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1 ZX 公开 技术总结报告 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治 科技 重大专项 呼吸道病毒性传染病病原谱流行规律及变异研究 Spectrum and Genetic Variation of Respiratory Viruses in Acute Respiratory Tract Infections 课题负责人 : 任丽丽 中国医学科学院病原生物学研究所 2010 年 12 月

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3 辑要页 1. 题名呼吸道病毒性传染病病原谱流行规律及变异研究 2. 作者及作者单位课题负责人 : 任丽丽中国医学科学院病原生物学研究所 3. 科技报告类型, 起止日期 4. 辑要页密级技术总结报告公开 5. 科技报告密级公开 6. 完成单位科技报告编号 ZX 资助机构科技报告编号 8. 完成日期 特别声明 10. 摘要 本研究通过对呼吸道样本病毒谱的分析, 首次系统揭示了以北京 山东地区为代表的华北地区急性呼吸道感染中常见呼吸道病毒的流行地域 季节和年龄分布特征 ; 系统揭示包括流感病毒 偏肺病毒 腺病毒 肠道病毒和冠状病毒等的基因变异及规律 ; 首次发现一批国外已报道 但国内流行情况不明的病毒包括 C 组鼻病毒,Wu KI 多瘤病毒和博卡病毒 3 型和一些新的肠道病毒基因型等 这些基线数据为呼吸道突发疫情排查 鉴定, 开展病原监测及未来诊断提供依据和基础, 并为呼吸道传染病的异常流行的预警提供依据 创新性的将国际前沿病原组合检测鉴定技术引入监测技术体系, 实现从已知致病病原的检测到条件致病病原的发现和泛病原体检测的跨越, 为我国呼吸道病毒监测技术体系的升级 换代并与国际先进水平接轨打下基础 应用已建立技术平台承担并圆满完成国家应急检测任务, 并打造了一支熟悉国情 技术过硬同时又具有国际视野的队伍 关键词 : 呼吸道病毒, 病毒谱, 病原学, 变异, 进化 11. 资助机构及计划名称 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治 国家科技重大专项 12. 项目 / 课题名称及编号呼吸道病毒性传染病病原谱流行规律及变异研究,2009ZX 项目 / 课题承担单位中国医学科学院病原生物学研究所 14. 总页数 97 I

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5 中文摘要本研究通过对呼吸道样本病毒谱的分析, 首次系统揭示了以北京 山东地区为代表的华北地区急性呼吸道感染中常见呼吸道病毒的流行地域 季节和年龄分布特征 ; 系统揭示包括流感病毒 偏肺病毒 腺病毒 肠道病毒和冠状病毒等的基因变异及规律 ; 首次发现一批国外已报道 但国内流行情况不明的病毒包括 C 组鼻病毒,Wu KI 多瘤病毒和博卡病毒 3 型和一些新的肠道病毒基因型等 这些基线数据为呼吸道突发疫情排查 鉴定, 开展病原监测及未来诊断提供依据和基础, 并为呼吸道传染病的异常流行的预警提供依据 创新性的将国际前沿病原组合检测鉴定技术引入监测技术体系, 实现从已知致病病原的检测到条件致病病原的发现和泛病原体检测的跨越, 为我国呼吸道病毒监测技术体系的升级 换代并与国际先进水平接轨打下基础 应用已建立技术平台承担并圆满完成国家应急检测任务, 并打造了一支熟悉国情 技术过硬同时又具有国际视野的队伍 III

6 Abstract Through the spectrum analysis, it was systemly characterized by the seasonality, geographical and age distribution of common respiratory viruses in acute respiratory infections in north China which was represented by Beijing and Shandong Province. The epidemiology and genetic variation of important respiratory viruses are also adressed intensively, including influenza virus, human metapneumovirus, adenovirus, enterovirus and coronavirus. The epidemiology and pathogenesis of several novel viruses associated with respiratory tract infections that were reported in recent years, including rhinovirus type C, WU and KI polyomavirus and human bocavirus species 3 and several novel enteroviruses genotypes, were firstly identified in China by this study. These studies have provided baseline data for pathogen identification of emerging epidemics, development of new diagnostic methods, define strategies for the surveillance, and alert for future outbreaks of respiratory infections. The cutting-edge technology of integrated pathogen identification was also applied to the surveillance of respiratory pathogens in this study, realizing the identification of known pathogens, conditioned pathogens and pan-pathogens, upgrading our surveillance technology to a leading level. The platform developed in this study has also made contributions to national response to emerging infectious diseases in recent years. A strong talent team oriented by national demands with international vision and professional skills was also developed by the support of this project. IV

7 目次 引言 呼吸道病毒感染病原谱的研究 ( 华北地区 ) 研究背景 技术方案 技术路线流程图 病例定义 样本的采集和前处理 检测内容及方法 研究结果 常见重要呼吸道病毒在我国流行特征的系统研究 冠状病毒 腺病毒 副流感病毒 偏肺病毒 呼吸道合胞病毒 新发现呼吸道病毒在我国流行情况的研究 C 组鼻病毒 新型多瘤病毒 博卡病毒 肠道病毒 EV68 和 CA21 型 重要呼吸道病毒的变异变迁特征的初步揭示 偏肺病毒 博卡病毒 流感病毒 呼吸道病毒抗体人群血清流行率的研究 泛病原体监测技术在呼吸道传染病监测中的建立和应用 样本资源库的建设 结论和建议 参考文献 附录 A 呼吸道症候群监测数据统计分析报告 V

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9 插图清单 图 1. 冠状病毒流行季节性分布 图 2. 腺病毒基因进化分析 图 3. 腺病毒流行季节性分布 图 4. 副流感病毒的季节性分布 图 5. 偏肺病毒的季节性分布 图 6. 呼吸道合胞病毒各基因型的季节流行特点 图 7. HRV-C 抗原基因进化分析 图 8. C 种鼻病毒 (BCH019) 抗原蛋白 VP1 空间模拟图 图 9. 鼻病毒在成人 (a) 和儿童 (b) 急性呼吸道感染病例中的季节性分布特点 图 10. 博卡病毒抗原基因 VP1/2 的进化分析 图 11. 成人急性呼吸道感染呼吸道样本中 EV 的血清型分布 图 12. EV68 和 CA21 的季节分布 图 13. 偏肺病毒各亚型流行情况 图 14. 偏肺病毒分子进化分析 图 15. 偏肺病毒群体动力学分析 图 16. 偏肺病毒地理传播模式分析 图 型博卡病毒的基因变异重组分析 图 18. 流感病毒各亚型的季节性流行情况 图 甲型 H1N1 流感病毒流行期间各亚型的季节性流行情况 图 20. 流感病毒各亚型和其他呼吸道病毒的季节性流行情况 图 21. 偏肺病毒和呼吸道合胞病毒抗体血清流行病学分析 图 22. 呼吸道样本宏基因组分析 图 23. 入组病例临床信息表及存量记录表 VII

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11 附表清单 表 1. 呼吸道病毒核酸检测引物信息及扩增条件... 7 表 2. 冠状病毒阳性病例的各年检出情况 表 3. 冠状病毒阳性病例在不同年龄人群中的检出情况 表 4. 冠状病毒阳性者临床表现和特点 表 5. 腺病毒验证引物序列 表 6. 副流感病毒感染的临床表现特点 表 7. 副流感病毒的共检出 表 8. 偏肺病毒在呼吸道感染病例中的临床特点 表 9. 鼻病毒感染临床表现 表 10. 急性呼吸道感染病例 WU/KI 多瘤病毒阳性病例临床表现 表 11. 博卡病毒在急性胃肠炎病例粪便样本中的检出情况 表 12. 博卡病毒在呼吸道感染病例中的临床特点 表 13. 成人急性呼吸道感染样本中肠道病毒 CA21 与 EV68 的检出情况 表 14. CA21 与 EV68 阳性病例的临床表现 表 年甲型 H1N1 流感病毒回顾性筛查结果 IX

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13 引言传染病一直是人类健康的重大威胁, 病毒是人类传染病的重要病原体, 而呼吸道传染病相关病毒因其传播快 流行广等特点对社会生活的危害尤其巨大, 如历史上流感病毒曾引起三次全球流感大流行, 2003 年 SARS 冠状病毒突发流行, 高致病性禽流感病毒的肆虐以及肠道病毒 EV71 的影响等 每一次新发 突发传染病的出现都对人们的健康 生活秩序和经济发展造成不同程度的影响 特别是当短时间内不能明确病原时, 常引起社会的不安和恐慌, 甚至危及国家安全 随着我国参与全球性活动的日益频繁, 对传染病的防控能力提出了更高的要求 因此, 如何在传染病发生的早期, 在最短的时间内确定病原体的种类, 对传染病的预防控制至关重要, 更是国家公共卫生水平和综合科技能力的体现 我国目前在呼吸道病毒的监测方面已经有了一定的积累, 但是尚缺乏系统 全面的人群呼吸道病毒本底情况的检测数据, 缺少对新发现病毒流行情况的本底调查, 不利于及时发现传染病的新流行态势 因此, 开展全人群的常见呼吸道病毒的筛查, 充分了解常见呼吸道病毒的流行特点和变异规律, 通过对呼吸道病毒的变异监测, 阐明相关病原的流行优势型别 病原基因变异和重要位点的变异及其意义, 结合流行病学和临床分析病原变迁有助于及时发现传染病新的流行态势 我国目前在应对突发和不明原因传染病的技术体系已经建立, 但尚不系统 因此, 开展突发和不明原因传染病监测研究, 阐明新发突发传染病的相关病原, 并对其流行进行预测和预警, 以探索建立有效的突发和不明原因传染病的监测 防控和研究策略, 锻炼和提升突发传染病事件中病因快速鉴定和应急反应的能力 本课题作为传染病防治重大专项 传染病监测技术平台 的一部 1

14 分, 根据总体部署重点加强呼吸道病毒检测技术能力的建设 通过集成现有的先进技术, 对患呼吸道感染的广泛人群 ( 成人和儿童 ) 开展常见呼吸道病原谱的筛查, 建立和完善呼吸道病毒检测体系 ; 通过对呼吸道感染样本中常见呼吸道病毒的检测, 明确各种呼吸道病原的季节流行情况, 提供本底数据和了解常见呼吸道病原的疾病负担, 为我国呼吸道病毒感染的预防控制提供基础数据, 为呼吸道传染病的监测预警提供依据 ; 通过大规模重点基因和全长基因组序列测定, 对重要呼吸道病毒基因的生物信息学分析, 明确研究期间病毒基因的变异情况 ; 通过对重要呼吸道病毒包括冠状病毒和偏肺病毒的重要抗原表达, 初步进行人群血清流行病学分析, 为评估病毒的感染情况提供基础数据 ; 通过对常规筛查检测阴性的样本进行鼻病毒等扩大检测以及宏基因组学分析和检测, 开展未知病原检测鉴定的新技术 方法的建立, 发现未知病原, 通过常态的检测训练, 促进病毒检测新技术 新方法的应用 通过上述研究积累新发 突发病原的检测 分析技术体系, 增强未知病毒鉴定能力, 为我国突发呼吸道传染病疫情提供技术和人员保障 2

15 1. 呼吸道病毒感染病原谱的研究 ( 华北地区 ) 1.1 研究背景呼吸道病毒是人类呼吸道传染病的重要病原体, 因其传播快 流行广等特点对社会生活的危害尤其巨大 随着我国参与全球性活动的日益频繁, 对我国传染病的防控能力提出了更高的要求 我国目前尚缺乏系统 全面的人群呼吸道病毒本底情况的检测数据, 缺少对新发现病毒流行情况的本底调查, 不利于及时发现传染病的新流行态势 针对制约我国传染病研究和防控的主要因素之一, 即基础性科技工作滞后 ( 本底不清 标准菌毒株缺乏等 ) 现状, 本课题通过对北京地区及山东济南地区的成人和儿童呼吸道感染样本的常见呼吸道病毒的筛查, 初步获得了以北京和山东地区为代表的华北地区呼吸道病毒谱, 为我国呼吸道病毒感染的预防控制提供基础数据, 为呼吸道传染病的监测预警 提供依据 1.2 技术 方案 呼吸道样本, 血液样本 呼吸道细菌筛查 样本分装 -70 保存备 呼吸道 血样本 建立样本库 技 70 保存备 核酸提 血清学 术路线流 验证和深入 病毒核酸检 程图 分析备用 阳性结果 阴性结果 标本用于病毒分离和基因变异分析建立菌毒种库和数据库, 进行分子流行病学 标本用于扩大检测和未知病原检测分提高新发突发病原检测体系和未知病原分 3

16 1.2.2 病例定义 : 包括上呼吸道感染和肺炎 上呼吸道感染 : 表现发热 ( 体温 38 ), 并伴有乏力 头痛 咳嗽 咽喉疼痛 全身酸痛等上呼吸道症状 肺炎 : 指终末气道 肺泡和肺间质的炎症 发热 咳嗽, 常伴有气促 呼吸增快, 并伴有特征性胸部影像学表现 样本的采集和前处理选择符合急性上或下呼吸道感染病例进行样本和基本信息的采集 ; 标本采集时间覆盖各星期, 每周进行 3 次样本的分析 每年完成 4000 份样本的检测 上呼吸道感染采集鼻咽拭子 ; 下呼吸道感染成人采集痰液或鼻咽拭子及血液, 儿童采集鼻咽洗液或鼻咽拭子及血液 对于痰液需要进行合格痰检测 此外下呼吸道感染病例样本也可采集肺泡盥洗液 胸腔积液 检测内容及方法 : 1) 细菌学排查 对采集的样本进行常见细菌学检测包括肺炎链球菌 金黄色葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌 A 组链球菌 流感嗜血杆菌, 方法是痰培养和血培养, 下呼吸道样本必要时进行核酸检测, 排除已知细菌感染 4

17 2) 呼吸道病毒的筛查 细菌学筛查后的所有样本均进行常见呼吸道病毒包括流感病毒 呼吸道合胞病毒 副流感病毒 冠状病毒 偏肺病毒 博卡病毒 腺病毒和鼻病毒等的核酸检测 核酸的提取 : 取 200µl 标本用于核酸的提取 核酸提取后适当分装, 至少在 -70 冰箱内保存 1 份备份核酸, 便于后续研究和抽样检测 核酸的检测 1 核酸检测方法 :RNA 病毒的检测采用逆转录 - 聚合酶链式反应 (RT-PCR) 方法,DNA 病毒的检测采用 PCR 方法 2 污染控制方法 : PCR 污染控制是 PCR 检测操作人员必须非常注意的一项重要内容 严格分区操作, 配液区 加样区 扩增区 电泳区 EB 可能致癌, 要划定专门的 EB 污染区 操作过程中不许交谈和频繁外出, 无关人员不得进入配液区 大量配液连续操作 2 小时应休息 消毒台面后再进行后续工作 严禁将任何核酸样品带入配液区 加样区 PCR 操作柜内只允许进行核酸模板加样操作, 不得用于 PCR 相关溶液的配制, 不得操作质粒 配液区 加样区和电泳区的移液器均为专用, 不得带出相应的区域 每次实验完毕应用 75% 酒精擦拭消毒 建议加样区的移液器每半月轮换静止一次 及时 定期的 ( 仪器和工作区 ) 卫生消毒 ; 移液器的定期清洗 5

18 和消毒 3 各种病毒 RT-PCR 或 PCR 检测的引物及程序见表 1 6

19 病毒名称 Influen za A/B/C, RSV A/B 1 PIV 1/2/3/4, EV, RV 2 表 1. 呼吸道病毒核酸检测引物信息及扩增条件 引物序列 (5-3 ) 扩增基因 扩增条件 片段长度 (bp) RT-PCR( 第一轮 ) 48 45min FluAC1- F GAACTCRTYCYWWATS WCAAWGRRGAAAT 94 C 3min ACAGAGATAAAGAAGA NP FluB1-F GCGTCTACAA 94 C 30sec FluABC 2-R ATKGCGCWYRAYAMW CTYARRTCTTCAWAIGC 55 C 1min 45 cycles RSVAB1 -F ATGGAGYTGCYRATCC WCARRRCAARTGCAAT 72 C 30sec RSVAB2 AGGTGTWGTTACCCTG -R CATTRACACTRAATTC F 72 C 10 min 巢式 PCR( 第二轮 ) FluAB3-F GATCAAGTGAKMGRR AGYMGRAAYCCAGG 95 C 4 min Influen za FluC3-F AAATTGGAATTTGTTC CTTTCAAGGGACA 94 C 30 sec (A) 301 FluAC4-R TCTTCAWATGCARSWS MAWKGCATGCCATC 55 C 1min 35 cycles (B)226 CTTAATATGGAAACAG FluB4-R GTGTTGCCATATT NP 72 C 30 sec (C)111 RSVA3-F TTATACACTCAACAAT RCCAAAAAWACC 72 C 10 min RSV RSVA4-R AAATTCCCTGGTAATC TCTAGTAGTAGTCTGT (A)363 RSVB3-F ATCTTCCTAACTCTTGC TRTTAATGCATTG (B)611 RSVB4-R GATGCGACAGCTCTGT TGATTTACTATG F RT-PCR( 第一轮 ) 1PIV13 AGGWTGYSMRGATAT AGGRAARTCAT 48 45min CTWGTATATATATRTA 2PIV13 GATCTTKTTRCCTAGT 94 C 3min TAATTCCTCTTAAAATT HA 1PIV2 GACAGTATCGA 94 C 30sec 1PIV4 ATCCAGARRGACGTCA CATCAACTCAT 55 C 1min 45 cycles 2PIV24 TRAGRCCMCCATAYA MRGGAAATA 72 C 30sec 1-EV/RV CTCCGGCCCCTGAATR YGGCTAA 72 C 10 min 2-EV/RV TCIGGIARYTTCCASYA CCAICC 巢式 PCR( 第二轮 ) ACGACAAYAGGAARTC 3PIV13 ATGYTCT 95 C 4 min GACAACAATCTTTGGC 4PIV1 CTATCAGATA 94 C 30 sec 4PIV3 GAGTTGACCATCCTYC TRTCTGAAAAC HA 55 C 1min 35 cycles CYMAYGGRTGYAYTM 3PIV24 GAATWCCATCATT 72 C 30 sec GCTAGATCAGTTGTGG 4PIV2 CATAATCT 72 C 10 min PIV1: 439 PIV2: 297 PIV3: 390 PIV4: 174 EV: 226 7

20 PIV 1/2/3/4, EV, RV 2 4PIV4 3-EV/RV 4-EV/RV TGACTATRCTCGACYT TRAAATAAGG ACCRASTACTTTGGGTR WCCGTG CTGTGTTGAWACYTGA GCICCCA ( ) RV: 110 ( ) hmpv MPV P-F MPV P-R TyAACATTGCwACAGC AGGACC CTTCWGATTCWCCRCT TGTGCT P 48 C 45 min 94 C 3 min 94 C 30 sec 54 C 30 sec 40 cycles 72 C 1 min 72 C 10 min 247 HCoV 3 hcov-f hcov-r GGTTGGGACTATCCTA AGTGTGA CCATCATCAGATAGAA TCATCATA POL 48 C 45 min 94 C 3 min 94 C 30 sec 48 C 30 sec 40 cycles 72 C 1 min 72 C 10 min 440 AdV 4 ADV-F ADV-R GCCSCARTGGKCWTAC ATGCACATC CAGCACSCCICGRATGT CAAA Hexo n 94 C 3 min 94 C 30 sec 55 C 30 sec 40 cycles 72 C 1 min 72 C 10 min 301 巢式 PCR( 第一轮 ) 94 C 3 min AK-VP-F 1 CGCCGTGGCTCCTGCT CT 94 C 35 sec 10 cycles, 每 58 C 1 min 个 cycle 72 C 1 min 降 0.5 C 94 C 30 sec 611 HBoV 5 AK-VP-R 1 巢式 PCR( 第二轮 ) AK-VP-F 2 AK-VP-R 2 TGTTCGCCATCACAAA AGATGTG GGCTCCTGCTCTAGGA AATAAAGAG CCTGCTGTTAGGTCGTT GTTGTATGT VP1/ VP2 54 C 45 sec 30 cycles 72 C 45 sec 72 C 10 min 94 C 3 min 94 C 35 sec 10 cycles, 每 60 C 1 min 个 cycle 72 C 1 min 降 0.5 C 94 C 30 sec 54 C 45 sec 30 cycles 72 C 45 sec 72 C 10 min 576 8

21 1.3 研究结果课题组参加单位集中在北方, 采集的病例主要来自北京 山东和河北等北方地区, 占总采集病例的 98.5% 按照技术方案要求, 每日进行急性上呼吸道感染和肺炎病例的样本采集, 病例年龄分布从 0 岁至 85 岁以上 经过连续两年的常见呼吸道病毒筛查研究, 共采集 8838 例急性呼吸道感染病人的共 份样本, 包括呼吸道样本和血样本, 每份病例均具备完整的临床信息表 共完成 8853 份样本常见呼吸道病毒筛查 对其中 7161 份样本进行了鼻病毒和肠道病毒的扩大检测 初步获得北京 山东等北方地区急性呼吸道感染呼吸道病毒谱 系统分析了各种常见呼吸道病毒和细菌感染与临床症状的联系, 部分揭示了呼吸道病毒的地区 人群和季节差异为疾病鉴别和临床诊断提供依据, 结果简述如下 : 不同地区之间的差异, 同一年龄人群中北京地区的病毒谱与山东地区略有不同 ; 不同年龄人群中的差别, 如流感病毒在成人呼吸道感染病例中检出率最高, 而在儿童样本中以呼吸道合胞病毒的检出率最高 ; 不同季节的流行差异, 每种呼吸道病毒在不同季节中流行丰度不同, 如流感病毒在夏季和冬季均可出现流行的峰, 副流感病毒主要在春季检出较多 上述结果部分揭示了北方地区急性呼吸道感染患者呼吸道病毒谱流行情况, 为评估疾病的临床负担提供了基线数据 关于呼吸道病毒谱的研究数据及具体分析结果参见附录 A 2. 常见重要呼吸道病毒在我国流行特征的系统研究 我国在呼吸道病毒的基础研究上还存在不足, 对除流感以外的常 9

22 见的重要呼吸道病毒的流行特征还不完全清楚 因此我们在上述病毒谱研究的基础上, 进一步对常见和重要呼吸道病毒的流行特点及与临床症状的关系进行深入分析包括常见的 7 种共 17 个亚型的呼吸道病毒, 其中包括对以前认为的与致病性关系不大的 4 种共 8 个亚型的病毒进行了系统研究, 这些数据的获得为重新评估病毒的病原学意义提供了新的线索和参考 为进一步揭示其遗传变异特征及与临床疾病的联系打下了基础, 为认识 防控相关疾病提供了支撑, 为开展相关研究 提升我国呼吸道传染病新发病原体监测技术能力打下了基础 2.1 冠状病毒人冠状病毒 (Human Coronavirus, HCoV) 包括 OC43 229E NL63 HKU1 和 SARS-CoV, 其中 NL63 HKU1 是继 SARS-CoV 后发现的冠状病毒家族新成员 虽然在 SARS 后 HCoV 的致病性得到了更大的关注, 但是我国尚缺乏系统全面的 HCoV 流行特征数据, 限制了对其异常流行动态的监测 本课题组首次进行了以北京为代表的北方地区急性呼吸道感染成人大样本 长时间包括全亚型 HCoV 的研究, 分析了其流行特点和临床感染特征 检测方法参见表 1, 将获得的 440bp 序列进行测序和比对分型, 对阳性病例的临床数据采用卡方检验和 t 检验方法进行统计学分析 结果表明 HcoVs 在研究期间各年均有检出, 但每种 HcoV 的检出率有差异, 详见表 2 HCoV-OC43 229E HKU1 和 NL63 均可以在成人呼吸道感染样本中检出, 虽然 HCoV 在 65 岁以上老人检出率较高, 但 NL63 在年轻人中的检出率明显低于其他年龄组 ( 表 3), 为评估不同亚型人群感染特点提供参考 在临床表现上, 除了常见的呼吸道症状,229E 阳性患者伴有呕吐,HKU1 阳性者很少有痰, 促进了对冠状病毒致病性的了解 ( 表 4), 为评估其疾病负担提供信息 在季节分布上, 与国际传统观点认为 10

23 OC43 和 229E 是冬春季流行的毒株不同的是, 在所监测的时间内 ( 年 ),OC43 的流行主要集中在夏季和初秋,229E 则主要在春夏流行,OC43 229E 和 NL63 有两年流行一次的特征 ( 图 1), 其中 NL63 的流行特征为首次报道 为地域化监测提供了基础数据 6 表 2. 冠状病毒阳性病例的各年检出情况 Year HCoV 2005 (n = 1156) 2006 (n = 179) 2007 (n = 2214) 2008 (n = 1367) 2009 (n = 480) OC43* 6 (0.5) # 6 (0.2) 33 (1.5) 2 (0.2) 3 (0.6) 229E 6 (0.5) 0 3 (0.1) 0 6 (1.3) HKU1 1 (0.1) 8 (0.3) 1 (0.1) 3 (0.2) 1 (0.2) NL63 2 (0.2) 2 (0.1) 4 (0.2) 0 0 Total cases* 15 (1.3) 16 (0.5) 41 (1.9) 5 (0.4) 10 (2.1) 阳性病例占总检测例数的百分比 *χ² = , P < # 表 3. 冠状病毒阳性病例在不同年龄人群中的检出情况 25yrs 26 65yrs >65yrs Total (%) No. of detected OC43 11 (1.0) # 24 (0.8) 15 (3.6) 50 (0.6) 229E 6 (0.4) 8 (0.5) 1 (2.5) 15 (0.2) HKU1 5 (0.2) 5 (0.1) 4 (0.7) 14 (0.2) NL63 5 (0.2) 1 (0.02) 2 (0.3) 8 (0.1) Total (%)* 27 (1.0) 38 (0.8) 22 (3.6) 87 (1.0) # 阳性病例占总检测例数的百分比 *χ² = , P < 表 4. 冠状病毒阳性者临床表现和特点 Parameters HCoV (%) OC43 229E HKU1 NL63 No. of patients Age range (year) Age mean/median (year) 47.3/ / / /18.5 Gender (M/F) 16/34 6/9 7/7 6/2 URTI 45 (90.0) # 15 (100) 12 (85.7) 7 (87.5) LRTI 5 (10.0) 0 2 (14.3) 1 (12.5) Clinical symptoms Cough 26 (52.0) 7 (46.7) 6 (42.9) 4 (50.0) Sputum production 6 (12.0) 3 (20.0) 0 2 (25.0) 11

24 # Headache 34 (68.0) 11 (73.3) 9 (64.3) 6 (75.0) Muscle pain 29 (58.0) 12 (80.0) 12 (85.7) 6 (75.0) Sore throat 33 (66.0) 12 (80.0) 8 (57.1) 6 (75.0) Chilly 37 (74.0) 12 (80.0) 11 (78.6) 6 (75.0) Vomiting 1 (2.0) 12 (80.0) 0 0 Runing nose 36 (72.0) 12 (80.0) 9 (64.3) 5 (62.5) Sneezing 30 (60.0) 12 (80.0) 8 (57.1) 4 (50.0) Peripheral blood tests Mean leukocyte count 7.5± ±1.8 * 8.1± ±1.8 ( 10 9 /L) Co-detection 5 (10.0) 4 (26.7) 2 (14.3) 0 EV (n = 2) PIV3 (n = 2) EV+HRV (n = 1) HRV (n = 2) IFVA (n = 1) IFVB (n = 1) HRV (n = 1) PIV3 (n = 1) 阳性病例占总检测例数的百分比 *Student s t-test: P = 0.013, LRTI, 下呼吸道感染 ; URTI, 上呼吸道感染 ; PIV, 副流感病毒 ; EV, 肠道病毒 ; IFV, 流感病毒 ; HRV, 鼻病毒 图 1. 冠状病毒流行季节性分布 2.2 腺病毒腺病毒 (Adenovirus, AdV) 在许多临床疾病中扮演重要角色 目前腺病毒已经至少鉴定出 56 个血清型, 进一步分为 6 个亚群 (A~F), 而不同亚群的腺病毒会导致不同的疾病 腺病毒对儿童的感染率高于成人, 在我国对儿童 AdV 的感染的研究较多, 但是其在成人急性呼吸道感染中的流行情况的研究较少 AdV 感染后可根据病毒型别 病人免疫状况和其他健康因素等患者表现为从无症状到致死感染, 因此明 12

25 确成人中腺病毒的流行率及流行的血清型对于了解其临床负担非常重要 本课题对上万份成人呼吸道感染病例中腺病毒 (AdV) 的 Hexon 基因进行扩增 ( 检测方法见表 1), 并进行序列分析, 对于 hexon 基因扩增阳性的样本, 进行序列比对, 并进一步用其它 PCR 方法对结果进行验证, 首先用针对 E1A 基因的多重 PCR 方法对 B C 和 E 亚群进行扩增和验证,B 亚群阳性样本进一步用针对 hexon 基因另一区段的多重 PCR 对 3 7 和 21 型腺病毒进行扩增和验证 ;Hexon 基因扩增阳性的 14 型腺病毒利用 hexon 基因另一区段扩增进行扩增和验证 ( 表 5) 基因分析提示, 我国成人急性呼吸道感染病例样本中的 AdV 主要为 B C 和 E 群, 以 B 群 和 11 血清型为主, 其中 3 型腺病毒的感染最多 ( 图 2), 各群的季节流行情况参见图 3, 其中 4 7 和 11 型在春夏季流行, 但 4 型在冬季出现高峰 感染年龄主要集中在青壮年 这一研究数据为全面了解腺病毒在我国人群中的流行和评估临床负担提供了基线数据 表 5 腺病毒验证引物序列 primer Sequence (5'-3') Target Amplicon (bp) BCE multiplex Ad(E1A)B F CGGAGCT(G/T)CCTGGACATG AdB E1A 319 Ad(E1A)B R GCTTAGGCTTCACAGGAATG AdB E1A 319 Ad(E1A)C F GGTGATCGATCTTACCTG AdC E1A 410 Ad(E1A)C R CTCAGGAGGTGTGTTAGAAGG AdC E1A 410 Ad(E1A)E F CTGCACGATTTGTATGATCTGG AdE E1A 222(Ad4a) Ad(E1A)E R CCTGCTCGTICTCATCATCG AdE E1A 225(Ad4p) Ad3/Ad7/Ad21 multiplex Ad3 F GGTAGAGATGCTGTTGCAGGA Ad3 hexon 502 Ad3 R CCCATCCATTAGTGTCATCGGT Ad3 hexon 502 Ad7F GGAAAGACATTACTGCAGACA Ad7 hexon 311 Ad7R AATTTCAGGCGAAAAAGCGTCA Ad7 hexon 311 Ad21F GAAATTACAGACGGCGAAGCC Ad21 hexon 237 Ad21R AACCTGCTGGTTTTGCGGTTG Ad21 hexon

26 Ad14 Ad14F AAATGCTAATCTTGGACAGCAGTC Ad14 hexon 324 Ad14R AGCCGTCCAGTGGAAAACAGTAGT Ad14 hexon 324 图 2. 腺病毒基因进化分析 14

27 图 3. 腺病毒流行季节性分布 2.3 副流感病毒副流感病毒 (Human Parainfluenzavirus, HPIV) 是常见的呼吸道病毒, 有 1-4 个基因型, 对 HPIV1-3 的致病性研究较多, 由于 HPIV-4 难培养且常不作为常规检测病原, 因此对 HPIV-4 的致病性认识不足 本课题在呼吸道病毒谱筛查的基础上, 选取副流感病毒阳性病例详细比较分析了 HPIV4 型在儿童下呼吸道感染病例中的临床流行特点 ( 表 6), 明确 HPIV-4 也是引起下呼吸道感染的重要病原, 与 HPIV-1 2 不同,HPIV-4 可在春夏秋三个季节流行, 具有特征性的流行特点 ( 图 4), 与其他病毒的共检出率低于其他三个型 ( 表 7) 这一发现为 明确 HPIV-4 的致病性提供了参考 8 表 6. 副流感病毒感染的临床表现特点 Parameters HPIV (%) HPIV-1 HPIV-2 HPIV-3 HPIV-4 No. of patients Age, months 0-<6 13 (25.5) 2 (18.2) 63 (41.7) 8 (32.0) 6-<12 15 (29.4) 3 (27.3) 36 (23.8) 3 (12.0) 12-<36 19 (37.3) 3 (27.3) 38 (25.2) 3 (12.0) 36-<72 1 (2.0) 1 (9.1) 9 (6.0) 7 (28.0) (5.9) 2 (18.2) 5 (3.3) 4 (16.0) Gender (M/F) 34/17 6/5 108/43 14/11 15

28 Clinical symptomes Cough 48 (94.1) # 11 (100.0) 148 (98.0) 22 (88.0) Sputum production 27 (52.9) 10 (90.9) 108 (71.5) 16 (64.0) Chilly 5 (9.8) 3 (27.3) 11 (7.3) 2 (8.0) Running nose 20 (39.2) 5 (45.5) 39 (25.8) 6 (24.0) Sneezing 11 (21.6) 4 (36.4) 23 (15.2) 6 (24.0) Wheezing 18 (35.3) 3 (27.3) 50 (33.1) 8 (32.0) Vomiting * 3 (5.9) 3 (27.3) 2 (1.3) 2 (8.0) Diarrhoea 2 (3.9) 1 (9.1) 11 (7.3) 1 (4.0) Pneumonia 32 (62.7) 7 (63.6) 94 (62.3) 20 (80.0) Bronchopneumonia 8 (15.7) 1 (9.1) 23 (15.2) 2 (8.0) Bronchitis 6 (11.8 ) 2 (18.2) 21 (13.9) 3 ( 12.0) Peribronchitis and others 5 (9.8) 1 (9.1) 13 (8.6) 0 # 阳性病例占总检测例数的百分比 ; * X 2 =18.906, P= 表 7. 副流感病毒的共检出 HPIV-1 HPIV-2 HPIV-3 HPIV-4 Positive cases single detection 19 (37.3) # 4 (36.4) 42 (27.8) 14 (56.0) Co-detection* 32 (62.7) 7 (63.6) 109 (72.2) 11 (44.0) 1 virus 28 (54.9) 5 (45.5) 74(49.0) 11 (44.0) 2 virus 6 (11.8) 1 (9.1) 35 (23.2) 5 (20.0) 3 virus 2 (3.9) 2 (18.2) 4 (2.6) 0 4 virus (1.3) 0 Frequency of co-detected respiratory viruses HPIV-1 _ HPIV-2 0 _ 1 0 HPIV _ 3 HPIV _ RSV Rhinovirus Adenovirus Human metapneumovirus Human bocavirus Influenza virus Human Coronavirus Enterovirus WU /KI polyomavirus # 阳性病例占总检测例数的百分比 * X 2 =8.263, P=

29 图 4. 副流感病毒的季节性分布 2.4 偏肺病毒人偏肺病毒 (human metapneumovirus, hmpv) 是近年新发现的呼吸道病毒, 在儿童急性呼吸道感染中有重要临床意义 目前对其研究多集中在儿童 老人和免疫功能受损的成人群体 其在免疫功能正常成人急性呼吸道感染中的角色尚不明确 本课题组首次在免疫功能正常的急性呼吸道感染成人病例中进行了大样本的 hmpv 病原学研究, 对其在成人呼吸道感染中的临床意义进行了评估 本研究从 2008 年 07 月到 2010 年 06 月收集了北京地区急性呼吸道感染就诊成人病例 例 ( 约 22 例 / 天 ) 的鼻咽拭子, 从中选取了 2936 例 ( 约 4-5 例 / 天 ) 进行 hmpv 流行特点研究, 入组标准是 : 急性呼吸道感染的 14 岁以上成人, 急性发热 ( 体温 38 ) 且白细胞水平正常或偏低 收集的鼻咽拭子放入病毒转运液 (VTM) 中, 置 -80 保存 冻存的鼻咽拭子提取总核酸后用 RT-PCR 方法检测 hmpv RT-PCR 上游引物为 :5 -TYAACATTGCWACAG-3, 下游引 17

30 物为 :5 CTTCWGATTCWCCRCTTGTGCT-3,RT-PCR 扩增条件为 48 45m in,94 3m in,94 30sec,55 30sec,72 30sec,35 个循环,72 10min, 扩增片段为 240bp, 所有阳性扩增片段均经克隆测序验证 hmpv 在免疫健全成人中的检出率为 1.7%, 单月最高检出率可达 7.7%, 在流行高峰期间的平均月检出率为 6.6% hmpv 的流行趋势在两年中各有不同,hMPV 的流行高峰在 年以冬春季为主 (2008 年 11 月到 2009 年 03 月 ), 在 年以 2010 年春夏季为主 (2010 年 03 月 -06 月 ), 而在 2009 年冬季未出现 hmpv 流行高峰 ( 图 5) 上述数据表明,hMPV 在北京地区免疫健全成人中的流行高峰并非仅在每年冬春季, 春夏季也是其可能的流行高峰时间 我们需要更长时间跨度的研究以确定 hmpv 在北京地区免疫健全成人中流行规律 hmpv 的感染多见于 65 岁以上老人 ( 表 8) 虽然在成人病例中 hmpv 的检出率低于常见的流感病毒和副流感病毒等, 但高于冠状病毒和腺病毒等, 提示 hmpv 在成人急性呼吸道感染中病原学 意义应该引起重视 9 18

31 图 5. 偏肺病毒的季节性分布 表 8. 偏肺病毒在呼吸道感染病例中的临床特点 hmpv subtypes Parameters A2 B1 B2 No. of positive patients Age range (year) Mean/median age (year) 51.3/ / /32 Gender (M/F) 5/9 5/14 6/10 URTI 14 (93.3) * 18 (94.7) 16 (100) LRTI 1 (6.7) 1 (5.3) 0 Clinical symptoms Cough 9 (64.3) 12 (63.2) 9 (56.3) Sputum production 7 (50) 9 (47.4) 9 (56.3) Headache 8 (57.1) 14 (73.7) 14 (87.5) Muscle pain 6 (42.9) 13 (68.4) c 5 (31.3) Sore throat 11 (78.6) 13 (68.4) 9 (56.3) Chills 10 (71.4) 16 (84.2) 11 (68.8) Vomiting (6.25) Rhinorrhea 10 (71.4) 14 (73.7) 6 (37.5) Sneezing 8 (57.1) 12 (63.2) 5 (31.3) Peripheral blood tests Mean leukocyte count ( 10 9 /L) 6.8 ± ± ± 1.4 Co-detection 3 3 IFVA (n=2) IFVA (n=2) EV (n=1) IFVB (n=1) # 阳性病例占总检测例数的百分比 19

32 2.5 呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncitial Virus, RSV) 是导致儿童肺炎的重要病原, 在儿童呼吸道感染中的研究报道很多 但其在全人群中流行的基因型尚未完全阐明, 不利于监测其分子流行趋势 本课题组在病毒谱分析的基础上进一步统计分析了 RSV 在成人呼吸道感染中的流行情况, 明确了 年我国北方地区成人呼吸道感染样本中 RSVA 与 B 基因型交替流行情况 ( 图 6), 为评估 RSV 的分 子流行特点提供了参考数据 10 图 6. 呼吸道合胞病毒各基因型的季节流行特点 此外, 在呼吸道细菌感染方面, 系统分析了不同细菌感染导致的获得性肺炎患者的临床特征 : 肺炎链球菌肺炎患者往往合并基础病 外周血白细胞增高明显 ; 肺炎支原体肺炎患者往往年轻 基础病不多 咯痰症状少见 ; 病毒性肺炎胸片和 CT 表现为边界不清楚的结节影多见 肺炎支原体肺炎患者喹诺酮比大环内酯类抗生素疗效好 20

33 3. 新发现呼吸道病毒在我国流行情况的研究近年来, 随着技术水平的提高, 新的呼吸道病毒不断被发现, 给传染病的控制带来更多的挑战 突发和不明原因传染病病原体的检测能力是反映国家传染病应急能力的重要方面 开展突发和不明原因传染病监测研究, 阐明新发突发传染病的相关病原, 并对其流行进行预测和预警, 以探索建立有效的突发和不明原因传染病的监测 防控和研究策略, 锻炼和提升突发传染病事件中病因快速鉴定和应急反应的能力 本课题开展了国际上已经发现国内尚未报道的新发现的 3 种共 6 个亚型呼吸道病毒的研究, 对南方地区已经报道而华北地区尚未有报道的 1 种新病毒进行了研究, 在我国首次报道了这些流行情况不明的新发现呼吸道病毒, 初步获得其与临床症状的关系, 为评估其致病性提供重要参考 有关研究与国际同步, 达到国际先进水平 3.1 C 组鼻病毒鼻病毒 (Rhinovirus,HRV) 属于小 RNA 病毒科肠道病毒属, 包含 100 多个血清型, 一直分为 A (74 个血清型 ) 和 B(25 个血清型 ) 两个种 2007 年, 一种新的鼻病毒被陆续发现 11-19,2009 年被国际 病毒分类学委员会命名为鼻病毒的一个新的种 C 种鼻病毒 (HRV-C) 由于发现其与儿童急性下呼吸道感染的相关性, 其病原学研究越来越受到重视 继澳大利亚 香港等地发现 HRV-C 后, 本课题组对我国 2007 年 7 月到 12 月的 258 份急性下呼吸道感染儿童呼吸道样本的核酸用针对 5 -NCR-VP4/VP2 区自行设计的引物进行了 RT-PCR 检测, 上游引物为 :5 - ACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC -3, 下游引物为 :5 TTTCCRATAGTGATTTGCTTKAGCC -3,RT-PCR 21

34 扩增条件为 48 45min,94 3min,94 30sec,55 30sec,72 30sec, 35 个循环,72 10min, 扩增片段大小为 330bp 检测到 14 份样本中有 C 种鼻病毒, 首次报道了 HRV-C 在我国的存在 18, 继而对其基因进化情况 流行特点和可能的致病性进行了详细分析 发现 HRV-C 在我国北方流行季节集中在秋冬季, 可能与儿童急性下呼吸道感染有关 进化分析发现在我国同时流行多株 HRV -C( 图 7) 绘制了其抗原蛋白空间结构模拟图 ( 图 8), 为评估其潜在的流行性提供了数据参考 BCH221Oct07 (EU687518) 88 BCH264Oct07 (EU687523) 99 BCH200Oct07 (EU687515) 100 HRV C025 (EF582386) BCH341Dec07 (EU687527) 77 BCH217Oct07 (EU687516) 100 BCH250Nov07 (EU687522) 42 HRV C024 (EF582385) BCH237Oct07 (EU687519) 97 QPID (EU155158) NAT045 (EF077280) 63 BCH297Nov07 (EU687525) 100 QPID (EU155154) 100 BCH242Oct07 (EU687520) Picornaviridae str. tu403 (EU ) HRV-C 90 BCH220Oct07 (EU687517) 97 QPID (EU155153) NAT001 (EF077279) QPM (EF186077) HRV C026 (EF582387) QPID (EU ) BCH277Nov07 (EU687524) BCH336Nov07 (EU687526) BCH249Nov07 (EU687521) BCH343Dec07 (EU687528) 100 NAT083 (EF077264) 98 Picornaviridae str (EU081811) HRV78 (EF173418) HRV28 (DQ473508) 99 HRV23 (DQ473497) HRV10 (DQ473498) 43 HRV76 (DQ473502) 28 HRV-A HRV16 (L24917) HRV1B (D00239) HRV12 (EF173415) 24 HRV7 (DQ473503) 65 HRV89 (NC ) HRV35 (DQ473487) 91 HRV17 (EF173420) 100 HRV52 (EF173424) 77 HRV4 (DQ473490) HRV-B 27 HRV27 (EF173421) 24 HRV6 (DQ473486) 60 HRV14(K02121) 0.05 图 7. HRV-C 抗原基因进化分析 22

35 图 8.C 种鼻病毒 (BCH019) 抗原蛋白 VP1 空间模拟图 HRV 一直被认为仅导致普通感冒且致病性不强的呼吸道病毒, 随着对 HRV-C 病原学研究的深入, 发现 HRV 的致病性可能被低估了 我国目前尚缺少 HRV 流行特征等数据, 为全面了解 HRV 的流行特点和评估其临床意义, 本课题组进一步系统研究了 HRV 在我国成人和儿童呼吸道感染人群中的流行 基因进化及与临床症状的关系 因为 HRV 血清型较多, 不可能用一对引物来扩增出所有临床样本中的 HRV, 本课题组采用三对不同的引物用 nested RT-PCR 或 RT-PCR 的方法对 2005 年 12 月到 2008 年 4 月的 6104 份成人急性上呼吸道感染和 2007 年 4 月到 2008 年 3 月的 554 份儿童下呼吸道感染的呼吸道样本中所有的 HRV 进行了扩增 除了上述扩增 HRV-C 的引物外, 其他两对引物的序列和方法如下 第一种方法为巢式 PCR 20, 第一轮上游引物 P1-1 : 5 -CAAGCACTTCTGTYWCCCC-3, P3-1 : 5 - ACGGACACCCAAAGTAG-3 ; 扩增条件为 48 45min,94 3min, 94 20sec,68-52 ( 每次降低 2, 每个退火温度两个循环降低至 52 循环 12 次 )40sec,35 个循环,68 5min 第二轮引物 P1-1:5 -CAAGCACTTCTGTYWCCCC-3, P2-1:5 -TTAGCCACATTCAGGGGC-3, P2-1:5 -TTAGCCACATTCAGGAGCC-3,P2-3:5 -TTAGCCGCATTCA 23

36 GGGG-3, 扩增条件为 94 2min,94 20sec,52 20sec,68 40sec, 28 个循环,68 3min, 扩增片段大小为 300bp 第二种方法为一步法扩增, 上游引物 5 - GGGACCAACTACTTTGGGTGTCCGTGT, 下游引物 :5 - GCATCIGGYARYTTCCACCACCANCC -3 ; 扩增条件为 48 45min,94 3min,94 30sec,58 30sec,72 30sec,35 个循环,72 10min 扩增片段大小为 550bp21 我们发现成人和儿童均以 HRV-A 为主, 但在儿童呼吸道感染病例中 HRV-C 与 HRV-A 的检出率相近 ( 图 9), 在成人中与 HRV-B C 比较,HRV-A 导致上呼吸道感染比率更高, HRV-B 感染成人病例中全身症状如寒战 肌痛更明显 ( 表 9) 同时从基因水平对病毒抗原基因等的进化进行了分析 这一数据为重新认识 HRV 的致病性提供 了重要参考 22 表 9. 鼻病毒感染临床表现 HRV-A HRV-B HRV-C (N=154) (N=60) (N=25) χ 2 P Age, median (range) 30(14~87) 29 (14~82) 29(14~80) ND Male 70 (45.45%) 26(43.33%) 12 (48%) 0.17 P>0.05 Symptoms and signs Rhinorrhea 97 (62.99%) 27 (45%) 6 (24%) P<0.005 Sneezing 70 (45.45%) 21 (35%) 4 (16%) 8.55 P<0.025 Sore throat 106 (68.83%) 30 (50%) 11 (44%) P<0.01 Cough 85 (55.19%) 28 (46.67%) 12 (48%) 1.47 P>0.05 Swelling of tonsils 16 (10.39%) 6 (10%) 3 (12%) 0.06 P>0.05 Pharyngeal congestion 149 (96.75%) 57 (95%) 23 (92%) 1.35 P>0.05 Expectoration 40 (25.97%) 11 (18.33%) 7 (28%) 1.58 P>0.05 Abnormal breath sounds on auscultation 1 (0.65%) 3 (5%) 2 (8%) 6.78 P<0.05 Chilliness 107 (69.48%) 51 (85%) 16 (64%) 6.35 P<0.05 Rigors 8 (5.19%) 8 (13.33%) 1 (4%) 4.74 P>0.05 Myalgia 119 (77.27%) 49 (81.67%) 14 (56%) 6.70 P<0.05 Fever 38.1~39 C 137 (88.96%) 49 (81.67%) 19 (76%) 4.07 P>

37 39.1~41 C 17 (11.04%) 11 (18.33%) 6 (24%) 4.07 P>0.05 Headache 114 (74.03%) 47 (78.33%) 20 (80%) 0.71 P>0.05 Preliminary clinical diagnosis Upper respiratory 141 (91.56%) tract infection 49 (81.67%) 19 (76%) 7.18 P<0.05 Tonsillitis 1 (0.65%) 2 (3.33%) 0 ND Bronchitis 1 (0.65%) 0 0 ND Pulmonary infection 0 5 (8.33%) 2 (8%) ND Peripheral leukocyte count and classification NEUT% 76 (49.35%) 29 (48.33%) 14 (56%) 0.45 P>0.05 LYM% 107 (69.48%) 40 (66.67%) 19 (76%) 0.72 P>0.05 a b 图 9. 鼻病毒在成人 (a) 和儿童 (b) 急性呼吸道感染病例中的季节性分布特点 3.2 新型多瘤病毒 Wu 和 KI 多瘤病毒 (Polyomavirus, PyV) 是 2007 年从呼吸道感染样本发现的新病毒, 其在全球的流行特点和致病性还不清楚, 为传染病的防控带来隐患 本课题组对 417 例急性下呼吸道感染的儿童和 25

38 303 例免疫功能正常的急性下呼吸道感染的成人呼吸道样本采用普通 PCR 方法进行病毒检测, 方法参见文献 23 和 24 扩增产物经测序 分析验证 发现 WU 和 KIPyV 在呼吸道感染的儿童样本中有检出, 但是在免疫功能正常的急性呼吸道感染的成人样本中未检出, 且 WU 和 KIPyV 常与其他常见呼吸道病毒包括鼻病毒 副流感病毒和呼吸 道合胞病毒共检出 ( 表 10), 提示了这两种 PyV 的感染人群主要为 表 10. 急性呼吸道感染病例 WU/KI 多瘤病毒阳性病例临床表现 Patient no. Age/sex Date of collection Symptoms/ health deficiencies or sign BCH-151A 3.5 y/ F Aug 14 Cough, fever/ low O 2 sat BCH-370A 3.6 mon/ M Dec 15 Cough, gasping/ Premature (33w), patent foramen ovale, newborn wet lung, newborn aspiration pneumonitis, bronchopulmonary dysplasia BCH-004A 8.5 mon/m Mar 27 Cough, vomit, diarrhea, fever BCH-34A 2.2 mon/f Apr 12 Cough, gasping, fever/patent ductus arteriosus 26 Clinical diagnosis Time in hospital (days) Pathoge ns detected Peribronchitis KIPyV+ PIV2 Pneumonia 11 KIPyV Congestive heart failure Bronchopneumonia Myocardial damage 9 WUPyV +RSV Bronchopneumonia 9 WUPyV +HRV BCH-123A 2.7 mon/m Jul 30 Cough Bronchopneumonia 6 WUPyV +PIV3+ PIV4 BCH-172A 4.3 y/ M Sep 6 Cough, fever/patent foramen ovale Bronchopneumonia 12 WUPyV + MP BCH-200A 8 mon/ M Oct 15 Cough, gasping Peribronchitis WUPyV +HRV BCH-235A 2.9 y/ M Oct 29 Cough, fever, vomit, diarrhea Bronchopneumonia Myocardial 13 WUPyV +HRV damage BCH-259A 2.7 y/ M Nov 8 Cough, fever Pneumonia 14 WUPyV Pleural effusion +HRV BCH-312A 1.2 y/ M Nov 22 Cough Bronchopneumonia 15 WUPyV +HRV+ RSV BCH-313A 11 mon/ M Nov 25 Cough, vomit, fever/ metabolic acidosis BCH-404A 7.4 y/ F Dec 24 Cough, nausea, vomit, fever Bronchopneumonia Cardiac insufficiency 7 WUPyV +HRV+ RSV Pneumonia 7 WUPyV + RSV+ MP

39 婴幼儿, 可能与加重其他病毒的感染有关 25 在研究中首次明确 WUPyV 在腹泻病人粪便中的存在 26, 为明确其致病性提供新的线索 3.3 博卡病毒人博卡病毒 (Human Bocavirus, HBoV) 是近年新发现的病毒, 已经明确有 4 个基因型 (HBoV1-4) HBoV1 是 2005 年从呼吸道感染样本中发现的,HBoV2,3 和 4 型分别是 2009 年和 2010 年从粪便样本中新发现的亚型 因 HBoV 多与其他病毒共感染, 其致病性尚不清楚 HBoV1 经常在上下呼吸道感染的样本中检出, HBoV2 经常在粪便样本中检出, 而国际上对于 HBoV3 4 的流行情况 分子特征和临床意义研究较少, 且我国对 HBoV1-4 型的感染情况尚不明确 因此我们系统分析了 HBoV3 及 1 2 和 4 型在儿童急性胃肠炎和儿童急性下呼吸道感染病例中的流行特点 本研究采集了 366 份急性胃肠炎患儿腹泻粪便样本, 利用巢式 PCR 扩增 VP1/VP2 区域 576bp 大小片段, 并对 PCR 产物进行测序, 进一步对扩增序列进行进化分析 ( 引物序列参见表 1) 结果显示, 在 366 份样本中,44 份 (12%) 为 HBoVs 阳性, 其中 9 份 (2.5%) 为 HBoV1,33 份为 HBoV2(9%),2 份 (0.5%) 为 HBoV3, 未检测到 4 型的存在 本研究首次报道了我国儿童急性胃肠炎粪便样本中 HBoV3 的存在, 粪便样本中以 HBoV2 的感染为主,HBoV3 型感染主要集中在 5 岁以下儿童, 均与轮状病毒共感染 ( 表 11), 进化分析表明与已报道的 HBoV 基因同源 ( 图 10) 27 系统分析了 HBoV1-4 型与急性下呼吸道感染的临床关系 在 2008 年 3 月至 2010 年 7 月期间, 急性下呼吸道感染儿童呼吸道鼻咽抽吸物共 1238 份, 利用巢式 PCR 扩增 VP1/VP2 区域 576bp 大小片段, 并对 PCR 产物进行测序和进化分析 结果显示, 在 1238 份呼吸 27

40 道样本中,141 份 (11.4%) 为 HBoVs 阳性, 其中 131 份 (10.6%) 为 HBoV1 阳性,5 份 ( 0.4%) 为 HBoV2 阳性,5 份 ( 0.4%) 为 HBoV3 阳性, 未检测到 HBoV4 HBoVs 主要感染 5 岁以下的儿童 本研究在国际上首次报道了 HBoV3 在呼吸道样本中的存在, 明确在我国呼吸道样本中流行的主要为 HBoV1 型,2 3 型阳性者病毒载量较低, 未检测到 4 型的流行, 各亚型多与其他呼吸道病毒共检出 ( 表 12) 此外还发现在健康人群呼吸道样本中也有 HBoV1 的携带 ( 图 10) 28 这一系列研究为了解 HBoV 的流行特点和致病性提供了数据依据, 为国际上了解 HBoV 的基因型分布及其临床意义提供重要参考 表 11. 博卡病毒在急性胃肠炎病例粪便样本中的检出情况 Characteristic Value Symptom AGE Number tested 366 Nuimber (%)positive for HBoVs 44(12) Median age(months) 9.0 Number of patients infected (%) HBoV1 9(2.5) HBoV2 33(9.0) HBoV3 2(0.5) HBoV4 0(0) Co-detection in samples (%) Rotavirus 26(59.1) Norovirus 12(27.3) Sapovirus 0(0) Astrovirus 0(0) Adenovirus 0(0) 表 12. 博卡病毒在呼吸道感染病例中的临床特点 Parameters HBoV1 HBoV2 HBoV3 HBoV4 No. (%) positive* 131 (10.6) 5 (0.4) 5 (0.4) 0 Age range (months) NA# No. (%) of patients 5 years 124 (94.7) 4 (80) 4 (80) NA 28

41 Age mean/median (months) 19/ / /12 NA Male/female 72/59 3/2 4/1 NA Clinical manifestations (%) Fever 78 (59.5) 3 (60) 3 (60) NA Cough 131 (100) 5 (100) 5 (100) NA Sputum production 115 (87.8) 4 (80) 3 (60) NA Wheezing 65 (49.6) 3 (60) 4 (80) NA Runny nose 46 (35.1) 2 (40) 1 (20) NA Diarrhea 9 (6.9) 0 (0) 1 (20) NA Peripheral blood tests Mean leukocyte count ( 10 9 /L) 9.4± ± ±6.1 NA Codetection in samples (%) Rhinovirus 58 (44.3) 1 (20) 2 (40) NA Respiratory syncytial virus 42 (32.1) 2 (40) 2 (40) NA Parainfluenza virus 24 (18.3) 0 (0) 1 (20) NA Influenzavirus 11 (8.4) 1 (20) 2 (40) NA Conorovirus 15 (11.5) 0 (0) 0 (0) NA Adenovirus 14 (10.7) 0 (0) 1 (20) NA Human Metapneumovirus 16 (12.2) 0 (0) 0 (0) NA Enterovirus 2 (1.5) 1 (20) 0 (0) NA *χ2=234.1, P<0.01 图 10. 博卡病毒抗原基因 VP1/2 的进化分析 3.4 肠道病毒 EV68 和 CA21 型 EV68 和 CA21 是与呼吸道疾病密切相关的肠道病毒血清型 2008 年前很少有报道其流行 美国连续 36 年的监测中只发现有 42 例 29

42 CVA21 和 26 例 EV68 29 近年来很多国家 EV68 的爆发流行,EV68 在儿童中造成严重的呼吸道感染甚至死亡 我们对 2006 年 8 月 到 2010 年 4 月的 6942 份成人上呼吸道感染的样本采用巢式 RT-PCR 进行了肠道病毒的监测 36, 发现在成人急性呼吸道感染病例呼吸道样本出现 EV68 和 CA21 的高流行, 图 11 显示在成人急性呼吸道感染病例中不同型别肠道病毒的检出情况,EV68 主要出现在夏末和秋季, CA21 主要在秋冬季 表 13 显示了两种血清型检出的例数, 均有隔年流行的趋势 ( 图 12) CA21 感染的患者年龄明显低于 EV68 和其他血清型 ( 表 14) 37 其异常流行的分子机制和人群血清抗体免疫保护水平在进一步的探讨中 所获得的数据将有助于暴发流行的监测预警 图 11. 成人急性呼吸道感染呼吸道样本中 EV 的血清型分布 图 12. EV68 和 CA21 的季节分布 30

43 表 13. 成人急性呼吸道感染样本中肠道病毒 CA21 与 EV68 的检出情况 Year CVA21 EV68 Any HEV 2006Aug Dec 21 (41.2%) 11 (21.6%) Jan Dec 5 (16.1%) Jan Dec 8 (26.7%) 2 (6.7%) Jan Dec Jan Apr Total 34 (26.2%) 13 (10%) 130 表 14. CA21 与 EV68 阳性病例的临床表现 CVA21 (N=34) EV68 (N=13) Any HEV (N=130) Age, median (range) * 22 (15 67) 34 (18 67) 27.5 (15 70) Male 18 (52.9%) 7 (53.8%) 69 (53.1%) Female 16 (47.1%) 6 (46.2%) 61 (46.9%) Symptoms and signs Pharyngeal congestion 34 (100%) 13 (100%) 128 (98.5%) Headache 27 (79.4%) 10 (76.9%) 104 (80%) Myalgia 25 (73.5%) 9 (69.2%) 93 (71.5%) Chills 25 (73.5%) 7 (53.8%) 89 (68.5%) Sore throat 23 (67.6%) 7 (53.8%) 82 (63.1%) Rhinorrhea 17 (50%) 5 (38.5%) 50 (38.5%) Sneezing 14 (41.2%) 3 (23.1%) 44 (33.8%) Cough 7 (20.6%) 3 (23.1%) 19 (14.6%) Swelling of tonsils 6 (17.6%) 1 (7.7%) 16 (12.3%) Expectoration 4 (11.8%) 0 6 (4.6%) Rigors 1 (2.9%) 1 (7.7%) 4 (3.1%) Preliminary clinical diagnosis Upper respiratory tract infection 33 (97.1%) 13 (100%) 126 (96.9%) Tonsillitis (1.5%) Pulmonary infection (0.8%) Other viruses co-detected 1 (2.9%) 1 (7.7%) 8 (6.2%) Influenza virus A Influenza virus A Influenza virus A ( N=2) (N=1) ( N=1) Parainfluenza virus 3 ( N=2) Rhinovirus ( N=2) Metapneumovirus ( N=1) Coronavirus OC43 ( N=1) * CVA21 阳性病例的年龄明显小于其他 HEV (χ 2 =14.7, P<0.01) 31

44 4. 重要呼吸道病毒的变异变迁特征的初步揭示病原体的变异变迁与其流行特征 致病性和耐药性的改变密切相关, 从而可能引发传染病的大流行 因此对病毒变异特征和变迁趋势的研究将会为传染病预警提供重要的数据参考 本课题对 5 种常见和重要的呼吸道病毒展开基因变异特征分析, 包括偏肺病毒 流感病毒和博卡病毒等, 并逐步开展其抗原基因变异研究 为进一步研究病原体的变迁特点, 初步建立了病原体进化动力学分析方法, 为开展其他重要病毒的来源和变异及流行趋势和疾病的预警提供基础 4.1 偏肺病毒偏肺病毒是近年新发现的呼吸道病毒, 目前已经明确存在 A 和 B 两个基因型, A1 A2 B1 和 B2 四个亚型和 A2a A2b 两个亚系 其流行和变迁趋势还不清楚 在过去 10 年 ( 年 )hmpv 各亚型的流行特点分析数据表明 A2 亚型与其他亚型的流行高峰交替出现不同, 自 2001 年后其流行趋势逐渐增强, 并呈多年持续高流行 ( 图 13) 为探究 hmpv 亚型的系统进化特点与其流行趋势的关系, 本研究引入系统进化动力学研究手段, 初步建立了病毒系统进化特点研究体系, 并以偏肺病毒 (hmpv) 为模型, 初步建立了进化动力学分析体系 为阐述 A2 亚型 hmpv 持续性高流行与其系统进化特点的关系, 利用 GenBank 中递交的 hmpv 序列 (234 条 ) 和本室扩增序列 (60 条 ), 构建了基于 G 基因的系统进化分析体系, 绘制了分子钟进化图 ( 图 14), 获得了 hmpv 各亚型的系统进化特点 发现 hmpv-a2 型经历了与其他亚型不同的基因遗传多样性历史 ( 图 14,15),A2 亚 32

45 型遗传多样性自 1997 年后经历了多次跃升, 这与其多年的持续高流行一致 ( 图 15) 经分子地理学分析初步发现北京地区流行的 A2 亚型可能来最先来自荷兰 ( 图 16), 来自美国的 A2 亚型 hmpv 在本地区造成了更高程度的流行, 其原因可能是各国流行的 A2 亚型基因差异较大, 一个地区人群中 A2 亚型的中和抗体水平并不足以抵御另一地区引入的同亚型病毒, 因而在短期内造成 A2 亚型的更显著高流行 本研究还发现 A2 亚型 G 蛋白的某些氨基酸位点在时序进化过程中不断发生突变 ( 图 14), 提示这些位点可能是其免疫逃逸的关键位点, 对这些位点变异与病毒逃逸关系的进一步研究有助于深入了解宿主 免疫和病毒逃逸的机制, 并为 hmpv 病毒防控提供关键靶点信息 38 以 hmpv 为模型建立的病毒系统进化特点研究体系将用于分析其他 呼吸道病毒, 对于从分子水平上预测病毒可能的变异时间和了解其来 源提供了重要的分析方法 图 13. 偏肺病毒各亚型流行情况 33

46 图 14. 偏肺病毒分子进化分析 图 15. 偏肺病毒群体动力学分析 34

47 图 16. 偏肺病毒地理传播模式分析 4.2 博卡病毒 (HBoV) HBoV 有四个基因型, 我国流行的主要基因型和亚型尚不清楚, 在前期研究中我们通过基因序列的分析, 发现我国北京地区流行的 HBoV2 型均为 2A 型 且发现了 HBOV3 型的存在, 通过全序的扩增, 经过 Simplot 和 Bootscanning 方法分析分析发现我国的 HBoV3 型可能为 1 和 4 型重组的结果, 这一结果不同于已有的关于 HboV3 型可能由 1 型和 2 型重组的报道, 这为了解 HBoV 的进化提供新的参考数据 27 ( 图 17) 图 型博卡病毒的基因变异重组分析 35

48 4.3 流感病毒 在 2009 甲型 H1N1 流感病毒流行后, 为评估其对季节性流感病 毒和其他呼吸道病毒的流行的影响, 基于 年四个整年中流 感病毒流行数据 ( 图 18), 通过自主设计的引物和 real-timepcr 方 法进行分型 39, 发现华北区 2009 年 10 月甲型 H1N1 流感病毒流行前 以 H3N2 型流行为主, 在 2009 年 月则甲型 H1N1 的流行逐渐 被乙型流感病毒取代,2010 年 12 月仍以 H3N2 为主要流行毒株 ( 图 19) 甲型 H1N1 的流行除了对 HRV 的流行产生影响, 其他呼吸道 病毒的流行未受到明显影响 40 ( 图 20) % positive Week 71.4 图 18. 流感病毒各亚型的季节性流行情况 No. positive speciments IFVC IFVB IFVA (unsubtyped) IFVA (H1N1) 2009 IFVA (H1N1) IFVA (H3N2) % positive (Beijing) % positive (China) % positive (U.S.) % positive Week 图 甲型 H1N1 流感病毒流行期间各亚型的季节性流行情况 36

49 90 week 40 of of 2007 week 40 of of 2008 week 40 of of 2009 week 19 of of IFV A (H3N2) IFV A (H1N1) % positive IFV A (H1N1 2009) IFV B % positive HRV RSV AdV EV HMPV HPIV IFV C HCoV % positive Week 图 20. 流感病毒各亚型和其他呼吸道病毒的季节性流行情况 5. 呼吸道病毒抗体人群血清流行率的研究目前, 我国对人群呼吸道病毒本底情况及对新发现病毒流行情况尚缺乏系统 全面的数据, 不利于及时发现传染病的流行规律及流行态势 对重要呼吸道病毒进行血清学调查, 可以获得人群血清本底数据, 为呼吸道传染病的监测预警提供科技支撑 本课题首先利用建立的蛋白表达平台, 完成偏肺病毒 呼吸道合胞病毒 N 蛋白的表达纯化, 进行人群完血清流行病学分析 具体方法为 : 将纯化的 hmpv N 蛋白和 RSV N 蛋白分别用包被液 (ph9.6 的碳酸盐缓冲液 ) 进行稀释 (hmpv N 0.25μg/ml,RSV N 0.125μg/ml) 后包被酶标板按照常规 ELISA 方法进行检测, 测定 450nm 处的吸光值 以 Western blot 检测阴性的婴幼儿血清作为阴性对照, 计算其 OD 值的均数和标准差, 根据 cut-off= 均数 +3 标准差计算 cut-off 值,OD 值大于 cut-off 值判为阳性, 小于 cut-off 值判为阴性 结果表明 hmpv 37

50 和 RSV 在 6 岁以后的人群血清流行率达到 96% 以上, 其中 RSV 的血清抗体阳性率在 6 个月至 1 岁的婴儿中仅 59%, 与临床上 RSV 感染的主要是婴幼儿的情况相符 同时对不同人群中血清抗体滴度也进行了测定 ( 图 21), 揭示了其在不同年龄人群的感染水平和特征, 为 进一步评估各病毒的流行特点打下基础 41 本课题组还制备了包括博卡病毒 1-3 型 VP1 VP2 NS1 NP1, 偏肺病毒 N, 呼吸道合胞病毒 N, 流感病毒 H4 H6 H8 H10-H16 亚型 HA1 重组蛋白共计 24 种 42, 为进一步分析血清流行率做好材 料准备 图 21. 偏肺病毒和呼吸道合胞病毒抗体血清流行病学分析 38

51 6. 泛病原体监测技术在呼吸道传染病监测中的建立和应用本课题组通过与所内有关课题组合作, 将传统核酸检测技术与国际前沿宏基因组学技术有机结合, 探索将宏基因组学技术平台应用于病毒谱研究工作中 常规分子生物学筛查监测是针对已知病原体逐个排查, 通量低, 耗时长 当常规筛查阴性的样本, 普通分子检测技术不能有效进行深入分析 本课题将宏基因组检测方法引入呼吸道样本 检测中, 与其他课题组合作并利用建立的吸道样本宏因组检测体系 系统分析呼吸道样本中的微生物谱, 获得的数据可了解样本的本底, 是否存在病原, 是何种病原, 如图 22 所示, 实现从已知致病病原的检测到条件致病病原的发现和泛病原体检测的跨越 初步建立了基于呼吸道样本宏基因组学筛查分析的监测技术, 为我国呼吸道病毒监测技术体系的升级 换代并与国际先进水平接轨打下基础 43 图 22. 呼吸道样本宏基因组分析 7. 样本资源库的建设 在研究过程中, 建立了规范的样本库和毒株库 其中样本库中有 约两万千余例呼吸道感染病例样本 ( 含以前样本 ), 每份样本均有配 39

52 对血清和详细的背景资料包括临床信息表 常规呼吸道病毒检测结果 使用情况记录等一例一套的纸质文件 ( 图 23) 每份病例的呼吸道样本和血样本均分装 3 份, 按照使用和备份管进行存储, 每个管壁上均有唯一的编码便于后续样本的查询和使用 同时参照国际标准课题组建立了数据管理软件系统和条码系统对样本的保藏和使用进行实时电子管理 毒株库中每个毒株均具有其来源的样本信息 抗原基因序列信息等 为我国呼吸道传染病研究积累了宝贵的样本和信息资源 样本库在甲流应急支撑防控中已经发挥了重要作用, 为排除既往甲型 H1N1 在我国流行情况提供了重要的支持 随着技术水平的提高, 将会有越来越多的新病原的发现, 这个样本库将是未来国呼吸道传染病方面研究的一个重要的资源和基础 图 23. 入组病例临床信息表及存量记录表 课题的实施大大提高了本网络实验室的监测能力, 包括检测方法储备的增加, 检测技术能力的提高, 技术人员水平的提高和快速应急反应能力的增加 利用上述技术平台和基础, 课题组应急检测反应能力明显提高并在传染病疫情应急处置中发挥重要作用, 包括甲型 H1N1 流感疫情 手足口病和超级耐药菌实验室检测方面以及国庆 60 周年等国家重大活动保障工作 40

53 课题实施中获得的人群病毒感染谱基线数据和重要病原基因变异数据等将作为重要共享资源, 其成果以形成社会效益服务于我国传染病防控 除了以共享方式形成具有社会效益的基线数据, 将会进一步积极争取上述能够形成自主知识产权的成果 目前本课题尚未申请专利 上述研究以论文形式发表 8. 结论和建议本研究关于发热呼吸道症候群病毒谱的筛查结果提供了我国北方地区急性呼吸道感染呼吸道病毒谱及其变异变迁特征, 所获得的数据有助于补充我们对呼吸道病毒流行情况的认识 如 : 在北方地区流感病毒一般在秋冬季开始进入高流行, 但研究数据显示夏季也会有流感小高峰存在, 这对于流感病毒相关的传染病的监控提供了重要的基线数据支持 ; 鼻病毒和副流感病毒是引起普通感冒的常见病毒, 研究发现这两种病毒在成人和儿童呼吸道感染中的检出率均占有重要地位, 这为重新认识这些 老 病毒导致的临床负担提供了依据 ; 偏肺病毒是新发现的呼吸道病毒, 本研究对其进化动力的分析提示我国流行的偏肺病毒的来源, 揭示其亚型高流行的分子机制, 这对于传染病的预警具有重要的参考意义 本研究针对的是发热伴呼吸道症候群中的呼吸道病毒开展了系统研究, 虽然入组病例经呼吸道细菌排查为阴性, 但由于临床上抗生素的使用以及检测方法灵敏度的限制, 不能完全排除入组病例存在呼吸道细菌的感染 本研究采用的方法主要是分子生物学方法, 这种方法虽然能够弥补对于难分离病毒无法用细胞培养方式进行检测的不足, 但也同时带来另外一个问题 即检出的病毒不一定代表机体正在感染这一种病 41

54 毒, 如博卡病毒, 可能是因为既往感染的病毒核酸的残留, 也可能呼 吸道寄生的病毒 病毒核酸的检出尤其是对新发的致病性不清的病毒 与临床症状的关系还需要更进一步的研究 本研究建立了完善的样本检测技术方法和样本库资源优势, 先后 在甲型 H1N1 流感疫情 手足口病 44 和超级耐药菌实验室检测方面以 及国庆 60 周年等国家重大活动保障工作中发挥了重要的技术支撑作 用 如在甲型 H1N1 流感应急支撑方面, 按照卫生部部署和要求,2009 年 4 月在世界卫生组织公布疫情 72 小时内, 建立了甲型 H1N1 流感 检测 PCR 技术, 在此基础上建立了可同时进行流感分型和甲型流感 亚型分型的多重荧光定量 PCR 技术, 为疫情早期甲型 H1N1 流感病 毒检测提供了技术保障 ; 基于前期建立的样本库, 完成了对既往样本 中甲型流感阳性样本的甲型 H1N1 流感感染情况的溯源调查 ( 表 15), 排除了我国既往存在类似病毒感染的可能, 为国家早期制定 外堵输 入 内防扩散 这一甲型 H1N1 流感防控策略的制定提供了重要参考 ; 圆满完成了我国内地第二 三例甲型 H1N1 流感病例的复核确证任务 ; 分离出一批毒株, 开展了人群中和抗体的筛查, 评估了人群易感性 ; 参与了北京市网络实验室的筛查工作, 及时总结了中国大陆地区甲型 H1N1 流感早期流行期间的临床特征规律, 为制定中国 甲型 H1N1 流感临床诊治指南 奠定基础, 为甲型 H1N1 流感疫情研判和防控决 策提供了有力支持 42

55 人群 表 年甲型 H1N1 流感病毒回顾性筛查结果 来源 种类 样本背景信息 样本数量 / 病毒检出率 % 甲型流感病毒阳性病例 / 检出率 % 筛查病例 筛查结果 A/H1N1/2009 筛查结果 成人发热门诊鼻咽拭子 3984/ / 阴性儿童住院病人鼻洗液 1500/ / 阴性 合计 阴性 参考文献 [1]. Coiras MT, Pérez-Breña P, García ML, Casas I. Simultaneous detection of influenza A, B, and C viruses, respiratory syncytial virus, and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested- PCR assay. J Med Virol. 2003, 69: [2]. Coiras MT, Aguilar JC, García ML, Casas I, Pérez-Breña P. Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested-pcr assays. J Med Virol. 2004, 72: [3]. Woo PC, Lau SK, Chu CM, et al. Characterization and complete genome sequence of a novel coronavirus, coronavirus HKU1, from patients with pneumonia. J Virol. 2005, 79: [4]. Allard AK, Girones R, Juto P, Wadell G. Polymerase chain reaction for detection of adenoviruses in stools. J Clin Microbiol. 1990, 28: [5]. Human Bocaviruses Are Highly Diverse, Dispersed Recombination Prone, and Prevalent in Enteric Infections. J Infect Dis. 2010, 201: [6]. Ren L, Gonzalez R, Xu J, Xiao Y, Li Y, Zhou H, Li J, Yang Q, Zhang J, Chen L, Wang W, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Wang Z, Wang J. Prevalence of human coronaviruses in adults with acute respiratory tract infections in Beijing, China. J Med Virol. 2011, 83: [7]. Metzgar D, Osuna M, Kajon AE, Hawksworth AW, Irvine M, Russell KL. Abrupt emergence of diverse species B adenoviruses at US military recruit training centers. J Infect Dis. 2007, 196: [8]. Ren L, Gonzalez R, Xie Z, Xiong Z, Liu C, Xiang Z, Xiao Y, Li Y, Zhou H, Li J, Yang Q, Zhang J, Chen L, Wang W, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Shen K, Wang J. Human parainfluenza virus type 4 infection in Chinese children with lower respiratory tract infections: A comparison study. J Clin Virol. 2011, 51: [9]. Li J, Wang Z, Gonzalez R, Xiao Y, Zhou H, Zhang J, Paranhos-Baccala G, Vernet G, Jin Q, Wang J, Hung T. Prevalence of human metapneumovirus in adults with acute respiratory tract infection in Beijing, China.J Infect. 2012, 64: [10]. Xiang Z, Gonzalez R, Ren L, Xiao Y, Chen L, Zhang J, Wang W, Yang Q, Li J, Zhou H, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Wang Z, Wang J. Prevalence and clinical characteristics of human respiratory syncytial virus in Chinese adults with acute 43

56 respiratory tract infection. J Med Virol. 2013, 85: [11]. McErlean P, Shackelton LA, Lambert SB, Nissen MD, Sloots TP, Mackay IM. Characterization of a newly identified human rhinovirus, HRV-QPM, discovered in infants with bronchiolitis. J Clin Virol. 2007, 39: [12]. Kistler A, Avila PC, Rouskin S, Wang D, Ward T, Yagi S, et al. Panviral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 2007, 196: [13]. Lau SKP, Yip CC, TsoiHW, Lee RA, So LY, Lau YL, et al. Clinical features and complete genome characterization of a distinct human rhinovirus (HRV) genetic cluster, probably representing a previously undetected HRV species, HRV-C, associated with acute respiratory illness in children. J ClinMicrobiol. 2007, 45: [14]. Huang T, Wang W, Bessaud M, Ren P, Sheng J, Yan H, et al. Evidence of recombination and genetic diversity in human rhinoviruses in children with acute respiratory infection. PLoS ONE. 2009, 4 : e6355. [15]. Lee W-M, Kiesner C, Pappas T, Lee I, Grindle K, Jartti T, et al. A diverse group of previously unrecognized human rhinoviruses are common causes of respiratory illnesses in infants. PLoS ONE. 2007, 2: e966. [16]. Renwick N, Schweiger B, Kapoor V, Liu Z, Villari J, Bullmann R, et al. A recently identified rhinovirus genotype is associated with severe respiratory tract infection in children in Germany. J Infect Dis. 2007, 196: [17]. Briese T, Renwick N, Venter M, Jarman RG, Ghosh D, Ko ndgen S, et al. Global distribution of novel rhinovirus genotype. Emerg Infect Dis. 2008,1 4: [18]. Xiang Z, Gonzalez R, Xie Z, Xiao Y, Chen L, Li Y, et al. Human rhinovirus group C infection in children with lower respiratory tract infection. Emerg Infect Dis. 2008, 14: [19]. Khetsuriani N, Lu X, Teague WG, Kazerouni N, Anderson LJ, Erdman DD. Novel human rhinoviruses and exacerbation of asthma in children. Emerg Infect Dis. 2008, 14: [20]. Lee WM, Kiesner C, Pappas T, Lee I, Grindle K, Jartti T, Jakiela B, Lemanske RF Jr, Shult PA, Gern JE. A diverse group of previously unrecognized human rhinoviruses are common causes of respiratory illnesses in infants. PLoS One. 2007, 2: e966. [21]. Savolainen C, Blomqvist S, Mulders MN, Hovi T. Genetic clustering of all 102 human rhinovirus prototype strains: serotype 87 is close to human enterovirus 70. J Gen Virol. 2002, 83(Pt 2): [22]. Xiang Z, Gonzalez R, Wang Z, Xiao Y, Chen L, Li T, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Jin Q, Wang J. Human rhinoviruses in Chinese adults with acute respiratory tract infection. J Infect. 2010, 61: [23]. Gaynor AM, Nissen MD, Whiley DM, Mackay IM, Lambert SB, Wu G, et al. Identification of a novel polyomavirus from patients with acute respiratory tract infections. PLoS Pathog. 2007, 3: e64. [24]. Allander T, Andreasson K, Gupta S, Bjerkner A, Bogdanovic G, Persson MA, et al. Identification of a third human polyomavirus. J Virol. 2007, 81: [25]. Ren L, Gonzalez R, Xie Z, Zhang J, Liu C, Li J, Li Y, Wang Z, Kong X, Yao Y, 44

57 Hu Y, Qian S, Geng R, Yang Y, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Jin Q, Shen K, Wang J. WU and KI polyomavirus present in the respiratory tract of children, but not in immunocompetent adults. J Clin Virol. 2008, 43: [26]. Ren L, Gonzalez R, Xu X, Li J, Zhang J, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Jin Q, Wang J. WU polyomavirus in fecal specimens of children with acute gastroenteritis, China. Emerg Infect Dis. 2009, 15: [27]. Wang Y, Gonzalez R, Zhou H, Li J, Li Y, Paranhos-Baccalà G, Vernet G, Guo L, Wang J. Detection of human bocavirus 3 in China. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2011, 30: [28]. Guo L, Gonzalez R, Xie Z, Zhou H, Liu C, Wu C, Paranhos-Baccalà G, Vernet G, Shen K, Jin Q, Wang J. Bocavirus in Children with Respiratory Tract Infections. Emerg Infect Dis. 2011, 17: [29]. Khetsuriani N, Lamonte Fowlkes A, Oberst S, Pallansch MA. Enterovirus surveillance United States, MMWR Surveill Summ. 2006, 55:1 20. [30]. Imamura T, Fuji N, Suzuki A, Tamaki R, Saito M, Aniceto R, et al. Enterovirus 68 among children with severe acute respiratory infection, the Philippines. Emerg Infect Dis. 2011, 17: [31]. Kaida A, Kubo H, Sekiguchi J, Kohdera U, Togawa M, Shiomi M, et al. Enterovirus 68 in children with acute respiratory tract infections, Osaka, Japan. Emerg Infect Dis. 2011, 17: [32]. Petitjean Lecherbonnier J, Dina J, Nguyen E, Gouarin S, Lebigot E, Vabret A. Molecular diagnosis of respiratory enterovirus infections: use of PCR and molecular identifi cation for a best approach of the main circulating strains during Pathol Biol (Paris). 2011, 59: [33]. Rahamat Langendoen J, Riezebos Brilman A, Borger R, van der Heide R, Brandenburg A, Schölvinck E, et al. Upsurge of human enterovirus 68 infections in patients with severe respiratory tract infections. J Clin Virol. 2011, 52: [34]. Centers for Disease Control and Prevention. Clusters of acute respiratory illness associated with human enterovirus 68 Asia, Europe, and United States, MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2011, 60: [35]. Hasegawa S, Hirano R, Okamoto-Nakagawa R, Ichiyama T, Shirabe K. Enterovirus 68 infection in children with asthma attacks: virusinduced asthma in Japanese children. Allergy. 2011, 66: [36]. Nix WA, Oberste MS, Pallansch MA. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens. J Clin Microbiol. 2006, 44: [37]. Xiang Z, Gonzalez R, Wang Z, Ren L, Xiao Y, Li J, Li Y, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Jin Q, Wang J. Coxsackievirus A21, enterovirus 68, and acute respiratory tract infection, China. Emerg Infect Dis. 2012, 18: [38]. Li J, Ren L, Guo L, Xiang Z, Paranhos-Baccalà G, Vernet G, Wang J. Evolutionary dynamics analysis of human metapneumovirus subtype A2: genetic evidence for its dominant epidemic. PLoS One. 2012, 7:e [39]. Yang Y, Gonzalez R, Huang F, Wang W, Li Y, Vernet G, Wang J, Jin Q. Simultaneous typing and HA/NA subtyping of influenza A and B viruses including the 45

58 pandemic influenza A/H1N by multiplex real-time RT-PCR.J Virol Methods. 2010,167:37-44 [40]. Yang Y, Wang Z, Ren L, Wang W, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Jin Q, Wang J. Influenza A/H1N pandemic and respiratory virus infections, Beijing, PLoS One. 2012, 7:e [41]. Lu G, Gonzalez R, Guo L, Wu C, Wu J, Vernet G, Paranhos-Baccalà G, Wang J, Hung T. Large-scale seroprevalence analysis of human metapneumovirus and human respiratory syncytial virus infections in Beijing, China. Virology Journal. 2011, 8:62. [42]. Cui S, Wu C, Zhou H, Zhao R, Guo L, Wang J, Hung T. Secretory expression of all 16 subtypes of the hemagglutinin 1 protein of influenza A virus in insect cells. J Virol Method. 2011, 177: [43]. Yang J, Yang F, Ren L, Xiong Z, Wu Z, Dong J, Sun L, Zhang T, Hu Y, Du J, Wang J, Jin Q. Unbiased parallel detection of viral pathogens in clinical samples by use of a metagenomic approach. J Clin Microbiol. 2011, 49: [44]. Yang F, Ren L, Xiong Z, Li J, Xiao Y, Zhao R, He Y, Bu G, Zhou S, Wang J, Jin Q. Enterovirus 71 outbreak in P. R. China, J Clin Microbiol. 2009, 47:

59 附录 A 呼吸道症候群监测数据统计分析报告 A1. 说明 本分析报告的数据来源于 传染病监测技术平台信息管理系统, 包括 2009 年 1 月 1 日至 2011 年 2 月 18 日期间录入的发热呼吸道症候群中国医学科学院病原生物学研究所全部数据, 导出时间为 2011 年 2 月 18 日 A1.1 各单位任务量和完成情况 传染病监测技术平台 项目以中国医学科学院病原生物学研究所为课题责任单位的 5 家合作单位共同承担了 8000 份发热呼吸道症候群监测任务, 各单位承担的任务量见表 1. 根据导出的原始数据, 截止 2011 年 2 月 18 日, 各合作单位的采样和检测完成量见表 2. 表 A-1 中国医学科学院病原生物学研究所各合作单位监测任务量 (2 年 ) 合作单位名称 病毒 监测任务量 ( 份 ) 细菌 北京市疾病预防控制中心 中国医学科学院北京协和医院 首都医科大学附属北京儿童医院 首都医科大学附属北京朝阳医院 山东省医药生物技术研究中心 合计 表 A-2 各单位病例 样本和检测信息录入情况 (2009 年 1 月 1 日至 2011 年 2 月 18 日 ) 课题责任单位中国医学科学院病原生物学研究所 合作单位 病例数 各类病原检检测病检测样样本数测样本数例数本数细菌病毒 北京市疾病预防控制中心 中国医学科学院北京协和医院 首都医科大学附属北京儿童医院 首都医科大学附属北京朝阳医院 山东省医药生物技术研究中心 合计

60 A1.2 本报告所用名词及指标定义病例数 : 采集了一份或多份样本的病例数量样本数 : 采集的样本数量检测病例数 : 进行过任一病原检测的病例数量检测样本数 : 进行过任一病原检测的样本数量某病原阳性病例 : 任一样本检测出某种病原阳性的病例细菌阳性病例 : 任一样本检测出任一细菌阳性的病例病毒阳性病例 : 任一样本检测出任一病毒阳性的病例细菌阳性样本 : 检测出任一细菌阳性的样本病毒阳性样本 : 检测出任一病毒阳性的样本病例来源 : 门急诊病例 住院病例病原类型 : 细菌 病毒 液 样本类型 : 鼻 / 咽拭子 尿液标本 痰 鼻炎抽吸物 胸腔穿刺物 血 支气管肺泡灌洗 病原谱 : 检出病原中各病原的病例数构成细菌检出率 = 任一细菌检测阳性的病例数 / 做过细菌检测的病例数病毒检出率 = 任一病毒检测阳性的病例数 / 做过病毒检测的病例数各病原检出率 = 该病原检测阳性病例数 / 做过该病原检测的病例数各病原检测阳性的判断标准 : 见表 3( 同时可参考附录 : 信息系统录入信息阳性病原判断标准 ) 48

61 病原 分类 细菌 病原名称流感嗜血杆菌金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌铜绿假单胞菌 A 组链球菌肺炎链球菌军团菌肺炎衣原体肺炎支原体 表 A-3 各病原检测阳性的判断标准用于判断结果类别阳性判断标准备注的检测项目 培养实验结阴性 阳性 未检测论培养实验结论为阳性或者或者血液 胸水 支气管灌洗液 PCR 检测阴性 阳性 未检测标本 PCR 检测为阳性 成人标本该抗尿液标本中原检测可以作肺炎链球菌阴性 阳性 未检测为, 但儿童不可抗原检测以 尿液标本中 军团菌抗原检测 阴性 阳性 未检测 阳性可以作为 IgM 检测 阴性 阳性 未检测 不可以 IgG 检测 阴性 阳性 未检测 若有双份血清, 四倍升高可以 PCR 检测 阴性 阳性 未检测 阳性可以作为 血液标本中细菌核酸检测荧光定量 PCR 检测阳性可以作为阳性判断标准, 普通 PCR 不可以 人流行性感冒病毒 IgM 检测 阴性 阳性 未检测 病毒 人副流感病毒呼吸道合胞病毒人冠状病毒人偏肺病毒人博卡病毒人腺病毒 PCR 检测 免疫荧光 阴性 阳性 未检测未检测 IgM 检测或者 PCR 检测为阳性 或免疫荧光为 若有双份血清,IgG 检测四倍升高可以 A1.3 数据清理 本报告的数据来源于传染病监测技术平台导出的原始数据, 进行分析前, 对数据进行了 清理 清理条件 步骤及其结果如下 : 1. 导出 2009 年 1 月 1 日至 2011 年 2 月 18 日中国医学科学院病原生物学研究所录入的传染病监测技术平台发热呼吸道症候群数据, 共计 条样本记录 ; 2. 删除发病时间或样本采集时间缺失的记录, 共 0 条 ; 3. 删除样本采集时间早于发病时间的记录, 共 81 条 ; 49

62 4. 删除发病时间早于 2009 年的记录, 共 0 条 ; 5. 删除重复样本号记录 120 条 ; 6. 删除非本单位录入样本信息记录 3 条 ; 7. 经清理后, 数据共包含 条样本记录, 涉及病例 8838 例 A1.4 报告各部分采用的数据集由于分析指标的不同, 本报告各部分分析的数据集有所不同, 具体如下 : (1) 基本描述和检出率分析 : 采用数据清理后的发热呼吸道症候群数据, 共包含 8838 个病例的 条样本记录 (2) 病原谱分析 : 病毒病原谱 : 纳入开展了所有病毒病原体检测 ( 人流感病毒 人副流感病毒 呼吸道合胞病毒 人冠状病毒 人偏废病毒 人博卡病毒 人腺病毒 ) 且任一病毒检测结果为阳性的病例, 分析病毒病原谱 发热呼吸道症候群 ( 中国医学科学院病原生物学研究所 ) 开展了所有病毒病原检测的病例共 7161 例, 其中检出病毒阳性的病例 2584 例 (3) 阳性病例特征分析 : 根据各病原检测阳性的判断标准, 纳入任一病毒检测结果为阳性的病例进行分析 其中病毒阳性病例 3139 例 (4) 同时检测两种及以上病毒病原的病例分析 : 对检出两种及以上病毒 ( 人流感病毒 人副流感病毒 呼吸道合胞病毒 人冠状病毒 人偏废病毒 人博卡病毒 人腺病毒 ) 的病例进行分析, 共 238 例 (5) 检测多类病原的病例分析 : 对开展了所有细菌病原检测 ( 肺炎链球菌 A 组链球菌 流感嗜血杆菌 金黄色葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌 肺炎支原体 肺炎衣原体 军团菌 ) 和所有病毒病原检测 ( 人流感病毒 人副流感病毒 呼吸道合胞病毒 人冠状病毒 人偏废病毒 人博卡病毒 人腺病毒 ) 的病例进行分析, 共 0 例 A1.5 地区划分 (1) 区域地区组 : 华东地区 : 山东 江苏 安徽 浙江 福建 上海华南地区 : 广东 广西 海南华中地区 : 湖北 湖南 河南 江西 50

63 华北地区 : 北京 天津 河北 山西 内蒙古西北地区 : 宁夏 新疆 青海 陕西 甘肃西南地区 : 四川 云南 贵州 西藏 重庆东北地区 : 辽宁 吉林 黑龙江 (2) 南北地区组 : 南方十五省 : 上海 江苏 浙江 安徽 福建 江西 湖北 湖南 广东 广西 海南 重庆 四川 贵州 云南北方十六省 : 北京 天津 河北 山西 内蒙古 辽宁 吉林 黑龙江 山东 河南 西藏 陕西 甘肃 青海 宁夏 新疆 A1.6 年龄划分根据发热呼吸道症候群病原特点及病例特征, 对发热呼吸道症候群病例的年龄进行如下划分 : 0-, 1-,2-,3-,4-,5-,15-,35-,50-,65 岁及以上描述所有病例的年龄分布时, 采用 10 岁以下每 1 岁为 1 组,10 岁以上每 5 岁 1 组,85 岁及以上为 1 组的分组方式 A1.7 时间定义本报告所有时间相关分析均按发病时间计算 51

64 A2. 基本描述 说明 本部分分析数据集及其相关定义 : 基本描述 部分的分析基于 2011 年 2 月 18 日从信息系统导出的 2009 年 1 月 1 日至 2011 年 2 月 18 日的原始数据, 共 条样本记录 在进行数据分析前, 对数据进行清理 : 删除发病时间或样本采集时间缺失的记录 0 条 ; 删除样本采集时间早于发病时间的记录 81 条 ; 删除发病时间早于 2009 年的记录 0 条 ; 删除重复样本号记录 120 条 ; 删除非本单位录入样本信息记录 3 条 经数据清理后, 基本描述部分采用的数据集包括 条样本记录, 涉及病例 8838 例, 其中检测样本 8853 条, 涉及检测病例 8666 例 A2.1 病例数和样本数的时间分布 2009 年 1 月 1 日至 2011 年 2 月 18 日, 本课题组承担的发热呼吸道症候群呼吸道病毒谱筛查病例数为 8838 例, 采集样本数为 份 与 2009 年相比,2010 年发热呼吸道症候群病例数和样本数均有增加 其中, 病例数增加 574 例 ( 增加 14.03%); 采集样本数增加 951 份 ( 增加 17.33%) 年, 检测病例数为 8666 例, 检测样本数为 8853 份 与 2009 年相比,2010 年检测病例数增加 455 例 ( 增加 11.17%); 检测样本数增加 337 份 ( 增加 7.98%) 2009 年 表 A-4 病例数 样本数的时间分布 时间病例数检测病例数样本数检测样本数 1 月 月 月 月 月 月 月 月 月 月 月 月 计