第 47 卷第 1 期 陈雷霖, 等 : 液 质联用技术鉴定安立生坦有关物质 59 Figure1 Chemicalstructureofambrisentan 材料 1 1 药品与试剂安立生坦原料药 ( 批号 AAL140601), 安立生坦片剂 ( 批号 TAL140801, 规格 5mg),

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1 58 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2016,47(1):58-65 液 质联用技术鉴定安立生坦有关物质 陈雷霖, 宋敏, 张戈, 王磊, 杭太俊 ( 1 中国药科大学药物分析教研室, 南京 ; 2 江苏嘉逸医药有限公司, 南京 ) 摘 要 采用液相色谱 飞行时间质谱 (LC TOF/MS) 和液相色谱 二级质谱联用 (LC MS/MS) 两种液 质联用技术对安立生 坦有关物质进行结构鉴定 采用 XBridgeC 18 (4 6mm 150mm,3 5μm) 色谱柱, 以乙腈 水溶液 ( 含 0 15% 甲酸 ) 为流动相 线性梯度洗脱, 对安立生坦及其有关物质进行分离 ; 通过电喷雾正离子化 TOF/MS 检测, 并结合 MS/MS 碎片和对照品对照 鉴定各有关物质的结构 在建立的色谱条件下安立生坦及其有关物质均分离良好, 共检测到 10 个有关物质, 并通过联用 技术和有机反应机制解析确证了它们的结构 液 质联用技术能够有效地鉴定安立生坦有关物质, 为其质量控制和工艺优 化提供参考依据 关键词 安立生坦 ; 有关物质 ;LC TOF/MS;LC MS/MS 中图分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 (2016) doi: /j.isn 引用本文陈雷霖, 宋敏, 张戈, 等. 液 质联用技术鉴定安立生坦有关物质 [J]. 中国药科大学学报,2016,47(1):58-65 Citethisarticleas:CHENLeilin,SONGMin,ZHANGGe,etal.IdentificationofrelatedsubstancesinambrisentanbyLC MS/MS[J].JChina PharmUniv,2016,47(1):58-65 IdentificationofrelatedsubstancesinambrisentanbyLC MS/MS CHENLeilin 1 牞 SONGMin 1 牞 ZHANGGe 1 牞 WANGLei 2 牞 HANGTaijun 1 1 DepartmentofPharmaceuticalAnalysis 牞 ChinaPharmaceuticalUniversity 牞 Nanjing 牷 2 JiangsuJiayiPharmaceuticalsCorporation 牞 Nanjing 牞 China Abstract AnLC TOF/MSandLC MS/MSmethodwasestablishedfortheidentificationtherelatedsubstances inambrisentan HPLCseparationwascariedoutonanXBridgeC 18 column 牗 4 6mm 150mm 牞 3 5μm 牘 with lineargradientelutionusingamobilephaseconsistingofacetonitrile 牞 waterand0 15% formicacid Thestruc turesoftherelatedsubstanceswereidentifiedbyelectrospraypositiveesihighresolutiontof/msandms/ms spectra 牞 andverifiedfurtherthroughreferencesubstances Ambrisentananditsrelatedsubstancescanbesepara tedwiththeestablishedhplcconditions Tenrelatedsubstancesweredetectedandidentified Theestablished methodisusefulfortheidentificationofrelatedsubstancesinambrisentan Theresultsobtainedarevaluablefor itsmanufacturingprocesoptimizationandqualitycontrol Keywords ambrisentan 牷 relatedsubstances 牷 LC TOF/MS 牷 LC MS/MS 安立生坦 (ambrisentan) 即 () (2S) 2 [(4, 6 二甲基嘧啶 2 基 ) 氧基 ] 3 甲氧基 3,3 二苯基丙酸 ( 图 1), 是 2007 年上市的由美国 Abbot 公司研发的内皮素受体拮抗剂 [1] 口服用于治疗肺动脉高血压, 可以改善患者的运动能力并延缓临床恶化, 具有高效 低毒等优点 [2-3] 目前尚无安立生 坦有关物质定性鉴定的研究报道 [4] 本研究建立了适用于安立生坦有关物质检查鉴定的液 质联用方法, 结合杂质对照品对照和强制降解试验, 鉴定了安立生坦有关物质的结构并分析了降解途径, 为安立生坦的工艺优化和质量控制提供了参考依据 收稿日期 通信作者 Tel: E mail:hangtj@cpu edu cn

2 第 47 卷第 1 期 陈雷霖, 等 : 液 质联用技术鉴定安立生坦有关物质 59 Figure1 Chemicalstructureofambrisentan 材料 1 1 药品与试剂安立生坦原料药 ( 批号 AAL140601), 安立生坦片剂 ( 批号 TAL140801, 规格 5mg), 安立生坦有关物质对照品 A~F( 表 1) 均由江苏嘉逸医药有限公司提供 ; 市售安立生坦片剂 ( 商品名 : 凡瑞克, 规格 5mg, 英国葛兰素史克股份公司 ); 乙腈 ( 色谱纯, 美国 Tedia 公司 ); 纯净水 ( 杭州娃哈哈集团有限公司 ), 其余试剂均为市售分析纯 1 2 仪器 1290Infinity 液相色谱 6224 飞行时间质谱仪 ( 美国安捷伦科技公司 );TSQQuantumUltraAM 型 LC MS/MS 联用仪 ( 美国热电公司 );BS21S 电子天平 ( 德国赛多利斯公司 );ZF C 型三用紫外分析仪器 ( 上海康和光电仪器有限公司 ) 方法 2 1 液相色谱条件 WatersXBridgeC 18 (4 6mm 150mm,5μm) 色谱柱, 含 0 15% 甲酸水溶液为流动相 A, 含 0 15% 甲酸的乙腈为流动相 B, 线性梯度洗脱 (A B):0min(70 30) 40min(55 45) 60min(30 70) 70min(30 70) 71min(70 30) 76min (70 30), 流速 1mL/min, 检测波长 220nm, 柱温 35, 进样量 20μL 2 2 TOF/MS 条件电喷雾正离子化 (ESI ) 质谱检测 ; 喷雾电压 4kV, 雾化氮气压力 275kPa, 干燥气流量 10L/min, 温度 325, 碎片电压 175 V, 参比离子 m/z ( 质子化嘌呤 ) 和 ( 质子化六 (1H,1H,3H 四氟丙氧基 ) 磷嗪,HP 921), 质量数扫描范围为 m/z110~ MS/MS 条件电喷雾正离子化 (ESI ) 质谱检测 ; 喷雾电压 5kV, 雾化氮气压力 300kPa, 加热毛细管温度 350,CID 氩气压力 0 20Pa 能量 10~35eV 2 4 样品处理 供试液取安立生坦或安立生坦片细粉适量 ( 约相当于安立生坦 5mg), 精密称定, 分别以乙腈溶解并稀释至 10mL 作为供试液 精密量取上述各溶液适量, 加起始比例流动相定量稀释, 分别制成 1% 和 0 1% 的自身对照溶液 强制降解供试液取安立生坦约 5mg, 精密称定, 加适量乙腈溶解, 分别经 10% 过氧化氢溶液 80 水浴 24h 1mol/L 盐酸溶液 60 水浴 3h 4mol/L 氢氧化钠溶液 90 水浴 48h 乙腈溶液 75 水浴 6d 或乙腈溶液 UV365nm(6W) 光照 6d 强制降解破坏处理后, 酸碱破坏样品先中和, 再加含 0 15% 甲酸的乙腈 水 (30 70) 溶液溶解并稀释至 10mL( 相当于供试液浓度 0 5mg/mL) 作为不同强制降解试验供试液 杂质对照液取安立生坦有关物质 A~F 对照品各适量, 精密称定, 分别用乙腈溶解并定量稀释制成质量浓度约为 0 5mg/mL 的溶液作为对照品储备液 取各储备液适量, 用起始比例流动相定量稀释制成质量浓度约为 5μg/mL 的溶液作为杂质对照液 结果 3 1 有关物质检查安立生坦及其强制降解供试液的 HPLC DAD 检查图谱见图 2, 对主要有关物质峰按保留时间从小到大顺次编号为 1~10 安立生坦原料药及供试片中均未检测到杂质, 参比片中存在 1 个含量大于 1% 的杂质 ( 有关物质 10) 强制降解共产生 5 个杂质 ( 有关物质 ), 其中杂质 3 和 9 分别与已知杂质 B 和 F 色谱保留一致 已知杂质 A C D E 存在于原料药合成工艺中, 有引入的可能, 但均未在原料药 片剂及其降解产物中出现, 鉴于篇幅仅将其检查结果列入杂质鉴定表中, 不再做进一步分析 强制降解结果表明 : 本品对强光相对稳定, 未形成降解产物 ( 未提供色谱图 ); 酸破坏形成 1 个主要降解产物, 为有关物质 9( 图 2 e); 碱破坏形成 3 个主要降解产物, 分别为有关物质 3 5 9( 图 2 f); 高温破坏形成 3 个主要降解产物, 分别为有关物质 2 4 9( 图 2 g); 氧化破坏形成含量均较小的

3 学报 J Ch Ph m c c U v y2 0 1 6 4 7 1 5 8 6 5 60 第4 7卷 多个降解产物 不列入杂质鉴定表中 各降解产 3 根据有关物质最大吸收相对安立生坦的变化来 物与主峰均分离良好 其紫外特征吸收曲线见图 辅助有关物质结构解析 F g 2 HPLCc h m g m mb d M x d mp y c b API AAL1 40 60 1 c T b TAL14 0 80 1 d R c b Ac dh y d y A k h y d y g Ox d v d g d h Th md g d 3 2 有关物质结构的鉴定 F g 3 UV b p c v mb d d b c MS碎片及裂解规律分 鉴定 再根据三重四极 MS 负离子检测模式下除安立生坦和有关物质 3 析 以下所有裂解机制图中离子加合位点均为可 4外其余杂质均无响应 故均采用 ESI 质谱检测 能性较大的情况 同时也存在其他的可能 并结 TOF MS测得这些有关物质母离子的准确质量 通 合对照品对照推定有关物质的结构 各有关物质 过 M H 软件对各有关物质进行元素组成的 的色谱 质谱信息及推断的结构见表 1 Tb 1 S c h d b c mb d dbylc TOF MSdLC MS MS N M c R m z m I m D F gm z 10 6 m Chm c c Chm cm P p d g 1 A M H 187 0535 2 2 C7H11N2O2S 2 M H 212 1073 9 6 C14H14NO 3 B M N 295 0937 13 9 C16H16O4N 0 01 219 g m 2 Hyd xy 3 m hxy 3 3 d S ddg d phy p p cc d 4 M H 167 0826 19 3 C8H11N2O2 7 27 149 126 85 4 6 D m hy py m d 2 y xy c dhyd 5 M H 347 1394 27 4 C21H19N2O3 0 31 329 303 125 2 4 6 D m hy py m d 2 Dg d y xy 3 3 d phy c y cc d 6 C M N 309 1099 27 7 C17H18O4N 10 74 125 107 82 6 64 195 167 134 106 0 16 205 197 2 M h y 4 6 d m hy S gm py m d 2 4 Am phy 2 phy Dg d h Dg d 2 Hyd xy 3 m hxy 3 3 d I mp y phy p p cc dm hy gm

4 第 47 卷第 1 期 陈雷霖, 等 : 液 质联用技术鉴定安立生坦有关物质 61 No Molecularion/ (m/z) 7(D ) [MH] t R / min Ion formula Dif Fragmentions ( 10-6 ) (m/z) Chemical structure Chemicalname (Continued) Proposed origins 28 1 C 13 H 11 O Diphenyl methanone Impurityinstart ingmaterial 8(E ) [MH] C 16 H 15 O ,195, 167,105 3,3 Diphenyl oxirane 2 carbox ylic acidmethylester Impurityinstart ingmaterial 9(F ) [MH] C 20 H 19 N 2 O ,125 2 (2,2 Diphenyl vinyloxy) 4,6 dimethyl pyrimidine Degradation 10 [MH] C 30 H 30 NO (2,2 Diphenyl ethylamino) aceticacid 2,2 diphenyl ethylester Degradation Impurityreferencesubstance 安立生坦 :ESI TOF/MS 测得 m/z379 的 [M H] m/z401 的 [MNa] 和 m/z417 的 [M K],ESI - TOF/MS 测得 m/z377 的 [M-H] -, 测得安立生坦 [MH] 的准确质量为 , 与 离子式 C 22 H 23 N 2 O 4 相应 MS/MS 主要特征碎片离子 m/z 和 125 与安立生坦的结构相应 :m/z347 由 [MH] 离子脱去甲氧基得 到,m/z329 由 m/z347 脱去羟基得到,m/z303 由 [MH] 离子脱去羧基和甲氧基得到,m/z179 和 125 由 m/z303 碳氧键断裂得到 可见安立生坦的主要碎片离子均来自于甲氧基 羧基以及间二甲基嘧啶氧基的断裂 安立生坦的二级质谱分析 ( 图 4) 对于解析其有关物质结构具有重要意义 Figure4 MS/MSspectrumofambrisentan[MH] (m/z379)ionanditsfragmentationmechanism Figure5 MS/MSspectrumofimpurity2[MH] (m/z212)ionanditsfragmentationmechanism

5 62 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2016,47(1):58-65 第 47 卷 有关物质 2:ESI TOF/MS 测得 m/z212 的 [M H] m/z234 的 [M Na] 和 m/z250 的 [MK], 测得有关物质 2[MH] 离子的准确质量为 , 与离子式 C 14 H 14 NO 相应 ;MS/ MS 特征碎片离子为 m/z 推测热破坏条件下甲氧基和羧基脱去, 由于出峰时间较早, 极性较大, 推测间二甲基嘧啶氧基碳氧键断裂生成羟基, 根据相对分子质量为奇数, 应含奇数个 N, 推测在丢失间二甲基嘧啶环的同时与含氮化合物反应, 苯环上加氨基 ( 氨基位置不确定 ) 其紫外最大吸收波长相对安立生坦红移, 推测是由于生成助色团 OH NH 2 的同时又生成碳碳双键与苯 环发生共轭作用所致, 佐证了以上推测 故推测有关物质 2 为安立生坦在热破坏条件下脱羧基 甲氧基 间二甲基嘧啶基的氨基化反应产物 ( 图 5) 有关物质 3:ESI TOF/MS 测得 m/z295 的 [MNa],ESI - TOF/MS 测得 m/z271 的 [M - H] -, 测得有关物质 3[M Na] 的准确质量为 , 与离子式 C 16 H 16 O 4 Na 相应 ;MS/MS 特征碎片离子为 m/z219 其紫外特征吸收曲线 质谱特征和保留时间 (t R =13 9min) 均与有关物质 B 对照品一致 故确证有关物质 3 为安立生坦脱间二甲基嘧啶基产物 2 羟基 3 甲氧基 3,3 二苯基丙酸 ( 图 6) Figure6 MS/MSspectrumofimpurity3[MNa] (m/z295)ionanditsfragmentationmechanism 有关物质 4:ESI TOF/MS 测得 m/z167 的 [MH] m/z205 的 [M K] 和 m/z333 的 [2MH],ESI - TOF/MS 测得 m/z331 的 [2M- H] -, 测得有关物质 4[M H] 的准确质量为 , 与离子式 C 8 H 11 N 2 O 2 相应 ;MS/MS 特征碎片离子为 m/z 推测热破坏条件下丢失羧基, 根据出峰时间, 极性与安立生坦接近, 其相对分子质量比安立生坦少 212, 推测丢失了两个苯基和一个甲基, 其中甲基由甲氧基碳氧键断裂脱去, 形成的烯羟基由于不稳定而转变成醛基 其紫外最大吸收波长相对安立生坦红移, 推测是脱去生色团羧基所致, 佐证了以上推测 故推测有关物质 4 为安立生坦在热破坏条件下脱去苯基 羧基 甲基的剩余结构部分 ( 图 7) Figure7 MS/MSspectrumofimpurity4[MH] (m/z167)ionanditsfragmentationmechanism 有关物质 5:ESI TOF/MS 测得 m/z347 的 [MH] m/z369 的 [MNa], 测得有关物质 5 [MH] 的准确质量为 , 与离子式 C 21 H 19 N 2 O 3 相应 ;MS/MS 特征碎片离子 m/z 与安立生坦部分碎片相同, 推测为碱性条 件下安立生坦脱去甲氧基生成 其紫外最大吸收波长相对安立生坦红移, 推测是生成碳碳双键与苯环和羰基发生共轭作用所致, 佐证了以上推测 故推测有关物质 5 为安立生坦碱破坏条件下脱去甲氧基的产物 ( 图 8)

6 第 47 卷第 1 期 陈雷霖, 等 : 液 质联用技术鉴定安立生坦有关物质 63 有关物质 9:ESI TOF/MS 测得 m/z303 的 [M H] m/z325 的 [M Na] 和 m/z341 的 [MK], 测得有关物质 9[MH] 的准确质量为 , 与离子式 C 20 H 19 N 2 O 相应 ;MS/MS 特征碎片离子为 m/z 其紫外特征吸收曲 线 质谱特征和保留时间 (t R =57 1min) 均与有关物质 F 对照品一致 故确证有关物质 9 为安立生坦脱去羧基和甲氧基的产物 2 (2,2 二苯基 乙烯氧基 ) 4,6 二甲基吡啶 ( 图 9) Figure8 MS/MSspectrumofimpurity5[MH] (m/z347)ionanditsfragmentationmechanism Figure9 MS/MSspectrumofimpurity9[MH] (m/z303)ionanditsfragmentationmechanism 有关物质 10:ESI TOF/MS 测得 m/z436 的 [MH] 和 m/z458 的 [MNa], 测得有关物质 10[MH] 的准确质量为 , 由于出峰时 间晚, 极性小, 应与离子式 C 30 H 30 NO 2 相应 ;MS/ MS 特征碎片离子为 m/z179, 与安立生坦其中一 个碎片离子相同 其紫外最大吸收波长相对安立生坦红移, 推测是由于甘氨酸引入助色团 NH 2 和 OH 所致 结合安立生坦的裂解机制, 推测有关物质 10 为安立生坦与辅料中甘氨酸反应产物 ( 图 10) Figure10 MS/MSspectrumofimpurity10[MH] (m/z436)ionanditsfragmentationmechanism 讨论 结合安立生坦的合成工艺 强制降解实验以及有关物质对照品比对, 研究鉴定出了 10 个有关物 质, 其降解途径见图 11 根据鉴定结果, 有关物质可分为 3 类 : 合成起始原料或由起始原料引入的有关物质 ( 有关物质 ), 降解产物 ( 有关物质 和 9) 和辅料杂质 ( 有关物质 10)

7 64 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2016,47(1):58-65 第 47 卷 强制降解实验表明, 安立生坦对光照相对稳定, 对酸 碱 氧化 高温不稳定 强酸条件下, 易脱去羧基及甲氧基生成比安立生坦极性小的有关物质 9 强碱条件下, 易脱去间二甲基嘧啶氧基生成比安立生坦极性大的有关物质 3, 脱去甲氧基生成有关物质 5, 和脱去羧基及甲氧基生成有关物质 9 在持续高温条件下, 安立生坦苯基 羧基脱去, 甲氧基脱去或其碳氧键断裂, 间二甲基嘧啶环脱去会生 成少量杂质, 包括有关物质 2,4,9 氧化破坏条件下, 在相对保留时间为 10 6~21 8min 处生成多个有关物质 ( 图 12), 经 LC TOF/MS 分析, 其准分子离子 m/z 分别为 , 分别与分子离子式 C 22 H 23 N 2 O5,C 21 H 21 N 2 O4,C 21 H 19 N 2 O 4 相对应, 推测为安立生坦非选择性的羟基化 脱甲基以及脱甲基再羟基化的产物 ( 分析见图 13~15), 另外还产生有关物质 9 Figure11 Degradationpathwayofambrisentan Figure12 Totalionchromatogramofoxidativestrestestsolution Figure13 Extractedionchromatogram,probablestructure,representativefragmentationmechanismofm/z395ofoxidativetestrelatedsubstances

8 第 47 卷第 1 期 陈雷霖, 等 : 液 质联用技术鉴定安立生坦有关物质 65 Figure14 Extractedionchromatogram,probablestructure,representativefragmentationmechanismofm/z365ofoxidativetestrelatedsubstances Figure15 Extractedionchromatogram,probablestructure,representativefragmentationmechanismofm/z363ofoxidativetestrelatedsubstances 安立生坦供试品中各有关物质含量均未超过 0 1%, 分析强制降解试验结果, 其中有关物质 为降解产生, 而降解产生的有关物质在片剂中均未检出, 表明在适宜的存储条件下, 其质量和稳定性良好 参考文献 [1] HrometzSL,ShieldsKM.Roleofambrisentaninthemanagement ofpulmonaryhypertension[j].ann Pharmacother,2008,42 (11): [2] ChengJW.Ambrisentanforthemanagementofpulmonaryarterial hypertension[j].clinther,2008,30(5): [3] GuoW.Potentialdrugforpulmonaryarterialhypertensionwil rise[j].shanghaimedpharmj( 上海医药 ),2007,28(4): [4] JiangXP.Toobservethedevelopmentstrategyofdrugstandards throughchinesepharmacopoeia2010edition[j].chinpharmj ( 中国药学杂志 ),2010,45(17):

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