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溃谷
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1 2009 年第 67 卷化学学报 Vol. 67, 2009 第 21 期, 2439~2444 ACTA CHIMICA SINICA No. 21, 2439~2444 研究论文乌头碱在家兔肠道内代谢产物的 LC/ESI-MS n 研究随志刚 a,d 姜雅秋 b 刘志强 c 梁峰 ( a 吉林大学药学院长春 ) ( b 吉林大学第一医院长春 ) ( c 中国科学院长春应用化学研究所长春 ) ( d 吉林大学白求恩医学院长春 ) a 闫峻 a 刘忠英 *,a 摘要采用 LC/ESI-MS n 的方法对家兔肠道内的乌头碱代谢产物进行研究. 经与空白组比较发现, 给药后家兔小肠内容物中新增加 6 个化合物峰 (M 1 ~M 6 ), 盲肠内容物中新增加 5 个化合物峰 (M 2 ~M 6 ), 粪便中新增加 2 个化合物峰 (M 3, M 4 ). 分别测定各化合物的准分子离子及各级串联碎片离子, 并与标准品的质谱断裂规律进行比较, 同时参考文献, 推断肠道内化合物 M 1 为 16-O- 去甲基 -8-O- 去乙酰基乌头碱, M 2 为 8-O- 去乙酰基乌头碱, M 3 为 16-O- 去甲基乌头碱, M 4 为乌头碱 (AC), M 5 为去氧乌头碱, M 6 为印乌头碱. 关键词乌头碱 ; 代谢产物 ; 液相色谱 - 电喷雾电离 - 多级串联质谱法 (LC/ESI-MS n ) Study on Metabolites of Aconitine in Rabbit Intestines by Using LC/ESI-MS n Sui, Zhigang a,d Jiang, Yaqiu b Liu, Zhiqiang c Liang, Feng a Yan, Jun a Liu, Zhongying*,a ( a College of Pharmaceutical, Jilin University, Changchun ) ( b The First Hospital of Jilin University, Changchun ) ( c Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun ) ( d Norman Bethune College of Medicine, Jilin University, Changchun ) Abstract LC/ESI-MS n was used to separate and determine the major metabolites of aconitine in intestines of rabbit. Compared with the control samples, six compounds (M 1 ~M 6 ) were found in small intestine, five compounds (M 2 ~M 6 ) in caecum and two compounds (M 3, M 4 ) in feces. On the bases of MS n fragmentation of standard and references, they were deduced as 16-O-demethyl-8-O-deacetylaconitine (M 1 ), 8-O-deacetylaconitine (M 2 ), 16-O-demethylaconitne (M 3 ), aconitine (M 4 ), deoxyaconitine (M 5 ) and indaconitine (M 6 ). Keywords aconitine (AC); metabolites; LC/ESI-MS n 乌头属植物的块茎如草乌附子等, 是我国应用较广的一类传统中药, 它们主要的生理活性成分是乌头类双酯型生物碱, 乌头碱 (aconitine, AC) 为此类生物碱的代表. 现代药理研究证实乌头碱具有广泛的药理作用, 尤其在抗炎方面 [1], 故乌头属植物历来为治疗风湿痹证之要药. 但是由于乌头碱毒性较大 [2,3], 治疗剂量和致毒剂量比较接近, 所以每年因误服或服用不当导致乌头碱中毒的案例颇多, 死亡率较高 [4,5]. 目前针对乌头碱体内外代谢的研究不多, 多采用液质联用的方法考察乌头碱在血液, 尿液, 胆汁以及肝微 * liuzy@jlu.edu.cn Received February 12, 2009; revised June 16, 2009; accepted July 1, 计划项目 (No. 2006CB504706) 国家自然科学基金(Nos , ) 资助项目.

2 2440 化学学报 Vol. 67, 2009 粒体中的代谢产物, 鉴定出了一些代谢产物并在此基础上推断出乌头碱的生物转化过程 [6~13]. 但是, 没有文献报道过乌头碱在消化道内的生物转化. 人们在服用乌头属植物的时候, 多采用口服的给药方式, 药物经口服后直接进入消化道并在这里产生一些代谢产物. 有些代谢产物可能活性降低甚至丧失活性, 也有些代谢产物可能具有新的药理活性或者新的毒性, 它们会与原形药物一起被吸收进入循环系统而发挥作用, 所以这些代谢产物很可能会对机体产生疗效或者毒性. 为了深入认识乌头碱产生疗效和毒性的物质基础, 我们采用 LC/ESI-MS n 对口服给药乌头碱的肠道代谢产物进行了系统的研究. 1 实验部分 1.1 仪器和试药 LCQ 离子阱质谱仪 (Finnigan); Xcalibur 数据处理系统 (Finnigan); Waters 高效液相色谱仪 (waters). 乌头碱对照品购于中国药品生物制品检定所 ; 乙腈为色谱纯 (Fisher); 其它试剂与药品均为分析纯 ; 家兔由吉林大学实验动物中心提供. 1.2 样品制备健康家兔三只, 实验前禁食 12 h, 自由饮水. 取两只家兔, 以 1.0 mg kg -1 的剂量灌胃给药乌头碱生理盐水混悬溶液, 第三只家兔作为空白对照灌胃给予生理盐水, 于给药后 4 h 处死动物, 收集小肠盲肠内容物和结肠中的粪便适量. 分别向各样品中加入等重量的水, 用 0.1 mol L -1 HCl 调 ph 为 2, 用组织破碎器充分搅拌, 8000 r min -1 离心 5 min, 上清液过滤, 滤液用 0.1 mol L -1 氨水调至 ph 为 8. 用三倍体积的乙酸乙酯萃取三次, 合并萃取液, 用旋转蒸发仪减压蒸干, 温度为 20. 残渣溶解于 500 µl 乙腈中, 经 0.45 µm 滤膜过滤, 取滤液进行 LC/ESI-MS n 分析. 1.3 分析条件色谱条件 : 色谱柱为 Agilent C 18 Extend 柱 (4.6 mm 150 mm, 5 µm); 流动相由乙腈 (A) 和 0.1% 三乙胺溶液 (B) 组成, 采用线性梯度洗脱, 0~30 min, A 相由 45% 升至 60%, 30~55 min, A 相由 60% 升至 80%; 流速为 0.6 ml min -1 ; 柱温为 30. 质谱条件 : 电喷雾离子化源 (ESI); 正离子模式 ; 毛细管温度 200 ; 毛细管电压 17 V; 喷雾电压 5 kv; 鞘气流速 60 arb; 辅助气流速 10 arb; 采用一级全扫描质谱及选择离子二级和三级全扫描方式检测. 2 结果与讨论 2.1 结果乌头碱中乌头碱 (mesaconitine, MA) 和次乌头碱 (hypaconitine, HA) 结构相似 ( 图 1), 对比研究它们的裂解行为有利于深入认识乌头碱的裂解规律, 发现一些与结构特异性相关的诊断离子. 将 AC, MA 和 HA 分别制成浓度为 1 nmol L -1 的标准品溶液, 在选定的条件下进行 ESI-MS n 分析, 各级质谱图见图 2. 在 AC 的 MS 2 谱中显示其质子化离子 [M+H] + 的 m/z 为 646( 图 2a), 串联后的基峰离子 m/z 为 586( 图 2a), 该离子为 [M+H-60] +, 是 [M+H] + 失去一分子醋酸所形成. 对 [M+H-60] + 进行三级串联, 可得到基峰离子 [M+H ] + (m/z 为 526) ( 图 2b). 根据文献 [13], 由于 AC 的结构中存在 C-15 位羟基, 才会有离子 [M+H ] + 产生, 所以, 此离子可以作为判断 AC 及其同类化合物是否具有 C-15 位羟基的诊断离子. 同时, 在对比研究 AC, MA 和 HA 的 MS 2 谱时发现, AC 和 MA 的 MS 2 谱 ( 图 2a 和图 2c) 中均存在 [M+H-18] + 而 HA 的 MS 2 谱 ( 图 2d) 没有该离子. 对比三者的结构, AC 和 MA 具有 C-3 位羟基而 HA 没有, 说明 [M+H-18] + 产生的结构基础为 C-3 位羟基, 所以, [M+H-18] + 可以作为判断 AC 及其同类化合物是否具有 C-3 位羟基的诊断离子. 诊断离子 [M+H ] + 和 [M+H-18] + 的产生过程见图式 1. Alkaloids 生物碱 R 1 R 2 R 3 MW Aconitine 乌头碱 C 2 H 5 OH CH 3 COO 645 Mesacontitine 中乌头碱 CH 3 OH CH 3 COO 631 Hypaconitine 次乌头碱 CH 3 H CH 3 COO 315 图 1 乌头碱中乌头碱和次乌头碱结构图 Figure 1 Structures of AC, MA and HA 通过比较空白小肠内容物 ( 图 3a) 和给药后小肠内容物 ( 图 3b) 的 BPC 色谱图 ( 即在总离子流色谱图的基础上扣除背景所得的色谱图 ) 发现, 给药后家兔小肠内容物新增 5 个色谱峰 M 1 ~M 5, 选择 m/z 为 630 对总离子流图进行处理, 得到选择离子流色谱图 ( 图 4), 发现了一个含量很低的代谢产物 M 6. 化合物 M 2 的保留时间为 17.7 min, 准分子离子为 m/z 604. 经过二级串联得到基峰碎片离子 [M+H-32-18] + (m/z 554), 对其进行三级串联得到主要碎片离子

3 No. 21 随志刚等 : 乌头碱在家兔肠道内代谢产物的 LC/ESI-MS n 研究 2441 图 2 乌头碱, 中乌头碱和次乌头碱的 MS n 谱 a: 乌头碱的 MS 2 谱, b: 乌头碱的 MS 3 谱, c: 中乌头碱的 MS 2 谱, d: 次乌头碱的 MS 2 谱 Figure 2 MS n of aconitine, mesaconitine and hypaconitine a: MS 2 of AC, b: MS 3 of AC, c: MS 2 of MA, d: MS 2 of HA 图式 1 乌头碱的裂解规律 Scheme 1 Proposed fragmentation pathways of aconitine [M+H ] + (m/z 522). 根据相关文献 [6~11], AC 在体内会发生 C 8 位乙酸酯键水解, 脱去乙酰基后, 产生与 AC 相差 42 Da 的水解产物, 8-O- 去乙酰基乌头碱. 化合物 M 2 与 AC 相差 42 Da, 并且其各级质谱的数据与文献报道的 8-O- 去乙酰基乌头碱裂解规律相同, 故推断此化合物为 8-O- 去乙酰基乌头碱.

4 2442 化学学报 Vol. 67, 2009 图 3 小肠内容物样品的 BPC 图 a: 空白样品, b: 给药后样品 Figure 3 BPC of sample obtained from small intestine of rabbit a: control, b: after administered 为 646, 与 AC 对照品的质子化离子 [M+H] + 一致. 对其进行 ESI-MS n 分析, 多级串联质谱行为与 AC 对照品相同, 参考相关文献 [10~12], 推断其为 AC. 化合物 M 5 的保留时间为 52.1 min, 准分子离子为 m/z 630, MS 2 谱的主要碎片离子为 m/z 570, 此离子的 MS 3 谱的主要碎片离子 m/z 分别为 538 和 510. M 6 的保留时间为 39.7 min, 准分子离子也为 m/z 630, MS 2 谱的主要碎片离子为 m/z 570, 对其串联后的 MS 3 谱中主要碎片离子分别为 m/z 538 和 m/z 520. 由于 M 5 和 M 6 的 MS 谱及 MS 2 谱的基峰离子相同, 推断两者为同分异构体, 又由于它们的分子量均与 AC 相差 16 Da, 推测两者均为 AC 的一个羟基被还原成氢的产物. 对比研究两者的 MS 2 谱图, M 5 的 MS 2 谱中没有 [M+H-18] + 离子 (m/z 612) 而 M 6 的 MS 2 谱中存在该离子, 说明 M 5 没有 C-3 位羟基而 M 6 具有 ; 对比研究两者的 MS 3 谱图, M 5 的 MS 3 谱中存在 [M+H ] + 离子 (m/z 510) 而 M 6 的 MS 3 谱中没有该离子, 说明 M 5 具有 C-15 位羟基而 M 6 不具有. 由于 M 5 和 M 6 均为乌头碱减少一个羟基的产物, 所以只要确定了丢失羟基的位置就可以确定代谢产物, 图 4 小肠内容物样品的选择离子流图 Figure 4 Selective ion chromatograms of sample obtained from small intestine of rabbit 化合物 M 3 的保留时间为 30.2 min, 准分子离子为 m/z 632. 其选择离子二级和三级串联质谱图中基峰离子的 m/z 分别为 572 和 512, 与 AC 在同样条件下所得的基峰离子 (m/z 分别为 586 和 526) 均相差 14 Da, 说明两者具有相同的断裂规律, 因此推断 M 3 与 AC 结构相似, 由于两者相差 14 Da, 推测它们相差一个 CH 2. 文献 [8, 9, 11] 中报道了 AC 在体内代谢过程中可以丢失 C-16 位甲氧基中的亚甲基而形成 C-16 位羟基, 产生 16-O- 去甲基乌头碱. 化合物 M 3 与 AC 相差 14 Da, 并且其各级质谱的数据与文献报道的 16-O- 去甲基乌头碱裂解规律相同, 故推断此化合物为 16-O- 去甲基乌头碱. 化合物 M 1 的保留时间为 12.5 min, 准分子离子为 m/z 590, 与 M 2 相差 14 Da. 其选择离子二级和三级串联质谱中主要碎片离子的 m/z 分别为 540 和 508, 与 M 2 相比, 相对应的离子分别少了 14 Da. 据此推测化合物 M 1 与 M 2 具有相似的结构, 且相差一个 CH 2. 文献 [7, 8] 报道 AC 在体内代谢过程中可以丢失 C-16 位甲氧基中的亚甲基而形成 C-16 位羟基, 同时 C-8 位乙酸酯键水解, 产生 16-O- 去甲基 -8-O- 去乙酰基乌头碱. 化合物 M 3 的各级质谱数据与文献报道的 16-O- 去甲基 -8-O- 去乙酰基乌头碱裂解规律相同, 故推断此化合物为 16-O- 去甲基 -8-O- 去乙酰基乌头碱. 化合物 M 4 的保留时间为 41.5 min, 准分子离子 m/z 质谱数据显示, 相对于 AC, M 5 没有了 C-3 位羟基而 M 6 没有了 C-15 位羟基. 由此, 推断 M 5 为去氧乌头碱, M 6 为印乌头碱. 文献 [13] 报道的去氧乌头碱和印乌头碱标准品的裂解规律同 M 5 和 M 6 的裂解规律一致, 印证了我们的推断是正确的. 比较空白盲肠内容物 ( 图 5a) 和给药盲肠内容物 ( 图 5b) 的 BPC 色谱图可以看到, 给药后新增 5 个色谱峰, 通过对比色谱行为和质谱裂解规律, 推断它们为化合物 M 2 ~M 5. 图 5 盲肠内容物样品的 BPC 图 Figure 5 BPC of sample obtained from caecum of rabbit a: control, b: after administered 比较空白粪便样品 ( 图 6a) 和给药后粪便样品 ( 图 6b) 的 PBC 图谱可以看到, 给药后新增 2 个色谱峰. 通过对比色谱行为和质谱裂解规律, 推断它们为化合物 M 3 和 M 4.

5 No. 21 随志刚等 : 乌头碱在家兔肠道内代谢产物的 LC/ESI-MS n 研究 2443 图 6 粪便样品的 BPC 图 a: 空白样品, b: 给药后样品 Figure 6 BPC of sample obtained from feces of rabbit 2.2 讨论 a: control, b: after administered 本文首次应用 LC/ESI-MS n 鉴定了家兔口服乌头碱后在肠道中存在的原型药物及 5 种代谢产物. 其中单纯去甲基产物一个, 即 M 3 (16-O- 去甲基乌头碱 ); 单纯水解产物一个, 即 M 2 (8-O- 去乙酰基乌头碱 ); 既去甲基又水解产物一个, 即 M 1 (16-O- 去甲基 -8-O- 去乙酰基乌头碱 ); 羟基还原为氢的产物两个, 即 M 5 ( 去氧乌头碱 ) 和 M 6 ( 印乌头碱 ). 各化合物的 LC/ ESI-MS n 数据见表 1. 这些代谢产物的存在说明了 AC 在肠道中会受到去甲基酶水解酶和氧化还原酶的催化作用而降解. 由上述代谢产物的结构我们推测出了乌头碱在肠道内的生物转化过程, 见图式 2. 通过对比小肠内容物, 盲肠内容物和粪便 ( 直肠内容物 ) 的 BPC 图谱, 我们发现在消化道中按照由小肠到直肠的顺序, 代谢产物越来越少. 相对于小肠, 盲肠内少了 16-O- 去甲基 -8-O- 去乙酰基乌头碱, 说明此代谢产物在小肠以上部位产生, 且被小肠完全吸收了 ; 相对于盲肠, 粪便中少了 8-O- 去乙酰基乌头碱去氧乌头碱和表 1 乌头碱及其代谢物 (M 1 ~M 6 ) 的 LC/MS n 数据 Table 1 LC/MS n data of acontine and its metabolites (M 1 ~M 6 ) Compound RT/min Name [M+H] + MS 2 MS 3 Reference M O-demethyl-8-O-deacetyl-aconitine 590 M O-deacetyl-aconitine 604 M O-demethyl-aconitine 632 M AC 646 M deoxyaconitine 630 M indaconitine (100) 558(18) 554(100) 572(45) 572(100) 512(5) 586(100) 526(3) 570(100) 538(9) 570(100) 538(3) 508(100) 476(16) 522(100) 490(21) 512(100) 540(37) 526(100) 554(12) 510(100) 538(74) 520(100) 538(93) [7,8] [6,7,8,9,10,11] [8,9,11] [10,11,12] [10,12,13] [13] 图式 2 乌头碱在家兔肠道内的生物转化过程 Scheme 2 Proposed biotransformation process of aconitine in rabbit intestines

6 2444 化学学报 Vol. 67, 2009 印乌头碱, 说明除原型药和 16-O- 去甲基乌头碱以外, 所有的代谢产物均被吸收完全. 在各部分代谢物中 16-O- 去甲基乌头碱的含量与乌头碱的含量相当, 说明乌头碱转化为 16-O- 去甲基乌头碱的比率很大. 我们还研究了 AC 在家兔体内的动力学行为, 结果也发现家兔灌胃给药 AC 一段时间后, 血液样品中 16-O- 去甲基乌头碱的浓度与 AC 的浓度同属一个数量级. 由此可见 16-O- 去甲基乌头碱是 AC 主要代谢产物, 为进一步研究 AC 的体内代谢产物与其药效和毒性之间的关系打下基础. References 1 Ameri, A. Prog. Neurobiol. 1998, 56, Fatovich, D. M. Ann. Emerg. Med. 1992, 21, Chuan, L.-C.; Thomas, Y. K.; Fang, D.-J. Ann. Emerg. Med. 2004, 43, Dickens, P.; Tai, Y. T.; But, P. P. Forensic Sci. Int. 1994, 67, Naofumi, Y.; Kunio, G.; Akira, T. Forensic Sci. Int. 1996, 81, Wang, Z.-H.; Wen, J.; Chen, Y.-H. Chin. J. Forensic Med. 2006, 21, 88 (in Chinese). ( 王朝虹, 文静, 陈义华, 中国法医学杂志, 2006, 21, 88.) 7 Zhang, H.-G.; Sun, Y.; Duan, M.-Y. Toxicon 2005, 46, Zhang, H.-G.; Shi, X.-G.; Sun, Y. Chin. Chem. Lett. 2002, 13, Li, W.-D. M.S. Thesis, Institute of Materia medica Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Peking, 2001 (in Chinese). ( 李文东, 硕士论文, 中国医学科学院协和医科大学药物研究所, 北京, 2001.) 10 Wang, Y.; Liu, Z.-Q.; Song, F.-R. J. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, Wang, Y.-G.; Wang, S.-Q.; Liu, Y.-X. Chromatogr. B 2006, 844, Yue, H.; Pi, Z.-F.; Song, F.-R. Acta Chim. Sinica 2008, 66, 211 (in Chinese). ( 越皓, 皮子凤, 宋凤瑞, 化学学报, 2008, 66, 211.) 13 Li, R.; Wu, Z.-J.; Zhang, F. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006, 20, 157. (A Lu, Y.)

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