面培养物试管 7.7 菌种标识对使用的菌种应标注如下信息 : a) 菌种名称 标准号和批号 ; b) 接种日期 ; c) 传代数 ; d) 菌种生长的培养基和培养条件 ; e) 菌种保藏的位置和条件 ; 3

8 f) 其他需要的信息 8 消毒效果测试指示物的准备 8.1 血液测试指示物无菌条件下, 将适量菌悬液 (7.7) 与无菌去纤维蛋白羊血置于无菌锥形瓶中充分混匀, 使最终菌浓度 >10 9 cfu/ml 染菌 80~100 个载体大约需要 50ml 血液 宜现配现用 8.2 小麦泥测试指示物 制作将 10g 脱脂奶粉加入 100ml 饮用水中, 充分搅拌使奶粉溶解, 加入 5g 细砂糖和 4g 黄油, 加热至滚沸, 再加入 4g 粗粒小麦粉 ( 或杜兰小麦粉 ), 一边搅拌一边继续加热 20 分钟 完成上述操作后, 将制作好的小麦泥置于锥形瓶中, 在 121 下蒸汽灭菌 15 分钟 染菌无菌条件下, 将适量菌悬液 (7.7) 与灭菌冷却后的小麦泥充分混匀, 使最终菌浓度 >10 9 cfu/ml 染菌 80~100 个载体大约需要 100mL 小麦泥 注 : 在无菌环境中准备的小麦泥 ( 如超净工作台 ) 及染菌载体, 可以保存在不会引起二次污染的冰箱中, 温度条件为 7 ~10, 这并不会造成载体上初始菌浓度的明显改变 8.3 蛋黄液测试指示物 制作先将鸡蛋置于 20 的恒温水浴槽中 30 分钟, 然后用 100 的蒸汽加热 4 分钟, 再置于 20 的水中冷却 5 分钟 无菌条件下打开鸡蛋, 确保蛋清为固态 蛋黄为液状, 将蛋黄分离至一无菌锥形瓶中 约 15 个鸡蛋可制得 100mL 蛋黄 染菌无菌条件下, 将适量菌悬液 (7.7) 与无菌蛋黄液充分混匀, 使最终菌浓度 >10 9 cfu/ml 染菌 80~100 个载体大约需要 50ml 蛋黄液 建议现配现用 9 染菌载体的准备 9.1 不锈钢螺钉 清洗染菌前, 应彻底清洗螺钉, 建议人工清洗和机器清洗相结合 进行人工清洗时可使用软毛刷充分刷洗, 以防残留在螺纹间的油污影响试验菌种的生长 机器清洗可以选择待验证的清洗消毒器 (WD) 或实验室专用超声波清洗器, 并使用实验室专用清洁剂 清洁后, 用充分浸泡螺钉, 晾干后 121 蒸汽灭菌 15 分钟, 取出恢复室温后贮存在干燥皿中备用 螺钉可重复使用数次 注 : 超声清洗器只能使用中性清洁剂 染菌 4

9 从干燥皿中取出螺钉, 分别置于各测试指示物中, 完全浸没至少 1 分钟 准备一无菌烧杯, 杯底铺上灭菌过滤纸, 用无菌镊子逐一取出螺钉倒置其上, 待纸片吸取多余的浸泡液后, 竖立放置在另一无菌烧杯中, 将该烧杯置于干燥皿中 24 小时, 或 (36±1) 恒温培养箱内 4 小时 注 : 对于一些特殊试验, 也可将消毒效果测试指示物涂抹在染菌载体的表面 9.2 橡胶软管 清洗橡胶软管应以一截 70mm 长的管段作为单个染菌载体 染菌前应彻底清洗管段, 可采用以下两种方式 : 置于待验证的清洗消毒器中, 温度设置为 93 进行清洁, 或者置于实验室专用清洁剂中煮沸 10 分钟 清洁后, 用充分浸泡管段, 晾干后 121 蒸汽灭菌 15 分钟, 取出恢复室温后贮存在干燥皿中备用 管段不可重复使用 染菌从干燥皿中取出管段, 分别投入各测试指示物中, 完全浸没至少 1 分钟后, 用无菌镊子逐一取出管段水平放在无菌容器中, 然后置于干燥皿中 24 小时, 或 (36±1) 恒温培养箱内 4 小时 注 : 对于一些特殊试验, 也可将消毒效果测试指示物涂抹在染菌载体的表面 10 针对不同用途的试验要求 10.1 用于清洗外科器械用去纤维蛋白羊血 蛋黄和小麦泥分别制成的消毒效果测试指示物对螺钉进行染菌, 每种指示物至少准备 20 个螺钉 可根据清洗消毒器的实际空间大小有所增加 在无菌条件下将染菌螺钉逐一放置在清洗消毒器的腔体内, 布点原则应均匀分散且远离喷淋口 可以将染菌螺钉装在负载篮中, 放置在最上层负载架的各个侧边 按照使用说明将待清洗物品满载于清洗消毒器中, 单独运行消毒程序进行验证 10.2 用于清洗麻醉器械用去纤维蛋白羊血分别对螺钉和管段进行染菌, 每种载体至少准备 20 个 可根据清洗消毒器的实际空间大小有所增加 在无菌条件下将染菌管段逐一放置在管道冲洗专用的喷淋嘴上, 将染菌螺钉逐一放置在清洗消毒器的腔体内, 布点原则应均匀分散且远离喷淋口 可以将染菌螺钉装在负载篮中, 放置在最上层负载架的各个侧边 按照使用说明将待清洗物品满载于清洗消毒器中, 单独运行消毒程序进行验证 11 消毒效果验证 11.1 结果处理消毒程序结束后, 在无菌条件下从清洗消毒器中逐一取出染菌载体, 置于含 10mL 胰蛋白胨 - 大豆肉汤培养基 (TSB) 的试管中, 在 (36±1) 恒温培养箱内培养 7 天 若试管中培养基澄清, 即无菌生长 ; 若试管中培养基变混浊, 即有菌生长 对难以判定的肉汤管, 取其中一环悬液划线接种营养琼脂平板, 置 (36±1) 培养箱中培养 48 5

10 h 后做染色镜检, 观察菌落形态, 或进一步做其他鉴定试验, 以判断生长者是否为屎肠球菌 若有非试验菌污染, 应查找原因重新进行试验 11.2 确定试验菌浓度无菌操作下, 将未经消毒处理的同批染菌载体置于 10mL 0.03mol/L 磷酸盐缓冲液 (PBS) 的试管中, 用旋涡振荡器至少振荡 20s, 然后按 消毒技术规范 (2002 版 ) 活菌培养计数技术确定试验菌浓度 11.3 阴性对照无菌操作下, 将未经染菌的同批载体各 2 个接种于 10mLTSB 培养基的试管中, 与同批次未经接种的 TSB 培养基 PBS 同时放入 (36±1) 培养箱中作定性培养, 观察有无细菌生长 11.4 结果判定试验应重复进行三次 每次试验的结果应符合以下要求方可判定为消毒合格 : 消毒程序结束后, 有菌生长的染菌载体培养管数量应小于总数量的 5%; 同时, 未经消毒处理的染菌载体 : 螺钉的回收菌数应 > cfu/ 个, 管段的回收菌数应 > cfu/ 个 阴性对照组应无菌生长 12 屎肠球菌耐热性的确定 至少每半年确认一次屎肠球菌的耐热性, 并记录确认结果 取 20 支含 10mLTSB 的试管置于恒温水浴槽中加热, 当温度达到 70 时, 按无菌操作在每支试管中加入一染菌载体 继续放置 10 分钟后, 取出试管, 立即冰敷冷却, 或用自来水冲泡, 随后置于 (36±1) 恒温培养箱中培养 24 小时 如果 90% 的试管有屎肠球菌生长, 可认为现存菌种的耐热性满足验证要求 13 生物安全 13.1 废弃物处置被屎肠球菌污染过的血液 试剂 载体和容器等物品必须经过高温高压灭菌后方可处理, 具体要求可参照 GB 实验室生物安全通用要求 中的相关信息 13.2 环境消毒使用实验室专用消毒剂, 对可能污染的环境表面应进行擦拭消毒 6

11 A A YY/T XXXXX XXXX 附录 A ( 规范性附录 ) 培养基和试剂 A.1 营养肉汤培养基 (Nutrient Broth) 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉膏 3.0g 1000mL 121 高压蒸汽灭菌 20min, 调节 ph 值至 7.2~7.4 用途 : 用于屎肠球菌的增菌培养 A.2 营养琼脂培养基 (Nutrient Agar) 蛋白胨 10.0g 牛肉膏粉 3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 1000mL 121 高压蒸汽灭菌 20min, 调节 ph 值至 7.2~7.4 用途 : 用于屎肠球菌的分离 纯化 A.3 胰蛋白胨 - 大豆肉汤培养基 (Tryptic Soy Broth) 胰蛋白胨 17.0g 植物蛋白胨 3.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 2.5g 1000mL 121 高压蒸汽灭菌 20min, 调节 ph 值至 7.2~7.4 用途 : 用于染菌载体的定性培养 A.4 胰蛋白胨 - 大豆琼脂培养基 (Tryptic Soy Agar) 胰蛋白胨 15.0g 大豆蛋白胨 5.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 1000mL 7

12 121 高压蒸汽灭菌 20min, 调节 ph 值至 7.2~7.4 用途 : 用于试验菌种的培养 A mol/L 磷酸盐缓冲液 (PBS,pH7.2±0.2) 磷酸氢二钠 (Na2HPO4, 无水 ) 2.83g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 1.36g 1000mL 121 高压蒸汽灭菌 20min 用途 : 用于菌液和试验样本的稀释 A.6 革兰氏染色液 第 1 液 : 结晶紫溶液结晶紫 1g 95% 乙醇 20mL 1% 草酸胺溶液 80mL 将结晶紫溶解于乙醇中, 然后与草酸铵溶液混合 第 2 液 : 卢戈碘液碘化钾 2g 碘 1g 200mL 第 3 液 : 脱色剂 95% 乙醇第 4 液 : 复染液 (1) 沙黄复染液 : 沙黄 0.25g 95% 乙醇 10mL 90mL 将沙黄溶解于乙醇中, 然后用稀释 (2) 稀石炭酸复红液 : 称取碱性复红 10g, 研细, 加 95% 乙醇 100mL, 放置过夜, 滤纸过滤 取该液 10mL, 加 5% 石炭酸水溶液 90mL 混合, 即为石炭酸复红液 再取此液 10mL, 加水 90mL, 即为稀石炭酸复红液 8

13 参 考 文 献 [1] 消毒技术规范 ( 中华人民共和国卫生部出版,2002 版 ) [2] 中华人民共和国药典 (2010 年版 ) 二部 [3] GB/T 实验室质量控制规范食品微生物检测 [4] GB 一次性使用卫生用品卫生标准 [5] GB/T 纳米无机材料抗菌性能检测方法 [6] QB/T 抗菌塑料抗菌性能试验方法和抗菌效果 [7] GB/T 纺织品抗菌性能的评价第 1 部分 : 琼脂扩散法 [8] YY/T 清洗消毒器第 1 部分 : 通用要求 术语定义和试验 [9] YY/T 清洗消毒器第 2 部分 : 对外科和麻醉器械等进行湿热消毒的清洗消毒器要求和试验 [10] YY/T 清洗消毒器第 3 部分 : 对人体废弃物容器进行湿热消毒的清洗消毒器要求和试验 [11] GB 实验室生物安全通用要求 9

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