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1 616 第三军医大学学报,2017,39(7) htp://aammt.tmmu.edu.cn DOI: /j 低氧和牙周炎对牙周组织中 HIF 1α 和 MMP2 表达的影响徐倩 1, 杨佳佳 1, 刘志华 1, 刘锐 1, 安建平 1, 周霞 1, 陈发明 2 1, 邓蔓菁医院野战外科研究所口腔科 1 ; 西安, 第四军医大学口腔医学院牙周科 2 ) ( 重庆, 第三军医大学大坪 [ 摘要 ] 目的研究低氧条件下 HIF 1α MMP2 在大鼠牙周炎牙周组织中的表达及其与牙周炎的相关性, 初步探讨 HIF 1α 与 MMP2 之间的关系方法建立低氧牙周炎动物模型,40 只大鼠采用简单随机化分组法分为常氧组常氧牙周炎组低氧组低氧牙周炎组, 每组 10 只, 分别检测牙龈指数菌斑指数探诊深度及牙槽骨吸收度 4 项牙周炎临床指标 ; 牙周组织切片 HE 染色观察牙周炎症程度 ; 免疫组化及 Westernblot 检测牙周组织中 HIF 1α MMP2 的表达结果牙周炎各临床指标及组织切片的 HE 染色均表明低氧牙周炎组大鼠牙周组织炎症程度最重 ; 与常氧两组比较, 低氧组均促进了牙周组织中 HIF 1α MMP2 的表达 (P<0.05); 与非牙周炎组比较, 牙周炎组 HIF 1α MMP2 表达明显增加 (P< 0 05); 低氧牙周炎组 HIF 1α MMP2 表达最高 (P<0.05) 结论低氧促进了牙周炎组织中 HIF 1α MMP2 的表达, 加速了牙周炎的发展进程 [ 关键词 ] HIF 1α;MMP2; 牙周炎 ; 低氧 [ 中图法分类号 ] R362;R780.2;R [ 文献标志码 ] A EfectofperiodontitisunderhypoxiaonexpresionofHIF 1αandMMP2inrat periodontium XuQian 1, YangJiajia 1, Liu Zhihua 1, Liu Rui 1, An Jianping 1, Zhou Xia 1, Chen Faming 2, Deng Manjing 1 ( 1 DepartmentofStomatology,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity, Chongqing,400042; 2 DepartmentofPeriodontology,SchoolofStomatology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi an, ShaanxiProvince,710032,China) [Abstract] Objective Toinvestigatetheexpresionofhypoxia induciblefactor 1α(HIF 1α)and matrixmetaloproteinase2(mmp2)intheperiodontaltisuesofratswithperiodontitisunderhypoxia,and exploretherelationshipofhif 1αandMMP2expresionwithperiodontitis.Methods Fortyhealthyadult ratswererandomlydividedinto4groups:normoxiagroup,normoxicperiodontitisgroup,hypoxiagroup (simulating5000m abovesealevel)andhypoxicperiodontitisgroup(n=10foreachgroup).gingival index,plaqueindex,depthofprobingandalveolarboneresorptionweremeasuredrespectively.hestaining wasusedtoobserveperiodontalinflammationintheperiodontaltisuesections.immunohistochemicalasay andwesternblotingwereemployedtodetecttheexpresionlevelsofhif 1αandMMP2intheperiodontal tisues.results ClinicalindicatorsofperiodontitisandtheresultsofHEstainingshowedthattheperiodontal inflammationofthehypoxicperiodontitisgroupwasthemostsevere.comparedwiththe2normoxicgroups, hypoxiapromotedtheexpresionofhif 1αandMMP2intheperiodontaltisuesinthe2hypoxicgroups(P< 0.05).TheexpresionofHIF 1αandMMP2wassignificantlyhigherinperiodontitisgroupsthaninthenon periodontitisgroups(p<0.05),withthehighestlevelsinthehypoxicperiodontitisgroup(p<0.05). [ 基金项目 ] 军事口腔医学国家重点实验室开放课题项目 (2014KA04) [ 通信作者 ] 邓蔓菁,E mail:iradeng@163.com [ 优先出版 ] htp://

2 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(7) 617 Conclusion HypoxiapromotestheexpresionlevelsofHIF 1αandMMP2inperiodontitisandacceleratesits progresion. [Keywords] hypoxia induciblefactor 1α;matrixmetaloproteinase2;periodontitis;hypoxia SupportedbytheOpeningProjectofStateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology(2014KA04).Corespondingauthor:DengManjing,E 163 com 我国高原地域辽阔, 各海拔高度均有人居住研究报道, 高原环境人群牙周炎患病率明显高于平原地区, 而且随着移居时间的延长, 其牙周炎患病率逐渐增高, 说明高原低氧可能是引起牙周炎患病率增加的重要原因 [1] 低氧诱导因子 1α(hypoxia induciblefactor 1α,HIF 1α) 作为低氧重要的转录因子, 通过调节多个下游基因的表达, 维持组织和细胞的氧稳态, 对低氧应答过程有重要作用 [2] 牙周炎症时, 激活宿主免疫反应, 产生的基质金属蛋白酶 (matrixmetaloproteinases, MMPs), 参与牙周组织破坏降解过程, 在牙周炎的发生发展过程中起重要作用 [3] 文献[4] 报道, 炎症条件下, 细胞对氧的适应性调节主要通过调控 HIF 1α 进而影响 MMP2 和 MMP9 的表达, 从而影响炎症的发展和转归另有研究表明, 低氧可以改变 MMP 及其抑制剂 (tisueinhibitorofmetaloproteinase,timp) 的表达, 引起 MMP 及 TIMP 表达失衡, 在牙周炎的发展过程中起重要作用 [5] 而目前关于低氧是如何调控 MMP 的表达尚不清楚低氧是否可以通过调控 HIF 1α 进而影响 MMP2 的表达, 对牙周炎的发生发展产生影响是目前研究的难点本研究在低氧条件下, 检测牙周炎牙周组织中 HIF 1α 及 MMP2 的表达, 探究牙周炎与 HIF 1α 和 MMP2 表达之间的关系, 初步探索 HIF 1α 对 MMP2 表达的调控作用, 为将来制定高原牙周病的防治策略奠定理论基础 1 材料与方法 1.1 材料实验动物选择健康成年 SD 大鼠 40 只 ( 由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供 ), 牙周健康无龋齿, 体质量 (200±20)g, 雌雄各半, 分笼饲养主要仪器及试剂低压氧舱 ( 中国贵航集团风雷军械厂 ), 光学显微镜 (Olympus 公司 ), 体视显微镜 (Olympus 公司 ), 戊巴比妥钠 ( 中国医药上海化学试剂公司 ), 醋酸泼尼松龙 ( 浙江仙琚制药股份有限公司 ),0.20 号正畸结扎丝 ( 长沙市天天齿科器材有限公司 ),SDS PAGE 配制试剂盒 ( 碧云天生物技术研究所 ),PVDF 膜 (Roche, 美国 ), 牛血清白蛋白 ( 碧云天生物技术研究所 ),5 蛋白上样缓冲液 ( 碧云天生物技术研究所 ),HIF 1α MMP2 一抗抗体 (Abcam, 美国 ), 山羊抗兔山羊抗小鼠二抗抗体 ( 碧云天生物技术研究所 ) 1.2 方法牙周炎动物模型的建立将 40 只 SD 大鼠采用简单随机化分组法分为 4 组 : 常氧组 (A 组 ) 常氧牙周炎组 (B 组 ) 低氧组 (C 组 ) 低氧牙周炎组 (D [6] 组 ), 每组 10 只, 雌雄分笼饲养采用 Fischer 等方法建立牙周炎动物模型 :3% 戊巴比妥钠 (40mg/kg) 经腹腔注射麻醉, 麻醉起效后采用 0.20 号正畸结扎丝结扎 B D 组大鼠右上颌第一磨牙牙颈部, 使结扎丝尽量下压于龈沟内, 结扎后连续 8d 使用醋酸泼尼松龙 1.25mg/(kg d) 注射大鼠股四头肌, 根据牙周炎高糖饮食喂养, 对照组不处理 A B 组于平均海拔 308m 饲养 ;C D 组于低压氧舱模拟海拔 5000m 饲养, 23h/d,1h 开舱予以补充饲料及更换垫料在造模及饲养过程中各组大鼠状态良好, 未发现明显异常牙周临床指标的检测建模 8 周后检测大鼠牙龈指数 (gingivalindex,gi): 采用文献 [7] 的方法分为 4 度 ; 菌斑指数 (plaqueindex,pli): 采用 Silnes 和 Loe 法 1964 [7] 分为 4 度 ; 牙周探诊深度 (probing depth,pd): 采用 Wiliama 牙周探针测量牙周袋底至龈缘的距离 ; 牙槽骨吸收度 (alveolarbonelos,abl): 采用文献 [8] 的方法测量釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离 Westernblot 建模 8 周后采用 Westernblot 检测大鼠右上颌第一磨牙牙周组织 HIF 1α MMP2 蛋白表达切取大鼠右上颌第一磨牙牙周组织, 常规蛋白提取 SDS PAGE 电泳转膜封闭后孵育 HIF 1α MMP2 一抗抗体, 辣根过氧化物酶标记二抗,ECL 化学显色,Bio Rad 凝胶成像系统成像 HIF 1α MMP2 图像经 QuantityOne 软件计算灰度值, 与内参灰度值比较后进行统计分析组织学表现和免疫组化建模 8 周后处死大鼠, 截取右上颌第一磨牙区段, 放入 4% 多聚甲醛中

3 618 第三军医大学学报,2017,39(7) htp://aammt.tmmu.edu.cn 固定 24h,EDTA 脱钙液脱钙后, 常规脱水包埋切片,HE 染色 ; 免疫组化 (S P) 法检测大鼠牙周组织中 HIF 1α MMP2 的表达 1.3 统计学分析采用 SPSS18.0 统计软件进行统计分析, 等级资料 GI PLI 采用有序 Logistic 回归分析, 计量资料 PD ABL 及 HIF 1α MMP2 蛋白表达水平进行两因素方差分析, 数据以 x±s 珋表示, 检验水准 α= 结果 2.1 牙周临床指标情况牙龈指数菌斑指数频数分布比较 4 组大鼠的牙龈指数及菌斑指数, 发现低氧牙周炎组其牙龈指数菌斑指数值最高, 表明低氧牙周炎组大鼠的牙龈炎症程度最重, 菌斑量最多, 差异有统计学意义 (P< 0.05, 表 1) 各组探诊深度和牙槽骨吸收度比较与其他组比较, 低氧牙周炎组探诊深度和牙槽骨吸收度数值最高, 差异有统计学意义 (P<0.05, 图 1) 2.2 牙周组织学特征牙周组织肉眼观察造模 8 周后肉眼观常氧组低氧组大鼠牙周组织无明显改变, 常氧牙周炎组低氧牙周炎组大鼠牙周组织糜烂大量食糜附着, 触之明显出血溢脓 ( 图 2) 牙周组织 HE 染色结果 HE 染色结果显示, 常氧组牙周组织未见明显组织病理学改变 ; 常氧牙周炎组可见沟内上皮糜烂, 牙周纤维排列紊乱, 牙槽骨轻度吸收 ; 低氧组少量炎细胞浸润 ; 低氧牙周炎组大量中性粒细胞淋巴细胞浸润, 胶原水肿变性, 牙周纤维紊乱断裂 ( 图 3) 表 1 4 组大鼠牙龈指数与菌斑指数的频数分布牙龈指数菌斑指数指数分级常氧组常氧牙周炎组低氧组低氧牙周炎组常氧组常氧牙周炎组低氧组低氧牙周炎组 a a bc bc a:p<0.05, 与常氧组比较 ;b:p<0.05, 与低氧组比较 ;c:p<0.05, 与常氧牙周炎组比较 1: 常氧组 ;2: 常氧牙周炎组 ;3: 低氧组 ;4: 低氧牙周炎组 a:p<0.05, 与常氧组比较 ;b:p<0.05, 与低氧组比较 ;c:p<0.05, 与常氧牙周炎组比较图 1 4 组大鼠牙周探诊深度 (A) 及牙槽骨吸收度 (B) 比较 A: 常氧组 ;B: 常氧牙周炎组 ;C: 低氧组 ;D: 低氧牙周炎组图 2 各组大鼠牙周组织肉眼观察

２Ｗｅｓｅｒｎｂｌｏ检测各组大鼠牙周组织ＨＩ１α ＭＭＰ２的表达ＭＭＰ２蛋白的表达低氧条件下ＨＩ低氧条件下ＨＩ１α ＭＭＰ２的明显增加牙周炎症时ＨＩ增加表达明显增加牙周炎症时ＨＩ增

"$%&# '"# '"(%&# $%&"!#!"# ''() 图４免疫组化检测各组大鼠牙周组织中ＨＩ $ & (!"#!$"4))*& *+,-./ &2', (!"#!$"!%&!$' "!

4 ｈｐａａｍｍｍｍｕｅｄｕｃｎ６１９第三军医大学学报２１７３９７ # $! " Ａ常氧组Ｂ常氧牙周炎组Ｃ低氧组Ｄ低氧牙周炎组图３各组大鼠牙周组织ＨＥ染色观察２３牙周组织中ＨＩ的棕黄色颗粒图４２３１免疫组化检测各组大鼠牙周组织ＨＩ１α ２３２Ｗｅｓｅｒｎｂｌｏ检测各组大鼠牙周组织ＨＩ１α ＭＭＰ２的表达ＭＭＰ２蛋白的表达低氧条件下ＨＩ低氧条件下ＨＩ１α ＭＭＰ２的明显增加牙周炎症时ＨＩ增加表达明显增加牙周炎症时ＨＩ增显微镜下观察大鼠牙周组织中ＨＩ加低氧牙周炎组ＨＩ１α ＭＭＰ２表达量最高Ｐ阳性染色呈棕黄色低氧牙周炎组大鼠牙周组织中５图５ＨＩ１α ＭＭＰ２表达量最高切片组织中可观察到明显!"$%&# '"# '"(%&# $%&"!#!"# ''() 图４免疫组化检测各组大鼠牙周组织中ＨＩ $ & (!"#!$"4))*& *+,-./ &2', (!"#!$"!%&!$' "! $23 #$% #$&'(% )$% )$&'(% ＳＰ $2' - - '23 ))*&!+,!$'("! #!-./01!,(!$'("! ' $!"#!$" ＡＷｅｓｅｒｎｂｌｏ检测结果１常氧组２常氧牙周炎组３低氧组４低氧牙周炎组Ｂ半定量分析结果５与常氧组比较ｂＰ５与低氧组比较ｃＰ５与常氧牙周炎组比较图５ＨＩ１α ＭＭＰ２蛋白表达水平 % ))*& ａＰ

5 620 第三军医大学学报,2017,39(7) htp://aammt.tmmu.edu.cn 3 讨论牙周病是发生在牙周支持组织的一种复杂的炎症感染性疾病, 主要由革兰阴性菌堆积在牙齿表面, 激活宿主的促炎介质, 导致牙周组织的破坏, 最终导致失牙 [9] 目前牙周炎的治疗方法局限, 牙周炎失牙率高, 促使我们探索新的治疗方法, 为牙周炎的治疗提供新思路研究表明, 厌氧菌牙合创伤吸烟以及不良口腔卫生习惯均可加重牙周炎的发展进程, 而牙周炎不仅对口腔健康有严重的影响, 同时影响许多系统性疾病的发生和发展 [10] [6] 本研究利用低氧 Fisher 等的方法建立牙周炎动物模型, 检测低氧及炎症条件下, 牙周组织的病理改变及 HIF 1α MMP2 的表达情况, 发现低氧牙周炎组大鼠牙周炎症程度最重, 牙周组织明显充血水肿, 大量浆细胞淋巴细胞浸润, 牙周纤维变性断裂 ; 此外, 低氧及炎症均促进了 HIF 1α MMP2 的表达, 且在低氧合并牙周炎条件下,HIF 1α MMP2 表达量最高, 提示低氧可能通过 HIF 1α 通路调控 MMP2 的表达, 从而加重牙周炎症程度 ; 在常氧条件下, 牙周炎组 HIF 1α MMP2 表达量也增加, 说明牙周炎症同时也可增加 HIF 1α MMP2 表达 HIF 1 是低氧重要的转录调控因子, 由 α 和 β 两个亚基组成, 其中 β 亚基为结构亚基, 在常氧及低氧条件下均稳定表达, 而 α 亚基为功能亚基, 在常氧条件下其通过泛素化, 被蛋白酶水解 ; 而在低氧条件下, 这一进程被抑制,α 亚基与 β 亚基结合, 进而发挥功能作用 [11-12] [13] Li 等研究发现, 慢性牙周炎可能使牙周成纤维细胞中 HIF 1α 转录激活, 进一步加重牙周炎的发展此外,HIF 1α 可诱导牙周膜细胞的凋亡和自噬性细胞死亡 [14] 这提示通过调控 HIF 1α 的表达, 可能对牙周炎发生发展有重要作用, 为牙周炎的治疗提供新的思路炎症细胞因子如 MMP 在维持细胞炎症状态有重要作用, 对于炎症相关的增殖及组织破坏性疾病有重要意义 [15] MMP2 作为基质金属蛋白酶家族的重要成员, 是一种锌依赖的蛋白酶类, 是胚胎发育组织重建等过程的关键作用因子, 其对于细胞外基质的合成和降解发挥重要作用牙周炎症时, 其合成和降解紊乱可能是导致牙周炎症程度加重的重要原因 [3,16] 文献 [17] 报道,MMP2 的表达可能与牙周炎症程度呈正相关研究发现, 低氧时细胞可能通过 HIF 1α 调控 MMP2 表达, 在血管生成细胞迁移及伤口愈合等多种病理生理过程中发挥重要作用 [18] 尽管目前对于 HIF 1α MMP2 的研究较多, 而对于低氧炎症共同作用下牙周组织发生的病理改变仍不清楚, 低氧是否通过 HIF 1α 影响 MMP2 的表达, 炎症是否可以引起局部组织处于低氧状态, 进而调控 MMP2, 加重牙周炎症程度, 仍是目前研究的重点及难点本研究利用大鼠低氧牙周炎动物模型, 研究低氧及炎症对牙周组织的影响, 发现低氧及炎症均可促进 HIF 1α MMP2 的表达, 且 HIF 1α 与 MMP2 的表达呈一致性, 说明低氧可能通过 HIF 1α 信号通路促进 MMP2 的表达, 从而加重牙周炎症程度 ; 另一方面, 炎症可能使牙周组织局部处于低氧状态, 并激活 HIF 1α 信号通路, 影响下游靶基因的表达, 进而加重牙周炎症程度然而, 目前关于 HIF 1α 及 MMP2 的关系仍不清楚, 促使我们进一步探讨 HIF 1α 与 MMP2 之间的关系, 为将来制定高原牙周病的防治策略奠定理论基础参考文献 : [1] 冯秀娟. 高海拔地区牙周疾病就诊原因分析 [J]. 高原医学杂志,2002,12(2):26-27.DOI: /j.isn FengXJ.Analysisofthecausesofperiodontaldiseasesin highaltitudearea[j].journalofhighaltitudemedicine, 2002,12(2):26-27.DOI: /j.isn [2] AbdolahiH,HarisLJ,ZhangP,etal.Theroleofhypoxia instemceldiferentiationandtherapeutics[j].jsurgres, 2011,165(1): DOI: /j.js [3] CamposK,GomesCC,FariasLC,etal.DNAMethylation ofmmp9isasociatedwithhighlevelsofmmp 9Mesenger RNAinPeriapicalInflammatoryLesions[J].JEndod,2016, 42(1): DOI: /j.joen [4]BaeW J,ShinM R,KangSK,etal.HIF 2InhibitionSu presesinflammatoryresponsesandosteoclasticdiferentia tioninhumanperiodontalligamentcels[j].jcelbio chem,2015,116(7): doi: /jcb [5] YuXJ,XiaoCJ,DuYM,etal.Efectofhypoxiaonthe expresionofrankl/opg inhumanperiodontalligament celsinvitro[j].intjclinexppathol,2015,8(10): [6] FischerRG,KlingeB.Clinicalandhistologicalevaluationof ligature inducedperiodontitisinthedomesticferet[j].j

6 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(7) 621 ClinPeriodontol,1994,21(4): DOI: / j x.1994.tb00311.x [7] LoeH,SilnesJ.PeriodontalDiseaseinPregnancy:Preva lenceandseverity[j].actaodontolscand,1963,21: doi: / [8]LlavanerasA,RamamurthyNS,HeikkilP,etal.Acombi nationofachemicalymodifieddoxycyclineandabisphospho nate synergisticaly inhibits endotoxin induced periodontal breakdowninrats[j].jperiodontol,2001,72(8): doi: /jop [9] G lzl,memmerts,rath DeschnerB,etal.Hypoxiaand P.gingivalissynergisticalyinduceHIF 1andNF κbactiva tioninpdlcelsandperiodontaldiseases[j].mediatorsin flamm,2015,2015: doi: /2015/ [10] LiK,DongSG,ZhangH X,etal.ExpresionofRUNX2 andmdm21inratswithperiodontitisunderchronicintermit tenthypoxia[j].asianpacjtropmed,2016,9(8): doi: /j.apjtm [11]SchipaniE,MaesC,CarmelietG,etal.Regulationofoste ogenesis angiogenesiscouplingbyhifsandvegf[j].j BoneMinerRes,2009,24(8): DOI: /jbmr [12] BulenJW,TchernyshyovI,HolewinskiRJ,etal.Protein kinasea dependentphosphorylationstimulatesthetranscrip tionalactivityofhypoxia induciblefactor1[j].scisignal, 2016,9(430):ra56.DOI: /scisignal.aaf0583 [13]LiJP,LiFY,XuA,etal.Lipopolysaccharideandhypox ia inducedhif 1 activationinhumangingivalfibroblasts [J].JPeriodontol,2012,83(6): DOI: /jop [14] SongZC,ZhouW,ShuR,etal.Hypoxiainducesapoptosis andautophagicceldeathinhumanperiodontalligamentcels throughhif 1αpathway[J].CelProlif,2012,45(3): DOI: /j x [15] ThorntonRD,LaneP,BorghaeiRC,etal.Interleukin1 induceshypoxia induciblefactor1inhumangingivaland synovialfibroblasts[j].biochem J,2000,350(Pt1): DOI: / : [16] TangL,PeiH,YangY,etal.Theinhibitionofcalpains amelioratesvascularrestenosisthroughmmp2/tgf β1path way[j].scirep,2016,6:29975.doi: /srep29975 [17]EbersoleJL,KirakoduSS,NovakM J,etal.Transcrip tomeanalysisofbcelimmunefunctionsinperiodontitis: MucosalTisueResponsestotheOralMicrobiomeinAging [J].FrontImmunol,2016,7:272.DOI: /fimmu [18]DeppeJ,PoppT,EgeaV,etal.Impairmentofhypoxia in ducedhif 1αsignalinginkeratinocytesandfibroblastsby sulfurmustardiscounteractedbyaselectivephd 2inhibitor [J].ArchToxicol,2016,90(5): DOI: /s y ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑张维 )

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