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冻许
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1 中国中西医结合杂志年月第卷第期!"#$ %" 补肾化痰方对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗, 通路调控的实验研究洪艳丽吴飞摘要目的探讨补肾化痰方对多囊卵巢综合征 "# -,)- "2)* *3"(45 模型大鼠卵巢内胰岛素信号传导分子的调控方法 ), 雌鼠只随机分为溶媒对照组模型组中药低剂量组 // 中药中剂量组 // 中药高剂量组 // 每组只测定大鼠空腹血糖及胰岛素水平计算稳态模型胰岛素抵抗指数 64 技术检测糖原合成酶激酶 758 葡萄糖转运蛋白 79: 胰岛素受体底物 5 以及过氧化物酶增殖体激活受体 44 表达,* #", 法检测卵巢内胰岛素信号传导分子蛋白激酶 ;, 表达结果与溶媒对照组比较模型组 6 及 44(% 表达明显升高卵巢 75879:5 (% 表达及,, 蛋白表达均明显降低差异均有统计学意义 4 与模型组比较中药高剂量组 6 明显降低 75879:5 (% 表达及, 蛋白表达均显著升高, 蛋白表达尤为显著差异均有统计学意义 4 4 中药低中剂量组 75879: (% 显著升高 44(% 明显降低差异有统计学意义 4 中药低剂量组, 蛋白表达明显升高差异有统计学意义 4 结论 45 模型鼠存在胰岛素抵抗并存在卵巢组织信号通路传导异常补肾化痰方能够改善 45 大鼠胰岛素抵抗与胰岛素信号传导分子蛋白表达的调控有关关键词多囊卵巢综合征补肾化痰方蛋白激酶 ; 通路胰岛素抵抗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基金项目南京中医药大学青年自然科学基金项目 %"&' 作者单位南京中医药大学第一临床医学院妇科南京通讯作者洪艳丽 # ()#*+,-(."*/#)0$-"( 1

2 中国中西医结合杂志年月第卷第期!"#$ %" *3 ()33# ;6 /" 4 $. )"* ", )/*))-*,# )*-3 )*,. #" 3" ;6 /" 4 $ "*-#)"* *3 *"(# )*#)* )/*#,. ),3 )* 45 ("3#,$ ;6 -"#3 )("2 " 45,.)-. -"#,3 ),. /#,)*/ ",)* )"* " )*#)* )/*#,*3-,)"* ("#-#$ 815 "# -,)- "2)* *3"( ;.* 6,* -), )/*#,. )*#)* ),*- 多囊卵巢综合征 "# -,)- "2)* * 3"(45 是育龄期妇女常见的一种生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合征临床以高雄激素持续无排卵及多囊卵巢为特征病理生理涉及范围广泛其代谢异常主要表现为肥胖糖耐量减低和血脂代谢异常等胰岛素抵抗 )*#)* ), *- 是其关键发病机制自 < 年 ;/. * 首次提出参与 45 的发病以来大量研究证实与 45 之间存在密切关系胰岛素信号传导途径中的任何一个环节受损均可导致的发生多年来关于 45 的研究一直是妇产科及生殖领域的焦点采用的西药多为人工合成制剂不良反应大中药资源丰富其多系统调理多靶点作用及中医的辨证论治整体观念使其在治疗 45 方面存在着优势从 45 临床和基础研究文献不难看出肾虚是 45 排卵障碍的基础肾中阴阳失衡气化失司天癸的产生与泌至失调变生痰浊之证以致包膜变厚排卵不利而 45 的则是在痰浊不化的基础上形成的补肾化痰方是临床经验方前期临床研究取得较满意效果本实验通过建立 45 大鼠模型观察补肾化痰方对模型鼠卵巢内胰岛素信号传导分子的调控作用为补肾化痰方的临床应用提供现代科学理论依据材料与方法动物与分组选用体重 = / 日龄的未成年 ), 雌鼠清洁级只由南京中医药大学实验动物中心提供许可证号 5&8 沪饲养于标准实验环境中饮水及食物自由摄取采用随机数字表法将大鼠分组溶媒对照组模型组中药低中高浓度组每组只仪器试剂与药物超速低温离心机美国 ;-(* :9 超低温冰箱美国.(" 自动生化分析仪日本电泳仪上海天能科技有限公司普通光学显微镜日本 # ( 8' 紫外可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司核酸蛋白分析仪德国 *3" ;)"4.","(, 脱氢表雄酮 16 购自西安高远生化有限公司纯度为国产分析纯 << > 批号 6< 注射用茶油购自广州汉方现代中药研究开发有限公司批号 < 95 试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司逆转录酶和引物购自美国 4"(/ 公司 4 试剂盒购自日本 8 公司补肾化痰方药由仙灵脾 / 仙茅 / 苍术 / 半夏 / 陈皮 / 九节菖蒲 / 香附 / 川芎 / 泽泻 / 鹿角霜 / 胆南星 / 砂仁 / 等组成由江苏省中医院煎药室加工制成含生药 /(9 的溶液按照人和动物体表面积折算的等效剂量比率表计算给药剂量根据临床等效剂量的倍倍及倍设立低 // 中 // 高浓度 // 模型制备按 9 等方法 51 雌性大鼠日龄开始溶媒对照组每日皮下注射茶油 (9 连续注射日其余各组每日皮下注射 16 (/ / 体重加 (9 茶油混合剂均连续注射日注射完成后取阴道涂片连续观察日以阴道涂片连续出现角化细胞判定为造模成功给药方法造模结束次日开始给药方案为溶媒对照组与模型组灌服生理盐水 (9 / 次日连续日中药组分别灌服低中高浓度补肾化痰方次日连续日标本采集与储存大鼠灌胃天后禁食水. 用戊巴比妥腹腔麻醉于腹主动脉采血以 ()* 离心 ()* 分离血清保存备用随后大鼠断颈处死一侧卵巢置入多聚甲醛中固定另一侧液氮冷冻保存观察指标及方法 6 血清标本采集后采用放免法测定空腹葡萄糖 ;7 及胰岛素 %5 由南京中医药大学附属江苏省中医院检验科检测计算稳态模型胰岛素抵抗指数."(",) ("3# (*, " )*#)* ),*-6 计算公式 6? ;7 (("#9 %5 (: 9

3 中国中西医结合杂志年月第卷第期!"#$ %" 卵巢相关信号分子 (% 表达应用 4 法检测卵巢组织糖原合成酶激酶 758 葡萄糖转运蛋白 79: 胰岛素受体底物 5 以及过氧化物酶增殖体激活受体 44 (% 表达具体引物序列见表组织匀浆加入 (9 )@"# 提取总 % 按照试剂盒说明在 9 体系下完成逆转录逆转录反应体系为 9 下扩增 ()*< 下变性 ()* 保存聚合酶链反应体系为 9< 下预变性 ()*< 下变性下延伸重复变性退火延伸个循环下充分延伸 ()* 结束温度为取 9 产物! 下经 > 的琼脂糖凝胶电泳 ()* 利用凝胶电泳成像系统拍照获得条带密度值和面积数据利用与内标基因 7416 扩增产物的灰度比反映各基因转录表达水平表 4 引物基因名引物序列长度 : < 卵巢组织, 及, 蛋白表达采用,* #", 法检测卵巢组织蛋白激酶 ;, 及, 蛋白表达标本采集冻存后提取卵巢组织蛋白质考马斯亮蓝法测定蛋白浓度样品进行凝胶电泳转膜封闭加入一抗兔抗大鼠, 多克隆抗体孵育静置过夜洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的半抗兔二抗孵育充分洗涤化学发光显影定影蒸馏水冲洗终止以 7416 为内参凝胶图像处理系统分析结果统计学方法采用 5455 统计软件进行分析数据均采用表示两组间比较采用秩和检验多组间比较采用单因素方差分析 4 为差异有统计学意义结果各组大鼠 ;7%5 及 6 比较表与溶媒对照组比较模型组 %56 明显升高差异有统计学意义 4 而 ;7 则无明显变化 4 A 与模型组比较中药中剂量组 %5 显著降低差异有统计学意义 4 中药高剂量组 %56 明显降低差异有统计学意义 4 表各组大鼠 ;7%5 及 6 比较组别 * ;7 (("#9 %5 (:9 6 溶媒对照模型中药低剂量中剂量 < 高剂量 << 注与溶媒对照组比较 4 与模型组比较 4 各组大鼠卵巢组织 75879:5 及 44(% 表达比较图与溶媒对照组比较模型组 75879:5 (% 表达明显降低 44(% 表达显著升高差异有统计学意义 4 与模型组比较中药低中剂量组 75879: (% 表达显著升高 44 (% 表达明显降低差异有统计学意义 4 而 5 (% 表达无明显变化 4 A 中药高剂量组 75879:5 ( % 表达均显著升高差异有统计学意义 4 而 44(% 则无明显变化 4 A 各组大鼠卵巢组织, 及, 蛋白表达比较图与溶媒对照组比较模型组, 及, 蛋白表达均显著降低差异有统计学意义 4 与模型组比较中药低中高剂量组, 蛋白表达均显著升高差异有统计学意义 4 中药低高剂量组, 蛋白表达明显升高高剂量组尤为显著差异有统计学意义 4 4 中药中剂量组无明显变化 4 A 讨论中医学认为 45 属肾虚痰阻证肾虚则经断无源脾虚则运化失职痰湿壅阻胞宫则表现为经少闭经不孕及排卵障碍等生殖方面的异常大量研究表明补肾化痰中药能够改善 45 患者的高雄激素血症及能够逆转卵巢多囊样改变方中仙灵脾仙茅鹿角霜补肾益气苍术半夏陈皮石菖蒲泽泻胆南星砂仁健脾化痰利水渗湿香附川芎活血化瘀调经助孕全方补肾健脾化痰逐瘀通经

4 中国中西医结合杂志年月第卷第期!"#$ %" 注为溶媒对照组 ; 为模型组为中药低剂量组 1 为中药中剂量组为中药高剂量组与溶媒对照组比较 4 与模型组比较 4 图各组大鼠 75879:5 44(% 表达比较注为溶媒对照组 ; 为模型组为中药低剂量组 1 为中药中剂量组为中药高剂量组与溶媒对照组比较 4 与模型组比较 4 4 图各组大鼠卵巢组织, 及, 蛋白表达比较胰岛素 %5 通过与靶细胞膜上的特异性受体结合发挥其生物学效应当 %5 与受体结合后激活酪氨酸蛋白激酶进而催化酪氨酸残基发生磷酸化过程磷酸化的 5 能够结合并激活 5- 和胶原同源蛋白 5.- 等下游效应物后者激活磷脂酰肌醇 4 可使肌肉 79: 由细胞内的贮存室移位并融合到细胞膜上使葡萄糖由细胞外向细胞内的跨膜运输完成 < 4 激酶亦可激活, 后者使 758 发生磷酸化而失活进而使糖原合成酶激活促进糖原合成近年来研究证实 45 患者卵巢存在胰岛素受体 * 活性下降 5 表达及活性下降 4 8 活性下降 79: 表达下降等多处信号分子异常从而形成葡萄糖摄取率下降本实验结果发现模型组大鼠存在 6 明显升高卵巢组织 5 (% 表达降低证实 45 模型鼠存在胰岛素抵抗卵巢局部的 5 蛋白水平的高低和功能的改变是胰岛素信号转导的基础还有研究发现 48 下游信号分子, 和 758 蛋白表达下调减弱了胰岛素信号的传递引起卵巢 79: 蛋白表达的下调影响葡萄糖的摄取利用导致的发生本实验发现经补肾化痰方处理后 6 明显降低卵巢 5 (% 表达升高 75879: (% 及, 蛋白表达均显著上调说明补肾化痰方能促进 5 磷酸

5 中国中西医结合杂志年月第卷第期!"#$ %" 化上调 48, 通路活性促进卵巢对葡萄糖摄取改善 44 是一类核转录因子属于核受体超家族成员目前研究证实 44 的功能性受体也是调控多种脂肪细胞分泌的蛋白质因子基因的表达同时可以调节胰岛素敏感性本实验发现 45 模型鼠卵巢中 44(% 表达明显高于对照组提示 44 可能在 45 形成中起调节作用但 44 是如何影响卵巢局部胰岛素信号途径有待进一步研究综上所述 45 大鼠存在胰岛素抵抗卵巢局部组织存在信号传导通路的异常补肾化痰方能够改善胰岛素抵抗可能与胰岛素信号传导分子蛋白表达的调控有关参考文献伊西娟田秀珠 $ 多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜生存素 8) 环氧合酶的表达及二甲双胍对其影响的研究中国药物与临床沈文娟吴效科 $ 卵巢胰岛素抵抗的生物学效应实用妇产科杂志 < 梁晨丛晶常惠等 $ 补肾化痰复方对多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢内胰岛素信号传导分子的调控中国中西医结合杂志 <.+ 5 ), $ "#-# B /*,)- -," -"*,),)*/," )*#)* ),*- )* "# -,)- "2 *3"(*3 3 '.*/ 6 '.*/ 6* 8, #$ -,)2,)"* *3 )/*))-*- ",. 48,,. )* *3"(,)( ),. "# -,)- "2 *3"(,)*,.)*, 7 *-"# < 王晓冰侯丽辉吴效科 $ 痰浊与多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的关系研究中国中医基础医学杂志王波吴效科 $ 多囊卵巢综合征痰湿症候与代谢综合征的关系世界中西医结合杂志 9 *3"* 9 7$.*/ )* "2)* ("."#"/ *3 (."("* )*,.,,,,(*, ),. 3. 3")*3","* *, - << < < 谢铁男 $ 多囊卵巢综合征子宫内膜胰岛素抵抗的分子机制 1 吉林吉林大学 ##(*3 2)*/ ; (**, #$ -, ",,","* "* )*#)*,)(#,3 5 5."." #,)"* )* )(, ( ", ",*,)# ("3# " 45#,3 )*#)* ),*- 49"5 * < 黄健康李启富 $ 胰岛素抵抗与多囊卵巢综合征医学综述 < < "* (@3 4 ", #$.*/ )*,. )"* " )*#)* )/*#)*/,. ("# -# )* *3"(,) "( "# -,)- "2 * 3"( "(* ),. " ),.",. )*#)*() "# 3 < 魏兆莲 $ 二甲双胍对 45 患者卵巢颗粒细胞胰岛素受体底物及 4 芳香化酶的作用 1 合肥安徽医科大学 * &) &, #$ "-),)"* " 5 *3 5 /* "# (".)( ),. "# -,)- " 2 *3"( (,*# ) *3"- < < 1/, 5 5)). 4 %#2*) 8, #$ 4"# (".)( )*,. 5 *3 44/(( /* *3,.) "-),)"* ),. "# -,)- "2 * 3"( ("*/ 5",. *3)* "(* 7* '.*/ 6 ;) 6, #$ "-),)"*,*,. 4"# "# (".)( " 44/(( /* *3,. "# -,)- "2 *3"( (,*# ) " --"*,"#,3) 7* 收稿修回

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