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战抑邱
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1 907 DOI: /j 论著慢性牙周炎患者唾液中 mir146a 的表达及临床意义赵家珍 1,2, 闫文娟 1 1, 吴补领院口腔科 2 ) ( 广州, 南方医科大学南方医院口腔科 1 ; 重庆, 第三军医大学西南医 [ 摘要 ] 目的通过检测慢性牙周炎患者唾液中 mir146a 的表达, 以探讨 mir146a 在慢性牙周炎发病中的作用及意义方法选取 2012 年 1 月至 2013 年 8 月期间第三军医大学西南医院口腔科收治的 48 例慢性牙周炎患者 ( 其中男性 28 例, 女性 20 例, 平均年龄 42 岁 ) 同时选择 20 名性别年龄匹配的健康志愿者作为对照组采用实时荧光定量 PCR 技术检测上述人员唾液上清中 mir146a 的表达水平对治疗组患者 (32 例 ) 进行牙周基础治疗, 分别记录治疗前和治疗 6 周后患者的探诊深度 (probingdepth,pd) 临床附着丧失 (atachmentlos,al) 及菌斑指数 (plaqueindex,pli), 并检测治疗后唾液上清液标本中 mir146a 的表达结果慢性牙周炎患者唾液上清液中 mir146a 的表达水平 (252±0.87) 显著高于健康对照组 (0.81±0.58)(P<0.01) 治疗组患者经过治疗后的牙周临床指数唾液中 mir146a 表达水平均显著降低 (P<0.05) 唾液中 mir146a 水平与 PD(r=0.574,P< 005) AL(r=0.629,P<0.01) 及 PLI(r=0.758,P<0.01) 均呈正相关结论慢性牙周炎患者唾液上清中 mir146a 表达水平明显高于正常人, 并在牙周基础治疗后显著下降, 提示唾液 mir146 可作为牙周病防治及疗效评估的潜在靶分子 [ 关键词 ] 慢性牙周炎 ; 唾液 ; 微小 RNA;miR146a [ 中图法分类号 ] R446.19;R [ 文献标志码 ] A Expresionand clinicalsignificanceofsalivamir146ain patientswith chronic periodontitis ZhaoJiazhen 1,2,YanWenjuan 1,WuBuling 1 ( 1 DepartmentofStomatology,NanfangHospital,SouthernMedical University,Guangzhou,GuangdongProvince,510515; 2 DepartmentofStomatology,SouthwestHospital,ThirdMilitary MedicalUniversity,Chongqing,400038,China) [Abstract] Objective TodeterminetheexpresionofmiR146ainsalivaofpatientswithchronic periodontitisandinvestigateitsclinicalvalue.methods Fortyeightchronicperiodontitispatientsadmitedin stomatologyofsouthwesthospitalfrom January2012toAugust2013wereinvestigated(including28males and20femalesatameanageof42years)and20ageandsexmatchedhealthyvolunteerswereenroledas healthycontrols.realtimepcrwasperformedtodetecttheexpresionofsalivamir146ainthesesubjects. Thirtytwopatientswithchronicperiodontitisweretreatedwithbasicperiodontaltherapyfor6weeks.Their probingdepth(pd),atachmentlos(al) andplaqueindex(pli) wererecordedbeforeandafter treatment.results TheexpresionofsalivamiR146awerehigherinchronicperiodontitispatientsthanin thehealthycontrols(2.52±0.87vs0.81±0.58,p<0.01).afterbasicperiodontaltherapy,themir146a expresionandalperiodontalindexeswerereduced(p<0.05).positivecorelationwasfoundbetweensaliva mir146aexpresionwithperiodontalpd(r=0.574,p<0.05),al(r=0.629,p<0.01)andpli(r= 0.758,P<0.01).Conclusion MiR146aexpresionisobviouslystrongerinsalivaofpatientswithchronic [ 通信作者 ] 吴补领, bulingwu@smu.edu.cn [ 优先出版 ] htp://

2 908 第 37 卷第 9 期 periodontitisthaninhealthypeople,andsignificantlydecreasedafterinitialtherapy,indicatingthatmir146a maybeconsideredasapotentialtargetforpreventionandtreatmentofchronicperiodontitis. [Keywords] chronicperiodontitis;saliva;microrna;mir146a Corespondingauthor:WuBuling, bulingwu@smu.edu.cn 牙周炎是发生于牙周支持组织的炎症破坏性疾病牙周炎的发病机制涉及多种因素, 目前认为, 宿主对菌斑细菌及其产物的过度免疫应答在牙周组织的破坏及疾病的慢性迁延中起重要作用 [1] 近年来, 微小 RNA(microRNA,miRNA) 被发现在许多疾病中异常表达, 其在慢性炎症发病过程中的作用成为该领域的研究热点 [2] mirna 是一类高度保守的小分子非编码 RNA, 通过与靶基因 mrna 互补配对, 降解 mrna 或抑制翻译, 从而负性调节转录后基因表达在已发现的众多与慢性炎症发病过程有关的 mirna 中,miR 146a 的作用尤为引人关注 [3-5] [6] Xie 等采用基因芯片技术发现, 慢性牙周炎患者牙龈组织中 mir146a 表达上调, 提示 mir146a 可能参与了慢性牙周炎的发病过程鉴于唾液是比较容易得到的样品, 从唾液中寻找疾病生物标志物 (biomarkers) 一直以来是人们研究的热点 [7] 本研究以 mir146a 为切入点, 比较慢性牙周炎患者及健康对照者唾液上清中 mir146a 的表达水平, 并比较牙周基础治疗前后唾液上清中 mir146a 的变化, 分析其与牙周临床指标的相关性, 探讨唾液 mir146a 在牙周炎中的发病作用 1 资料与方法 1.1 研究对象选取 2012 年 1 月至 2013 年 8 月于第三军医大学西南医院口腔科就诊的慢性牙周炎患者 ( 牙周炎组 ) 48 例, 其中男性 28 例, 女性 20 例, 平均年龄 42 岁牙周炎组纳入标准 : 确诊为慢性牙周炎, 诊断标准参照文献 [8] 同时选择本院体检的健康志愿者 20 例作为健康对照组, 包括男性 12 例, 女性 8 例, 平均年龄 40 岁排除标准 :1 身体有其他局部炎症, 如慢性扁桃体炎慢性咽炎等 ;23 个月内使用过抗生素类药物免疫抑制剂及其他影响白细胞的药物 ;31 年内有牙周炎药物及手术治疗史, 或伴有其他口腔感染性疾病的原发病例 ;4 女性在妊娠哺乳及月经期 ;5 接受过正畸治疗 1.2 主要试剂 Trizol 试剂 (Invitrogen 公司, 美国 );mirvanaparis Kit(Ambion 公司, 美国 );OneStepPrimeSerippmiRNA cdnasynthesis 反转录试剂盒 (TaKaRa 公司, 日本 ); SYBRPremixExTaq TM PCR 反应试剂盒 (TaKaRa 公司, 日本 ) 1.3 口腔检查全部受试者接受口腔检查, 由同一位医师完成用 Wiliam 牙周探针检查牙齿 6 个位点的探诊深度 (periodontalprobingdepth,pd) 附着丧失 (clinical atachmentlos,al) 水平, 采用 Silnes 和 Le 的方法测定菌斑指数 (plaqueindex,pli) 1.4 牙周基础治疗及复查治疗前对纳入分析的慢性牙周炎患者进行口腔卫生宣教及口腔卫生指导, 然后治疗组患者行全口超声龈上洁治术龈下刮治及根面平整术, 嘱患者治疗结束 6 周后进行复诊复诊时采集患者唾液上清, 通过实时荧光定量 PCR(RTqPCR) 检测唾液上清中 mir146a 的表达, 并检测 PD AL 及 PLI 各项牙周临床指标 1.5 mir146a 检测唾液标本的采集及处理清晨采集受试对象的唾液, 采集前 4h 受试者必须禁食禁饮不能漱口用棉签蘸取 2% 的柠檬酸多次擦拭口腔, 待唾液流出时, 用 2 支无菌无 RNA 酶 1.5mL 离心管 (AX GEN 公司 ) 收集唾液, 每只离心管收集大约 1.5mL 唾液 ; 将收集好的唾液 4,3000r/min, 离心 15min, 收集唾液上清将收集好的上清冻存于 -80 备用总 RNA 提取及纯化采用 Ambion 公司 mirvanapariskit 提取和纯化唾液上清中的总 RNA, 提取步骤参照试剂盒说明书进行 BioRad 公司 Smartspecplus 分光光度仪检测总 RNA 浓度和质量, 检测合格后将 RNA 于 -80 冻存待用 mirna 反转录采用 TaKaRa 公司 One StepPrimeSerippmiRNAcDNASynthesis 反转录酶试剂盒对提取的总 RNA 中的 mirna 反转录成互补脱氧核糖核酸 (cdna) 反转录产物于 -80 冻存待用 RTqPCR 检测在 ABIStepOnePlus 实时定量 PCR 仪上按照 SYBRPremixExTaq TM PCR 反应试剂盒 (TaKaRa 公司 ) 进行 RTqPCR 检测以 mir 16 为内参 [9], 反应总体积为 20μL:SYBRPremixEx TaqⅡ 10μL,ROXReferenceDyeⅡ0.5μL,cDNA 模板 2μL,miR146a 或 mir16 上下游引物各 0.5μL,

3 909 RNaseFreedH 2 O 6.5μL PCR 反应条件 :95 15min 预变性,95 15s,60 60s, 反应 40 个循环每个标本做 3 个复孔计算各标本平均循环阈值 (cyclethreshold,ct), 将 mir146a 的 Ct 值减去 mir16 Ct 值作为 Ct 值采用相对定量法对 RTqPCR 结果进行分析, 计算标准化后的 2 - Ct 值表示 mir146a 的相对表达含量 1.6 统计学分析采用 SPSS17.0 统计软件, 数据以 x±s 珋表示, 组间比较行 LSDt 检验, 牙周基础治疗前后相关指标的检测行配对 t 检验,miR146a 表达水平与牙周临床指标的关系行 Pearson 相关系数分析 2 结果 2.1 慢性牙周炎组与健康对照组唾液上清 mir146a 表达水平的比较 RTqPCR 检测结果显示, 慢性牙周炎组唾液上清中 mir146a 表达水平 (2.52±0.87) 显著高于健康对照组 [(0.81±0.58),P<0.01, 图 1] A: 慢性牙周炎组 ;B: 健康对照组图 1 慢性牙周炎组及健康对照组唾液上清中 mir146a 的表达水平 2.2 慢性牙周炎患者牙周基础治疗前后唾液上清 mir146a 表达水平变化最终按要求完成牙周基础治疗后进行复诊的患者共 32 例比较牙周炎患者治疗前后唾液中 mir146a 表达水平, 发现治疗后患者唾液上清 mir146a 的水平 (1.52±0.63) 较治疗前 (2.57±0.84) 显著降低 (P< 0.05, 图 2) A: 治疗前 ;B: 治疗后图 2 慢性牙周炎患者牙周基础治疗前后唾液上清中 mir146a 表达水平的变化 2.3 唾液上清 mir146a 表达水平与牙周临床指标的比较 32 例患者牙周基础治疗后 6 周, 患者牙周状况均明显改善, 菌斑指数 (PLI) 探诊深度 (PD) 附着丧失 (AL) 均显著降低, 与治疗前相比, 差异有统计学意义 (P<0.01, 表 1) 相关性分析结果显示, 牙周炎患者唾液中 mir146a 的表达水平与 PLI(r=0.758,P< 001) PD(r=0.574,P<0.05) 及 AL(r=0.629,P< 0.01) 均呈正相关

4 910 第 37 卷第 9 期表 1 慢性牙周炎患者基础治疗前后各项牙周临床指标的比较 (n=32, x±s) 珋时间菌斑指数探诊深度 (mm) 附着丧失 (mm) 治疗前 2.21± ± ±1.02 治疗后 1.38±0.26 a 2.68±0.41 a 3.18±0.55 a 3 讨论 a:p<0.01, 与治疗前比较近年来, 越来越多的研究者开始关注慢性牙周炎患者唾液中成分的变化, 目前已经检测出唾液中多种成分在慢性牙周炎的发生及调控中起到了重要的作用, 并且有可能成为慢性牙周炎诊断治疗及预后疗效评价的重要指标 [10] 研究表明, 唾液 mirna 能作为疾病诊断及进展监测的候选生物学标志物, 包括口腔鳞癌食道癌等 [11] 目前, 尚少见有关慢性牙周炎患者唾液 mirna 的研究为了进一步探讨 mirna 在慢性牙周炎发生发展中的作用和意义, 本研究以 mir 146a 为切入点, 应用 RTqPCR 技术检测了慢性牙周炎患者唾液上清中 mir146a 的表达情况, 结果显示, 慢性牙周炎患者唾液上清中 mir146a 表达水平显著高于健康对照组为了观察牙周基础治疗是否会影响慢性牙周炎患者唾液上清中 mir146a 的表达, 本研究对治疗组患者进行基础牙周治疗, 治疗后 6 周随访观察其牙周临床指标变化并检测其唾液上清中 mir146a 的表达, 结果显示, 经治疗后, 患者唾液上清中 mir 146a 表达水平显著降低, 并伴有牙周临床指标的明显改善, 经直线相关分析结果显示, 牙周组织损害程度与唾液上清中 mir146a 含量呈正相关 mirna 是一种对基因表达调控发挥重要作用的非编码小 RNA, 广泛参与了许多疾病的发病过程, 如肿瘤感染性疾病及自身免疫性疾病等越来越多的研究发现,miRNA 在调节免疫功能维持免疫系统稳定方面发挥着重要作用,miRNA 的异常表达可能与慢性炎症发病过程密切相关而在与慢性炎症有关的 mirna 分子中, 研究人员证实,miR146a 在慢性炎症 [12] 发生和发展过程中发挥重要作用如 Wang 等发现慢性乙肝患者 T 细胞中 mir146a 水平在病毒抗原作用下明显上调, 且 mir146a 上调可以显著抑制 T 细胞抗病毒功能由于唾液腺血运丰富, 唾液常被认为是血循环的末端产物近年来有研究证实, 组织血浆和唾液三者具有相似的 mirna 表达谱, 检测这些体液中 mirna 同样能获得疾病的发生发展和预后预测的相关分子信息 [13] 血液中 mirna 在疾病发生和发展过程中的作用已被大量的研究证实, 而随着生物技术的不断发 [14] 展, 唾液 mirna 研究亦备受关注 Patel 等研究发现, 唾液中 mirna 的表达量在同一机体内不会随时间而改变, 且不会轻易降解, 即唾液 mirna 表达量相对 [15] 恒定 Park 等利用 RTqPCR 技术检测了 50 例口腔鳞癌患者及 50 例健康对照人群唾液上清中 mirna 的表达, 发现 mir125a 和 mir200a 在口腔鳞癌患者唾液上清中均显著下调, 指出其有望成为诊断口腔癌的标志物通过对唾液 mir146a 的检测, 并分析牙周基础治疗前后 mir146a 表达的变化, 结果提示,miR146a 可能在慢性牙周炎的发病机制中发挥一定作用, 患者唾液上清中 mir146a 表达水平的变化可能与患者牙周基础治疗的临床转归存在关系这提示我们可以把唾液上清中 mir146a 的表达作为反映牙周炎症发展状况及治疗效果评估的一个潜在生物指标, 对于病程监测及预后评估具有一定的参考意义但本项研究的例数较少, 随访时间仅 6 周, 将来有必要扩大样本并延长随访时间作进一步研究和证实 mir146a 是天然免疫和获得性免疫的重要调控因子在固有免疫中, 研究者发现,miR146a 可靶向抑制肿瘤坏死因子受体相关因子 6 和白细胞介素 1 受体相关激酶 l, 从而负向调控固有免疫反应的强弱 [16] [17] 在适应性免疫中,Lu 等研究发现 mir146a 可下调 Th1 细胞分化必需的关键转录因子信号传导与转录激活子 1 的表达, 从而抑制慢性炎症反应 ; 但也有研究者证实, 在类风湿性关节炎患者体内过表达的 mir146a 不能有效抑制 Th1 细胞分化, 进而使患者体内肿瘤坏死因子白介素 6 等炎症因子产生增多, 导致了类风湿性关节炎的发病近年来研究发现, 慢性牙周炎患者唾液中肿瘤坏死因子白介素 6 等表达升高, 且与牙周局部炎症程度密切相关, 然而,miR146a 是否参与了慢性牙周炎患者炎症因子的产生, 仍需更进一步研究综上所述, 慢性牙周炎患者唾液上清中 mir146a 表达水平显著升高, 且唾液上清中 mir146a 表达变化与牙周组织的炎症破坏程度有关, 提示其在慢性牙周炎发病过程中可能起着重要作用

5 911 参考文献 : [1] 李丛华, 杨霞, 吴亚菲, 等. 牙周病相关危险因素分析 [J].,2010,32(3): [2] SinghR P,MasachiI,ManickavelS,etal.Theroleof mirna ininflammationandautoimmunity[j].autoimmun Rev,2013,12(12): [3] StaedelC,DarfeuileF.MicroRNAsandbacterialinfection [J].CelMicrobiol,2013,15(9): [4] ChengH S,SivachandranN,LauA,etal.MicroRNA146 represesendothelialactivationbyinhibitingproinflammatory pathways[j].embomolmed,2013,5(7): [5]SipertCR,MorandiniAC,DionisioTJ,etal.MicroRNA 146aandmicroRNA155showtisuedependentexpresionin dentalpulp,gingivalandperiodontalligamentfibroblastsin vitro[j].joralsci,2014,56(2): [6] XieYF,ShuR,JiangSY,etal.ComparisonofmicroRNA profilesofhumanperiodontaldiseasedandhealthygingival tisues[j].intjoralsci,2011,3(3): [7] 程兴群, 邓盟, 徐欣, 等. 唾液和唾液组学与疾病早期诊断 [J]. 国际口腔医学杂志,2014,41(2): [8] 王春风, 黄民江, 金玲, 等. 牙周基础治疗对慢性牙周炎伴冠心病患者血清 HsCRP IL18 TNFα 水平及冠脉狭窄程度的影响 [J].,2013,35(20): [9] XieZ,ChenG,ZhangX,etal.SalivarymicroRNAsas promisingbiomarkersfordetectionofesophagealcancer[j]. PLoSOne,2013,8(4):e [10] 刘莉, 谭颖徽, 吕俊, 等. 高原地区牙周炎患者唾液中 3 种牙周致病菌与临床牙周指数的相关性研究 [J].,2014,36(5): [11] SextonW M,LinY,KryscioRJ,etal.Salivarybiomarkers ofperiodontaldiseaseinresponsetotreatment[j].jclin Periodontol,2011,38(5): [12]WangS,ZhangX,JuY,etal.MicroRNA146afeedback suppresestcelimmunefunctionbytargetingstat1inpa tientswithchronichepatitisb[j].jimmunol,2013,191 (1): [13] GuayC,RegaziR.CirculatingmicroRNAsasnovelbio markersfordiabetesmelitus[j]. NatRevEndocrinol, 2013,9(9): [14]PatelRS,JakymiwA,YaoB,etal.Highresolutionofmi crornasignaturesinhumanwholesaliva[j].archoralbi ol,2011,56(12): [15] ParkNJ,ZhouH,ElashofD,etal.SalivarymicroRNA: discovery,characterization,andclinicalutilityfororalcanc erdetection[j].clincancerres,2009,15(17): [16]LochheadRB,MaY,ZacharyJF,etal.MicroRNA146a providesfeedbackregulationoflymearthritisbutnotcarditis duringinfectionwithboreliaburgdorferi[j].plospathog, 2014,10(6):e [17]LuLF,BoldinM P,ChaudhryA,etal.FunctionofmiR 146aincontrolingTregcelmediatedregulationofTh1re sponses[j].cel,2010,142(6): ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑栾嘉 )

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