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1 荧光分光光度计 Fluorescence Spectrophotometer 原理及应用

2 HITACHI F-4500

3 一 荧光分光光度计的工作原理二 荧光分光光度计的构造三 荧光分光光度计的应用四 影响荧光分析的因素

4 荧光光度分析法 当物质被辐射能照射后, 分子内部获得外源能量, 基态分子能级的电子跃迁到较高能级转变成激发态分子能级, 使分子处在高能域不稳定状态, 因此, 它必须释放多余能量变成稳定状态分子 在由激发态能级回到基态能级的过程中, 以光的形式释放多余能量, 并发射出比原波长更长的光谱, 这一过程称为分子发光, 检测分子发射光谱的分析方法称为荧光光度分析法

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6 任何荧光化合物都具有两种特征光谱 荧光激发光谱 ( 吸收光谱 ) 固定某一发射波长, 测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱

7 荧光发射光谱 ( 荧光光谱 ) 固定某一激发波长, 测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱

8 工作原理 分子荧光光谱与物质本身的结构有关, 荧光强度的大小与物质的含量有关, 利用物质荧光光谱的形状和强度的大小即可对物质进行定性和定量的分析

9 定性分析 : 将未知物测定到的光谱参数与已知化合物进行比较, 从而确定未知物的基本性质 不同物质, 由于其分子结构的不同, 其激发态能级的分布具有各自不同的特征, 这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱, 因此, 可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定

10 定量分析 : 利用荧光分子发射荧光的强弱进行定量测定 在溶液中, 当荧光物质的浓度较低时, 其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系, 利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析

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12 荧光分析的特点 专一性强 : 利用荧光物质的发光性质来检测其发射光谱, 使测定的物质更具有特性 灵敏度高 : 测定同样浓度物质的含量, 通常比吸收光谱灵敏度高 2-4 个数量级, 可检测出 克数量级的物质 选择性强 : 可分析发射光谱, 也可分析激发光谱 如果某几个物质的发射光谱相似, 难以做出判断, 就可以测量其激发光谱 发光方式多 : 物理 化学 生物发光 可分析参数多 : 荧光光谱 荧光强度 荧光效率 荧光寿命等

13 荧光分光光度计的构造

14 光源 要求 : 在全波长范围提供恒定连续的光强, 低噪 声, 使用寿命长, 稳定性好, 足够的输出功率 紫外光源 : 氢灯 nm 氘灯 nm( 辐射能量强度大, 使用寿命长, 较常用 ) 可见光源 : 钨灯 nm 钠灯 nm 紫外 - 可见兼用 : 氙灯 nm

15 分光光度计的光源装置 : 反射聚光系统 (J 平面镜,M1 球面镜,F 消除杂散光的滤光片 ) (J 光源灯,M2

16 光源的稳定性影响测量的重复性和精确度 光源的强度影响测量的灵敏度

17 单色器 在辐射能的照射下, 能够将连续复合光源分解成单一波长的单色光或者具有一定宽度谱带的分光器, 称为单色器 特点 : 有效提供较窄谱宽的单色光, 而且波长可以在一个很宽的范围内任意改变 组成 : 入射狭缝 准直透镜 棱镜或光栅 聚焦透镜 出射狭缝

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19 棱镜单色器 棱镜单色器是根据光的折射原理而进行的分光 系统 ( 对短波长的光折射率大, 长波长的光折射率小 ) 分光原理 : 当一束平行光进入棱镜散射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光, 经聚焦镜聚焦后, 在聚焦面的不同位置上成像, 得到按波长展开的光谱

20 棱镜的色散

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22 优点 : - 简单 便宜 缺点 : - 色散线弯曲 而非线性 ( 不同波长区域色散效果不同, 红端色散差, 紫端色散较好 ) - 散射角随温度变化而变化

23 光栅单色器 - 利用光的衍射和干涉原理 衍射光栅是由一系列刻划在高光洁度反射表面上的沟纹组成的 沟纹排列异常密集, 每英寸长度上有 或 条 将光栅放在一平行光束里, 光栅的一面被照亮, 这一面就相当是块非常小的反射镜 从沟纹反射镜反射出的光线相重叠, 发生干涉 另一方面, 如果在光线方向上的沟纹条数是波长的整数倍时, 光线就被沟纹分开, 这种波就是同向的, 射线被反射 当它不是波长的整数倍时, 光线被抵消, 没有反射现象 改变光线照射到光栅上的角度, 就可以改变反射光的波长 能将入射光按不同波长进行色散

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25 光栅单色器表面涂铝膜, 以不同角度反射 散射角与波长成线性, 与温度无关 配滤光片消除不同基数光相重叠

26 与棱镜色散相比 : 分辨率高 : 取决于 mn 值 ; 光栅的性能由单位长度内的刻线数和总的刻线面积来描述 ; 色散呈线性

27 狭缝 由两块锋利金属刀片组成, 这两刀片之间是严格平行的或一块弧形 一块直形的两刀片组成 类似于照相机的光圈, 用来采集光的面积 狭缝直接关系到仪器的分辨率 主要作用 : 将来自单色器的散射光切割成单色光

28 比色杯 用来盛装所分析样品液的比色容器 可见光区 --- 无色光学玻璃或塑料紫外区 石英玻璃要求 : 透光性好, 耐腐蚀性好

29 检测器 把光信号转换为电信号, 供进一步放大处理 要求 : 在较宽的波长范围内对辐射信号都有响应 灵敏度 高 噪声小 种类 : - 光电二极管 : nm 光照 电子流 相连电容放电 电流大小与光照强度成正比 - 光电倍增管 : 原理同上, 增加了若干个倍增电极 由若干个逐级放大的信号 传输器构成 - 二极管阵列检测器 : 个或更多些的二极管检测单元, 以阵列方式同时接收信号 每一个二极管相当于一个出口狭缝 ( 窄带光谱 ), 波长重复性可达 0.02nm 固态技术, 性能可靠 优点 : 一次性全光谱扫描, 高效率 重复性好

30 荧光分光光度计的应用 定性分析 : 将未知物测定到的光谱参数与已知化合物进行比较, 从而确定未知物的基本性质 不同物质, 由于其分子结构的不同, 其激发态能级的分布具有各自不同的特征, 这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱, 因此, 可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定

31 应用 荧光光谱法鉴别海上溢油原油 各种燃料油等油类是海洋的主要污染物之一 及时准确地发现油污染事故并鉴别某油种, 对海洋环境管理和海洋污染防治具有重要意义 海上溢油鉴别就是一例, 可以通过比较溢油样和可疑源油样的荧光光谱进行鉴别 如果溢油样的荧光光谱与某艘船底污油样的荧光谱相重合, 则溢油就是由该船所排放的 这对追查船舶违章排入含油污水是十分有用的

32 图 22 所示的光谱图, 就 1982 年 6 月 5 日山海关船厂港内五号码头发现的海上溢油样和被怀疑排放污油的四艘船 ( 拖轮 1 号, 拖轮 2 号, 冀北 4 号, 津水基 1 号 ) 的舱底污油样的荧光发射光谱图 从图上看出, 津水基 1 号油样的荧光发射光谱与海上溢油样的荧光发射光谱图相合, 从此可以判断该船即为排污源

33 时间扫描

34 定量分析 : 利用荧光分子发射荧光的强弱进行定量测定 在溶液中, 当荧光物质的浓度较低时, 其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系, 利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析

35 标准曲线法 以已知量的标准荧光物质经过同样的处理后, 配成系列的不同浓度的标准溶液, 将测得的值绘成标准曲线

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37 内标法 通常一定的浓度范围内, 选择一个合适的标准样品浓度, 进行荧光强度测定, 与在同样条件下的未知样品的值进行比较, 通过公式计算出未知样品的浓度 未知样品浓度 未知样品荧光强度值 ===== 标准样品浓度 标准样品荧光强度值

38 影响荧光分析的因素 溶液的 PH 值的影响温度的影响溶剂的影响激发光源的影响器皿污染的影响内滤效应的影响稀样品溶液的影响

39 溶液 PH 值的影响 每一种荧光物质都有它最适的发射荧光的离子状态, 有能使它解离度达到最大的最适 PH 值溶液, 以保持荧光物质和溶剂之间的电离平衡 一般情况, 当溶液的 PH 值发生改变时, 荧光物质在溶液中的解离状态也随之改变, 发射荧光的效率也随之下降 但有些荧光物质正好相反, 处于分子状态时有荧光, 处于离子状态则无荧光 如 : 苯酚 -- 酸性溶液 -- 分子形式 ---- 有荧光 -- 碱性溶液 -- 阴离子形式 -- 无荧光

40 温度的影响 荧光物质随着温度的变化, 分子内部能量相互之间的转化也发生变化 一般情况 温度升高 荧光效率 荧光强度 下降温度降低 荧光效率 荧光强度 升高

41 溶剂的影响 荧光物质的荧光波峰位置和荧光强度与溶剂的介电常数有关 不同的溶剂对各种荧光物质发生荧光的影响程度是不同的, 某些溶剂可以使荧光物质形成络合物, 某些溶剂可以改变荧光物质的解离状态 总之, 凡是能引起荧光物质分子结构发生变化和影响对光量子吸收能力的溶剂, 将都会导致荧光波峰和荧光强度发生改变

42 激发光源的影响 荧光分子中每一种化学键都有一定的 强度, 能承受一定的外界机械冲击力或辐射能照射 激发光能量过大 化学键变化或断裂 光分解 荧光强度下降

43 器皿污染的影响 在测试样品中混入一些微量的外源荧光物质, 会直接影响测定结果的准确性 器皿污染是指在实验操作中, 使用的比色皿或容器量具等不洁净, 在器皿的内壁含有极少量的荧光物质, 使测定结果造成偏差 如 : 合成洗涤剂 较强荧光

44 内滤效应的影响 自吸收 : 在合适浓度条件下, 荧光强度与样品浓度成正比 但当样品浓度高到超出一定范围后, 由于浓度大, 而大部分的辐射光能在到达样池中心点以前, 就被荧光分子完全吸收了, 使样池的表层至中心点形成一个光吸收梯度 位于中心点的分子吸收的辐射能很弱或无辐射能, 这部分分子就不可能发射荧光, 即使能发射少量荧光, 由于分子密度太大很难到达表面发射出来, 被仪器检测到 杂质吸收 : 在样品溶液中存在着能够吸收激发光或发射光能量的杂质, 使检测到的荧光强度变弱, 称为杂质吸收 从理论上说, 与浓度过高相似

45 稀样品溶液的影响 氧化作用 : 荧光物质的稀溶液通常不如浓度高的溶液稳定, 很容易发生氧化作用, 造成荧光分子的某些基团或某些化学键发生变化, 导致分子的光吸收和发射荧光的能力减弱, 检测到的荧光强度与溶液的浓度不成正比 光分解 : 稀溶液相对于浓度高的溶液更容易发生光分解 表面吸附 : 某些非待测的荧光物质吸附在比色皿内壁的表面上, 在荧光分析过程中这些荧光物质会发射相应的荧光干扰测定, 影响测定结果的准确性 表面吸附通常对于浓度较高的溶液影响不大, 但对稀溶液的影响不容忽视

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