1 总 则

Transcription

1 消毒技术规范 Technical standard for disinfection (2008 版 ) 中华人民共和国卫生部 二〇〇八年五月

2 1 总则 General Principle 1.1 引言根据 中华人民共和国传染病防治法 和卫生部 消毒管理办法 制订本规范 1.2 适用范围本规范适用于消毒产品申报和监督时为评价其安全性 有效性和理化特性而开展的检测活动及与检测活动相关的实验条件的控制 1.3 术语 消毒 disinfection 杀灭或清除传播媒介上病原微生物, 使其达到无害化的处理 灭菌 sterilization 杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理 化学指示物 chemical indicator 利用某些化学物质对某一杀菌因子的敏感性, 使其发生颜色或形态改变, 以指示杀菌因子的强度 ( 或浓度 ) 和 / 或作用时间是否符合消毒或灭菌处理要求的制品 生物指示物 biological indicator 染有一定量的特定微生物, 用于指示消毒或灭菌效果的制品 消毒剂 disinfectant 用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂 有效氯 available chlorine 有效氯是衡量含氯消毒剂氧化能力的标志, 是指与含氯消毒剂氧化能力相当的氯量 ( 非指消毒剂所含氯量 ), 其含量用 mg/l 或 % 浓度表示 ( 有效碘及有效溴的定义和表示法与有效氯对应 ) 中和剂 neutralizer 在微生物杀灭试验中, 用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂, 使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂 中和产物 product of neutralization 中和剂与消毒剂作用后的产物 菌落形成单位 colony forming unit,cfu 在活菌培养计数时, 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落, 称为菌落形成单位, 以其表达活菌的数量 自然菌 natural bacteria 本规范指存在于某一试验对象上非人工污染的细菌 1

3 存活时间 survival time,st 用于生物指示物抗力鉴定时, 指受试指示物样本, 经杀菌因子作用后全部样本有菌生长的最长作用时间 (min) 杀灭时间 killing time,kt 用于生物指示物抗力鉴定时, 指受试指示物样本, 经杀菌因子作用后全部样本无菌生长的最短作用时间 (min) D 值 D value 杀灭微生物数量达 90% 所需的时间 (min) 杀灭对数值 killing log value 当微生物数量以对数表示时, 指消毒前后微生物减少的对数值 杀灭率 killing rate,kr 在微生物杀灭试验中, 用百分率表示微生物数量减少的值 灭菌保证水平 sterility assurance level,sal 灭菌处理后单位产品上存在活微生物的概率, 通常表示为 10 -n, 本规范规定为 10-6, 即经灭菌处理后, 每件物品中有菌生长的概率是 1/ 无菌检验 sterility testing 为明确灭菌后的物品中是否存在活微生物所进行的试验 生物负载 bioburden 被测试的一个单位物品上承载活微生物的总数 暴露时间 exposed time 消毒或灭菌物品受到消毒因子作用的时间, 又称作用时间 处理时间 载体 carrier 试验微生物的支持物 满载 fully loaded 厂家说明书规定的最高装载量和摆放方式 灭菌过程验证装置 process challenge device,pcd 对某一灭菌过程构成特定抗力的装置, 用于评价该灭菌过程的有效性 抗菌 antibacterial 采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程 抑菌 bacteriostasis 采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程 1.4 消毒产品检验的基本要求 实验室要求开展消毒产品检测的检测机构应该通过实验室资格认定, 其认定的检测项目应该涵盖消毒产 2

4 品检测项目 消毒产品申报卫生部卫生许可批件时, 应该在卫生部授权的检测机构进行检测 消毒实验室应按 微生物实验室生物安全管理条例 管理, 符合 GB 实验室生物安全通用要求 的条件, 进行致病微生物包括分枝杆菌 黑曲霉菌 白色念珠菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌和脊髓灰质炎病毒的消毒学试验时或检测现场标本时, 应在生物安全 Ⅱ 级以上的实验室内进行, 并符合国家有关生物安全的标准 实验室应采取封闭式布局, 便于清洁 消毒 无菌检验必须在 100 级洁净度的实验室或 100 级层流操作柜中进行 容量分析实验室工作温度应控制在 20 ~25 毒理实验室应该为 ABSL-Ⅱ 级或高于此要求 人员要求消毒产品检测的实验室人员应该是经过实验操作技术培训的专业人员 实验审核人员应该具有中级职称 五年以上的消毒产品检测经历并经过专门培训 实验室技术负责人和质量负责人应该具有高级职称, 五年以上的消毒产品检测经历并经过专门培训 受理要求对申报卫生部卫生许可批件的国产消毒产品, 检验机构应该只受理由生产企业所在地的卫生监督部门现场抽样并封样的样品, 发现封签破损或其他异样情况导致封样无效时, 应不予受理 对申报卫生部卫生许可批件的进口消毒产品, 检验机构受理时应该查验并留存消毒产品生产地所在国的销售证明和经我国海关验证的报关单底单 留存的销售证明和报关单可以为送检单位盖章认可的复印件 检验项目由送检单位决定 受理样品数量应满足各项检测需要, 发现数量不足时应该拒绝受理 因不可预知的原因, 试验中确实需要补充样品数量时, 送检单位应该按规定重新送样并在检验申请中说明理由, 检验机构应重新受理, 重新编排受理号 受理时应同时要求送检单位提供盖章认可的产品说明书 配方 研制报告等材料 盖章认可的说明书应该与每件样品的说明书完全一致 受理后发现按说明书无法完成检验项目时应停止检测并向送检单位说明理由 消毒效果检验要求 无菌操作要求 (1) 试验开始前, 应以湿式方法清洁台面和打扫室内地面 (2) 实验人员应穿戴工作服 防护鞋 口罩 帽子, 进行无菌检验时, 需经风淋后进入实验室, 然后, 正确穿戴好无菌隔离衣 鞋套 帽子和口罩 (3) 每吸取一次不同样液应更换无菌吸管, 接种环 ( 针 ) 需在火焰上烧灼灭菌后, 才可再次使用, 也可用一次性使用的无菌吸管和接种环 ( 针 ) (4) 要求无菌的试剂, 如蒸馏水 生理盐水 磷酸盐缓冲液 培养基 标准硬水 中和剂等, 均需灭菌 3

5 (5) 无菌器材和试剂, 使用前须检查容器或包装是否完整, 有破损者不得使用 (6) 正在使用的无菌器材和试剂不得长时间暴露于空气中 (7) 重复使用的器材, 使用后应立即放入盛有消毒液的容器中, 一次性使用的器材使用后应立即放入感染性废物收集袋中 (8) 若不慎发生微生物培养物打碎或试验微生物其他泄漏事故时, 不论是否具有致病性, 均应立即停止手中工作, 对污染及可能波及的区域进行消毒处理 (9) 全部试验结束后, 应对室内环境进行消毒处理 检测要求 (1) 消毒学试验分为实验室试验 模拟试验和现场试验三个阶段 (2) 实验室试验以悬液定量试验为主, 试验应重复 3 次 对不适宜用悬液定量试验评价的消毒剂, 如粘稠的消毒剂 冲洗用消毒剂和原液一次性使用的消毒剂等的实验室试验用载体定量试验, 试验应重复 3 次 无特殊要求的情况下, 载体定量试验以布片为载体, 用途单一 明确的可以选用对应的玻璃片 不锈钢片 滤纸片等 评价消毒剂的实验室试验, 消毒剂试验浓度需用产品说明书规定的该消毒剂对某一有代表性消毒对象的最低使用浓度 试验设 3 个不同作用时间, 原则上第一时间为说明书规定的最短作用时间的 0.5 倍, 第二时间为最短作用时间, 第三时间为最短作用时间的 1.5 倍 对多用途的消毒剂, 消毒对象所涉及的微生物相同时, 若使用浓度相同, 选择各种用途中最短的作用时间 若作用时间相同, 选择各种用途中最低的使用浓度 使用浓度低 作用时间短者与使用浓度高 作用时间长者同时存在时, 以前者为准 使用浓度高 作用时间短者与使用浓度低, 作用时间长者同时存在时, 每个剂量均须进行试验 消毒器械产生的化学杀微生物因子的试验要求同消毒剂 对于冲洗用化学消毒因子可以用载体流动浸泡试验 如为物理杀微生物因子, 试验一般用载体定量试验, 在无特殊要求的情况下, 以布片为载体 用途单一 明确的可以选用对应的玻璃片 不锈钢片 滤纸片等 试验重复 3 次 灭菌试验应用载体定性试验, 普通医疗器械的灭菌以不锈钢片为载体, 特殊用途的可以选用玻璃片 聚四氟乙烯片等 灭菌试验按产品说明书规定的最低使用浓度 ( 强度 ) 和 0.5 倍的最短作用时间进行试验 载体定性试验应重复 5 次, 载体数量应不小于 30 个, 每次试验均应该设立规定数量的阴性对照和阳性对照 (3) 消毒模拟现场或现场试验, 以使用说明书的最低有效浓度 ( 强度 ) 和最短作用时间进行试验, 试验应重复 3 次 每次试验均应该设立规定数量的阴性对照和阳性对照 (4) 灭菌模拟现场或现场试验, 以使用说明书的最低使用浓度 ( 强度 ) 和 0.5 倍的最短作用时间进行试验, 消毒器械的灭菌试验应重复 5 次, 消毒剂的灭菌试验应试验 60 个样本, 至少重复 3 次 每次试验均应该设立规定数量的阴性对照和阳性对照 (5) 在对消毒剂进行监督监测时, 定量杀菌试验以说明书规定的最低浓度和最短时间验证其消毒效果 对用于灭菌的消毒剂则以说明书中规定的使用浓度和其 0.5 倍的作用时间验证其 4

6 灭菌效果 (6) 鉴定和监测多用途消毒剂与消毒器械消毒效果时, 现场或模拟现场试验的消毒对象原则上是在类似物品中最难达到消毒合格者, 如医疗器械消毒或灭菌选用止血钳齿端 ; 皮肤消毒选用人体前臂屈面皮肤 ; 织物消毒选择棉布 ; 一般物品表面 ( 包括木质 塑料 橡胶 玻璃 ) 消毒选用木质表面 ; 餐具消毒选用竹 ( 木 ) 筷, 不用于筷子消毒的可选用瓷质碗盘 ; 瓜果蔬菜消毒选用黄瓜 ; 地面消毒选择水泥地面 ; 手消毒选择五指屈面 ; 对于特指消毒对象而又在上述物品中不能选出有代表性物品时, 则需用该特指对象进行试验 (7) 进行实验室试验和模拟现场试验时, 对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂, 有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为 0.3%, 对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂, 有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为 3.0% 对重复试验的要求重复性试验不是只在同次试验中增加菌片数, 或多作几份样本, 而是应分期分批进行 必要的器材和试剂应重新制备或灭菌, 以防产生系统性误差 理化检验要求 标准品的纯度 99.0%, 对照品的纯度应采用最高纯度的试剂, 也可使用标准品或对照品进行标定过的标准溶液作为含量测定的对照物 以滴定法分析有效成分时, 滴定液用量不得超过滴定管所标示的量 本规范规定滴定时所取样本的质量或容量 ( 包括浓度 ), 均根据此原则设定 若所测消毒剂浓度过高, 可适当减少取样量或稀释后测定 ; 若消毒剂浓度过低, 可增加取样量或采用灵敏度更高的方法进行测定 有效成分含量以法定计量单位表示 复方消毒剂以其杀菌主要有效成分含量表示 ; 植物消毒剂以百分浓度表示, 如 1 份原液加 4 份水即该消毒剂溶液的浓度为 20% 溶液或消毒剂的有效成分含量的表示, 以 mg/l 或 mg/kg 为主 采用百分数表述含量时有下列 2 种含义 :1 液体和液体之间为体积百分数, 用 % 表示, 即 100mL 溶液中含溶质若干毫升, 或 100mL 消毒剂中含有效成分若干毫升 ;2 固体和固体之间为质量百分数, 用 % 表示, 即 100g 消毒剂中含有效成分若干克 ; 对固体和液体之间采用质量浓度表示 (mg/l g/l 等 ), 即 1L 溶液中含溶质若干毫克或克, 或 1L 消毒剂中含有效成分若干毫克或克等 本规范中所列试剂的纯度涉及基准 分析纯 化学纯及色谱纯等, 未作专门说明者, 一般采用分析纯 配制滴定液试剂 ( 如硫代硫酸钠 ) 因配制后尚需专门处理, 亦可用化学纯 本规范中, 滴定液 是指经过标定, 浓度准确至 0.001mol/L~0.0001mol/L 的溶液 未经浓度标定者则称 溶液, 以示区别 摩尔 (mole,mol) 为物质量的单位, 当分子 原子或其它粒子等的个数约为 6.02³10 23 时即为 1mol 本规范中滴定液浓度的计算, 除碘滴定液按原子量计算外, 其它滴定液均按分子量计算 滴定液的标定及所有样品测定均平行进行两次 将滴定管中滴定液补足至全量后滴定 所有试验结果 ( 包括消毒剂有效成分测定及滴定液标定 ) 应当以空白试验校正 所使用的滴定液 5

7 应按要求在有效使用期内使用 粉剂和片剂的取样量为测定所需量的 10 倍以上, 经研磨后精确称取适量样品进行测定 如果选用色谱法或分光光度法, 进行方法可靠性论证时应附空白样品 ( 不含被测成分的 其它成分所构成的样品 ) 模拟样品( 空白样品加有效成分的标准品 ) 以及待测样品的色谱图或 光谱图 如果无法提供空白样品, 可用加入标准量法进行方法可靠性的论证 对理化检测方法检出限和定量下限的要求 检出限为被测物能被检出的最低量 定量下 限为能够对被测物准确定量的最低浓度或质量, 称为该方法的定量下限 检出浓度为按规范方法 操作时, 方法检出限对应的被测物浓度 最低定量浓度为按规范方法操作时, 定量下限对应的被 测物浓度 常用检验方法的检出限和定量下限的计算可参考表 1-1 表 1-1 检出限及定量下限的定义 检验方法 检出限 ( 对应的质量 浓度 ) 定量下限 ( 对应的质量 浓度 ) AAS/AFS 3 SD 10 SD GC 3 倍空白噪音 10 倍空白噪音 HPLC 3 倍空白噪音 10 倍空白噪音 分光光度法 A A 容量法 X * +3 SD X+10 SD 注 :* X 为在终点附近出现可察觉变化的最小试剂体积的平均值 对于本规范中测定方法不适用的产品, 有效成分的测定, 由厂家提供检测方法及方法可靠性的论证报告, 经检验机构认可后方可采用 样品的重量测定用秤重法, 天平的精度应为测定样品重量的 1% 以上 对消毒剂测定一个批号,3 个样品, 每个样品平行测定 2 次 对消毒器械的杀菌因子强度应该测定强度曲线, 该曲线应能反映消毒器械消毒灭菌全过程杀菌因子强度的变化趋势 玻璃仪器清洗干净, 用蒸馏水冲洗 3 遍 所用容量瓶和量筒等不能加热, 对仪器设备应进行计量检定 毒理学实验要求 消毒产品毒理学实验评价程序消毒剂安全性毒理学评价, 可分为 4 个阶段 第一阶段包括急性经口毒性试验 急性吸入毒性试验 皮肤刺激试验 急性眼刺激试验 阴道黏膜刺激试验和皮肤变态反应试验等 第二阶段包括亚急性毒性试验和致突变试验 后者包括体外哺乳动物细胞基因突变试验 (L5178Y 细胞基因突变试验,V79 细胞基因突变试验 ) 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 ( 体细胞染色体水平, 体外试验 ) 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 ( 体细胞染色体水平, 体内试验 ) 6

8 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 ( 体细胞染色体水平, 体内试验 ) 程序外 DNA 修复合成试验 (DNA 水平, 体外试验 ) 小鼠精子畸形试验( 性细胞基因和染色体水平, 体内试验 ) 睾丸生殖细胞染色体畸变试验 ( 性细胞染色体水平, 体内试验 ) 小鼠精原细胞染色体畸变试验和小鼠精母细胞染色体畸变试验等 第三阶段包括亚慢性毒性试验和致畸胎试验等 第四阶段包括慢性毒性试验和致癌试验等 毒理学试验受试物 (1) 在急性经口毒性试验 急性吸入毒性试验 亚急性毒性试验 致突变试验 亚慢性毒性试验 致畸胎试验 慢性毒性试验和致癌试验时, 一般采用消毒剂原形样品 消毒剂原形是指在销售过程中原包装的粉剂 片剂或原液 对于二元或多元包装的消毒剂, 以按说明书规定的比例配制后作为消毒剂原形 (2) 在皮肤刺激试验 急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验中所用受试物的浓度, 通常是对皮肤 黏膜消毒时应用浓度的 5 倍 使用原形 ( 原液 ) 对皮肤 黏膜进行消毒的消毒剂, 则采用消毒剂原形 ( 原液 ) 作为试验受试物, 不需对消毒剂原形再进行浓缩 (3) 在皮肤变态反应试验时, 采用的诱导浓度应为引起皮肤刺激反应的最低浓度或原液, 激发浓度应为不引起皮肤刺激反应的最高浓度或原液 检测记录要求实验室对所进行的试验, 应认真观察试验结果, 按实验室资格认定和 / 或实验室认可的要求作好原始记录 为使记录规范化, 一般用表格方式记录, 表格中应包括样品名称与编号 检验日期 检测项目 检测依据 试验条件 使用仪器编号 观察结果 试验者和校核者签名等栏目 表格中每一栏目应用蓝黑或碳素墨水逐项填写 一次试验填写一份表格 原始记录数据和计算应及时校核, 整理装订附于检验报告后, 入档保存备查 检测报告要求检测报告必须逐项报告清楚, 凡检验方法在本规范和有关标准中未列出者, 必须详细描述 消毒灭菌效果的结果部分用表格将各试验组 阳性对照 阴性对照及其他对照组的数据列出, 定性试验的对照可用文字加以说明 试验组应列出其杀灭对数值, 杀灭效果合格时, 杀灭对数值无须列出具体数值, 用大于等于某一规定值表示 ; 当杀灭对数值小于某一规定值时, 则应列出具体杀灭对数值 并用文字简要叙述所得的结果 检验报告的结论部分, 应根据试验结果得出明确的结论 此外, 对试验中出现某些异常现象亦应加以说明 检测结果评价消毒效果试验 理化检验和毒理学实验均符合要求时可以认为该产品检测合格 理化检验结果评价 7

9 符合下列条件的消毒产品认为理化检验合格 : (1) 消毒剂有效成分符合我国允许的消毒剂组分, 不含有抗生素 激素等各种处方药成分和卫生部规定的禁用物质 (2) 用于皮肤黏膜消毒的消毒剂限量成分符合要求 ; 用于饮用水 食品和餐饮具消毒的消毒剂其有毒有害成分在使用浓度下符合有关标准的限量要求 ; 消毒器械产生的有毒有害物质符合有关标准和规范的限量要求 (3) 消毒剂的成分与申报的配方一致 在产品有效期内, 有效成分含量及其变化应在规定的范围内 (4) 最小样品单位间的重量误差小于 5%, 主要有效成分含量误差小于 10% (5) 用于金属物品消毒的消毒剂对金属基本无腐蚀性, 偶尔接触金属物品的消毒剂如果存在金属腐蚀性时在标识中应有警示 (6) 消毒剂的 ph 值在合理的范围内, 并与企业标准一致 消毒效果试验结果评价符合下列所有相应条件的消毒产品认为消毒效果试验结果合格 : (1) 去除残留消毒剂效果的鉴定试验合格 (2) 消毒产品的实验室试验结果符合下列相应条件 : a. 悬液定量试验时, 每次试验对细菌繁殖体和细菌芽孢如金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 白色葡萄球菌 枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭对数值 5.00, 对龟分枝杆菌脓肿亚种 白色念珠菌和黑曲霉菌的杀灭对数值 4.00, 对病毒的灭活对数值 4.00 对照组微生物数在规定的范围内 b. 载体定量试验和载体流动浸泡试验时, 每次试验对各类微生物的杀灭对数值或灭活对数值 3.00, 对照组微生物数在规定的范围内 载体定性试验时, 各次试验所有载体相应细菌芽孢均无生长, 对照组微生物数在规定的范围内 (3) 消毒模拟现场试验时, 各次试验对试验微生物的杀灭对数值 3.00, 对照组微生物数在规定的范围内 灭菌模拟现场试验时, 各次试验所有载体相应细菌芽孢均无生长, 对照组微生物数在规定的范围内 (4) 现场试验时, 对消毒对象上自然菌的平均杀灭对数值 1.0 (5) 消毒产品用于饮用水消毒时, 消毒效果的评价按 生活饮用水卫生监督管理办法 进行 8

10 2 消毒产品检验技术规范 Technical Standard for Testing Disinfection Products 2.1 消毒剂消毒与灭菌效果验证试验 适用范围适用于消毒剂的消毒效果的许可检验和监督监测 菌悬液与菌片的制备 适用范围制备消毒剂杀菌试验用菌悬液与菌片, 以供消毒剂杀菌试验时使用 也适用于本规范中其他消毒学试验所用菌悬液与菌片 实验器材 (1) 实验菌种金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 铜绿假单胞菌 ATCC 大肠杆菌 8099 枯草杆菌黑色变种 ATCC 9372 白色葡萄球菌 8032 在上述规定的菌株基础上, 根据消毒剂特定用途或试验特殊需要, 还可增选其他菌株 (2) 有机干扰物见附录 A (3) 磷酸盐缓冲液见附录 A (4) 无菌蒸馏水或其他纯化水 (5) 稀释液见附录 A (6) 细菌培养基营养琼脂培养基, 营养肉汤培养基, 见附录 A (7) 革兰染色液见附录 A (8) 芽孢染色液见附录 A (9) 恒温水浴箱 (10) 玻璃漏斗 (11) 刻度吸管 (1.0mL 5.0mL 10.0mL), 毛细吸管 (12) 移液器 (10μL 20μL 100μL 200μL 1000μL) 及配套的塑料吸头 (13) 离心机 (14) 电动混匀器 (15) 浊度计 (16) 恒温培养箱 细菌悬液制备程序 (1) 细菌繁殖体悬液的制备 9

11 1) 以无菌操作方式开启菌种管, 用毛细吸管加入适量营养肉汤培养基, 轻柔吹吸数次, 使菌种融化分散 取含 5.0mL~10.0mL 营养肉汤培养基试管, 滴入少许菌种悬液, 置 37 培养 18h~24h 用接种环取第 1 代培养的菌悬液, 划线接种于营养琼脂培养基平板上, 置 37 培养 18h~24h 或从 microbank 中取出一粒菌珠接种于平皿上, 置 37 培养 18h~24h, 挑取上述第 2 代培养物中典型菌落, 接种于营养琼脂斜面, 置 37 培养 18h~24h, 即为第 3 代培养物 2) 取第 3~6 代的营养琼脂培养基培养 18h~24h 的新鲜斜面培养物, 用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL~5.0mL 稀释液 ( 一般用 TPS, 酸化水用生理盐水 ) 加入斜面试管内, 反复吹吸, 洗下菌苔 随后, 用 5.0mL 吸管将洗液移至另一无菌试管中, 用电动混匀器混合 20s, 或在手掌上振打 80 次, 以使细菌悬浮均匀 3) 初步制成的菌悬液, 先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度, 然后以稀释液稀释至所需浓度 4) 细菌繁殖体悬液应保存在 4 冰箱内备用 应当天使用不得过夜 5) 怀疑有污染时, 应以菌落形态 革兰染色与生化试验等法进行鉴定 (2) 细菌芽孢悬液的制备 1) 以无菌操作方式开启菌种管, 用毛细吸管加入适量营养肉汤培养基, 轻柔吹吸数次, 使菌种融化分散 取含 5.0mL~10.0mL 营养肉汤培养基试管, 滴入少许菌种悬液, 置 37 培养 18h~24h 用接种环取第 1 代培养的菌悬液, 划线接种于营养琼脂培养基平板上, 置 37 培养 18h~24h 挑取上述第 2 代培养物中典型菌落, 接种于营养肉汤培养基, 置 37 培养 18h~ 24h, 即为第 3 代培养物 2) 用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL~10.0mL 第 3~5 代的 18h~24h 营养肉汤培养物, 接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面, 将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面, 再将多余肉汤培养物吸出, 将罗氏瓶置 37 恒温培养箱内培养 5d~7d 3) 用接种环取菌苔少许涂于玻片上, 固定后以改良芽孢染色法染色, 并在显微镜 ( 油镜 ) 下进行镜检 当芽孢形成率达 95% 以上时, 即可进行以下处理 否则, 应继续在室温下放置一定时间, 直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理 改良芽孢染色法 :1 用接种环取菌苔涂布于玻片上, 待自然干燥, 而后通过火焰加热将菌固定于玻片上 2 将涂片放入平皿内, 片上放两层滤纸, 滴加足量的 5.00% 孔雀绿水溶液 将平皿盖好, 放 54 ~56 条件下, 加热 30min 取出, 去滤纸, 用自来水冲去残留液 3 加 0.5% 沙黄水溶液, 染 1min 水洗, 待干后镜检 芽孢呈绿色, 菌体呈红色 4) 加 10.0mL 无菌蒸馏水于罗氏瓶中, 以 L 棒轻轻推刮下菌苔, 吸出, 再加入 5.0mL 无菌蒸馏水冲洗培养基表面, 吸出 将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌三角烧瓶中, 振摇 5min 5) 将三角烧瓶置 45 水浴中 24h, 使菌自溶断链, 分散成单个芽孢 6) 用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液, 清除琼脂凝块 7) 将芽孢悬液置无菌离心管内, 以 3000r/min 速度离心 30min 弃上清液, 加蒸馏水吹吸 10

12 使芽孢重新悬浮, 本步骤重复 3 遍 8) 将洗净的芽孢悬液放入含适量小玻璃珠的三角烧瓶内,80 水浴 10min( 或 60 30min), 以杀灭残余的细菌繁殖体 待冷至室温后, 摇匀分装保存于 4 冰箱中备用 有效使用期为半年 9) 芽孢悬液在使用时, 应先进行活菌培养计数 10) 怀疑有杂菌污染时, 应以菌落形态 革兰染色与生化试验等法进行鉴定 菌片 ( 染菌载体 ) 的制备程序 (1) 菌片用载体应根据消毒对象选择, 常用的材料有金属 玻璃 滤纸 棉布 聚四氟乙烯等 金属载体一般用 12mm 直径圆形金属片 ( 厚 0.5mm), 其他材质载体一般为方形, 大小 10mm³10mm, 特定用途的消毒产品可使用其他材质 形状的载体 (2) 所用载体 ( 除滤纸片外 ) 于染菌前, 应进行脱脂处理 脱脂方法如下 :1 将载体放在含洗涤剂的水中煮沸 30 min;2 以自来水洗净 ;3 用蒸馏水煮沸 10min;4 用蒸馏水漂洗至 ph 呈中性 ;5 晾干 熨平备用 (3) 布片用 40 织纱的白平纹棉布制作 将脱脂后的布块按载体规定的大小抽去边缘一周的经纬纱各一根, 按抽纱痕剪开 金属片以不锈钢制作, 纸片以新华滤纸制作 (4) 载体经压力蒸汽灭菌后, 使用滴染法染菌 染菌用菌悬液 : 菌悬液和芽孢悬液的制备按 进行, 试验用菌悬液的含菌量约为 2³10 8 cfu/ml~1³10 9 cfu/ml, 可使用浊度计调整菌液浓度 然后加入等量 3.0% 或 0.3% 的牛血清白蛋白, 使菌液的浓度为 1³10 8 cfu/ml~5³10 8 cfu/ml 滴染法染菌时, 将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内, 用移液器逐片滴加菌液 10μ L, 必要时用接种环涂匀整个载体表面 置 37 恒温培养箱或室温干燥备用 (5) 每个菌片 ( 载体 ) 的回收菌数应为 1³10 6 cfu/ 片 ~5³10 6 cfu/ 片 注意事项 (1) 用浊度计测定的菌悬液浓度, 只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计 作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告 ( 如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量 ), 必须以活菌培养计数的实测结果为准, 不得使用根据比浊法判定的估计值 (2) 菌液滴加不宜过快, 避免流散影响染菌的准确性 (3) 细菌繁殖体在载体上干燥的过程中, 可引起部分死亡 因此应提高初始菌浓度, 以便达到所需的回收菌量 (4) 配制菌悬液和制备菌片时, 应严格无菌操作, 以防污染杂菌, 影响杀菌试验的结果 (5) 保存菌液的容器使用橡皮塞时, 应将其预先煮沸 10min 进行脱硫处理 (6) 菌悬液和菌片应随时放入冰箱内, 尽量缩短室温放置时间, 以减少细菌的自然死亡 活菌培养计数技术 适用范围测定消毒试验用细菌悬液 菌片 ( 染菌载体 ) 采样液等样本含有活菌的数量 11

13 实验器材 (1) 稀释液见附录 A (2) 细菌培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (TSA), 胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (TSB) 等, 见附录 A (3) 刻度吸管 (1.0mL 5.0mL 10.0mL) (4) 移液器 (10μL 20μL 100μL 200μL 1mL 5mL) 及配套的塑料吸头 (5) 电动混匀器 (6) 浊度计 (7) 恒温培养箱 操作程序活菌培养计数一般使用倾注法, 有特殊规定者, 可以使用其他方法 倾注法操作程序如下 : (1) 对菌悬液可直接进行培养计数 对菌片和小型固体样本, 将其直接投入含 5.0mL 稀释液的无菌试管中, 对棉拭则将其采样端剪入管内 用电动混匀器混合 20s, 或在手掌上用力振打 80 次, 将菌洗下形成菌悬液 以上操作应严格按无菌要求进行 (2) 将试管按需要数量分组排列于试管架上, 每管加入 4.5mL 稀释液 各组由左向右, 逐管标上 等 (3) 将菌悬液样本用电动混匀器混合 20s, 或在手掌上用力振打 80 次, 随即吸取 0.5mL 加至 10-1 管内 (4) 将 10-1 管依前法用电动混匀器混合 20s, 或在手掌上用力振打 80 次, 混匀, 再吸取出 0.5mL 加入 10-2 管内 如此类推, 直至最后一管 必要时, 还可作某稀释度的 1:1 或 1:4 稀释 (5) 选择适宜稀释度试管 ( 以预计生长菌落数每平板为 15cfu~300cfu 者为宜 ), 吸取其中混合均匀的悬液 1.0mL 加于无菌平皿内 每一稀释度接种 2 个平皿 一般需接种 2 个 ~3 个不同稀释度 (6) 将 40 ~45 熔化的培养基, 倾注于已加入样液的平皿中, 每平皿 15mL~20mL (7) 将平皿盖好, 即刻轻轻摇动混匀, 平放 待琼脂凝固后, 翻转平皿使底向上, 置 37 恒温培养箱内培养 (8) 培养至规定时间, 计数菌落数 对于现场试验样本, 应每日观察并记录菌落数 (9) 计数菌落时, 一般以肉眼观察, 必要时用放大镜检查 以每平板菌落数在 15cfu~300cfu 的稀释度为准记录结果 对黑曲霉菌活菌计数时, 以每平板菌落数在 15cfu~100cfu 的稀释度为准记录结果 对菌量极少的样本, 即使平板菌落数未达 15cfu 时, 亦可用其计算最终结果 (10) 根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片 ( 染菌载体 ) 上的平均菌落数 活菌计数中技术操作误差的测定活菌计数因技术操作而引起的菌落数误差率 ( 平板间 稀释度间 ) 不宜超过 10% 误差率的计算可按下列公式进行 12

14 平板间误差率 平板间菌落数平均差平板间菌落平均数 100 % 平板间菌落数平均差 ( 平板间菌落平均数 各平板菌落数 ) 的绝对值之和 平板数 各平板菌落数之和平板间菌落平均数 平板数 稀释度间菌落数误差率 稀释度间菌落数平均差稀释度间菌落平均数 100 % 稀释度间菌落平均差 ( 稀释度间菌落平均数 各稀释度菌落数 ) 的绝对值之和 稀释度数 各稀释度平均菌落数之和稀释度间菌落平均数 稀释度数 注意事项 (1) 严格无菌操作, 防止污染 (2) 认真检查实验器材有无破损 ( 要特别注意试管底的裂痕和破洞 ), 以防丢失样本和污染环境 (3) 注意菌液的均匀分散 (4) 取液要准确, 尽量减少误差 (5) 每吸取一个稀释度样液, 必须更换一支吸管或吸头 (6) 样液加入平皿后应尽快倾注培养基, 避免样液干燥 (7) 倾注时培养基温度不得超过 45, 以防损伤细菌或真菌 (8) 倾注和摇动应尽量平稳, 勿使培养基外溢, 确保细菌分散均匀, 便于计数菌落 残留消毒剂 ( 化学因子 ) 的去除方法 目的对于消毒剂的消毒效果试验, 在达到规定的消毒时间时, 要求立即终止其继续作用, 以便准确检测出试验体系中仍然存活的微生物及其数量 本方法可去除残留消毒剂对微生物的杀灭和抑制作用 去除残留消毒剂方法的原则要求 (1) 应有效去除残留的消毒剂 13

15 (2) 对试验微生物无害, 不减少其回收量 (3) 不破坏培养基的营养成份, 不影响其透明度 去除残留消毒剂的方法 (1) 稀释中和法 ( 又称中和剂法 ) 指在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时, 取样加于适宜种类和浓度的中和剂中, 将残留消毒剂迅速中和, 使其不再持续杀灭和抑制微生物的方法 其操作要点如下 : 1) 将经消毒剂作用过的微生物样本, 在达到规定作用时间, 即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中 2) 所用中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同 3) 即刻混匀, 并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测 4) 在将样本接种培养基以前的操作, 应按规定时间内进行, 以免微生物与中和剂或中和产物接触过久 (2) 过滤冲洗法将经消毒剂作用过的微生物样本, 立即加入适量稀释液中混匀 ( 通过适量稀释, 可减轻消毒剂的持续作用 ), 并倾入装有微孔滤膜的滤器内, 接真空泵抽吸过滤 ( 或加压过滤 ) 后, 再加适量稀释液冲洗, 同时过滤, 可去除残留的消毒剂 多用于难以找到适宜中和剂的消毒效果试验 本方法应按拟进行试验具体情况, 经鉴定合格后再使用 其操作要点如下 : 1) 准备好微孔滤膜 滤器 滤膜及滤器需先经灭菌处理 2) 初次过滤后, 应使用一定量对微生物无害的稀释液进行冲洗, 冲洗次数一般以洗净消毒剂为准 3) 最后一次冲洗 滤净后, 将微孔滤膜以无菌操作法取出, 进行随后的培养检测 注意事项 (1) 处理时应严守无菌操作要求, 所有试液须灭菌, 接触样本和试液的器材均须无菌 (2) 每次吸液, 均须更换一支无菌吸管, 以防交叉污染 (3) 所用吸管的容量应尽量与拟吸取的液体量相近, 不要用大吸管吸取少量液体 (4) 试验条件可影响残留消毒剂的去除效果, 故每进行一种消毒效果试验, 均需按规定对所选方法进行去除效果的鉴定试验 中和剂鉴定试验 目的确定所选中和剂是否适用于拟进行的消毒效果鉴定试验 实验器材 (1) 实验菌菌悬液和菌片 ( 见 2.1.2) (2) 刻度吸管 (1.0mL 5.0mL) (3) 平皿 14

16 (4) 恒温水浴箱 (5) 稀释液见附录 A (6) 培养基见附录 A (7) 电动混匀器 试验设计原则 (1) 通过所设各组试验结果综合分析, 应可确定所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用, 对试验用微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响 (2) 试验中所用消毒剂的浓度应为杀菌试验中使用的最高浓度 (3) 同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时, 所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验 对细菌繁殖体, 在大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌中任选其一进行试验 ; 对细菌芽孢 白色念珠菌 黑曲霉菌 分枝杆菌应分别进行鉴定试验 当用其他特定微生物进行杀灭试验时, 均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验 (4) 鉴定时根据所用杀菌试验方法, 相应使用悬液或载体进行试验 实验分组在细菌与真菌杀灭试验中所用除药方法的鉴定, 至少应平行进行以下各组试验 第 1 组中和剂 + 菌悬液 培养第 2 组 ( 消毒剂 + 中和剂 )+ 菌液 培养第 3 组稀释液 + 菌悬液 培养第 4 组稀释液 + 中和剂 + 培养基 培养 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序根据实验分组, 准备足量试管和平皿, 依次进行编号 将菌悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释成 2.5³10 3 cfu/ml~1.5³10 4 cfu/ml, 作为试验菌悬液 鉴定试验包括 4 组 : 第 1 组取 0.4mL 标准硬水于试管内, 加入 4.5mL 中和剂, 混匀, 置 20 ±1 水浴中 5min 后, 再加入 0.1mL 试验菌悬液, 混匀, 作用 10min, 分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中, 做活菌培养计数 第 2 组取 0.4mL 消毒剂于试管内, 加入 4.5mL 中和剂 ( 对于酸性氧化电位水检测时, 取 0.5mL 消毒剂于试管内, 加入 4.4mL 中和剂 ) 混匀, 置 20 ±1 水浴中 5min 后, 再加入 0.1mL 试验菌悬液, 混匀, 作用 10min, 分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中, 做活菌培养计数 第 3 组取 0.4mL 标准硬水于试管内, 加入 4.5mL 稀释液, 混匀, 置 20 ±1 水浴中 5min 后, 再加入 0.1mL 试验菌悬液, 混匀, 作用 10min, 分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中, 做活菌培养计数 第 4 组分别吸取稀释液 标准硬水与中和剂各 0.5mL 于同一无菌平皿内, 倒入上述试验同批次的培养基 15mL~20mL, 培养观察 15

17 中和剂载体定量鉴定试验操作程序根据实验分组, 准备足量试管和平皿, 依次进行编号 各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本 将适宜浓度的菌悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释作为试验菌悬液, 载体试验用菌量应保证其回收菌量在 2.5³10 2 cfu/ 片 ~1.5³10 3 cfu/ 片之间 鉴定试验包括 4 组 : 第 1 组吸取中和剂 5.0mL 于无菌平皿中, 将其置 20 ±1 水浴中 5min 后, 用无菌镊子夹入 1 菌片, 并使浸透于中和剂内, 作用 10min 立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0mL 中和剂试管中, 用电动混匀器混合 20s, 或将试管振打 80 次, 混匀, 分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中, 做活菌培养计数 第 2 组吸取中和产物溶液 ( 按每片浸有消毒剂的载体加入含 5.0mL 中和剂的量制备中和产物 ) 5.0mL 于无菌平皿内, 将其置 20 ±1 水浴中 5min 后, 用无菌镊子夹入 1 菌片, 并使浸透于中和产物溶液中 作用 10min, 用无菌镊子取出菌片, 移入含 5.0mL 中和产物溶液的试管中, 用电动混匀器混合 20s, 或将试管振打 80 次, 混匀 分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中, 做活菌培养计数 第 3 组吸取稀释液 5.0mL 于无菌平皿内, 将其置 20 ±1 水浴中 5min 后, 用无菌镊子夹入 1 菌片, 并使浸透于稀释液中 作用 10min, 立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0mL 稀释液的试管中, 用电动混匀器混合 20s, 或将试管振打 80 次, 混匀, 分别吸取 1.0mL 接种于两个平皿中, 做活菌培养计数 第 4 组分别吸取稀释液与中和剂各 1.0mL 于同一无菌平皿内, 倒入上述试验同批次的培养基 15mL~20mL, 培养观察 评价规定实验结果符合以下全部条件, 所测中和剂可判为合格 : (1) 第 1 2 和 3 组有相似量试验菌生长, 悬液试验作用体系中菌量在 50cfu/mL~300cfu/mL 之间, 载体试验菌量在 2.5³10 2 cfu/ 片 ~1.5³10 3 cfu/ 片之间 其组间菌落数误差率应不超过 15% 第 1 2 和 3 组间菌落数误差率计算公式如下 : 组间菌落数误差率 ( 三组间菌落平均数 各组菌落平均数 ) 的绝对值之和 100 % 三组菌落平均数之和 (2) 第 4 组无菌生长 否则, 说明试剂有污染, 应更换无污染的试剂重新进行试验 (3) 试验重复 3 次, 每次试验均应符合以上要求 注意事项 (1) 试验所分各组均有其特定意义, 不得任意删减 (2) 严守无菌操作, 保持试验用液和器材的无菌, 注意更换吸管, 以防止沾染影响试验的 16

18 准确性 (3) 实验组序应按本规范所列排列 过滤冲洗法去除残留消毒剂试验 目的通过滤膜过滤和冲洗的方法, 去除试验体系中的残留消毒剂, 以便准确检测出试验体系中仍然存活的微生物及其数量 本方法可去除残留消毒剂对微生物的杀灭和抑制作用 实验器材 (1) 过滤设备包括灭菌处理的滤器 微孔滤膜 ( 孔径为 0.45µm), 真空泵 ( 或抽滤泵 ) (2) 稀释液和冲洗液应不影响滤膜的性质, 对微生物无伤害作用 可用生理盐水 PBS 稀释液 ( 见附录 A) 0.5% 吐温 80 的 PBS 可中和部分消毒成分的中和剂 (3) 其他器材随试验微生物确定 试验设计原则 (1) 通过所设各组试验结果综合分析, 应可确定所选方法是否对测试消毒剂有良好的去除作用, 对试验微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响 (2) 试验中所用消毒剂的浓度应为杀菌试验中使用的最高浓度 (3) 同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时, 所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验 对细菌繁殖体, 在大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌中任选其一进行试验 ; 对细菌芽孢 白色念珠菌 黑曲霉菌 分枝杆菌应分别进行鉴定试验 当用其他特定微生物进行杀灭试验时, 均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验 (4) 鉴定中应根据正式杀灭试验的设计, 选择使用悬液定量试验, 还是载体定量试验 通常, 悬液鉴定试验结果可用于载体试验 过滤冲洗去除方法的鉴定操作程序如下 : 根据实验分组, 准备足量试管和平皿, 依次进行编号 将菌悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释成 2.5³10 2 cfu/ml~1.0³10 3 cfu/ml, 作为试验菌悬液 其试验分以下 3 组进行 : 第 1 组吸取 1.0mL 试验菌悬液于试管内, 加入 4.0mL 标准硬水, 混匀 取 1.0mL 加入到过滤器中, 然后加入 50mL 蒸馏水作冲洗过滤处理, 然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面, 放置在 37 恒温培养箱中培养 48h( 真菌和芽孢培养 72h), 计数菌落数 第 2 组吸取 0.2mL 试验菌悬液直接加入到过滤器中, 然后加入 150mL 至 500mL 冲洗液于过滤器中, 做第 1 次冲洗过滤处理, 再加入 50mL 蒸馏水做第 2 次冲洗过滤处理, 最后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面, 放置在 37 恒温培养箱中培养 48h( 真菌和芽孢培养 72h), 计数菌落数 第 3 组吸取 4.0mL 消毒剂于试管中, 加入 0.5mL 有机干扰物, 再加入 0.5mL 稀释液, 混匀, 取 1.0mL 加入到过滤器中, 加入 150mL 至 500mL 冲洗液做第 1 次冲洗过滤处理, 再加入 17

19 50mL 冲洗液做第 2 次冲洗过滤处理, 冲洗后吸取 0.2mL 试验菌悬液直接加入到过滤器中, 再加入 50mL 蒸馏水做第 3 次冲洗过滤处理, 然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面, 置 37 恒温培养箱中培养 48h( 真菌和芽孢培养 72h), 计数菌落数 评价规定试验结果符合以下全部条件, 所测中和剂可判为合格 : (1) 第 1 2 和 3 组测定的结果, 菌悬液菌数应在 50cfu/ 滤膜 ~200cfu/ 滤膜之间, 其组间菌落数误差率不得超过 15% 组间菌落数误差率的计算见 中公式 (2) 试验重复 3 次, 每次试验均应符合以上要求 细菌杀灭试验 目的在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢的消毒效果 实验器材 (1) 按 所示方法制备的金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片 对特定用途或试验特殊需要, 可准备相应其他菌种的悬液或菌片 (2) 消毒剂溶液除有特殊规定者外, 应使用无菌硬水配制 消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准 例如, 含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准, 碘伏以所含有效碘为准, 过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准, 复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分含量为准 各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算, 应以实验菌与消毒剂的混合液中有效成份的最终浓度 ( 作用浓度 ) 为准 (3) 去除残留消毒剂的中和剂或设备 ( 经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材 ) (4) 消毒剂稀释用标准硬水见附录 A (5) 有机干扰物质悬液试验和载体试验用牛血清白蛋白溶液, 本规范中规定对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂, 有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为 0.3%; 对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂, 有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为 3.0% 有机干扰物的配置方法见附录 A (6)TSA 培养基见附录 A (7) 含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基 ( 中和剂 TSB), 中和剂经鉴定合格 (8) 刻度吸管 (1.0mL 5.0mL) (9) 恒温水浴箱 (10) 恒温培养箱 (11) 电动混匀器 (12) 秒表 实验分组试验中应分以下各组 : (1) 试验组按测试目的有两种选择 18

20 第一种适用于消毒产品鉴定 根据使用说明书, 选定试验菌和一个消毒剂浓度 ( 即产品使用说明书中指定的最低浓度 ) 以及 3 个作用时间 ( 说明书指定最短作用时间, 指定最短作用时间的 0.5 倍, 指定最短作用时间的 1.5 倍 如说明书指定最短作用时间为 20min, 则 3 个作用时间应分别为 10min 20min 和 30min) 进行试验 第二种适用于消毒产品监督机构日常监测 根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力, 选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度 ( 即产品使用说明书中指定的最低浓度 ) 以及 1 个作用时间 ( 说明书指定最短作用时间 ) 进行试验 (2) 阳性对照组根据各种试验的规定, 用标准硬水代替消毒剂溶液, 按上述同样的步骤进行试验 所得结果代表试验体系中的菌液浓度, 以其作为对照组活菌浓度 悬液定量杀菌试验操作程序 (1) 按照 配制实验用菌悬液, 使其浓度为 1³10 8 cfu/ml~5³10 8 cfu/ml( 回收菌落数为 1³10 7 cfu/ml~5³10 7 cfu/ml) (2) 按照产品说明书要求配制消毒液 无特殊说明者, 一律使用无菌硬水配制, 配制的浓度为待测浓度的 1.25 倍 ( 例如要评价的消毒液浓度为 200mg/L, 则应配制的浓度为 250mg/L), 置 20 ±1 水浴备用 (3) 取消毒试验用无菌试管, 先加入 0.5mL 试验用菌悬液, 再加入 0.5mL 有机干扰物质, 混匀, 置 20 ±1 水浴中 5min 后, 用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0mL 注入其中, 迅速混匀并立即计时 (4) 待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间, 分别吸取 0.5mL 试验菌与消毒剂混合液加于 4.5mL 中和剂中, 混匀 (5) 各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后, 分别吸取 1.0mL 样液, 按活菌培养计数方法测定存活菌数, 每管样液接种 2 个平皿 如平板上生长的菌落数较多时, 可进行系列 10 倍稀释后, 再进行活菌培养计数 (6) 同时用标准硬水代替消毒液, 进行平行试验, 作为阳性对照 (7) 所有试验样本均在 37 恒温培养箱中培养, 对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果 ; 对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果 (8) 试验重复 3 次, 计算各组的活菌浓度 (cfu/ml), 并换算为对数值 (N), 然后按下式计算杀灭对数值 : 杀灭对数值 (KL)= 对照组平均活菌浓度的对数值 (No)- 实验组活菌浓度对数值 (Nx) 计算杀灭对数值时, 取小数点后两位值, 可以进行数字修约 但是, 如果消毒实验组消毒处理后平均生长菌落数小于 1 时, 本规范规定此时的杀灭对数值, 即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值 (KL No) 19

21 载体浸泡杀菌试验操作程序 (1) 载体浸泡定量杀菌试验操作程序 1) 按照 制配实验用菌片, 使每个菌片的回收菌数为 1³10 6 cfu/ 片 ~5³10 6 cfu/ 片 2) 取无菌平皿, 标明所注入消毒液的浓度 按每片 5.0mL 的量, 吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中 3) 将盛有消毒剂平皿置 20 ±1 水浴 5min, 用无菌镊子取预先制备的菌片 3 片分别放入平皿中, 并使之浸没于消毒液 4) 待菌液与消毒剂相互作用至各预定时间, 用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中 用电动混匀器混合 20s, 或将试管在手掌上振打 80 次, 中和作用 10min 混匀后, 吸取 1.0mL 直接接种平皿, 每管接种 2 个平皿, 测定存活菌数 5) 另取一平皿, 注入 10.0mL 稀释液代替消毒液, 放入 2 片菌片, 作为阳性对照组 其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同 6) 所有试验样本均在 37 恒温培养箱中培养, 对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果 ; 对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果 7) 试验重复 3 次, 计算各组的活菌量 (cfu/ 片 ), 并换算为对数值 (N), 然后按下式计算杀灭对数值 : 杀灭对数值 (KL)= 对照组平均活菌量的对数值 (No)- 实验组活菌量对数值 (Nx) (2) 载体浸泡定性灭菌试验操作程序 1) 按照 制配实验用菌片, 使每个菌片的回收菌落数为 1³10 6 cfu/ 片 ~5³10 6 cfu/ 片 2) 取无菌平皿, 标明所注入消毒液的浓度 按每片 5.0mL 的量, 吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中 3) 将盛有消毒剂平皿置 20 ±1 水浴 5min, 用无菌镊子取预先制备的菌片 6 片分别放入平皿中, 并使之浸没于消毒液 4) 待试验菌与消毒液相互作用至预定时间, 用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中 用电动混匀器混合 20s, 作为试验组样本 5) 另取一平皿, 注入 20.0mL 标准硬水代替消毒液, 放入 4 片菌片, 作用至设定时间, 取出 2 片, 分别移入含 5mL 中和剂试管中, 其随后的试验步骤与上述试验组相同, 作为阳性对照组样本 另取出 2 片, 分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中, 用电动混匀器混合 20s, 或将试管在手掌上振打 80 次, 然后用稀释液做系列 10 倍稀释, 选择适宜稀释度, 吸取 1.0mL 接种平皿, 每管接种 2 个平皿, 做活菌培养计数, 作为菌数对照组样本 6) 所有试验样本均在 37 恒温培养箱中培养, 对细菌繁殖体培养 48h, 观察最终结果 ; 对细菌芽孢需培养 7d, 观察最终结果 7) 试验重复 5 次, 计算各组的活菌量 (cfu/ 片 ) 20

22 流动浸泡载体定量杀灭试验操作程序 (1) 按照 制备实验用菌片, 使每个菌片的回收菌落数为 1³10 6 cfu/ 片 ~ 5³10 6 cfu/ 片 (2) 开启消毒设备, 待产生的酸性氧化电位水或臭氧水中有效成分处于稳定状态时, 进行杀灭试验 (3) 取尼龙网片或不锈钢网片放 250mL 烧杯底部中央, 将染菌载体放于尼龙网片或不锈钢网片表面, 染菌载体上再盖一尼龙网片或不锈钢网片 将酸性氧化电位水或臭氧水通过管路沿烧杯壁流下, 流动浸泡消毒至规定作用时间, 用无菌镊子将染菌载体取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中 用电动混匀器混合 20s, 或将试管在手掌上振打 80 次, 中和作用 10min 混匀, 吸取 1.0mL 直接接种平皿, 每管接种 2 个平皿, 作为试验组样本 (4) 另取两个染菌载体放入 250mL 烧杯中, 放置方法与试验组相同 以自来水代替酸性氧化电位水或臭氧水, 在相同流量下流动浸泡至最长作用时间, 其余步骤与试验组相同, 作为阳性对照组样本 (5) 分别吸取稀释液与中和剂各 1.0mL 于同一无菌平皿内, 倾入上述试验同批次的培养基 15mL~20mL, 作为阴性对照样本 (6) 所有试验样本均在 37 ( 黑曲霉菌在 30 ) 恒温培养箱中培养, 对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果 ; 对真菌和细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果 (7) 试验重复 3 次, 计算各组的活菌量 (cfu/ 片 ), 并换算为对数值 (N), 然后按 (1)7) 公式计算杀灭对数值 滤膜过滤悬液定量杀灭试验 (1) 菌悬液的制备和定量杀灭试验同 (1) (2) 和 (3) (2) 滤膜孔径 0.45µm (3) 待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间, 分别吸取 1.0mL 试验菌与消毒剂混合液加入到过滤器中过滤, 然后加入 150mL 至 500mL 冲洗液 ( 预先置 20 ±1 水浴中 5min) 做第 1 次冲洗过滤处理, 再加入 50mL 蒸馏水做第 2 次冲洗过滤处理, 最后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面, 置 37 恒温培养箱中培养至规定时间 (4) 吸取 0.5mL 试验菌悬液于试管内, 加入 0.5mL 有机干扰物, 再加入 4.0mL 标准硬水, 混匀 做系列 10 倍稀释后取适当稀释度该混合液 1.0mL 加入到过滤器中, 然后加入 50mL 蒸馏水 ( 预先置 20 ±1 水浴中 5min) 作冲洗过滤处理, 然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面, 置 37 恒温培养箱中培养至规定时间, 计数菌落数, 作为阳性对照 (5) 分别吸取稀释液 蒸馏水和硬水各 1.0mL 于同一无菌平皿内, 倒入上述试验同批次的培养基 15mL~20mL, 置 37 恒温培养箱中培养至规定时间, 计数菌落数, 作为阴性对照 (6) 试验重复 3 次, 计算各组的活菌量 (cfu/ml 或片 ), 并换算为对数值 (N), 然后按 (1)7) 公式计算杀灭对数值 21

23 评价规定 (1) 产品监督检验, 在产品说明书指定的最低浓度与最短作用时间, 重复试验 3 次 悬液定量杀灭试验中, 各次的杀灭对数值均 5.00, 判定为消毒合格 载体定量杀灭试验, 各次的杀灭对数值均 3.00, 判定为消毒合格 (2) 产品申报卫生许可检验中, 要求在产品说明书指定的浓度与 3 个作用时间, 重复试验 3 次 在产品指定最低浓度与最短作用时间, 以及最短作用时间的 1.5 倍时, 要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均 5.00 载体定量杀灭试验和流动浸泡载体定量杀灭试验中, 各次的杀灭对数均 3.00, 判定为消毒合格 在产品指定浓度与最短作用时间的 0.5 倍时, 可允许对不同细菌或在部分重复次数中, 出现不合格结果 在申报卫生许可检验中, 检验机构如果发现产品说明书指定的浓度与作用时间, 与常规消毒剂量差异较大, 不能进行消毒试验评价时, 可根据专业知识合理调整其浓度与时间, 然后再进行测试 (3) 对载体浸泡定性灭菌试验, 阳性对照组有菌生长, 菌数对照组符合要求, 阴性对照组无菌生长,5 次试验均无菌生长, 判定为灭菌合格 (4) 报告中应将各次试验的结果全部以表格的形式列出 阳性对照组应列出各次实验菌浓度, 以及平均实验菌浓度 实验组应列出杀灭对数值, 例如, 杀灭对数值大于 5.00 时, 应表示为 5.00, 而不必列出具体的数字 ; 杀灭对数值小于 5.00 时, 应列出具体的数字 ( 例如 2.58,4.65) 注意事项 (1) 在杀菌试验中, 每次均应设置阳性对照 (2) 试验中所使用的中和剂 稀释液和培养基等, 各批次均应进行无菌检查, 发现有菌生长, 则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做 (3) 悬液定量杀菌试验时, 有机干扰物质一般采用 3.0%(W/V) 牛血清白蛋白贮存溶液, 在消毒体系中稀释 10 倍 ( 含量为 0.3%), 进行消毒试验 如果某消毒剂使用说明书中指定, 其产品只用于清洁物品或器械的消毒或只用于冲洗浸泡消毒, 可采用 0.3%(W/V) 牛血清白蛋白贮存溶液, 在消毒体系中稀释 10 倍 ( 含量为 0.03%), 进行消毒试验 分枝杆菌杀灭试验 目的在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上分枝杆菌的消毒效果 实验器材 (1) 实验菌株龟分枝杆菌脓肿亚种 CA 93326(ATCC 19977) (2) 培养基分枝杆菌干燥培养基 (3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备 (4) 中和剂 ( 根据 所示方法鉴定合格者 ) (5) 稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液 22

24 (6) 消毒剂稀释用硬水见附录 A (7) 有机干扰物质见附录 A (8) 刻度吸管 (0.1mL 1.0mL 5.0mL) (9) 恒温水浴箱 (10) 电动混匀器 (11) 计时装置 (12) 恒温培养箱 龟分枝杆菌脓肿亚种菌悬液的制备 (1) 以无菌操作方式开启冻干菌种管, 用毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中, 轻柔吹吸数次, 使菌种融化分散 取含 5.0mL~10.0mL 营养肉汤试管, 滴入少许菌种悬液, 置 37 培养 18h~24h 用接种环取第 1 代培养的菌悬液, 划线接种于分枝杆菌培养基平板上, 置 37 培养 72h 挑取上述第 2 代培养物中典型菌落, 接种于分枝杆菌培养基斜面, 置 37 培养 72h, 即为第 3 代培养物 密封后,4 保存, 时间不得超过 6 周 (2) 试验时取第 3 代斜面培养物, 在分枝杆菌干燥培养基斜面上连续传代, 培养方法与第 3 代相同 取第 5~6 代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物 (72h), 用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL~ 5.0mL 稀释液加入斜面试管内, 反复吹吸, 洗下菌苔 随后, 用 5.0mL 吸管将洗液移至另一含有 6g~7g 玻璃珠的无菌圆锥底塑料试管中, 在电动混匀器混合 5min 然后将菌液吸入到另一试管内制成菌悬液 (3) 将制成的菌悬液, 进行活菌培养计数 ( 见 2.1.3), 按其结果用稀释液稀释至所需浓度 (4) 菌悬液保存在 4 冰箱内备用, 当天使用不得过夜 实验分组试验分为下列各组 : (1) 试验组, 按 规定, 选定消毒剂浓度与作用时间 (2) 阳性对照组, 以标准硬水代替消毒剂溶液, 按 规定程序进行试验 所得结果代表试验体系中所含受试菌的活菌浓度, 并以其计算消毒因子对受试菌的杀灭对数值 (3) 阴性对照组, 观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染 试验程序常用杀灭试验有 : 悬液定量杀灭试验 载体浸泡定量杀灭试验和流动浸泡载体定量杀菌试验等 其操作程序按 和 进行, 接种后的平皿应放入干净的塑料袋内, 置 37 恒温培养箱中培养 7d, 观察最终结果 评价规定 (1) 产品监督检验, 按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间, 重复试验 3 次, 悬液定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均 4.00, 载体定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均 23

25 3.00, 判定为消毒合格 (2) 产品申报卫生许可检验, 按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间, 重复试验 3 次 用悬液定量杀菌试验评价杀菌效果时, 在产品规定使用浓度与最低作用时间, 以及最短作用时间的 1.5 倍时, 各次试验的杀灭对数值均应 4.00, 在产品规定使用浓度与最短作用时间的 0.5 倍时, 允许杀灭对数值 <4.00, 判定为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量 用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时, 在产品规定使用浓度与最短作用时间和最短作用时间的 1.5 倍时, 各次试验的杀灭对数值 3.00, 在产品规定使用浓度与最短作用时间的 0.5 倍时, 允许杀灭对数值 <3.00, 判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量 注意事项 (1) 分枝杆菌试验操作应在生物安全 Ⅱ 级实验室中进行, 避免造成实验人员实验室感染和对环境污染 (2) 其它注意事项见 真菌杀灭试验 目的在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子的消毒效果 实验器材 (1) 麦芽浸膏琼脂 (MEA) 见附录 A (2) 沙堡琼脂培养基见附录 A (3) 试验菌及其菌悬液或菌片白色念珠菌 ATCC 和黑曲霉菌 ATCC 孢子悬液与菌片, 按 (1) 和 (2) 所示方法制备 根据消毒剂特定用途和特殊需要, 可选择相应的真菌或孢子悬液与菌片 (4) 中和剂 ( 根据 所示方法鉴定合格者 ) (5) 磷酸盐缓冲液 ( PBS,0.03 mol/l,ph7.2) (6) 消毒剂稀释用硬水见附录 A (7) 有机干扰物质见附录 A (8) 刻度吸管 (0.1mL 1.0mL 5.0mL) (9) 恒温水浴箱 (10) 电动混匀器 (12) 计时装置 (13) 恒温培养箱 真菌悬液制备 (1) 白色念珠菌悬液的制备 1) 以无菌操作方式开启冻干菌种管, 用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于菌种管中, 轻 24

26 柔吹吸数次, 使菌种融化分散 取含 5.0mL~10.0mL 沙堡液体培养基试管, 滴入少许菌种悬液, 置 37 培养 18h~24h 用接种环取第 1 代培养的菌悬液, 划线接种于沙堡琼脂培养基平板上, 置 37 培养 18h~24h 挑取上述第 2 代培养物中典型菌落, 接种于沙堡琼脂斜面, 置 37 培养 18h~24h, 即为第 3 代培养物 2) 取第 3~6 代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物 (18h~24h), 用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL~ 5.0mL 稀释液加入斜面试管内, 反复吹吸, 洗下菌苔 随后, 用 5.0mL 吸管将洗液移至另一无菌试管中, 用电动混匀器混合 20s, 或在手掌上振打 80 次, 以使白色念珠菌悬浮均匀 3) 悬液定量杀菌试验时, 实验用菌悬液的含菌量为 1³10 7 cfu/ml~5³10 7 cfu/ml; 载体定量杀菌试验时, 菌片制备按 要求进行 4) 菌悬液保存在 4 冰箱内备用, 当天使用不得过夜 5) 怀疑有污染时, 应以菌落形态 革兰染色与生化试验等法进行鉴定 菌落形态可直接用显微镜观察 菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察, 也可用墨水阴地法染色 ( 将菌与黑墨水在玻片上混匀, 推成薄膜 ) 后观察 (2) 黑曲霉菌 (ATCC 16404) 孢子悬液或菌片的制备 1) 以无菌操作方式开启冻干菌种管, 用毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中, 轻轻吹吸, 使菌种沉淀物融化分散 取少许沉淀物悬液加到含 5.0mL 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中, 置 30 ±1 恒温培养箱中培养 42h~48h 用接种环划线接种第 1 代培养物于 MEA 培养基平板, 置 30 ±1 恒温培养箱中培养 42h~48h 取平板培养物中的典型菌落, 接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基, 置 30 ±1 恒温培养箱中培养 42h~48h, 即为第 3 代培养物 2) 用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL~10.0mL 第 3 代培养物, 接种罗氏瓶, 并摇动使菌液布满 MEA 培养基表面, 然后将多余肉汤培养物液体吸出, 置 30 ±1 恒温培养箱中培养 42h~48h 3) 向罗氏瓶培养物中加入 5.0mL~10.0mL 0.05%(V/V) 吐温 80 生理盐水溶液, 刮洗黑曲霉菌分生孢子于溶液中, 将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中, 轻轻振摇 1min 后, 滤过除去菌丝 滤过后, 显微镜下 (400 倍 ) 观察是否存在菌丝, 若悬液中有菌丝存在, 可经 5000 r/min~ 6000 r/min, 离心 20min 再次在显微镜下(400 倍 ) 观察, 若悬液中仍有菌丝存在, 须再离心 4) 黑曲霉菌分生孢子悬液在 2 ~8 储存不能超过 2d, 使用前, 混合均匀, 在显微镜下 (400 倍 ) 观察是否有孢子出芽, 若有孢子出芽, 则不得使用 5) 悬液试验时, 可用稀释液适当稀释使实验用菌悬液的含菌量为 1³10 7 cfu/ml ~5³10 7 cfu/ml 6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法, 每片加菌悬液 10μ l 染菌后, 置二级生物安全柜内干燥备用 回收菌数应达 1³10 6 cfu/ 片 ~5³10 6 cfu/ 片 实验分组试验分为下列各组 : 25

27 (1) 试验组, 按 规定, 选定消毒剂浓度与作用时间, 对受试菌种的杀灭能力进行测定 (2) 阳性对照组, 以标准硬水代替消毒剂溶液, 按 规定程序进行试验 所得结果代表试验体系中所含试验菌的活菌浓度, 并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值 (3) 阴性对照组, 观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染 试验程序常用杀灭试验有 : 悬液定量杀菌试验 载体浸泡定量杀菌试验等 对白色念珠菌使用沙堡琼脂培养基, 对黑曲霉菌使用麦芽浸膏琼脂 (MEA) 其操作程序详见 活菌培养计数时, 对白色念珠菌, 在 37 恒温培养箱中培养 72h 观察最终结果 对黑曲霉菌, 在 30 恒温培养箱中培养 72h 观察最终结果 评价规定 (1) 产品监督检验, 按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间, 重复试验 3 次, 对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均 4.00, 判定为消毒合格 对所试特定真菌的杀灭对数值均 4.00, 判定为消毒合格 (2) 产品申报卫生许可检验, 按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间, 重复试验 3 次, 在产品规定使用浓度与最短作用时间, 以及最短作用时间的 1.5 倍时, 各次试验的杀灭对数值均应 4.00, 在产品规定使用浓度与最短作用时间的 0.5 倍时, 允许杀灭对数值 <4.00, 判定为消毒合格 用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时, 在产品规定使用浓度与最短作用时间, 以及最短作用时间的 1.5 倍时, 各次试验的杀灭对数值 3.00, 在产品规定使用浓度与最短作用时间的 0.5 倍时, 允许杀灭对数值 <3.00, 判定为消毒合格 注意事项 (1) 黑曲霉菌试验操作应在专门的生物安全 Ⅱ 级实验室内进行, 避免造成环境污染和操作者受污染 (2) 其它注意事项见 病毒灭活试验 目的评价各种用途的消毒因子对病毒的灭活效果 实验器材 (1) 实验用病毒株脊髓灰质炎病毒 Ⅰ 型 (poliovirus-Ⅰ,pv-Ⅰ) 疫苗株 ; 艾滋病病毒 1 型 (human immunodeficiency virus,hiv-1) 美国株 (2) 宿主细胞可采用 VERO 细胞系 BGM 细胞 Hela 细胞系或 FL 细胞系, 作为 PV-Ⅰ 的测试细胞 用含有人 T 淋巴细胞白血病病毒 1 型 (human T cell leukemiavirus 1,HTLV-1) 基因的人淋巴细胞 (MT4 株 ) 作为 HIV-1 的测试细胞 26

28 (3) 细胞培养瓶 (4)96 孔培养板 (5) 恒温水浴箱 (6) 二氧化碳培养箱 (7) 二级生物安全柜 (8) 低温冰箱 (-20,-80 ) (9) 液氮罐 (10) 倒置显微镜 (11) 低温高速离心机 (12) 可调移液器及配套一次性塑料吸头 (13) 细胞维持培养基见附录 A (14) 细胞完全培养基见附录 A (15) 去离子水 标准硬水 ( 硬度为 324mg/L) (16) 有机干扰物对未清洗较脏的物品用 3.0% 牛血清白蛋白 对已清洗较清洁的物品用 0.3% 牛血清白蛋白 (17) 胎牛血清或新生牛血清 病毒悬液的制备 (1) 从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞, 在 37 温水中迅速融化, 用毛细吸管移置于含有细胞维持液的细胞管内, 吹吸数次, 混匀, 立即离心 (3000r/min,3min), 去上清液 再加入适当的细胞维持液, 吹吸数次, 混匀, 同上离心后, 转种于加有 10mL 完全培养基的培养瓶中 逐日观察细胞生长情况, 在细胞长满单层时, 用于传代或消毒试验 (2) 取出低温冻存的试验病毒毒种, 室温融化, 用不含胎牛血清的培养基作 10 倍稀释, 然后全部接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内, 置 37 CO2 培养箱中, 吸附 1~2h, 吸出病毒悬液, 加入细胞维持液, 至 37 CO2 培养箱内培养 待 3/4 细胞出现病变时, 收获病毒 (3) 将含有病毒及宿主细胞的培养液, 在冰浴条件下, 用超声波 ( 或室温与 -20 反复冻融 3 次 ) 破碎宿主细胞或用其他相应的方法破碎宿主细胞, 释放病毒 然后, 尽快离心 (6000r/min, 15min) 去除沉淀 ( 主要为细胞碎片 ), 上清液即为所需的病毒悬液 按每管 1.0mL 分装于无菌离心管 (1.5mL) 中 (4) 取 1 支病毒悬液, 按病毒滴度测定法, 测定其病毒滴度 其余置 -80 冷冻保存备用 病毒载体的制备 (1) 按 制备载体 (2) 取出低温冻存的病毒悬液, 室温融化, 与等量有机干扰物混合, 取 0.01mL 滴染于载体片上, 室温凉干后备用 病毒滴度测定 27

29 (1) 操作步骤用细胞维持液对样本做系列 10 倍稀释, 每个稀释度滴加 4 孔 ( 各孔中应该已经长满单层的宿主细胞 ) 于培养板上, 置 37 CO2 培养箱 1h~2h, 确保病毒吸附在细胞上 取出培养板, 更换细胞维持液 放入 CO2 培养箱中 (37,5%CO2) 培养, 每日在显微镜下观察细胞病变, 连续观察 3d~5d, 逐孔记录细胞病变情况 (2) 病毒滴度的计算病毒滴度以半数细胞感染剂量 (TCID50) 表示,TCID50 的对数值计算公式如下 : TCID50 对数值 = 病变率高于 50% 组稀释度的对数值 + 距离比例 具体计算步骤如下 : 1) 计算细胞病变率 先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数, 然后分别计算 细胞病变 (-) 和 细胞病变 (+) 的累积总计值 计算 细胞病变 (-) 累积值时, 由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积 ; 细胞病变 (+) 累积值则相反, 由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积 ( 见表 2-2) 各稀释度样本组 细胞病变 (+) 累积总计值, 除以该稀释度样本组 细胞病变 (-) 与 细胞病变 (+) 累积总计值之和即为其病变比, 由之可得病变率 (%)( 见表 2-2) 2) 计算距离比例 距离比例可按下式计算 : 距离比例 高于 50% 组的病变率 50 高于 50% 组的病变率 低于 50% 组的病变率 注 : 病变率高于 50% 组是指病变率超过 50% 的最低组, 以下简称高于 50% 组 ; 病变率低于 50% 组是指病变率低于 50% 的最高组, 以下简称低于 50% 组 计算举例 : 设试验数据如表 2-2 表 2-2 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果 样本接种细胞病变累积值细胞病变细胞病变稀释度孔数 - + (-) (+) 病变比 病变率 (%) / / / / /8 0 本例, 高于 50% 组病变率 (%) 为 80; 低于 50% 病变率 (%) 为 20; 高于 50% 组稀释度对数值为 6 28

30 距离比例 TCID50 对数值 = = 残留消毒剂中和稀释法的鉴定试验 (1) 目的确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验 (2) 试验设计原则 1) 通过所设各组试验结果综合分析, 应可确定所用中和剂是否对测试消毒药物有良好的中和作用, 对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响 2) 根据试验目的, 选择适宜的病毒株和细胞株 3) 中和试验用消毒剂浓度应为最高使用浓度, 最短作用时间不得少于 30s (3) 实验分组 1) 中和剂 + 病毒悬液 细胞维持培养基系列稀释, 接种细胞培养观察中和剂对病毒有无抑制作用 2)( 消毒剂 + 中和剂 ) + 病毒悬液 细胞维持培养基系列稀释, 接种细胞培养观察中和产物, 或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰 3) 病毒悬液 细胞维持培养基系列稀释, 接种细胞培养观察病毒是否可正常生长, 并将其结果作为阳性对照值 4) 未接种病毒的细胞 培养观察其生长是否正常 (4) 病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序 1) 按 制备病毒悬液 消毒剂用标准硬水按规定浓度的 1.25 倍配制, 备用 2) 中和剂鉴定试验分以下 4 组 : 第 1 组吸取 0.98mL 中和剂溶液于试管内, 置 20 ±1 水浴 5min, 加入 0.02mL 病毒悬液, 混合均匀, 作用 10min, 以细胞维持培养基作系列稀释, 取样作为第 1 组样本 第 2 组吸取 0.98mL 中和产物 (0.9mL 中和剂 +0.08mL 消毒剂溶液 ) 于试管内, 置 20 ±1 水浴 5min, 再吸加 0.02mL 病毒悬液, 混合均匀, 作用 10min, 以细胞维持培养基作系列稀释, 取样作为第 2 组样本 第 3 组吸取 0.98mL 细胞维持液于试管内, 置 20 ±1 水浴 5min, 再吸加 0.02mL 病毒悬液, 混合均匀, 作用 10min, 以细胞维持培养基作系列稀释, 取样作为第 3 组样本 第 4 组将试验用细胞, 加细胞维持液 3) 将第 1~3 组样本进行病毒滴度测定, 观察第 4 组细胞生长情况 (5) 病毒载体定量中和剂鉴定试验操作程序 29

31 1) 按 制备染毒载体 2) 中和剂鉴定试验分以下 4 组 : 第 1 组吸取中和剂 1.0mL 于无菌试管中, 将其置 20 ±1 水浴 5min, 用无菌镊子夹入 1 片病毒载体片, 并使浸透于中和剂内, 作用 10min, 用细胞维持液做系列 10 倍稀释, 取样作为第 1 组样本 第 2 组吸取中和产物溶液 ( 以浸有消毒剂的载体置 1.0mL 中和剂内, 作用 10min)1.0mL 于无菌试管中, 将其置 20 ±1 水浴 5min, 用无菌镊子夹入 1 片病毒载体片, 并使浸透于中和产物溶液中 作用 10min, 用细胞维持液做系列 10 倍稀释, 取样作为第 2 组样本 第 3 组吸取细胞维持液 1.0mL 于无菌试管中, 将其置 20 ±1 水浴 5min, 用无菌镊子夹入 1 片病毒载体片, 并使浸透于细胞维持液中 作用 10min, 用细胞维持液做系列 10 倍稀释, 取样作为第 3 组样本 第 4 组将试验用细胞, 加细胞维持液 3) 将第 1~3 组样本进行病毒滴度测定, 观察第 4 组细胞生长情况 (6)3d~5d 记录试验结果, 试验重复 3 次 (7) 评价规定试验结果符合以下全部条件, 所测中和剂可判为合格 : 1) 第 组病毒滴度的误差率小于 50%, 悬液定量法病毒滴度对数值为 5~7, 载体法病毒滴度对数值为 4~6 2) 第 4 组细胞生长正常 3) 连续 3 次试验取得合格评价 残留消毒剂物理去除方法的鉴定试验要点病毒灭活试验中的物理去除法, 首选稀释法, 其次为吸附柱法 分子筛柱法 载体冲洗法 (1) 分组 1)( 病毒悬液 + 消毒剂 )+ 除药处理 细胞维持培养液系列稀释, 接种培养观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用 2) 病毒悬液 + 除药处理 细胞维持培养液系列稀释, 接种培养观察除药处理对病毒滴度有无影响 3) 病毒悬液 细胞维持培养液系列稀释, 接种培养观察病毒生长是否正常, 并以该结果作为阳性对照值 4) 未接种病毒的细胞 培养观察细胞生长是否正常 (2) 悬液定量操作程序 1) 按 制备病毒悬液 消毒剂用标准硬水按规定浓度 1.25 倍配制备用 30

32 2) 中和剂鉴定试验分以下 4 组 : 第 1 组吸消毒剂 0.8mL 于试管内, 置 20 ±1 水浴中经 5min 后, 吸加 0.2mL 病毒悬液, 混匀 待作用至规定的时间, 对此液进行除药处理, 根据试验规定量, 吸取最终样本 ( 或用细胞维持培养液系列稀释的样液 ), 进行随后的病毒滴度测定 第 2 组吸取病毒悬液 0.2mL, 加 0.8mL 细胞维持培养液, 做除药处理 根据试验规定量, 吸取最终样本 ( 或用细胞维持培养液系列稀释的样液 ), 进行随后的病毒滴度测定 第 3 组吸取病毒悬液 0.2mL, 加细胞维持培养液 0.8mL, 不加消毒剂亦不做任何除药处理 直接进行病毒滴度测定 第 4 组向未接种病毒的细胞管内, 加入细胞维持培养液进行正常培养 (3) 评价规定试验结果符合以下全部条件, 所测物理除药法可判为合格 : 1) 第 1 组无试验病毒或仅有少量病毒生长 且明显少于第 2 组 第 3 组的病毒生长 2) 第 2 3 组病毒生长量相近, 二者差异不超过 1 个对数滴度 3) 连续 3 次试验取得合格评价 4) 可使用病毒载体, 按同样的原理与操作步骤进行试验, 判定合格标准相同 脊髓灰质炎病毒灭活试验 (1) 目的验证各种消毒因子对病毒的灭活效果 (2) 悬液定量灭活试验操作程序 1) 按 制备病毒悬液, 低温保存备用 2) 取待测消毒剂, 用灭菌硬水稀释至说明书设定的作用浓度的 1.25 倍, 置 20 ±1 水浴中备用 3) 取 0.1mL 有机干扰物与等量病毒悬液混合, 置 20 ±1 水浴 5min, 加入 0.8mL 消毒剂样品混匀, 作用至设定时间, 取 0.1mL 加入到 0.9mL 的中和剂中混匀, 用细胞维持液做系列 10 倍稀释, 取样进行病毒滴度测定 4) 阳性 ( 病毒 ) 对照组试验中, 用细胞维持液代替消毒剂, 其它同实验组 5) 试验重复 3 次 (5) 脊髓灰质炎载体定量灭活试验操作程序 1) 按 制备病毒载体 2) 取待测消毒剂, 用灭菌硬水稀释至说明书设定的作用浓度, 于 20 ±1 水浴中备用 3) 取无菌平皿, 按每片 5.0mL 的量, 吸取消毒液注入平皿中 4) 将平皿置 20 ±1 水浴 5min 后, 用无菌镊子分别取病毒载体片浸没于消毒液中 5) 作用至设定时间, 取出载体片分别移入含 1.0mL 的中和剂试管中 振打 80 次, 进行病毒滴度测定 31

33 6) 直接将病毒载体片加到含 1.0mL 细胞维持液的试管中, 振打 80 次, 进行病毒滴度测定, 作为阳性对照组 7) 试验重复 3 次 (6) 平均灭活对数值的计算平均灭活对数值按下式计算 : 设阳性 ( 病毒 ) 对照组平均病毒感染滴度 (TCID50) 的为 N0, 试验 ( 消毒 ) 组平均病毒感染滴度 (TCID50) 为 Nx 平均灭活对数值 = lgn0-lgnx (7) 评价规定 1) 悬液定量杀灭试验中, 杀灭对数值 4.00, 阳性对照组病毒滴度对数值在 5~7 之间为消毒合格 2) 载体定量灭活试验中, 杀灭对数值 3.00, 阳性对照组病毒滴度对数值在 4~6 之间为消毒合格 艾滋病病毒灭活试验 (1) 目的测定消毒剂对艾滋病病毒灭活所需的剂量, 以验证对该病毒污染物消毒的实用剂量 (2) 实验原理用细胞感染法测定消毒剂作用前后 ( 或试验组与对照组 ) 样本中 HIV 的量 以细胞病变作为判断指标, 确定各组病毒的感染滴度, 计算消毒剂对 HIV 的灭活对数值 (3) 安全防护试验中要求采取严密防护措施 我国规定所有接触 HIV 的试验均需在生物安全三级 (biological safety level 3,BSL 3) 实验室内进行, 并制定有相应的安全防护措施 在 HIV 灭活试验时, 必须严格按照有关安全规定进行 (4) 实验分组 1) 试验组根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计, 设立适宜的浓度与作用时间组 ( 不少于 1 个浓度,3 个作用时间 ), 对作用时间的设计应不短于 30s 所设组应能测出使 HIV 全部灭活所需的最低有效剂量 ( 药物浓度与作用时间 ) 2) 阳性对照组用细胞维持液代替消毒剂, 按试验组规定步骤加入 HIV 悬液进行试验和培养, 观察 HIV 生长是否良好 3) 阴性对照组用不含 HIV 的完全培养基作为阴性对照, 观察所用培养基有无污染, 细胞是否生长良好 4) 消毒剂对细胞毒性组取系列稀释的不同浓度的待测消毒剂各 100μL, 分别加入含有 100μL 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液 ( 含细胞 个 /ml) 的 96 孔培养板内 置二氧化碳恒温培养箱 (37 ) 中培养 7d, 观察细胞生长情况, 确定对细胞无毒性的消毒剂最高稀 32

34 释度 (5)HIV 悬液定量灭活试验操作程序 1) 从液氮中取出冻存的 MT4 细胞, 在 37 温水中迅速融化, 并用细胞维持液洗涤两次后, 转种于加有 10mL 完全培养基培养瓶中 逐日观察细胞生长情况, 在细胞对数生长期时收获细胞用于消毒试验 2) 从液氮中取出冻存 HIV-1 毒种, 接种于含 10mL 细胞悬液 ( 含细胞 个 /ml~ 个 /ml) 培养瓶中 逐日观察病变, 待 3/4 细胞出现病变时, 收获病毒 收获时, 将培养液取出, 尽快离心, 并将含病毒的上清液按每管 0.5mL 分装于无菌离心管 (1.5mL) 中, 冷冻保存于 -80 备用 如不能立即离心, 可暂将培养瓶冷冻保存于 -20, 并争取尽快离心分装 3) 取待测消毒剂, 用无菌去离子水作 1:2 1:4 1:8... 系列稀释 视消毒剂的类型和实验目的, 确定最高稀释度 为防止污染培养液, 必要时在试验前需将消毒剂过滤除菌 4) 取 100μL 有机干扰物, 与 100μL 病毒原液混合 加入 0.8mL 待检消毒剂后计时 待作用至规定时间, 取出 100μL, 加入 0.9mL 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液 ( 个 /ml), 在 37, 放置 40min, 以确保残留病毒全部吸附在细胞上 阳性 ( 病毒 ) 对照组试验中, 用无菌细胞维持液代替消毒剂 ; 消毒剂对细胞毒性组试验中, 用细胞维持液代替病毒 5) 取出反应管, 立即采取去除残留消毒剂处理 处理可用物理去除法或中和稀释法 ( 所用方法需先经试验证明, 既可有效去除残留消毒剂, 又对细胞和 HIV 无杀灭或抑制作用 6) 在 96 孔培养板上滴定样本中残留的病毒量 先在培养板 (96 孔 ) 的各孔中, 加入 100μL 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液 ( 含细胞 个 /ml) 同时, 用完全培养基对待滴定样本做 1:10 系列稀释, 然后取 100μL 稀释好的样本加入已含 MT4 细胞悬液的 96 孔培养板内 每个稀释度做 4 孔 7) 将按上述程序加液的 96 孔培养板, 放入二氧化碳培养箱中 (37,5%CO2), 逐日在显微镜下观察细胞病变 被感染细胞融合肿胀, 出现多核巨细胞 第 4 天, 在各反应孔内补加 50μL 新鲜完全培养基 第 7 天, 逐孔观察并记录细胞病变情况 8) 试验重复 3 次 (6) 评价规定 1) 对测试滴度的 HIV,3 次灭活试验后均应不再检出, 此时的灭活对数值应 4.00, 可判为该消毒剂浓度与作用时间, 对 HIV 污染物消毒的实验室试验合格 2) 在正常情况下,HIV 阳性对照组病毒感染滴度 (TCID50) 对数值应在 5~7 之间 阴性对照组宿主细胞生长良好, 并且无 HIV 检出 所用浓度的消毒液对宿主细胞生长无不良影响 否则, 根据发现的问题, 或调整 HIV 悬液浓度, 或选择适宜消毒液浓度, 或更换污染试剂和培养基, 或改进其他有关条件后, 重做试验 (7) 注意事项 1) 操作人员应具有较丰富的病毒学实验工作经验, 必须绝对遵守 BSL3 实验室的安全制度 33

35 身体状态欠佳, 或有伤口时, 应暂时停止工作 2) 有感染可能性的操作, 均应在 BSL3 实验室的层流负压超净工作台中进行 3) 一旦发生事故, 有病毒感染或污染环境的可能时, 切莫惊慌, 除立即进行妥善消毒处理外, 并应尽快报告实验室和单位领导 4) 本试验周期较长, 在全部过程中应注意防止样本污染 消毒剂杀菌作用影响因素试验 目的对新消毒产品进行评价时, 了解有机物 温度和 ph 对消毒剂杀菌作用的影响规律 实验器材 (1) 菌片与菌悬液 ( 按 要求和方法制备 ) (2) 恒温水浴箱 (3) 冷水浴装置 ( 可放入试管架的容器, 以冰水调节水温 ) (4) 温度计 (5)pH 计 (6) 有机物, 根据消毒剂的使用对象选择, 如酵母粉 血清 蛋白胨 牛血清白蛋白 (7) 中和剂 ( 经中和剂试验鉴定合格 ) (8) 盐酸 ( 用无菌纯化水配制 ) (9) 氢氧化钠 ( 用无菌纯化水配制 ) 实验微生物的选择根据所测消毒剂鉴定需要决定 一般情况下, 对细菌繁殖体应选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌, 作为革兰阳性与阴性细菌的代表 ; 对细菌芽孢应选择枯草杆菌黑色变种芽孢 也可直接选择特定的微生物进行试验 消毒剂浓度和作用时间的设定试验中应分以下各组 : (1) 试验组各种因素影响的测定, 均用杀灭相应微生物试验所得最低有效浓度和 3 个作用时间进行杀灭试验 以该最低有效浓度所需的最短有效时间和最短有效时间的 2 倍 3 倍为 3 个作用时间 试验结果应测出合格杀灭对数值的最低有效剂量 必要时, 可根据需要调整消毒剂浓度或作用时间, 若最短有效时间较长 (>30min), 可根据情况适当缩短作用时间的组距 对最短有效时间较短者 (<5min), 可根据情况适当延长作用时间的组距 (2) 阳性对照组用标准硬水代替消毒剂溶液, 按上述同样的步骤进行试验 所得结果代表活菌浓度 有机物对杀灭微生物效果影响的测定 (1) 以小牛血清为有机物代表, 应设置无小牛血清对照组 ; 含 25% 小牛血清组 ; 含 50% 小牛血清组等 3 组 各组所用消毒剂浓度和作用时间, 见

36 (2) 菌悬液与无菌小牛血清按 1:1 与 3:1 比例混合, 分别配成含 50% 与 25% 小牛血清的菌悬液 此含小牛血清的菌悬液, 可用于悬液定量杀菌试验, 亦可滴染菌片进行载体定量试验 (3) 以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定, 试验程序见 (4) 试验应重复 3 次 (5) 计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值 温度对杀灭微生物效果影响的测定 (1) 设置 10 ±1 20 ±1 30 ±1 等, 以 10 为间隔 各组消毒剂浓度和作用时间的设置见 (2) 以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定, 试验程序见 (3) 试验应重复 3 次 (4) 计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值 ph 对杀灭微生物效果影响的测定 (1) 以该消毒剂的使用浓度 ph 值和使用浓度的 ph 值加 2 ph 值减 2, 设 3 组进行试验 对消毒液 ph 值的调节, 先用 ph 计测定原消毒剂的 ph 值, 在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液, 偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以调整 随时用 ph 计测定消毒剂的 ph 值 当达到所要求的 ph 值后, 停止调整, 进行随后的试验 必要时, 在 ph 值调整后可测定有效成分含量以观察是否受到 ph 值变化的影响 (2) 各 ph 组所用消毒液浓度和作用时间, 见 (3) 以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定, 试验程序见 (4) 试验应重复 3 次 (5) 计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值 评价规定有机物影响试验以不含小牛血清组为对照, 温度影响试验以 20 ±1 组为对照,pH 影响试验以消毒剂使用溶液 ph 值组为对照 (1) 该组第 1 个 ~3 个作用时间杀灭效果均合格, 判为该组所试因素无影响 (2) 该组第 1 个作用时间杀灭效果不合格, 第 2 个 第 3 个作用时间杀灭效果合格, 判为该组所试因素有轻度影响 (3) 该组第 1 个 第 2 个作用时间杀灭效果不合格, 第 3 个作用时间杀灭效果合格, 判为该组所试因素有中度影响 (4) 该组第 1 个 ~3 个作用时间杀灭效果均不合格, 判为该组所试因素有重度影响 2.2 消毒剂模拟现场和现场消毒效果鉴定试验 消毒剂对食 ( 饮 ) 具的模拟现场消毒效果鉴定试验 目的用于验证消毒剂对食 ( 饮 ) 具上细菌和病毒的消毒效果 35

37 实验器材 (1) 实验菌株大肠杆菌 (8099), 对尚需用于杀灭其他特定微生物者, 可用该微生物进行试验 菌悬液制备按 规定的方法和要求进行 (2) 中和剂溶液经中和剂鉴定试验合格 (3) 稀释液见附录 A (4) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (5) 有机干扰物对用于清洗后食 ( 饮 ) 具消毒的消毒剂使用 0.3% 牛血清白蛋白, 对用于未清洗的食 ( 饮 ) 具直接消毒的消毒剂使用 3.0% 牛血清白蛋白 (6) 无菌棉拭 (7) 规格板 ( 用可弯曲的软性材料制备, 中央留一大小为 5.00cm³5.00cm 空格作为采样部位 ) (8) 试验用食 ( 饮 ) 具样本瓷碗 ( 盘 ) 或竹 ( 木 ) 筷前端 ( 周长 2.0cm, 长度 12.5cm, 总面积为 25cm 2 ) (9) 标准硬水见附录 A 操作程序 (1) 按产品使用说明书的浓度和作用时间进行大肠杆菌杀灭试验 (2) 用无菌规格板在试验用碗 ( 盘 ) 内表面标出染菌区 无菌操作吸取菌悬液, 分别滴加于染菌区, 每区 0.1mL, 涂匀, 置 37 恒温培养箱至干燥 对筷子取前端 12.5cm 长度, 蘸染预定量菌液后, 置 37 或室温干燥 (3) 试验组将 10 个染菌碗 ( 盘 ) 或 10 个筷子样本, 依次定时放入含消毒剂溶液的容器中, 使其完全浸没 作用至规定时间, 轻轻取出碗 ( 盘 ), 弃掉消毒剂, 分别向碗 ( 盘 ) 内的染菌区加入 5mL 中和剂溶液, 用 L 棒刮洗染菌区, 作用 10min, 分别取 1.0mL 样液, 以倾注法接种 2 块平皿 轻轻取出筷子样本, 放入含 20mL~25mL 中和剂溶液的试管中, 电动混匀器振荡 20s 或振打 200 次, 作用 10min, 分别取 1.0mL 样液, 以倾注法接种 2 块平皿 将接种好的平板放 37 恒温培养箱培养 48h, 计数菌落数, 作为试验组 (4) 阳性对照组直接向 2 个染菌碗 ( 盘 ) 的染菌区加入 5mL 中和剂, 或直接将 2 支染菌筷子样本浸没于含 20mL 中和剂溶液的试管中 随试验组采样 检测, 检测结果作为消毒前菌量, 菌量应在 1³10 6 cfu/ 样本 ~5³10 6 cfu/ 样本 (5) 阴性对照组将本次试验未用完的中和剂 稀释液 培养基等分别设阴性对照 (6) 以上试验重复 3 次 (7) 按下式计算每件食 ( 饮 ) 具上的生长菌落数 每件食 ( 饮 ) 具样本生长菌落数 (cfu/ 样本 )= 平板上平均菌落数 ³ 检测时样本稀释倍数 (8) 按 (8) 计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值 36

38 评价规定阴性对照组均无菌生长, 阳性对照组菌量为 1³10 6 cfu/ 样本 ~5³10 6 cfu/ 样本, 以每种食 ( 饮 ) 具 30 个样本中大肠杆菌杀灭对数值均 3.00, 所用消毒剂的浓度和作用时间为消毒合格剂量 消毒剂对医疗器械模拟现场消毒效果鉴定试验 目的用于验证消毒剂对人工污染芽孢 分枝杆菌和白色念珠菌的医疗器械的消毒效果 实验器材 (1) 实验菌株枯草杆菌黑色变种 (ATCC 9372) 芽孢 ( 下简称芽孢, 其悬液的制备按 (2) 规定进行 ); 龟分枝杆菌脓肿亚种 (ATCC 19977); 白色念珠菌 (ATCC 10231) (2) 中和剂溶液经中和剂鉴定试验合格 (3) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基, 分枝杆菌干燥培养基, 沙堡琼脂培养基见附录 A (4) 有机干扰物 0.3% 牛血清白蛋白 (5) 载体医用止血钳齿端部分, 按 (2) 进行脱脂处理, 灭菌后备用 (7) 塑料试管 (1.8cm³18cm) (8) 标准硬水见附录 A 操作程序 (1) 以载体浸泡定量杀菌试验进行消毒效果的测定 按产品使用说明书中的消毒剂作用浓度和作用时间进行试验 (2) 染菌时, 将止血钳样本齿面朝上, 用 0.1mL 无菌吸管或移液器将 0.02mL 菌悬液滴染齿部, 涂匀, 置 37 恒温培养箱内至干燥 (3) 取无菌平皿, 按每个载体 10mL 用量加入消毒剂, 置 20 ±1 水浴中保温 5min (4) 将 10 个染菌样本浸没于消毒液中进行消毒处理 (5) 作用至规定时间, 取出样本, 分别移入含 10mL 中和剂溶液的塑料试管内 在手掌上振打 200 次, 分别取样液 1.0mL, 以倾注法接种 2 个无菌平皿, 放 37 恒温培养箱培养至规定时间, 计数菌落数, 作为试验组 (6) 每次试验, 以标准硬水代替消毒液, 将 2 个染菌样本以同样条件处理, 然后与试验组样本同法进行活菌培养计数, 作为阳性对照组, 其菌量应在 1³10 6 cfu/ 样本 ~5³10 6 cfu/ 样本 (7) 将本次试验未用完的同批次中和剂溶液 稀释液 培养基等分别设阴性对照 (8) 以上试验重复 3 次 评价规定阴性对照组均无菌生长, 阳性对照组菌量达到规定要求,30 个试验组样本的微生物杀灭对数值均 3.00, 判定为消毒合格 37

39 2.2.3 消毒剂对医疗器械模拟现场灭菌效果鉴定试验 目的用于验证消毒剂对人工污染芽孢的医疗器械的灭菌效果 实验器材 (1) 实验菌株枯草杆菌黑色变种 (ATCC 9372) 芽孢 ( 其悬液的制备按 (2) 规定进行 ) (2) 稀释液见附录 A (3) 中和剂溶液经中和剂鉴定试验合格 (4) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基, 见附录 A (5) 含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (6) 标准硬水见附录 A (7) 载体医用止血钳齿端部分, 按 (2) 规定方法进行脱脂处理 灭菌后备用 (8) 塑料试管 (1.8cm³18cm) 操作程序 (1) 按产品使用说明书中的最低使用浓度与 0.5 倍最短作用时间 (2) 染菌样本按 (2) 进行制备 (3) 取无菌平皿, 按每个载体 10mL 用量加入消毒剂, 置 20 ±1 水浴中保温 5min (4) 将 20 个染菌样本浸没于消毒剂中作用至规定时间后取出, 分别放于含 10mL 中和剂肉汤的试管内, 置 37 恒温培养箱中培养 7d, 观察最终结果, 作为试验组 (5) 以标准硬水代替消毒剂, 将 2 个染菌载体依上同样条件处理, 与实验组样本同法接种 培养 观察结果, 作为阳性对照组 (6) 另取 2 个染菌样本, 分别放入含 10mL 中和剂溶液塑料试管内 在手掌上振打 200 次, 取样液置 37 恒温培养箱中培养 72h, 计数菌落数, 作为菌数对照组 其菌量应为 1³10 6 cfu/ 样本 ~5³10 6 cfu/ 样本 (7) 将本次试验未用完的同批次中和剂溶液 稀释液 培养基等分别设阴性对照 (8) 试验重复 3 次 评价规定阳性对照组菌量达到规定要求, 阴性对照组均无菌生长, 试验组 60 个样本均无菌生长, 判定为灭菌合格 有菌生长者, 肉汤培养基呈轻度浑浊, 有皱褶状菌膜, 轻轻振摇可见絮状沉淀, 无菌生长者肉汤清澈透明 注意事项本试验应严格无菌操作, 否则灭菌试验可能失败 医疗器械消毒剂连续使用稳定性鉴定试验 目的 38

40 用于验证消毒剂在连续使用有效期内对医疗器械的消毒 灭菌效果 实验器材 (1) 枯草杆菌黑色变种 (ATCC 9372) 芽孢 ( 悬液按 (2) 进行制备 ) (2) 中和剂溶液经中和剂鉴定合格者 (3) 含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基见附录 A (4) 胰蛋白胨大豆肉汤培养基见附录 A (5) 载体医用止血钳齿端部分, 按 (2) 方法进行脱脂处理, 灭菌后备用 (6) 医疗器械医用剪刀 止血钳 镊子等小型器械 (7) 无菌带盖搪瓷盘 (8) 标准硬水见附录 A 操作程序 (1) 按 (2) 制备染菌样本 (2) 试验时, 配制双份 2000mL 消毒液, 分别盛装于 2 个无菌带盖搪瓷盘中 各放入清洁的试验用医疗器械, 使达满载要求 每次试验同时对 2 个搪瓷盘中的消毒液进行检测 (3) 搪瓷盘内放入器械后, 每日将器械取出, 用清水洗涤, 沥干, 再回放入消毒液中 连续每日将器械取出 洗涤 沥干 再放入, 直至试验结束 (4) 放入器械至使用说明书上连续使用的最长时间, 吸取消毒液样本 对于医疗器械消毒的消毒剂按消毒剂对医疗器械的消毒模拟现场试验 (2.2.2) 的方法, 每盘用 5 个染菌样本进行试验 ; 对于医疗器械灭菌的消毒剂按消毒剂对医疗器械的模拟现场灭菌试验 (2.2.3) 的方法, 每盘用 10 个染菌样本进行试验 测定该消毒液对芽孢的杀灭效果 (5) 试验重复 3 次 评价规定对于医疗器械消毒的消毒剂按消毒剂对医疗器械的消毒模拟现场试验 (2.2.2) 的评价规定进行 ; 对于医疗器械灭菌的消毒剂按消毒剂对医疗器械的模拟现场灭菌试验 (2.2.3) 的评价规定进行 试验均达到合格要求时判定为连续使用稳定性试验合格 注意事项 (1) 盛装消毒液的搪瓷盘, 在操作完毕后应加盖, 以免有杂菌污染 (2) 本试验应严格无菌操作, 否则灭菌试验可能失败 消毒剂对手模拟现场消毒效果鉴定试验 目的用于验证消毒剂对人工污染于手表面细菌的消毒效果 实验器材 (1) 实验菌株大肠杆菌 8099 或 NCTC 10538, 可增加特定细菌进行试验 菌悬液按 制备 39

41 (2) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (TSA) 见附录 A 胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (TSB) 见附录 A (3) 中和剂溶液经中和剂鉴定合格者 (4) 普通洗手液 (5) 参考样品正丙醇 60%(V/V) 与异丙醇 60%(V/V) (6) 标准硬水见附录 A (7) 稀释液见附录 A (8) 吸管 试管 平皿 (9) 电动混匀器 试验步骤 (1) 菌悬液的制备取 2 支在 TSB 中培养 18h~24h 的大肠杆菌培养物分别接种于 1L TSB 大三角烧瓶中, 在 36 ±1 恒温培养箱中培养 18h~24h, 用 TSB 将其稀释为 2³10 8 cfu/ml~ 2³10 9 cfu/ml 菌悬液 (2) 将 12 名 ~15 名志愿者随机分为两组, 第一组使用参考样品, 第二组使用试验样品 (3) 使用普通洗手液洗手 1min 去除手表面的自然菌, 用无菌纸 巾将手擦干 (4) 将 2³10 8 cfu/ml~2³10 9 cfu/ml 大肠杆菌的菌悬液放入无菌容器中 (5) 将手掌中间到指尖部位浸入菌悬液中, 手指分开, 停留 5s 后在空气中干燥 3min (6) 干燥后立即将拇指与其它手指尖在含 10mL TSB 的平皿中搓洗 1min, 做适当稀释后, 分别取样液 1.0mL 以倾注法接种 2 个无菌平皿, 置 37 恒温培养箱培养 48h, 计数菌落数, 作为试验前菌数 (7) 不再重复污染手, 并作为试验样品组, 立即进行消毒处理 (8) 对试验样品组, 按说明书规定的用量 作用时间和使用频率以标准的洗手方法 ( 如图 2-1) 搓擦 30s~60s( 卫生手消毒 ) 或最长 5min( 外科手消毒 ) (9) 参考样品组, 对于卫生手消毒, 取 60% 异丙醇 3mL 于手心中, 按标准的洗手方法用力搓擦 30s, 以确保手的所有部位均匀接触异丙醇 重复使用异丙醇按上述方法搓擦使总的搓擦时间为 60s 对于外科手消毒, 使用 60% 正丙醇 3mL, 按标准的洗手方法用力搓擦, 当接近干燥时, 再加 3mL 正丙醇搓擦 以保持作用 5min (10) 以自来水冲洗 5s, 抖掉手上残留的水 (11) 立刻将拇指与其它手指尖在盛有 10mL 含中和剂的 TSB 的平皿中搓洗 1min, 做适当稀释后, 分别取样液 1.0mL 以倾注法接种 2 个无菌平皿, 置 37 恒温培养箱培养 48h, 计数菌落数, 作为试验后菌数 40

42 1. 掌心对掌心搓擦 2. 手指交错掌心对手背搓擦 3. 手指交错掌心对掌心搓擦 4. 两手互握互搓指背 5. 拇指在长中转动搓擦 6. 指尖在掌心中摩擦 图 2-1 标准的洗手方法 (12) 在试验当日, 第一组与第二组样品对换, 重复上述试验 (13) 分别计算参考样品组和试验样品组菌数减少的对数值 评价规定 (1) 试验样品组减少的对数值大于或等于参考样品组减少的对数值, 判定为消毒合格 (2) 试验样品组减少的对数值小于参考样品组减少的对数值, 但无统计学意义, 判定为消毒合格 (3) 试验样品组减少的对数值小于参考样品组减少的对数值, 且有统计学意义, 判定为消毒不合格 注意事项 (1) 试验样品和参考样品必须在同一志愿者配对进行试验, 并在同一天 相同环境和同样试验条件下进行 (2) 志愿者应年满 18 岁, 身体健康, 手部皮肤应无破损 无皮肤病, 手指甲短而干净 (3) 所有志愿者都应使用同一批菌悬液染菌, 菌悬液最多可使用 3 小时 (4) 对于免洗手类消毒液, 试验组应根据说明书介绍的方法涂擦, 作用时间一般到消毒液干燥后停止 消毒剂对手现场消毒效果鉴定试验 目的 41

43 用于验证消毒剂对手表面细菌的消毒效果 实验器材 (1) 中和剂溶液经中和剂鉴定合格 (2) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基, 见附录 A (3) 稀释液见附录 A (4) 标准硬水见附录 A (5) 无菌棉拭 (6) 电动混匀器 (7) 吸管 试管 平皿 试验步骤 (1) 随机选定志愿者, 试验不少于 30 人次 (2) 消毒前, 在志愿者双手相互充分搓擦后, 让志愿者左手指并拢, 用无菌棉拭在含 10mL 稀释液试管中浸湿, 于管壁上挤干后, 在五指屈面指尖至指根, 往返涂擦 2 遍, 每涂擦一遍, 将棉拭转动一次 采样后, 以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内, 作为阳性对照组样本 (3) 按消毒剂使用说明书的方法和使用浓度对右手进行消毒, 对卫生手的消毒一般设定作用时间为最长 1min, 最短 30s; 对外科洗手后的泡手一般设定作用时间为 3min, 最长 5min 消毒后用中和剂溶液代替稀释液, 用与阳性对照组同样的方法对志愿者右手上残留的自然菌采样一次, 作为试验组样本 (4) 将阳性对照组和试验组样本, 分别取 1.0mL, 以倾注法接种平皿, 每个样本接种 2 个平皿, 置 37 恒温培养箱中培养 48h, 每日观察并记录最终结果 (5) 将本次试验未用完的同批次中和剂溶液 稀释液 棉拭 培养基等分别设阴性对照 (6) 计算杀灭对数值 评价规定阴性对照组应无菌生长,30 人次手上自然菌的平均杀灭对数值 1.00, 判定为消毒合格 注意事项 (1) 本试验需有志愿者参与, 重复人次较多, 一人可多次受试, 但不得在一批试验或同日反复参与, 否则可影响结果的准确性 (2) 志愿者接受试验时, 不得触摸任何表面, 以免使手的试验部位沾染杂菌 (3) 棉拭涂抹采样, 较难标准化, 为此应尽量使棉拭的大小, 用力的均匀, 吸取采样液的量, 以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致 (4) 擦拭消毒时, 要依据说明书适量均匀涂抹 (5) 现场样本须及时检测, 常温运送 存放不得超过 2h,4 冰箱存放不得超过 4h (6) 对于免洗手类消毒液, 试验组应根据说明书介绍的方法涂擦, 作用时间一般到消毒液 42

44 干燥后停止 消毒剂对皮肤模拟现场消毒效果鉴定试验 目的用于验证消毒剂对人工污染于皮肤表面细菌的消毒效果 实验器材 (1) 实验菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 27217, 可增加特定细菌进行试验 (2) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (TSA), 见附录 A (3) 稀释液见附录 A (4) 中和剂溶液经中和剂经鉴定合格 (5) 普通洗手液 (6) 金属筒 ( 直径 2.2cm 高度 3cm) (7) 尼龙刮菌棒 (8) 吸管 试管 平皿 (9) 电动混匀器 (10) 一次性接种环 (11) 外用皮肤消炎药膏 (12) 皮肤消毒剂 (13)75% 酒精 (14) 标准硬水见附录 A (15) 恒温培养箱 试验步骤 (1) 菌悬液的制备按 进行 (2) 用普通洗手液清洗志愿者前臂内侧 1min, 用自来水冲净残留洗手液, 用无菌纸 巾擦干, 以去除前臂内侧表面自然菌 (3) 在志愿者的双前臂内侧中段, 用带有印墨直径为 3.00cm 的玻璃筒扣在皮肤上, 划分出试验区 (4) 使用加样器取 10μ L 菌悬液, 滴加于前臂试验区 ( 使回收菌落数为 2³10 6 cfu/ 试验区 ~1³10 7 cfu/ 试验区 ), 用一次性接种环把菌悬液涂成圆形, 其边缘应与印墨有 4mm~5mm 的距离, 使其在空气中自然干燥 (5) 根据消毒剂使用说明书规定的方法对右前臂内侧进行消毒, 一般设定作用时间为 1min~3min, 最长 5min (6) 作用至规定时间, 用中和剂溶液对前臂上涂菌的区域进行取样 采样时, 将金属筒放置于试验区中间部位, 罩住染菌区, 不要接触到盖有印墨的边缘 将 1.0mL 中和剂溶液吸移至金属筒内, 用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤 60s, 将筒内液体吸移至试管内, 再加 43

45 1.0mL 中和剂溶液对该区域内的皮肤进行第二次刮洗 30s, 将第二次擦洗的液体, 注入含第一次刮洗液体的试管中, 作为试验组样本 (7) 以标准硬水代替消毒剂对左前臂做同样处理, 用稀释液做适当稀释, 取适宜稀释度作为对照组样本 (8) 将阳性对照组和实验组样本, 分别取 1.0mL, 以倾注法接种平皿, 每个样本接种 2 个平皿, 置 37 恒温培养箱中培养 48h, 观察最终结果 (9) 将本次试验未用完的同批次中和剂溶液 稀释液 棉拭 培养基等分别设阴性对照 (10) 计算杀灭对数值 (11) 试验不得少于 15 人次 评价规定阴性对照组无菌生长, 阳性对照组回收菌落数为 2³10 6 cfu/ 试验区 ~1³10 7 cfu/ 试验区, 且对每一人次皮肤表面人工污染的金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均 3.00, 判定为消毒合格 注意事项 (1) 志愿者录用标准 1) 年龄介于 18 岁至 65 岁 ; 2) 志愿者身体健康 ; 3) 前臂皮肤完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题 (2) 排除志愿者的标准, 如果志愿者有下列情况之一, 不能被录用参加试验 1) 孕妇 ; 2) 诊断患有糖尿病 各种传染病 器官移植者 (3) 试验采样结束后, 先用 75% 的酒精对志愿者前臂进行消毒, 然后用皮肤消毒剂对双前臂进行消毒处理, 处理后清水冲洗, 擦干, 再涂少量的抗生素软膏于试验区, 以防皮肤感染 (4) 在试验完成后的 48h~72h 内, 志愿者如发现前臂上有小脓疱 水疱, 隆起的红色痒疱, 应及时通知检验单位 消毒剂对皮肤现场消毒效果鉴定试验 目的用于验证消毒剂对皮肤表面细菌的消毒效果 实验器材 (1) 中和剂溶液经中和剂经鉴定合格 (2) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (TSA) (3) 稀释液见附录 A (4) 标准硬水见附录 A (5) 规格板 ( 用牛皮纸制备, 中央留一 3.00cm³10.0cm 的空格作为采样部位 )121 15min 灭菌备用 44

46 (6) 无菌棉拭 (7) 电动混匀器 (8) 吸管 试管 平皿 试验步骤 (1) 随机选定志愿者, 试验不少于 30 人次 (2) 让志愿者将左右前臂内侧中段相互充分对搓, 将规格板放于志愿者左前臂内侧中段表面, 用无菌棉拭在含 10mL 稀释液试管中浸湿, 于管壁上挤干后, 在规格板框定的区域内, 横向往返涂擦 3 遍, 纵向往返涂擦 10 遍, 每涂擦一遍, 将棉拭转动一次 采样后, 以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内, 电动混匀器振荡混匀 20s, 或在手掌振打 200 次, 用稀释液作适当稀释, 取适宜稀释度作为阳性对照组样本 (3) 按消毒剂使用说明书的方法对右前臂内侧进行消毒, 一般设定作用时间为 1min~3min, 最长不超过 5min 作用至设定时间用中和剂溶液代替稀释液, 与阳性对照组同样的方法对志愿者右前臂内侧表面残留的自然菌采样一次, 作为试验组样本 (4) 将阳性对照组和试验组样本, 分别取 1.0mL, 以倾注法接种平皿, 每个样本接种 2 个平皿, 置 37 恒温培养箱中培养 48h, 观察最终结果 (5) 将本次试验未用完的同批次中和剂溶液 稀释液 棉拭 培养基等分别设阴性对照 (6) 以手为单位计算杀灭对数值 评价规定阴性对照组无菌生长, 阳性对照组有较多细菌生长,30 人次皮肤表面自然菌的平均杀灭对数值 1.00, 判定为消毒合格 注意事项 (1) 本试验需有志愿者参与, 重复人次较多, 一人可多次受试, 但不得在一批试验或同日反复参与, 否则可影响结果的准确性 (2) 志愿者试验时, 不得触摸任何表面, 以免使试验部位沾染杂菌 (3) 棉拭涂抹采样, 较难标准化, 为此应尽量使棉拭的大小, 用力的均匀, 吸取采样液的量, 以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致 (4) 擦拭消毒时, 要依据说明书适量均匀涂抹 (5) 现场样本须及时检测, 常温运送 存放不得超过 2h,4 冰箱存放不得超过 4h 消毒剂对其他物体表面模拟现场消毒效果鉴定试验 目的用于验证消毒剂对人工污染于一般物体 ( 指除本规范已有专门规定如食 ( 饮 ) 具 医疗器械等以外的物体 ) 表面细菌的消毒效果 实验器材 (1) 实验菌株大肠杆菌 (8099) 可增加特定细菌进行试验 菌悬液按 制备 45

47 (2) 中和剂溶液经中和剂鉴定试验合格 (3) 稀释液见附录 A (4) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基, 见附录 A (5) 标准硬水见附录 A (6) 规格板 ( 用不锈钢材料制备, 中央留一 5.00cm³5.00cm 的空格作为采样部位 ) (7) 无菌棉拭 (8) 电动混匀器 试验步骤 (1) 一般以木制桌面为代表进行人工染菌, 也可以特定的实物为染菌对象 每次试验, 各类物品表面测试 30 个样本 (2) 染菌时, 选物品较平的部位, 于规格板中央空格, 用无菌棉拭沾以菌悬液均匀涂抹 待自然干燥后进行试验 每次试验设 2 个区块作为阳性对照区,10 个区块为试验区 (3) 将无菌棉拭在含 10mL 稀释液试管中浸湿, 于管壁上挤干, 对对照组区块涂抹采样, 每区块横竖往返各 8 次 以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内, 电动混匀器振荡 20s, 或在手掌上振打 200 次, 用稀释液做适当稀释后, 作为阳性对照组样本 (4) 按说明书中的方法和使用剂量对物体表面进行消毒 将无菌棉拭在含 10mL 中和剂溶液试管中浸湿, 于管壁上挤干, 消毒作用至设定时间时, 分别对消毒区块进行涂抹采样, 每区块横竖往返各 8 次 采样后, 以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原中和剂溶液试管内, 电动混匀器振荡 20s, 或在手掌上振打 200 次, 作为试验组样本 (5) 将阳性对照组和试验组样本, 分别取 1.0mL, 以倾注法接种平皿, 每个样本接种 2 个平皿, 放 37 恒温培养箱中培养 48h, 观察最终结果 (6) 将本次试验未用完的同批次中和剂溶液 稀释液 棉拭 培养基等分别设阴性对照 (7) 试验重复 3 次 (8) 计算平均杀灭对数值 评价规定阴性对照组无菌生长, 阳性对照组检测菌量为 2.5³10 7 cfu/ 样本 ~1.25³10 8 cfu/ 样本, 30 个样本的平均杀灭对数值 3.00, 判定为消毒合格 注意事项 (1) 阳性对照组和试验组应在相邻的区域, 但不得在同一区内进行试验 (2) 棉拭涂抹采样较难标准化, 为此应尽量使棉拭的大小, 用力的均匀, 吸取采样液的量, 洗菌时敲打的轻重等等先后一致 (3) 现场样本须及时检测 室温存放不得超过 2h,4 冰箱存放不得超过 4h 消毒剂对其他物体表面现场消毒效果鉴定试验 目的 46

48 用于验证消毒剂对一般物体 ( 指除本规范已有专门规定如食 ( 饮 ) 具 医疗器械等以外的物体 ) 表面自然菌的消毒效果 实验器材 (1) 中和剂溶液经中和剂鉴定试验合格 (2) 稀释液见附录 A (3) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基见附录 A (4) 规格板 ( 用不锈钢材料制备, 中央留一 5.00cm³5.00cm 的空格作为采样部位 ) (5) 无菌棉拭 (6) 电动混匀器 操作程序在使用现场, 按说明书介绍的用量 作用时间 使用频率和消毒方法消毒物体表面, 检测样本数应 30 份 (1) 在物体表面 ( 桌面 台面 门等 ) 用规格板标定 2 块相邻的面积各为 25cm 2 的区块, 一供消毒前采样, 一供消毒后采样 (2) 将无菌棉拭在含 10mL 稀释液试管中浸湿, 于管壁上挤干, 对对照区块涂抹采样, 横竖往返各 8 次 采样后, 以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内, 电动混匀器振荡 20s 或在手掌振打 200 次, 做适当稀释后, 作为阳性对照组样本 (3) 按说明书中的方法和剂量对物体表面进行试验 将无菌棉拭在含 10mL 中和剂溶液试管中浸湿, 于管壁上挤干, 消毒作用至设定时间, 对消毒区块涂抹采样, 横竖往返各 8 次 采样后, 以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原中和剂溶液试管内, 电动混匀器振荡 20s 或在手掌振打 200 次, 作为试验组样本 (4) 将阳性对照组和试验组样本, 分别取 1.0mL, 以琼脂倾注法接种平皿, 每个样本接种 2 个平皿, 置 37 恒温培养箱中培养 48h, 每日观察并记录最终结果 (5) 将本次试验未用完的同批次中和剂溶液 稀释液 棉拭 培养基等分别设阴性对照 (6) 计算杀灭对数值 评价规定阴性对照组应无菌生长, 阳性对照组应有较多细菌生长, 消毒样本的平均杀灭对数值 1.00, 判定为消毒合格 注意事项 (1) 在现场试验中, 自然菌的种类复杂, 平板上常出现大面积霉菌生长, 导致无法计数菌落 在两个平行的平板中如有一个平板可数清菌落数时, 即按该平板菌落数计算结果 如两平板均有大面积霉菌生长, 应重新进行试验 (2) 阳性对照组和试验组应在相邻的区域, 但不得在同一区内进行试验 (3) 棉拭涂抹采样较难标准化, 为此应尽量使棉拭的大小, 用力的均匀, 吸取采样液的量, 47

49 洗菌时敲打的轻重等等先后一致 (4) 现场样本须及时检测 室温存放不得超过 2h,4 冰箱存放不得超过 4h 消毒剂对织物表面模拟现场消毒效果鉴定试验 目的用于验证消毒剂对人工污染于织物上细菌的消毒效果 实验器材 (1) 实验菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 可增加特定细菌进行试验, 菌悬液按 制备 (2) 中和剂溶液经中和剂鉴定试验合格 (3) 稀释液见附录 A (4) 培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (5) 载体布片, 规格 10mm³10mm (6) 标准硬水见附录 A (7) 小布袋规格 50mm³50mm (8) 白大衣 (9) 电动混匀器 试验步骤 (1) 菌片的制备见 (2) 将菌片放入小布袋中, 每袋放入 1 个菌片, 分别将 10 个小布袋放入 5 件白大衣的左右口袋内 (3) 按说明书中的使用浓度将白大衣浸没于消毒剂溶液中, 浸泡至设定的消毒作用时间, 以无菌操作方式用镊子将菌片放入含 5mL 中和剂溶液的试管内, 电动混匀器振荡 20s 或在手掌振打 80 次, 作为试验组样本 (4) 将 2 个菌片放入一小布袋中, 浸没于标准硬水至与试验组同样的时间, 以无菌操作方式用镊子将染菌布片放入含 5mL 中和剂溶液的试管内, 在电动混匀器上振荡 20s 或在手掌振上打 80 次, 作为阳性对照组样本 (5) 将阳性对照组和试验组样本分别取 1.0mL, 以倾注法接种平皿, 每个样本接种 2 个平皿, 置 37 恒温培养箱中培养 48h, 观察最终结果 (6) 将本次试验未用完的同批次中和剂溶液 稀释液 培养基等分别设阴性对照 (7) 试验重复 3 次 (8) 计算杀灭对数值 评价规定 阴性对照组无菌生长, 阳性对照组回收菌落数为 1³10 6 cfu/ 片 ~5³10 6 cfu/ 片,30 个样本 的杀灭对数值均 3.00, 判定为消毒合格 48