9月22期文章(copy)

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冬柳
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1 中国农学通报 0,():- Chinese Agricultural Science Bulletin 国产决明属生理生化特性与系统分类的关系蔡静何家庆汪学敏舒畅吴玲安徽大学生命科学学院/安徽省资源植物研究中心合肥 00 摘要以国产决明属 Cassia 种植物为实验材料采用愈创木酚法和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳对其抗逆指标和过氧化物酶 POD 同工酶进行测定分析其系统树与传统决明属系统分类之间的差异结果表明发芽天的过氧化物酶活性和天的 MDA 含量差异显著可作为探讨其亲缘关系的指标之发现 POD 同工酶带条种决明没有共同拥有的条带,决明属植物的特征性酶带主要分布在 b 区和 a 区与传统分类不同抗逆指标和同工酶分析结果都表明槐叶决明 Cassia sophera 与豆茶决明 C. nomame 亲缘关系最近翅荚决明 C. alata 次之决明 C. tora 与其他种亲缘关系最远属于另支关键词决明属萌发抗逆生理指标过氧化物酶同工酶亲缘关系生理生化特性中图分类号 Q5. 文献标志码 A 论文编号 0-0 Relationship between Biochemistry Characteristics and System Classification of Cassia in China Cai Jing, He Jiaqing, Wang Xuemin, Shu Chang, Wu Ling (School of Life Science, Anhui University/Anhui Research Center of Plant Resource, Hefei 00) Abstract: In order to draw a phylogenetic tree of species of Cassia in China, the study used guaiacol method and polyacrylamide vertical slab gel electrophoresis to test the resistance indicators and peroxidase isozyme, and analyzed the differences between the result and traditional systematics. Peroxidase activity of day, MDA of days significantly differed among species, so it can be used as one of the indicators to explore their genetic relationship. POD enzyme bands were found, characteristic enzyme bands were mainly in b-zone and a-zone. Differed from traditional systematics, both resistance indicators and POD zymogram revealed that Cassia sophera was closer to C. nomame than C. alata in systematics, while C. tora belonged to another branch. Key words: Cassia; germination; physiological indicators of stress-resistant; peroxidase isozymes; genetic relationship; biochemistry characteristic 0 引言类群至此槐叶决明决明和豆茶决明归为类翅荚决明属 Cassia 为苏木科 Caesalpiniaceae 植决明归另类 Flora of Pakistan 按叶柄有无腺点将物中国约 5 种含引入种全世界决明属植物约决明和槐叶决明归为类翅荚决明和豆茶决明归为 00 种分布于热带亚热带和温带地区本实验选取类这种方法与中国植物志相矛盾 Chinese Plant 决明 C. tora 豆茶决明 C. nomame 茳芒决明 C. Names 按植株小叶的大小分为个类群而北京植物检索表 []则按小叶数目多寡处理属下各种因植物的生长受气候环境影响较大不同生境下形态差异较明显因此单纯从形态学分类不同文献差异较大 sophera 翅荚决明 C. alata 的种子为实验材料目前国内外对决明属的分类主要是从个方面中国 [] 植物志按生活习性将决明属分为木本或草本个基金项目国家自然科学基金项目 0000 安徽省环保局专项基金项目国家大学生创新实验项目 005 第作者简介蔡静女年出生安徽砀山人硕士研究生主要从事资源植物学研究通信地址 00 安徽大学生命科学学院安徽省资源植物研究中心 Tel caijing@.com 通讯作者何家庆男年出生安徽安庆人教授硕士生导师主要从事资源植物研究与利用通信地址 0000 安徽大学生命科学学院安徽省资源植物研究中心 Tel hejq@.com 收稿日期 0-0- 修回日期 0-0-

2 蔡静等国产决明属生理生化特性与系统分类的关系由于植物种子相对与叶片等营养器官受环境影响含量等生理特性讨论决明属的分类问题本实验将与较少本实验选用萌发种子作为实验材料而同工酶作过氧化物酶同工酶对比加以讨论通过过氧化物酶活为基因表达的产物其酶谱的差异能够很好的衡量种性 MDA 含量等抗逆指标及 POD 同工酶的电泳分析间的亲缘关系,也可揭示种间种内在进化过程中的变建立系统树并与传统分类学进行比较为后续决明属异程度利用同工酶技术探讨植物的亲缘关系是种的分类研究提供参考较为可靠的手段标准发芽是受遗传背景和在种子材料和方法产生及其储存条件的环境影响当储存条件及萌发条. 材料 [-] 件致时其生理特性与植物种类遗传效应有定的试验所用材料经安徽大学何家庆教授鉴定为豆科研究都表明不同植物决明属植物 C. sophera Linn. C. alata Linn. C. 种子活力差异很大并具有遗传性通过萌发耐逆性 nomame Kitagana C. obtusifolia 的种子室温贮藏备用材料来源见表相关性 Huang Sun 和 Soltani [5-] 等生理特性来表现是否可从过氧化物酶活性 MDA 表决明属植物材料来源名称种名来源经纬度槐叶决明翅荚决明 C. sophera Linn. 安徽砀山田地 N E C. alata Linn. 福建厦门植物园 N 0 E 豆茶决明 C.nomame Kitagana 安徽合肥董铺水库 5 N E 决明 C. tora Linn. 安徽合肥董铺水库 5 N E. 实验方法液研磨完成后将研磨液倒入 EP 管中在 000 r/min.. 幼苗培养每种植物选取饱满种子 00 粒在条件下冷冻离心 min 取上清放入冰箱中冷藏 0.% KMnO 溶液中浸泡 5 min 消毒处理后放入 0 备用采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶技术,分离胶的质的热水中浸泡 min 使种皮软化胶状物析出并用蒸量分数为 % 浓缩胶的质量分数为 % 在 ph. 的馏水反复冲洗干净,使其解除休眠倒去热水加入重 Tris-甘氨酸电极缓冲液中电泳每槽加样 0 μl 与蒸水室温吸涨 h 选取已吸胀但未破胸的种子均 5 μl 0%的蔗糖溶液 5 μl 溴酚蓝混匀加入槽内电匀平铺在无菌培养皿中培养皿内有两张已灭菌并用泳开始时稳压 0 V 当溴酚蓝前沿进入分离胶后稳水浸湿的滤纸 ± 恒温培养箱中培养定时补压 0 V 当溴酚蓝距离胶板末端 cm 处时停止电泳充水分 [] 在种子萌发的天分别取样次重整个过程在的冰箱中进行[0] 使用醋酸联苯胺法染复色染色剂配制方法醋酸联苯胺溶液 5 ml % HO 溶.. 种子萌发过程中抗逆指标的测定取萌发不同天液 0 ml 重蒸水 0 ml 染色 5~0 min 后出现清晰的数的不同材料在冰浴下使用不同的缓冲液对样品进条带即可照相行研磨 000 r/min 下离心 0 min 上清液及样品提取. 数据分析液冰箱放置再分别测定可溶性蛋白质含量过氧化试验数据采用 SPSS.0 统计软件进行分析用物酶 POD 活性和丙二醛(MDA)含量过氧化物酶活 Excel 000 软件制图性 POD 测定使用愈创木酚法以 min 内 A0 变化结果与分析 0.0 为个酶活性单位(U) 可溶性蛋白质含量测定使. 决明属植物萌发过程中抗逆指标的变化用采用考马斯亮蓝 G-50 法丙二醛(MDA)含量测定 [] 萌发中的种子相对于叶片受环境因素影响较小使用硫代巴比妥酸(TBA)法各项活性指标变化相对稳定决明属植物种子萌发过.. POD 酶液的提取及同工酶电泳由于预实验中程中吸水量很大浸泡后体积增大为干种子的倍左干燥的种子无法显现出清晰条带说明此状态下的右种子中的蛋白质分解是分步进行的产生的氨基 POD 活性极低因此本实验选取发芽 ~ 天的植物幼酸进入胚的生长部位[] 随着萌发的进行种子中可溶芽进行 POD 同工酶分析分别取各种幼芽 0 株称性蛋白质含量呈下降趋势经方差分析和多重比较重幼芽称重前用纸吸干表面水分并记录置于预冷种决明种子萌发过程中可溶性蛋白表以第天含的研钵中研磨研磨过程中逐量加入 Tris-甘氨酸缓冲量最高显著高于 ~ 天 POD 活性[]变化较大出现

3 中国农学通报表决明属萌发过程抗逆生理指标的变化材料槐叶决明翅荚决明决明豆茶决明天数/d 编号蛋白质/(g/L) POD/(g/min) MDA/(nmol/g).±0.a 5.±0.0d.±0.b.±0.b 5.±0.b.5±0.0a.±0.c.±0.a.5±0.c.±0.5c 5.±0.c.±0.d.5±0.a 5.5±0.d.5±0.5a 5.±0.5b 50.±c.±0.b.±0.c.±0.a.5±0.c.±0.d 5.±0.b.±0.d.05±0.a.±0.d.±0.a.0±0.0b.±0.b.±0.b.0±0.c 0.5±0.a.5±0.c.±0.5d 0.±0.c.±0.c.5±0.5a.±0.d.±0.0b 5.±0.0b 5.±0.b.0±0.a.±0.0c.0±0.0a.±0.c.5±0.d.5±0.c.5±0.c 注同列的数据中有不相同字母者表示差异显著(P<0.05) 表不同天数抗逆指标的显著性检验低高低的变化趋势第天达到最高值与同工酶检测结果致植物器官衰老或在逆境下遭受伤发芽天数/d 蛋白质含量 POD 活性 MDA 含量害往往发生膜脂过氧化作用丙二醛 MDA 是膜脂过氧化作用的最终分解产物其含量可以反映植物遭 ** 受逆境伤害的程度 [] 种子萌发过程中 MDA 的含量 * 变化较大其中槐叶决明与豆茶决明 MDA 最大值出现在第天翅荚决明与决明出现在第天通过测定 MDA 的含量根据含量的变化判断遭受逆境伤害的程 * * ** 注显著性水平为 0.05 显著性水平为 0.0 度通过脱落酸等进行预处理能提高细胞内保护酶天的 POD 活性规律不明显天的 MDA 含量槐叶系统清除植物细胞在低温逆境中增加的超氧物自由决明与豆茶决明相近其亲缘关系较近其次与翅荚决基使有毒物质丙二醛含量下降并保持在个相对较明关系较近决明与其他种差别明显亲缘关系较低水平防止膜脂的过氧化为其育种推广种植提供远理论依据. 决明属萌发过程中过氧化物酶同工酶分析. 通过抗逆指标进行亲缘关系分析从个种份决明属材料的过氧化物酶同工酶电植物的生理生化指标有定特异性相近亲缘关泳结果图可以看出 POD 同工酶谱带为条根系的植物萌发过程萌发中活性物质的变化有定的据谱带的分布按迁移率把酶谱从负极到正极分为相似性因此其理化指标亦可作为研究其亲缘关系的个区 a 区酶带 0 b 区酶带 c 区酶带参考对各天的各个抗逆指标分别进行卡方检验结个种没有共有带酶带 c Rf= c5 Rf= 果表明蛋白质含量个种间差异不显著说明其无种 c Rf=0.5 表为槐叶决明翅荚决明豆茶间特异性发芽天的 POD 活性差异极显著 P< 决明个种的共有带槐叶决明共有 5 条带全部分布 0.0 发芽天的 POD 活性差异显著 P<0.0 发芽在 c 区其中 c c c5 为主带直参与整个萌发过天的 MDA 含量差异显著 P<0.0 表对有显著程 c c 第天产生酶活量逐渐增强并在第天差异的几组指标进行分析天的 POD 活性决明与其降低 c Rf=0. 为其区别与其他种的特征酶带翅他种差别较大可推测其与其他种亲缘关系较远荚决明具有条带其中 c 为主带酶活性在第天

4 5 蔡静等国产决明属生理生化特性与系统分类的关系减弱 c b 参与前天的萌发过程第天消失其带豆茶决明共有条带 c c5 为主带 c 在发芽控制的代谢活动也随之停止第天出现条新的带的第天出现第天消失而第天出现的 b Rfb c) 第天 c c5 出现 c Rf=0.5 b Rf=0. 为 =0. 为其特征酶带其特征酶带决明具有条带 a Rf=0.5 为主带 b Rf=0.5 只出现了天即消失且逐渐减弱说明根据酶带在各区中的分布情况可以看出特征性酶带主要分布在 b 区和 a 区因此对萌发期的决明属植其参与前天的代谢活动第天增加 a Rf=0.0 物进行鉴定时可以通过检测此区的特征性酶来进行第天增加 a0 Rf=0. 此条带均为其特征酶区分 Rf c b - a 泳道编号代表材料同表高浓度酶带中浓度酶带低浓度酶带图决明属植物的 POD 同工酶电泳谱带表决明属植物 POD 同工酶酶带的相对迁移率分区 c b a 酶带材料编号注泳道编号代表材料同表. 通过 POD 同工酶谱进行亲缘关系分析结论与讨论运用欧氏距离以最短距离法对上述决明进行系中国决明亚族的种类虽然相对世界分布较少仅统聚类结果见图 T= 时决明属植物独立分类与 0 余种但开发利用历史深远其中决明早在神农本传统分类致 T= 时分为类豆茶决明与槐叶草经中就有久服能益精光轻身等记载[-5] 翅荚决明聚为类提示其有较近的亲缘关系而翅荚决明决明是国外引进的种而决明槐叶决明和豆茶决明是与决明分属另类 T= 时分为类豆茶决明槐中国本土植物对决明属的分类长期被限定于传统分叶决明和翅荚决明聚为类而决明与其亲缘关系较类角度研究相对较为薄弱国内些主要植物学文远以上结论与应用 POD 活性 MDA 含量推断的亲献在种类的划分学名的应用和属下分类系统等方面缘关系相符合尚存在相当的混乱与中国有关的些类群的系统分

5 中国农学通报 Label NO NO NO NO5 SO SO SO AL SO AL5 AL AL TO TO TO TO0 T T T 图决明属植物份不同萌发期材料 POD 同工酶聚类图类问题也未得到较好的解决改革开放以来花卉流通频繁, 中国审计登记草品种集 [] 记载了引进的圆叶决明 (Cassia rotundifolia) 和羽叶决明 (C. nictitans), 而未登记的伞房决明 (C. corymbosa) 作为良好的观赏植物在南京上海等地已广泛种植, 这些外来种在系统中的定位也是亟待解决的问题本研究对决明属植物的萌发生理生化特性进行了初步探讨, 通过不同萌发期各项指标的显著差异性检验, 对决明属的亲缘关系进行了分析结果表明, 亲缘关系相近的植物种类由于有相近的遗传关系, 往往具有相似的生理生化特征从蛋白质含量 POD 活性 MDA 含量分析结果推测, 决明与其他种亲缘关系较远, 槐叶决明与豆茶决明亲缘关系较近, 其次与翅荚决明关系较近, 该结果支持了 POD 同工酶测定将豆茶决明与槐叶决明翅荚决明聚为类, 而决明分属另类的结论, 说明通过抗逆指标进行决明属亲缘关系分析有定的可行性另外, 笔者首次对决明属植物萌发期间过氧化物酶同工酶研究, 结果表明 :() 发现决明属植物条酶带, 其中槐叶决明 5 条翅荚决明 5 条决明条豆茶决明条 () 个种没有共有带, 酶带 (c,rf=; c5,rf=;c,rf=0.5) 为槐叶决明翅荚决明豆茶决明的共有带 () 决明属的共同带主要分布在 c 区, 特征性酶带主要分布在 b 区和 a 区, 因此对萌发期的决明属植物进行鉴定时, 可以通过检测此区的特征性酶来进行区分其中槐叶决明的特征酶带为 c, 翅荚决明为 c 和 b, 决明为 a,b,a 和 a0, 豆茶决明特征酶带为第 d 出现的 b ()T= 时, 分为类, 豆茶决明槐叶决明和翅荚决明聚为类, 而决明与其亲缘关系较远但与 DNA 标记相比, 同工酶技术有效多态性 [-] 位点较少未来试验应把分子标记如 SSR 和同工酶结合起来, 从而更准确有效地确定材料间的亲缘关系决明属是类非常有经济价值的植物, 其中不少是中国传统中药, 目前对其关注较多的是决明子, 同属的其他药用植物的关注较少, 翅荚决明也仅限作为观赏植物栽培, 而本土植物豆茶决明和槐叶决明未受关注, 这无疑是对野生资源的浪费, 因此对决明属植物生化特性和同工酶的研究, 对其育种良繁及推广种植提供理论依据关于决明属分类中存在的疑问, 也需要后续更多的实验研究予以讨论参考文献 [] 中国科学院中国植物志编委会,. 中国植物志 ( 第三十九卷 )[M]. 北京 : 科学出版社,:-0. [] 华东师范大学, 上海师范学院. 种子植物属种检索表 ( 上册 )[M], :0. [] Ongkarn V, Wallie S, Puangpen S. Isozyme analysis of relationships among Boesenbergia (Zingiberaceae) and related genera in Southern Thailand[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 00, (5): -5. [] Larisa P G, Kimmo R, Igor V B. Genetic relationships in Chaenomeles (Rosaceae) revealed by isozyme analysis[j]. Scientia Horticulturae, 000,5(-): -5. [5] Huang Z, Yu T, Su L, et al. Identification of chromosome regions associated with seedling vigor in rice[j]. Acta Genetica Sinica, 00, :5-0. [] 孙彩霞, 沈秀瑛, 谷铁实. 不同基因型玉米种子萌发特性与芽苗期抗旱性的关系 [J]. 种子,00(5):-5. [] Soltani A, Zeinali E, Galeshi S. Genetic variation for and inter relationships among seed vigor traits in wheat from the Caspian Sea coast of Iran[J]. Seed Science and Technology, 00, : 5-. [] 何家庆, 王兴, 姚晴晴. 聚乙二醇对望江南种子萌发的影响 [J]. 中草药, 00,0():-. [] 张立军, 樊金娟. 植物生理学实验教程 [M]. 北京 : 中国农业大学出

6 蔡静等 : 国产决明属生理生化特性与系统分类的关系版社, 00. [0] Bao L X, Ning S, Fei Y, et al. Influence of transgenic and non-transgenic cottonseeds on the peroxidase isozymes of Pleurotus ostreatus[j]. Food Control, 00,():-. [] 毕辛华, 戴心维. 种子学 [M]. 北京 : 中国农业出版社,:0-. [] Karpinska B, Karlsson M, Schinkel H, et al. A novel superoxide dismutase with a high isoelect ric point in higher plant[j]. Expression regulation and protein localization. Plant Physiology, 00,:-. [] Abdul Jaleel C, Gopi R, Sankar B, et al. Studies on germination, seedling vigour, lipid peroxidation and proline metabolism in Catharanthus roseus seedlings under salt stress[j]. South African Journal of Botany, 00,():0-5. [] 国家药典委员会. 中国药典 ( 部 ) [M]. 北京 : 化学工业出版社, 005:. [5] Crockett C O, Guede-Guina F, Pugh D. Cassia alata and the preclinical search for therapeutic agents for the treatment of opportunistic infections in AIDS patients[j]. Cell Molecular Biology,, 5(5): [] 全国草品种审定委员. 中国审定登记草品种集 [M]. 北京 : 中国农业出版社,-00:0. [] Liu F, Bot hmer R V, Salomon B. Genetic diversity in European accessions of the Barley Core Collection as detected by isozyme elect rophoresis[j]. Genetic Resources and Crop Evolution, 000, : 5-5 [] Cheniany M, Ebrahimzadeh H, Salimi A, et al. Isozyme variation in some populations of wild diploid wheat s in Iran[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 00, 5: -

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AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L 2012 13 2 201-206 Journal of Plant Genetic Resources / 071001 41 SSR 21 SSR 41 52 2 ~ 4 2. 5 Shannon 0. 21 ~ 1. 40 0. 73 5. 54 3 7 9 13. 16% ~ 186. 49% 5. 48 6 11 SSR Genetic Diversity of Peanut Arachis