856 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 14 卷 斛中的应用研究进展作一综述. 1.1 RFLP 标记 RFLP (Restraction fragment length polymorphism) 标记 即限制性内切酶切片段长度多态性标记, 由 Botstei

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1 应用与环境生物学报 2008,14 ( 6 ): 855~862 Chin J Appl Environ Biol=ISSN X DOI: /SP.J * 分子标记技术在石斛属植物中的应用研究进展 1, 2 刘静 1 何涛 1** 淳泽 ( 1 中国科学院成都生物研究所成都 ) ( 2 中国科学院研究生院北京 ) 摘要石斛作为一种名贵中药, 近年来受到国内外研究人员的重视. 本文对 RFLP 技术 位点特异性 PCR RAPD 技术 AP-PCR 技术 AFLP 技术 ISSR 技术 SRAP 技术 DNA 序列分析 基因芯片技术等 DNA 分子标记技术的基本原理和特点作了简要介绍,DNA 分子标记技术为石斛类药材的鉴别提供了更加有效 可靠的鉴定方法. 综述了近年来上述分子标记技术在石斛属植物中的应用研究进展, 总结了这些技术在中药材鉴定中的地位, 并对其发展前景做出了展望. 表 1 参 36 关键词石斛 ;DNA 分子标记 ; 中药材鉴定 ; 中药 CLC Q : Q7 Advance in Application of DNA Molecular Markers on Dendrobium * LIU Jing 1,2, HE Tao 1 & CHUN Ze 1** ( 1 Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu , China) ( 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing , China) Abstract Dendrobium, as a valuable and expensive Chinese herb, has attracted great attention in China and abroad in recent years. This paper provides the basic principles and characteristics of some DNA molecular marker techniques, including RFLP, allele-specific diagnostic PCR, RAPD, AP-PCR, AFLP,ISSR, SRAP, and DNA sequencing analysis, genechip,and reviews their application progresses in Dendrobium. These techniques provide more effective and reliable methods for discrimination of true and false Dendrobium. Finally, it summarizes the importance of those techniques in identification and evaluation of Chinese herbs. Tab 1, Ref 36 Keywords Dendrobium; DNA molecular marker; identification; Chinese herb CLC Q : Q7 石斛属 (Dendrobium) 为兰科最大属之一, 属附生兰类, 多年生草本植物. 全球共有 种左右 ; 我国现共有 76 种, 主产区分布于四川 云南 广西和贵州等地的原始森林以及安徽 浙江等省. 石斛以新鲜或干燥茎入药, 中国药典 现将其功能与主治述载为 : 益胃生津 滋阴清热, 用于阴伤津亏 口干烦渴 食少干呕 病后虚热 目暗不明. 中国药典 2005 年版收载的石斛来源有 : 金钗石斛 (D. nobile Lindl) 铁皮 石斛 (D. officinale Kimura et Migo) 马鞭石斛 (D. firmbriatum Hook var. oculatum Hook) 及其近似种. 但目前市场上药用 的石斛除了来自石斛属植物, 还有来自石仙桃属 (Pholidota Lindl.ex Hook) 金石斛属 (Flickingeria Hawkes) 石豆兰属 (Bulbophyllum Thou) 的植物也在被当做石斛使用. 即使是同 收稿日期 : 接受日期 : 国家科技支撑计划 (No. 2006BAI06A11-10) 四川省科技支撑计划 (No. 07FG ) 省 十一五 育种攻关项目 (No. 2006YZGG-12) 和省公益性研究计划 (No. 2008NG0007) 资助 Supported by the National Key Science and Technology R & D Program of China (No. 2006BAI06A11-10), the Provincial Key Science and Technology R & D Program of Sichuan,China (No. 07FG ), the Key Project of Public Welfare Research (No. 2008NG0007) and the Breeding Project of 11 th Five-year Plan of Sichuan, China (No. 2006YZGG-12) ** 通讯作者 Corresponding author ( chunze@cib.ac.cn) 一种石斛也有道地性的区别, 市场上一些不是道地产区的石斛也混入道地石斛一同外销, 造成了石斛基源不清. 这些茎加工成药材后, 外形相似, 要准确地区分他们, 仅有形态鉴定是不够的. 人们期望有更新的技术和手段对这些不同属 同属不同种或同种不同产地的石斛属植物进行有效的区分和鉴定. 随着分子生物学技术的发展, 现在可以根据遗传物质 DNA 在不同生物个体之间的差异来鉴别生物物种. 在石斛的 鉴别中人们也在尝试采用分子生物学的方法, 其中常用的有 DNA 分子标记技术. 分子标记技术是以 DNA 多态性为基础, 主要检测 DNA 分子由于缺失 插入 易位 倒位 重排或存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性的一种技术, 具有快速准确, 多态性高以及不受组织类别 材料多少 发育时期和环境条件的限制等诸多优点, 是目前种质资源鉴定的重要手段之一. 1 DNA 分子标记技术在石斛研究中的应用 目前发展和应用的分子标记技术有很多种, 以下对在石斛属植物中常用的几种分子标记方法加以介绍, 并对其在石

2 856 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 14 卷 斛中的应用研究进展作一综述. 1.1 RFLP 标记 RFLP (Restraction fragment length polymorphism) 标记 即限制性内切酶切片段长度多态性标记, 由 Botstein 首先提出, 是最早发展的分子标记技术. RFLP 标记是以生物基因组 DNA 序列变异为基础研究不同基因间差异的一项新技术. 其 基本原理是生物由于长期进化的结果, 在种属间甚至品种间同源 DNA 序列上限制性内切酶识别位点不同, 经限制性内切酶切割成不同长度的限制性片段, 使其在凝胶上运动速率不同, 用 DNA 探针进行 Southern 杂交, 放射自显影后即得 DNA 限制性片段的多态性 (RFLP). RFLP 标记的特点是具有极大的丰富性 共显性 无上位性 稳定性 分析简单 酶切位点特异性和多态性变异低, 适于新鲜动植物药材的研究. 张婷等 [1] 采用聚合酶链式反应限制性片段长度多肽性 (PCR-RFLP) 方法获得 ITS 片段的限制性图谱. 束花石斛 (D. chrysanthum Wall. ex Lindl) 及其形态相似种的 PCR 扩增产物 用 Cla1 和 ApaL1 酶切, 流苏石斛 (D. fimbriatum Hook) 及其形态相似种的 PCR 扩增产物用 Sph1 酶切. 结果表明, 根据预测的 PCR-RLFP 图谱, 可以鉴别药用植物束花石斛 流苏石斛以 及它们的形态相似种. 采用这种方法鉴定了市场上收集的 25 件商品束花石斛 流苏石斛新鲜药材的原植物. 研究表明, rdna ITS 的 PCR-RFLP 可用于鉴定石斛药材的原植物, 具有 简便 费用低的优点. 序列分析结果证明 ITS 区序列信息位点丰富. 1.2 位点特异性 PCR PCR (Polymerase chain reaction) 技术是 20 世纪 80 年代中 期发明的一种无细胞分子克隆技术. 提取 DNA 后, 用鉴别引物对样品的 DNA 进行一次 PCR 反应, 经电泳检测便可达到准确鉴别样品真伪的目的. PCR 过程经过变性复性延伸约 30 个循环, 能在 2 h 内将衡量的靶 DNA 扩增数百万倍. PCR 成本低, 检测时不需要正品作对照, 鉴定准确性高, 重复性好, 对操作要求不十分严格, 具有较大的实用价值. PCR 技术问世为现代生物技术领域开创了一个新时代, 该技术已成为药材鉴定的一种崭新而有力的工具, 对属性特异的 DNA 序列扩增和直接测序以用于系统发育或亲缘关系的分析, 使 DNA 分子标记鉴别技术的推广应用与药材鉴别成为可能. 罗玉明等 [2] 根据细叶石斛 (D. hancockii Rolfe) 及其它 37 种枫斗类和黄草类石斛的 rdna ITS 序列, 设计了位点特异性 PCR 鉴别引物 XY-JB01S 和 XY-JB01X, 对细叶石斛进行了成功 的 DNA 分子鉴别, 在进行位点特异性鉴别 PCR 之前, 首先运用扩增 ITS 区的通用引物 P1 P2 对模板 DNA 进行扩增, 以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度, 当退火温度升为 64, 只有细叶石斛的模板 DNA 能被扩增出来, 而其它的 37 种石斛属植物均为阴性. 该方法已在细叶石斛的鉴别中发挥重要的作用. 刘石泉等 [3] 利用石斛属植物基因库中 rdna ITS 序列数据库进行同源性比较, 在与霍山石斛 (D. huoshanense C.Z. Tang et S.J. Cheng) 差异较大的区段设计 1 对特异性引物, 然后对 19 份石斛属植物模板 DNA 进行 PCR 扩增, 阳性者即为霍山石斛正品. 结果发现, 在退火温度为 60 时, 该引物能把霍山石 斛的模板从 19 份石斛属植物中扩增出来, 而其他的石斛属植物均为阴性. 运用位点特异性鉴别引物成功地对霍山石斛进行 PCR 鉴别, 该方法能在霍山石斛的鉴别中发挥重要的作用. [4] 应依等根据测定及 GenBank 上登录的 109 种共计 164 个石斛样本的 rdna ITS 序列, 设计了特异性鉴别引物 QH-JBI 和 QH-JB2, 并对球花石斛 (D. thysiflorum Rchb. f) 进行了位点特 异性 PCR 鉴别研究. 结果显示, 当复性条件为 min 时, 只有球花石斛的模板 DNA 能被扩增出约 300 bp 的阳性扩增带, 而其他种石斛均为阴性. 同时无论从新鲜还是干燥的球花石斛模板 DNA 中都能扩增出 300 bp 左右的 DNA 片段, 说明该鉴别条件对球花石斛有较高的灵敏性, 可用于新鲜或干燥球花石斛药材的鉴别. [5] 丁小余等根据齿瓣石斛 (D. devonianum Paxt) 及其它枫斗类石斛的 rdna ITS 序列数据库, 设计了齿瓣石斛的位点特异性 PCR 鉴别引物 JB-Chiban-01 和 JB-Chiban-01X. 然后, 对 38 种石斛属植物模板进行了 PCR 扩增, 阳性即为齿瓣石斛正品. 结果在退火温度为 58 时, 只有齿瓣石斛为强烈阳性扩增, 而其他的枫斗类石斛均为阴性. 该方法在齿瓣石斛的鉴别中发挥了重要的作用. [6] 丁小余等还根据兜唇石斛 [D. aphyllum (Roxb.) C.E. Fischer] 及其它 37 种枫斗类和黄草类石斛的 rdna ITS 序列, 设计了鉴别兜唇石斛的位点特异性 PCR 引物 DC-JB01S 和 DC- JBO1X, 并对兜唇石斛成功地进行了位点特异性 PCR 鉴别之 前, 首先运用扩增 ITS 区的通用引物 P1 P2 对模板 DNA 进行扩增, 以验证模板 DNA 的可靠性和扩增的合适浓度, 当退火温度上升为 64, 只有兜唇石斛的模板 DNA 能被扩增出来, 而其它的 37 种石斛属植物均为阴性, 该方法已在我国兜唇石斛的鉴别中发挥重要作用. 另外, 丁小余等 [7] 根据细叶石斛及其它 37 种枫斗类石斛和黄草类石斛的 rdna ITS 序列, 设计了位点特异性 PCR 引物 XY-JBO1S 和 XY-JBO1X, 对细叶石斛进行了成功的 DNA 分子 鉴别. 丁鸽等 [8] 利用叶绿体基因 matk rbcl 核糖体基因 ITS, 以及线粒体基因 nad1 intron2 的序列差异来调查石斛属的 8 个种. 在不同种间, 叶绿体基因 matk rbcl 和线粒体基因 nad1 intron2 没有发现差异, 除了在 ITS 区有 9 个单核苷酸突变位点. 根据这些单核苷酸突变位点设计了 2 对引物来进行位点特异性 PCR 以鉴别 2 个种 (GSG 和 FSC). 分别扩增出了 600 bp 和 560 bp 长度的片段, 退火温度分别为 55~57 和 58~60. 这两种 石斛制成的干的 枫斗 样品也可以用 2 对特异的引物进行鉴别. 这表明, 建立 ITS 序列位点差异和位点特异性 PCR 在 GAP 认证和石斛质量控制过程中简单 实用而有效. 丁小余等 [9] 根据药用石斛和其他 37 种石斛兰的 rdna ITS 序列, 设计了一对位点特异性引物 TP- JB01S 和 TP-JB01X 来鉴定出药用石斛. 在进行位点特异性 PCR 之前, 引物 P1 和 P2 先扩增整个 ITS 区域, 用于验证模板 DNA, 并获得合适的模板 DNA 进行位点特异性 PCR 反应. 当退火温度提高到 66 时, 只有药用石斛的模板 DNA 可扩增, 而其他石斛种均为阴性. 该实验可重复多次, 对鉴定药用石斛发挥了重要的作用. 与 DNA 测序相比, 位点特异性 PCR 不仅简单省时, 而且切实有

3 6 期刘静等 : 分子标记技术在石斛属植物中的应用研究进展 857 效. 1.3 RAPD 技术 RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) 即随机扩 增多态性 DNA, 是 1990 年由 J.G.K Williams 等发明的一种遗传标记. 该技术利用随机合成的一般为 10 个碱基的寡核苷酸序列为引物, 分别与 DNA 的两条单链结合, 在 DNA 聚合酶作用下, 对基因组的特定区域进行 PCR 扩增. 由于引物结合的生物总 DNA 序列上发生了单个碱基点突变 缺失 重复 易位 插入等, 从而改变了扩增片段的大小或无法扩增. 扩增产物通过琼脂糖电泳并经溴化乙锭染色, 即可在紫外光下检测 DNA 多态性片段. RAPD 技术的特点为显性遗传, 具有广泛性和通用性, 简便易行, 分析速度快, 可实现自动化. DNA 样品量少, 只需 10 ng 即可完成一次分析. RAPD 作为有用的分子标记可用来检测总 DNA 的多态性 进行种源鉴定和系统学研究. [10] 包英华等采用 RAPD 分子标记技术对不同产地美花石斛 (D. loddigesii Rolfe) 基因组总 DNA 进行 PCR 扩增, 根据其扩增产物分子量大小进行编码计算. 结果从 117 种随机引物中筛选出 8 种有效引物,S2108 的 PCR 扩增产物中的特异位点能够鉴别出广西玉林居群和贵州安龙居群. 该实验说明, 利用 RAPD 分子标记技术鉴别美花石斛种质资源是可行的, 任羽等 [11] 利用 RAPD 技术对 10 种石斛种质资源的遗传多样性及亲缘关系进行了分析, 从 100 条 10 bp 的 RAPD 引物中筛选获得 17 条多态性条带. 材料间遗传相似性系数变化范围为 0.356~ 根据 RAPD 标记的结果, 供试石斛属植物基因组 DNA 扩增谱带具有很高的多态性, 采用 UPGMA 法进行聚类 分析, 将石斛属的 10 个种区分开来, 在相似系数 0.48 处可将参试种分为 4 类. 结果表明,RAPD 标记技术能较好地从分子水平上揭示石斛种质资源的遗传背景和亲缘关系. 彭锐等 [12] 利用随机扩增多态性 DNA(RAPD) 技术分析了 15 种石斛属药用植物, 选用 10 个有效引物 (10 bp) 扩增出 99 条 DNA 片段, 用于遗传多样性分析, 构建 UPGMA 聚类图. 分析 结果表明,RAPD 方法能有效鉴别所试石斛属植物, 其多态位点百分率为 84.85%, 表现出丰富的遗传多样性. 丁鸽等 [13] 采用 RAPD 分子标记技术, 对铁皮石斛 8 个野生居群的遗传多样性 亲缘关系及分子鉴别等进行研究. 利用筛选出的 10 个引物对 8 个铁皮石斛野生居群所进行的 RAPD 研究结果显示, 各居群的多态性位点比率为 91.35%, 略高于石斛属种间的多态性比率, 远高于其他濒危植物, 说明铁皮石斛具有较为丰富的遗传多样性, 居群间基因交流少, 造成较大的遗传分化. 由本实验可得, 铁皮石斛居群间遗传差异明显, 具有较丰富的遗传多样性 ;RAPD 可以作为铁皮石斛野生居群遗传多样性 居群亲缘关系和分子鉴别研究的有效手段 ; 引物 S412 可以有效地鉴别铁皮石斛的 8 个野生居群. 刘石泉等 [14] 利用从 20 个随机引物筛选出来的 3 个稳定性较好的 10 个碱基引物对来自 5 个不同荚果的霍山石斛种群进行 RAPD 检测. 结果显示,5 个荚果内遗传相似系数大, 在 %~100.00% 之间, 其中 H1 H9 H10 H14 存在一定程 度的变异,H23 是一个较为稳定的群体 ;5 个荚果间 H1 H9 H10 H23 的遗传距离小,H14 与其他 4 个荚果的遗传距离则 较大. 可见, 建立霍山石斛稳定的无性快繁体系是切实可行的, 同时说明霍山石斛种内存在一定的变异,H14 与其他荚果的差异最大. 刘石泉等 [ 1 5 ] 利用从 2 0 个随机引物筛选的 3 个稳定性较好的 10 碱基引物对已继代 7 ~ 8 次的 H 2 3 种群进行 R APD 检测. 结果发现不同阶段内遗传相似系数较大, 在 %~ % 之间, 其中在原球茎, 萌芽期和一叶期存 在的变异比两叶期 开花期要显著, 但程度都极其微弱. 这些结果表明, 来自同一蒴果的变异非常小, 建立霍山石斛稳定的无性快繁体系是切实可行的. 王慧中等 [16] 利用筛选的随机引物 UPGMA 类平均法对扩增出的谱带进行聚类分析, 共得到 188 条带, 其中多态性带有 180 条, 多态百分率 95.74%. 采用 UPGMA 类平均法对扩增出的 谱带进行遗传聚类分析, 得出反映各种亲缘关系的树状图. 在遗传距离 (D)=0.63 处, 可将供试材料分为 3 类,RAPD 对基因组的分析结果与传统分类学的结果差异不大. 该标记技术对石斛属植物遗传多样性和分类研究是可行的. [17] 肖鲲等分别设置模板 DNA Mg 2+ TaqDNA 聚合酶, dntps 引物的浓度梯度 优化 RAPD 反应体系, 结果表明, 在 25 μl 总反应体系中, 以上反应物的用量分别为 100 ng 3.0 nmol/l 1.0 U 0.2 mmol/l 0.4 mmol/l, 所获得的石斛属 DNA 指纹图谱谱带清晰, 重复性好. 其中用 S48 扩增的 DNA 指 纹图谱具有更大的相似性, 适合于石斛真伪鉴别 ; 而 S90 扩增的片段具有明显的多态性, 适合于石斛遗传分化研究. 由该实验可得, 优化后的 RAPD 可作为研究石斛属植物的遗传多样性真伪鉴别的有效方法. [18] 丁鸽等对影响铁皮石斛 RAPD 反应的模板质量 Mg 2+ 浓度 dntp 浓度 Taq 酶浓度 扩增程序及退火温度等多种因子进行了构建和优化, 通过各因子的组合研究, 得到铁皮石斛 RAPD 反应最适扩增体系 :25 μl PCR 反应体积,10 Buffer 2.5 μl,2.5 mmol/l MgCl 2+ dntp 2.5 μl ( 各 2.5 mmol/l). 模 板 DNA 为 30 ng,taq 聚合酶 1.5 U, 随机引物 12 pmol,ddh 2 O 14.2 μl, 最佳扩增程序 94 预变性 3 min,94 50 s,38 复性 1 min,72 延伸 2 min, 循环 40 次, 最后 72 延伸 5 min, 4 保存. 张建勇等 [19] 应用随机扩增多态性 DNA (RAPD) 技术, 对石斛属植物 16 个种进行了基因组 DNA 多态性分析. 从 82 个随机引物筛选出 20 个多态性好的引物进行 RAPD 扩增, 扩增 DNA 片段数据用 UPGMA 聚类法构建系统发育树. 20 条引物 共扩增出 142 条带, 多态性带 118 条, 约占总数的 83.1%. 聚类结果显示 RAPD 分子标记构建的系统发育树与经典分类系统一致. RAPD 标记可为石斛属植物的系统分类研究提供分子生物学依据. 1.4 AP-PCR 技术 AP-PCR (Oligo primer-pcr) 即随机引物 PCR 和 RAPD 标 记, 两者本质上是相同的, 即通过随机扩增多态性 DNA 的比较, 区分不同基源的药材. AP-PCR 标记由 Welsh 和 McClelland (1990) 提出, 是以任意的寡核苷酸引物 (20 或 34 个核苷酸长 ) 对 基因组 DNA 进行 PCR 扩增, 扩增产物 (3~20 个 ) 表现高度的变异性, 所扩增的序列是未知的. AP-PCR 标记的技术原理和特

4 858 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 14 卷 点与 RAPD 类似, 差别主要在于扩增的每个部分要求的条件和组分浓度不同. 其中, 第一个 PCR 循环中, 引物浓度高, 引物长度不定, 常来自为其它目的而设计的引物, 如 M13 通用测序引物. AP-PCR 标记的前二个循环反应严谨条件较 RAPD 低, 电泳用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 金国虔等 [20] 利用 AP-PCR 方法对 4 种霍山来源的石斛属植物基因组 DNA 进行了多态性分析, 从 75 种随机引物筛选出 10 种扩增条带清晰 稳定的随机引物, 通过 PCR 扩增共获得 250 条 DNA 片段, 其中呈多态性的片段数为 165 条, 占扩增条 带数的 66%, 表明霍山来源的石斛属植物具有较高的遗传多态性. 结果表明,4 种霍山来源的石斛品种具有较近的亲缘关系, 它们之间的平均遗传相似系数分别为 0.63, 其中铁皮石斛和铜皮石斛的亲缘关系最近, 二者的遗传相似系数为 它们与串珠石斛 (D. falconeri Hook) 的遗传相似系数分别为 0.60 和 0.61, 与霍山石斛的遗传相似系数分别为 0.63 和 0.58; 相对于形态接近的铜皮石斛, 铁皮石斛与霍山石斛的亲缘关系更近. 1.5 AFLP 技术 AFLP (Amplified fragment lenghth polymorphism) 即扩 增的限制性内切酶片段长度多态性, 由 Zabeau 和 Vos (1993) 发展. 该技术是一种选择性扩增限制性片段的方法, 结合了 RFLP 和 PCR 的优点, 比 RAPD 具有更大的优越性. 其基本原 理为基因组 DNA 先用限制性内切酶酶切, 酶切后的限制性片段两端在 T4 连接酶作用下与特定的接头连接, 形成一个带接头的特异片段, 通过接头序列和相邻的限制性位点序列, 作为引物结合位点, 进行 PCR 扩增. 引物的设计根据接头的设计决定, 均起始于 5G 残基. AFLP 具有多态性强 稳定性 重复性高等特点. AFLP 适用于所有不同大小的基因组, 也可分离克隆的 DNA 大片段. [21] 虞泓等采用扩增片段长度多态性 (AFLP) 技术对石斛内 4 个种和 1 个外类群种进行基因组 DNA 多态性分析. 结果从 64 对引物组合中选出 5 对引物组合构建了 5 个种的 DNA 图谱. 通过聚类分析, 石斛属 4 种植物聚成一个大类, 彼此关系得到了很好的分辨, 并获得了 bootstrap 检验的有力支持. 该实验充分说明 AFLP 技术可用于药用石斛 DNA 指纹图谱研究. 1.6 ISSR 技术 ISSR (Inter-simple sequence repeats) 技术即简单重复中间 区域技术, 是 1994 年由加拿大蒙特利尔大学 Zietkiewicz 等发展起来的一种基于微卫星 (SSR) 序列的分子标记技术. 与 SSR 相比, 用于 ISSR 的引物不需要预先的 DNA 测序, 而是用半随机引物进行扩增, 可获得丰富多态性 [22]. ISSR 标记的特点是 : 数量丰富, 广泛分布于整个基因组 ; 具有较多的等位性变异 ; 共显性标记, 可鉴别出杂合子和纯合子 ; 实验重复性好, 结果可靠. 沈洁等 [23] 通过筛选引物并设定影响铁皮石斛 ISSR 反应的诸因子的不同浓度, 检测 ISSR 不同反应体系的扩增效果 ; 通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化, 建立起铁皮石斛 ISSR 稳定可靠的反应体系. 利用此优化系统, 对铁皮石斛的 10 个居群进行了扩增, 得到了背景清晰 多态性稳定丰富的 DNA 扩增片段. 表明 ISSR 技术可以较好地应用于 铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态的研究. 沈颖等 [24] 选取 10 条由 SSR 组成的引物, 对 9 种石斛进行 PCR 扩增及琼脂糖电泳分析. 结果显示,10 条引物中有 7 条扩 增出多态性条带, 每条引物可检测的多态性位点最少 7 个, 最多 14 个, 扩增片段大小为 220~1 260 bp, 其中, 引物 UBC807 和 UBC864 具有较高的多态性条带比率, 均可以独立将所有被 测种区分开来. ISSR-PCR 作为一种简便 可靠的分子标记鉴定技术, 可以作为石斛属种间鉴别的方法之一. 沈洁等 [25] 从 76 条引物筛选了 10 条引物进行 ISSR 扩增来鉴别 8 种石斛药品. 总共扩增出了 127 条条带, 其中 115 条多态性条带 ( 占总条带的 90.5%). 找到了 16 个特异的鉴定标记. 为了增加鉴定的有效性,ISSR 指纹标记建立了 6 个多态性条带用于鉴定石斛中成药, 准确地鉴别出 8 个野生种的石斛药品. 1.7 SRAP 标记 SRAP (Sequence-related amplified polymorphism) 即序 列相关扩增多态性, 又称为 SBAP (Sequence-based amplified polymorphism, 基于序列扩增多态性 ), 在 2001 年由美国加州 大学蔬菜作物系 Li 和 Quiros 博士提出. SRAP 标记是一种新型的基于 PCR 的标记系统. 通过独特的引物设计对 ORFs (Open readings frames) 进行扩增 [26]. SRAP 标记的引物设计和实验 操作过程简单, 扩增谱带清晰, 结果稳定, 是一种吸收了 RFLP RAPD SSR 和 AFLP 标记的优点而又克服了它们一些 缺点的一种新型 DNA 分子标记 [27]. 樊洪泓等 [28] 研究了以霍山石斛总 DNA 为模板, 对石斛 SRAP 反应体系的重要参数进行优化试验. 经过大量重复试 验, 建立了一套适用于石斛属植物稳定可靠 重复性强的 SRAP 反应体系 :25 μl 的反应体系中, 模板 DNA 量 30 ng 2.5 mmol/l 浓度 0.8 μmol/l 的上下游引物 200 μmol/l 的 dntps 以及 Taq 酶 1 U. 该体系的建立为 SRAP 标记应用于石斛属植物的遗传多样性研究及原植物鉴别奠定了基础. 1.8 DNA 序列分析 DNA 序列分析是分子鉴定中必不可少的研究工具. 动 植物在进化过程中, 其基因会发生碱基的重排 替代等, 从而导致基因序列的差异. 通过检测其 DNA 片段序列, 对 DNA 结构有更详尽的认识, 并可进一步对氨基酸序列作出推测及突变的分析, 即可将不同的种区别开来. DNA 测序方法有多种, 例如 : 化学双脱氧法 PCR 直接测序法 自动荧光序列测定 燃料末端法和引物测序法等. 目前应用广泛的有两种, 一是 Maxam 和 Gilbert 用化学试剂产生特定的 DNA 片段, 这些片段用放射性标志物经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示, 从形成的片段长度来推断原来的 DNA 序列. 第二种测序方法是 1977 年 Sanger 发展的基于酶学 (Davis, et al., 1986; Sambrook, et al., 1989; Ausubel, et al., 1990) 的链终止法. DNA 测序, 准确性高, 重复性好, 但是实验操作复杂, 成本高, 对工作人员的素质和仪器设备的要求都比较高. 利用已知基因结构 序列, 可以为 PCR 引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件, 而基于 PCR 的 DNA 直接测序技术, 极大提高了 DNA 序列分析的效率. 目前用在石斛属植物 DNA 测序中的基因主要有叶绿体基因组 matk 与核基因组的 rdna ITS 等. matk 基因是一种叶绿

5 6 期刘静等 : 分子标记技术在石斛属植物中的应用研究进展 859 体基因, 编码成熟酶 K, 常用于植物的系统学研究. 近年来此基因研究较多, 进化速率在 ITS 与 2bcL 之间, 一般用于科间遗传关系的研究, 近期研究表明该基因也适合于科以下属间或种间遗传关系的研究. rdna ITS 序列是高度重复的串联序列单位, 具位点内或位点间的协同进化. 近年来用于探讨植物种内变异和种间 近缘属间分子系统关系的重要分子标记之一, 序列分析证明,ITS 信息位点丰富, 有一定程度的变异, 在不同植物类群中的应用价值不同. 被子植物的 ITS 区长度较为稳定, 总长度约为 600~700 bp, 易于测序. [29] 滕艳芬等比较几种药典收载石斛与常见市场混淆品种的 matk 基因序列, 结果发现, 非石斛属的几种混淆品与正品石斛间的 matk 基因序列差异远大于正品石斛间的差异, PAUP4.0 构建的树型图亦显示几种石斛属植物聚在一起, 而 非石斛属植物聚在外方. 可见, 通过 matk 基因序列可以分析石斛及其混淆品间的遗传关系, 将正品与混淆品区别开来. 在 ITS 序列分析方面, 已经有对多种石斛及其混淆品的 rdna 的 ITS 序列进行序列测序并将其用于石斛类药材的鉴 定的报道. 丁小余等 [30] 对枫斗类石斛的 rdna ITS 区进行序列 PCR 扩增 测序, 运用 CLUSTRAL MEGA 等软件以及枫斗类石斛 rdna ITS 区全序列数据库对待检种 rdna ITS 区进行序列分析鉴别. 结果显示, 建立了 21 种枫斗类石斛的 rdna ITS 区全序列数据库, 枫斗类石斛在该区的种间差异显著而 稳定, 转换和颠换总数为 131~161. 枫斗类石斛居群间差异较小, 转换和颠换总数为 0~6. 研究表明, 利用枫斗类石斛的全序列数据库及遗传分析软件, 通过对待检种 rdna ITS 区进行序列测定, 可以成功鉴别属于数据库中枫斗类石斛待检种. 迄今为止, 除其对黄草类石斛进行过序列分析外, 对枫斗类石斛的 rdna ITS 区的序列分析研究仅限于曲茎石斛及其相似种, 绝大部分枫斗类石斛的 rdna ITS 区序列尚未见报道. 利用 rdna ITS 区作为分子标记, 优点在于 :1), 克服了克隆测序 ;2), 长度为 600~700 bp, 方便测序. 利用此方法, 他们完成了齿瓣石斛 兜唇石斛 铁皮石斛 钩状石斛 (D. aduncum Wall. ex Lindl) 等多种鲜品的鉴定, 并申请了专利. rdna ITS 区在核基因组中是高度重复的, 而且通过不等交 换和基因转换, 这些重复单位间已发生了位点内或位点间的同步进化, 即不同 ITS 拷贝间的序列趋于相近或完全一致, 这就为对 PCR 扩增产物直接测序奠定了理论基础. DNA 测序工作的难易程度及成本与 DNA 片段长度有密切关系. 被子植物的 ITS 区长度比较稳定, 包括 5.8S rdna 在内, 总长度只有 600~700 bp. 丁小余等 [31] 在铁皮石斛各居群中,F 型居群与 H 型居群植物的 rdna ITS 区碱基序列有 2 个位点差异, 且变异分别发生在 ITS1 区及 5.8S 区内, 研究表明, 铁皮石斛居群内 r DNA ITS 区的差异与植物生活型的差异呈一定相关性. H 型居群的 铁皮石斛是 F 型的变种, 在 F 型和 H 型居群间, 其 5.8SrDNA 区存在单核苷酸多态 (SNP) 现象. 首次报道了铁皮石斛 ITS 区的碱基序列,ITS 区总长度为 634 bp, 其中 ITS1 为 231 bp,5.8s 为 163 bp,its2 为 240 bp. 从 rdna ITS 区碱基序列的比较分析进 一步证明, 铁皮石斛 F 型居群与 H 型居群间具有显著的差异性. 极少数个体在保守区域存在单核苷酸位点的变异, 称为单核苷酸多态 (SNP), 出现 SNP 现象的同种生物的个体间往往存在着显著的遗传变异, 并且这种变异常伴随着某种特征或疾病的出现. [32] 此外, 徐红等用一对引物进行 PCR 扩增, 扩增产物纯化后用双脱氧连终止法测序. 结果显示, 获得了核糖体 DNA 中 ITS 和 5.8S rdna 完整序列,14 个石斛类群的 ITS1 与 ITS2 序列的长度分别为 228~233 bp 和 242~247 bp. 石斛种间 ITS 序列的差异百分率为 11.79%~31.58%,ITS2 序列差异百分率为 10.29%~25.30%, 金钗石斛内 ITS 序列的差异百分率为 0.87%, ITS2 序列无差异. 由该实验可以看出,ITS1 ITS2 两段序列 在石斛种内保守, 在种间有较大差异, 与外类种群的差异最大, 可作为中药黄草石斛分子鉴定的标记, 而石斛属的系统发生关系尚需进一步研究. 石斛属 ITS1 序列种间信息位点比例为 41.01%,ITS2 为 34.42%. 该文还测出了 7 组 14 个种的变异位点数. [33] 张婷等扩增并测定了 9 种石斛属植物线粒体中 NADH 脱氢酶亚基 1 编码基因 (nad1) 内含子 2 (intron2) 的全场序列. 比对后的 nad1 intron 2 序列全长 872 bp, 其中有 17 个变异位点, 可以鉴别除粉花石斛 (D. loddihesii) 以外的 8 种植物, 可见, 线粒体 nad1 intron 2 序列可以作为一种新的分子标记用于石斛属植物的鉴定. [34] 徐红等通过分析 ITS 序列成功鉴别了 18 种被称为 黄草 的石斛. 该实验研究得出, 不同种间 ITS1 序列差异为 3.2%~37.9% ~37.9%,ITS2 的序列差异为 5.0%~26.6%. 然而, 这些差 异在种内非常低,ITS1 序列差异变化范围为 0~3.0%,ITS2 为 0~4.0%. 因此, 在 DNA 水平可以成功地鉴定这些种类. 而且, 他们根据 ITS 序列, 设计了 5 对特异引物用于 RAPD, 在石斛生药学中成功地鉴别了 5 种石斛. C. C. Tsai 等 [35] 根据分析 ITS 的序列差异确定了 12 种台湾 石斛的遗传关系, 完整地分析了 12 种石斛及 2 种非石斛属植物的 ITS 序列, 发现了 684 个特征. 建立了其遗传距离和一个系统发育树, 分为 4 组, 矩唇石斛 细茎石斛 黄花石斛 细茎石斛 ( 台湾 ) 串珠石斛与叠鞘石斛归为一组, 长距石斛与红花石斛为一组, 木石斛与燕石斛为一组, 双花石斛和小双花石斛单独归为一组, 近期的研究结果也认为这两个种不属于石斛属. 因此, 将双花石斛和小双花石斛列于石斛属植物之外更好. 1.9 基因芯片技术 DNA 芯片技术的出现为高通量中药鉴定提供了良好的 发展前景, 使中药材分子标记鉴定更加简捷. DNA 芯片技术已广泛应用于 DNA 测序 (Sequencing by hybridization equencing by hybridization,sbh) 单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphisms ingle nucleotide polymorphisms,snps) 分析 基因表达分析 基因诊断 药物筛选 物种鉴定等各个方面. 利用生物芯片技术可快速筛选高质量药材, 并建立生药质量标准, 筛选有效成分组成相近的稀有或濒危物种替代者开发新药资源, 稳定药材和药品生产质量标准, 阐明药效基础. SSH-array gdna 阵列技术主要技术流程 :1) 大量的种特异性探针筛选 ;2) 种质特异性探针制备 gdna 芯片 ;3)

6 860 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 14 卷 分子标记方法 Moleculer marker method 表 1 常用分子标记方法的技术要点 Table 1 The essentials of the common molecular marker methods 多态性程度 Polymorphism extent 种间 Interspecies 种内 Intraspecies 重现性 Recurrence 特异性 Particularity DNA 质量 DNA quality RFLP RAPD AFLP ISSR AP-PCR SRAP Allele-specific Diagnostic PCR DNA sequence analysis : 表示最高程度 ; + : 表示最低程度 ++++ indicates the maximal extent, and + the minimum extent 成本 Cost 待鉴样品 DNA 的提取 扩增及标记 ;4) 检测样品 DNA 与芯片杂交. 该技术具有操作方便 探针载体可靠等的特点, 可应用于中药物种的有效鉴定, 中药材种间 真伪鉴别系统基因库标准基因图谱建立, 道地药材的鉴别, 以及复方制剂中单位药材的检出等. 但有限的种特异性探针数量及鉴定的准确性也会成为应用基于探针的 DNA 芯片技术进行高通量中药鉴定的瓶颈. 李同祥等 [36] 介绍了筛选 gdna 种特异性探针的抑制性差减微阵列 SSH-array 新技术, 对 5 个石斛品种作为实验材料, 首先用抑制性差减杂交获得 2 个品种之间的 gdna 差异片段, 然后用这些 gdna 差异片段与由所有研究品种的 gdna 制备成的微阵列杂交筛选到某一个品种的种特异性 gdna 片段, 然后用这些 gdna 片段与由所有研究品种探针进行物种鉴定. 2 展望和结语综上所述, 在石斛属植物研究中常用的这几种分子标记技术, 各有其特点, 在种间 种内显示出的多态性程度并不完全一致, 重现性 特异性 DNA 质量以及成本也不尽相同, 现将其特点总结于表 1. 分子标记技术在中药材品种鉴别中的应用是中药现代化研究的一个重要方面, 具有快速 微量 特异性强的特点, 避免了贵重药品的损耗. 不受发育阶段 供试部位 环境条件的影响, 有助于解决中药鉴定中的一些难题, 提高中药鉴定水平. 传统的鉴定方法主要是基于形态学 解剖学和化学成分分析, 这些方法易受到环境及发育条件的影响, 具有很大主观性, 难以鉴别易混品种, 道地和非道地药材, 野生和栽培品种. 将传统的鉴定方法与 DNA 分子标记方法相结合, 通过单核苷酸多态性分析来诊断中药不同品种间的内在本质和外在表现差异, 从而为石斛药材鉴定提供更新更准确的鉴定方法. 就目前在石斛药材鉴定中, 应用最多的是 rdna 的 ITS 序列,RAPD RFLP ISSR AFLP SSR 等分子标记方法 都可用于石斛种间鉴定. 我国幅员辽阔, 地形复杂, 且跨寒 温 热三带, 药材品种极为丰富, 但由于缺乏系统的整理和归类, 致使中药材同名异物 同物异名的现象屡有发生, 中药品市场混乱, 有以 假充真 以次充好的现象. 随着 回归自然 这一世界潮流的兴起, 中药材的需求量日益增加, 但资源相对缺乏. 中药材的真伪优劣直接影响到临床有效性和人民生命安全. 要解决这些问题, 关键是要有一套简便快速 准确有效地鉴别中药材正品的技术与方法, 以杜绝假冒伪劣及混淆品的干扰, 找出形成质量好 产量高的道地药材机制, 明确其生长条件, 以培育出更多更优质的中药原材料. 对于珍稀濒危的动植物, 则需要大力保护, 积极寻找替代品, 或根据其习性进行人工栽培和繁殖. 这些问题的实施, 都需要高新技术的支持和应用, 可以将 DNA 分子标记技术在中药材鉴定方面的应用作为突破口, 灵活地解决上述关键问题, 鉴别中药材真伪优劣, 保障用药安全有效, 对中药质量评价, 对整个中医药的研究都将起到极大的推动作用, 以提高中医药的国际化 现代化和科学化进程. References 1 Zhang T ( 张婷 ), Xu LS ( 徐珞珊 ), Wang ZT ( 王峥涛 ), Zhou KY ( 周开亚 ), Zhang N ( 张宁 ), Shi YF ( 史永峰 ). Molecular identification of medicinal plants: Dendrobium chrysanthum, Dendrobium fimbriatum and their morphologically allied species by PCR-RFLP analyses. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2005, 40 (8): 728~733 2 Luo YM ( 罗玉明 ), Ding XY ( 丁小余 ), Xu LS ( 徐珞珊 ), Bao SL ( 保曙 琳 ), Chang J ( 常俊 ). Allele-specific diagnostic PCR authentication of D. hancockii from the other Dendrobium species. J Huaiyin Teachers Coll Nat Sci Ed ( 淮阴师范学院学报自然科学版 ), 2002, 1 (1): 82~85 3 Liu SQ ( 刘石泉 ), Li XJ ( 李小军 ), Yu QB ( 余庆波 ), Zhou GY ( 周根 余 ). Allele-specific diagnostic PCR authentication of Dendrobium huoshanense and its allied species of Dendrobium Sw. Chin Trad & Herbal Drugs ( 中草药 ), 2006, 37 (1): 111~114 4 Ying Y ( 应依 ), Xu H ( 徐红 ), Wang Z ( 王峥涛 ). Allele-specific diagnostic PCR authentication of Dendrobium thyrsiflorum. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2007, 42 (1): 98~103 5 Ding XY ( 丁小余 ), Xu LS ( 徐珞珊 ), Wang Z ( 王峥涛 ), Xu H ( 徐红 ), Zhou KY ( 周开亚 ). Allele-specific diagnostic PCR authentication of D. devonianum from other Dendrobium species. Acta Pharm Sin ( 药学学 报 ), 2002, 37 (11): 897~901 6 Ding XY ( 丁小余 ), Xu LS ( 徐珞珊 ), Chang J ( 常俊 ), Bao SL ( 保曙琳 ),

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