96 学 报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2016,47(1): 第 47 卷 (HMG CoA) 还 原 酶 活 性, 从 而 降 低 血 清 中 胆 固 醇 的 含 量 [2] 随 着 人 们 对 肠 道 菌 群 与 疾 病 发 生 和
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1 学 报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2016,47(1): 生 脉 散 对 人 肠 道 菌 群 失 衡 的 调 节 作 用 花 海 莹, 李 雪 晴, 刘 吉 华 ( 中 国 药 科 大 学 江 苏 省 中 药 评 价 与 转 化 重 点 实 验 室, 南 京 ) 摘 要 通 过 建 立 头 孢 曲 松 钠 所 致 人 肠 道 菌 群 紊 乱 体 外 模 型, 结 合 菌 群 的 选 择 性 培 养 平 板 计 数 及 短 链 脂 肪 酸 分 析, 研 究 经 典 名 方 生 脉 散 对 肠 道 菌 群 失 调 的 调 节 作 用 研 究 结 果 显 示, 生 脉 散 高 中 低 剂 量 (16 5,11 2,5 5mg/mL) 组 能 显 著 抑 制 肠 杆 菌 肠 球 菌 的 增 殖, 促 进 肠 道 益 生 菌 乳 酸 杆 菌 梭 菌 增 殖 与 模 型 组 相 比, 给 予 中 剂 量 生 脉 散 培 养 24h 后, 肠 球 菌 肠 杆 菌 增 殖 分 别 被 抑 制 了 24 9% 和 19 1%, 乳 酸 杆 菌 和 梭 菌 的 增 殖 分 别 提 高 了 22 3% 和 25 8% 同 时 生 脉 散 各 剂 量 组 均 能 显 著 促 进 肠 道 菌 群 产 生 丙 酸 和 乙 酸, 抑 制 潜 在 致 病 菌 的 增 殖, 促 进 失 衡 肠 道 菌 群 向 正 常 菌 群 结 构 发 展 关 键 词 生 脉 散 ; 肠 道 菌 群 ; 益 生 菌 ; 短 链 脂 肪 酸 中 图 分 类 号 R285 5 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2016) doi: /j.isn 引 用 本 文 花 海 莹, 李 雪 晴, 刘 吉 华. 生 脉 散 对 人 肠 道 菌 群 失 衡 的 调 节 作 用 [J]. 中 国 药 科 大 学 学 报,2016,47(1): Citethisarticleas:HUAHaiying,LIXueqing,LIUJihua.InvitrostudyontheregulationofShengmaiSanondysbacteriosisofintestinalflora[J]. JChinaPharmUniv,2016,47(1): InvitrostudyontheregulationofShengmaiSanondysbacteriosisofintesti nalflora HUAHaiying 牞 LIXueqing 牞 LIUJihua JiangsuKeyLaboratoryofTCM EvaluationandTranslationalResearch 牞 ChinaPharmaceuticalUniversity 牞 Nanjing 牞 China Abstract TostudytheregulationefectofShengmaiSan 牗 SMS 牘 onintestinaldysbacteriosis 牞 ceftriaxonesodium wasusedtoinduceintestinaldysbacteriosisinvitro 牞 togetherwithbacteriaculturedintheselectivemediumand enumeratedbyplatecounting 牞 andtheshortchainfatyacidwerealsoanalyzed TheresultsshowedthatSMS 牗 16 5 牞 11 2 牞 5 5mg/mL 牘 couldsignificantlyinhibittheproliferationofsuchpotentialyharmfulbacteriaas EnterocociandEnterobacteriaceae 牞 whilepromotingtheproliferationoflactobacilusandclostridum Compared withthemodelgroup 牞 theproliferationofenterocociandenterobacteriaceaewasinhibitedby24 9% and 19 1% 牞 whiletheproliferationoflactobacilusandclostridumwasincreasedby22 3% and25 8% 牞 respectively 牞 inthemediumdoseofsmsgroup 牗 11 2mg/mL 牘 at24h Meanwhile 牞 SMSindiferentconcentrationssignificantly increasedtheaccumulationofaceticacidandpropionicacidgeneratedbygutmicrobeswhichcouldsignificantly inhibittheproliferationofharmfulbacteria SMSshowedprobioticefectsonintestinalmicrofloraimbalance inducedbyantibioticsinvitro Keywords ShengmaiSan 牷 intestinalflora 牷 probiotics 牷 short chainfatyacid ThisstudywassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina 牗 No 牘 人 肠 道 菌 群 参 与 消 化 吸 收 代 谢 营 养 和 免 疫 等 生 理 过 程 现 有 研 究 表 明, 多 种 胃 肠 道 疾 病 肥 胖 症 糖 尿 病 心 血 管 疾 病 和 自 身 免 疫 性 疾 病 等 发 生 及 发 展 的 过 程 中 均 伴 有 肠 道 菌 群 失 衡 现 象 [1] 另 一 方 面, 正 常 的 肠 道 菌 群 能 产 生 丰 富 的 短 链 脂 肪 酸 (SCFA), 不 仅 能 为 肠 黏 膜 细 胞 提 供 能 量, 还 可 以 降 低 结 肠 环 境 ph, 抑 制 潜 在 致 病 菌 的 生 长 肠 道 菌 群 产 生 的 丙 酸 还 能 够 调 节 羟 甲 基 戊 二 酰 辅 酶 A 收 稿 日 期 通 信 作 者 Tel: E mail:jihualiu88@163.com 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (No )
2 96 学 报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2016,47(1): 第 47 卷 (HMG CoA) 还 原 酶 活 性, 从 而 降 低 血 清 中 胆 固 醇 的 含 量 [2] 随 着 人 们 对 肠 道 菌 群 与 疾 病 发 生 和 人 体 健 康 之 间 相 关 性 认 识 的 深 入, 中 药 对 肠 道 菌 群 的 调 节 作 用 也 日 益 受 到 研 究 者 的 关 注 研 究 表 明 : 多 种 中 药 及 其 活 性 成 分 如 四 君 子 汤 [3] [4] 党 参 多 糖 等 均 能 促 进 肠 道 益 生 菌 的 生 长 中 药 对 人 肠 道 菌 群 的 调 节 作 用, 也 可 能 是 其 发 挥 药 效 作 用 的 重 要 环 节 之 一 生 脉 散 是 著 名 的 中 医 传 统 方 剂, 最 早 见 于 金 代 张 元 素 的 医 学 启 源, 由 人 参 麦 冬 和 五 味 子 三 味 药 材 组 成, 具 有 强 心 抗 心 律 失 常 增 强 免 疫 等 多 种 药 理 活 性, 临 床 广 泛 应 用 于 心 脑 血 管 疾 病 等 的 治 疗 且 疗 效 显 著 [5] 研 究 显 示, 人 参 皂 苷 麦 冬 MDG 1 均 能 促 进 肠 道 有 益 菌 群 的 生 长 [6], 但 生 脉 散 整 方 对 肠 道 菌 群 的 调 节 作 用 尚 未 见 报 道 本 研 究 通 过 肠 道 菌 群 的 体 外 厌 氧 培 养, 以 抗 生 素 头 孢 曲 松 钠 诱 导 培 养 的 肠 道 菌 群 失 调, 探 索 生 脉 散 对 失 衡 的 人 肠 道 菌 群 结 构 的 调 节 作 用, 以 及 其 对 肠 道 菌 群 短 链 脂 肪 酸 代 谢 的 影 响 材 料 1 1 药 品 与 试 剂 人 参 麦 冬 五 味 子 购 自 安 徽 济 人 药 业, 经 鉴 定 复 核, 所 用 药 材 均 符 合 中 华 人 民 共 和 国 药 典 (2010 年 版 ) 标 准 头 孢 曲 松 钠 ( 上 海 罗 氏 制 药 有 限 公 司 ); 乙 酸 丙 酸 丁 酸 均 为 色 谱 纯, 其 他 试 剂 均 为 市 售 分 析 纯 1 2 培 养 基 BBL 培 养 基 MRS 培 养 基 梭 菌 选 择 性 培 养 基 EMB 培 养 基 和 肠 球 菌 培 养 基 均 购 自 青 岛 海 博 生 物 技 术 有 限 公 司 含 氮 基 础 培 养 基 : 蛋 白 胨 2g, 酵 母 膏 2g,NaCl 0 1g,K 2 HPO g,KH 2 PO g,MgSO 4 7H 2 O0 01g,CaCl 2 6H 2 O 0 01g,NaHCO 3 2g, L 半 胱 氨 酸 盐 酸 盐 0 5g, 胆 盐 0 5g,0 025% 刃 天 青 溶 液 4mL, 吐 温 802mL 和 6mg/mL 氯 高 铁 血 红 素 溶 液 1mL, 加 入 蒸 馏 水 1000mL 溶 解 后 调 节 基 础 培 养 基 ph 至 7 0, 高 压 灭 菌 后 待 冷 却 至 45, 无 菌 加 入 维 生 素 K 1 ( 终 浓 度 1mg/mL) 1 3 仪 器 YQX Ⅱ 厌 氧 工 作 站 ( 上 海 跃 进 医 疗 器 械 有 限 公 司 ); 气 相 色 谱 仪 ( 美 国 Bruker 公 司 ); 高 速 冷 冻 离 心 机 ( 美 国 Thermo 公 司 ); 冷 冻 干 燥 机 ( 美 国 Labconco 公 司 ) 方 法 2 1 生 脉 散 提 取 物 的 制 备 按 照 人 参 麦 冬 五 味 子 三 者 质 量 比 称 取 药 材, 分 别 加 入 10 倍 8 倍 和 6 倍 量 的 水, 煎 煮 3 次, 每 次 1h, 过 滤, 滤 液 合 并, 冷 冻 干 燥 即 为 生 脉 散 冻 干 样 品 2 2 人 肠 道 菌 群 培 养 受 试 者 为 23~27 岁 之 间 健 康 人 群 (n=5), 且 在 近 2 个 月 内 未 服 用 过 抗 生 素 收 集 受 试 者 的 新 鲜 粪 便, 置 于 无 菌 的 厌 氧 操 作 台 中, 使 用 10 倍 量 的 预 先 灭 菌 除 氧 的 PBS(0 1mol/L,pH7 2) 将 其 混 悬, 双 层 纱 布 过 滤 后 将 滤 液 以 2000r/min 离 心 10min, 取 上 清 液, 即 得 含 人 肠 道 菌 群 的 粪 便 悬 液 [7] 2 3 头 孢 曲 松 钠 对 培 养 人 肠 道 菌 群 的 影 响 制 备 头 孢 曲 松 钠 含 量 分 别 为 和 15 6μg/mL 的 含 氮 基 础 培 养 基 [8], 接 种 粪 便 悬 液 1mL,37 厌 氧 培 养 (10%H 2 5%CO 2 85%N 2 ), 分 别 于 培 养 0,2,4,6,8,12,24h 时 分 别 取 样 200μL, 置 96 孔 板, 以 酶 标 仪 测 定 在 600nm 处 的 吸 收 度, 以 未 接 种 菌 液 相 同 处 理 的 培 养 基 为 空 白 对 照 2 4 生 脉 散 对 肠 道 菌 群 的 影 响 制 备 含 3 9μg/mL 的 头 孢 曲 松 钠 和 不 同 剂 量 生 脉 散 ( 和 16 5mg/mL) 的 含 氮 基 础 培 养 基, 接 种 粪 便 悬 液 1mL, 混 匀 后 37 厌 氧 培 养, 分 别 于 培 养 0,6,12,24h 时 取 培 养 菌 液, 进 行 选 择 性 培 养 及 短 链 脂 肪 酸 检 测 实 验 分 为 6 组 (n= 3), 正 常 组 : 加 入 含 氮 培 养 基 和 粪 便 悬 液 ; 模 型 组 : 添 加 头 孢 曲 松 钠 处 理 ; 生 脉 散 低 中 高 剂 量 组 : 头 孢 曲 松 钠 处 理 后 分 别 加 入 低 中 高 剂 量 的 生 脉 散 ; 生 脉 散 对 照 组 : 正 常 组 添 加 中 剂 量 的 生 脉 散 2 5 肠 道 菌 选 择 性 培 养 及 平 板 计 数 人 体 肠 道 内 的 细 菌 种 类 以 双 歧 杆 菌 乳 酸 杆 菌 消 化 链 球 菌 梭 杆 菌 和 真 杆 菌 为 主, 兼 性 厌 氧 菌 和 需 氧 菌 如 肠 杆 菌 和 肠 球 菌 含 量 较 低 [9], 为 此, 选 择 肠 道 中 5 类 代 表 性 的 可 培 养 的 主 要 细 菌 作 为 考 察 对 象, 分 别 是 双 歧 杆 菌 乳 酸 杆 菌 梭 菌 肠 杆 菌 和 肠 球 菌 培 养 菌 液 分 别 通 过 双 歧 杆 菌 BBL 选 择 性 培 养 基 乳 酸 菌 MRS 选 择 性 培 养 基 梭 菌 选 择 性 培 养 基 肠 杆 菌 EMB 培 养 基 和 肠 球 菌 选 择 性 培 养
3 第 47 卷 第 1 期 花 海 莹, 等 : 生 脉 散 对 人 肠 道 菌 群 失 衡 的 调 节 作 用 97 基 的 选 择 性 培 养, 采 用 平 板 计 数 法 进 行 菌 体 计 数 [10] 结 果 以 每 毫 升 菌 液 中 的 菌 落 数 的 对 数 表 示 (lgcfu/ml) 2 6 SCFA 含 量 测 定 SCFA 的 生 成 对 人 体 有 非 常 重 要 的 生 理 功 能 [11], 主 要 由 厌 氧 微 生 物 发 酵 碳 水 化 合 物 产 生, 包 括 甲 酸 乙 酸 丙 酸 丁 酸 以 及 乳 酸 等 其 中 乙 酸 丙 酸 丁 酸 所 占 比 例 高 达 85%, 占 产 物 的 绝 大 部 分 因 此 本 研 究 通 过 对 乙 酸 丙 酸 和 丁 酸 含 量 测 定 来 研 究 生 脉 散 对 短 链 脂 肪 酸 的 影 响 SCFA 含 量 检 测 采 用 气 相 色 谱 外 标 法 [12] SCFA 标 准 曲 线 的 制 备 精 密 称 取 乙 酸 丙 酸 和 丁 酸 的 标 准 品, 溶 解 于 乙 醚 中, 配 制 成 线 性 范 围 0 5~50mmol/L 的 标 准 溶 液, 经 0 45μm 滤 膜 过 滤 后, 按 浓 度 从 低 到 高 的 顺 序 进 行 GC 检 测, 记 录 各 个 浓 度 对 应 的 峰 面 积 并 以 峰 面 积 对 浓 度 作 图, 得 到 各 种 SCFA 的 标 准 曲 线 SCFA 样 品 溶 液 的 制 备 样 品 溶 液 的 制 备 采 用 溶 剂 提 取 法 [12] 每 组 取 培 养 菌 液 1mL, 12000r/min 离 心 5min 后, 取 上 清 液 500μL, 加 入 50% 硫 酸 50μL 和 无 水 乙 醚 250μL, 涡 旋 混 匀 后,10000r/min 离 心 5min,4 静 置 30min, 取 乙 醚 上 清 液 作 为 供 试 品 溶 液 进 行 GC 分 析 2 7 统 计 学 分 析 实 验 结 果 以 x±s 珋 表 示, 采 用 Student t 检 验, P<0 05 表 示 有 统 计 学 意 义 上 的 显 著 差 异,P< 0 01 为 非 常 显 著 差 异 结 果 3 1 人 肠 道 菌 群 失 衡 体 外 模 型 抗 生 素 浓 度 的 确 定 头 孢 曲 松 钠 的 抑 菌 曲 线 头 孢 曲 松 钠 对 培 养 的 人 肠 道 菌 群 的 抑 菌 作 用 具 有 剂 量 依 赖 关 系 ( 图 1), 在 培 养 至 24h 时, 低 中 高 剂 量 的 头 孢 曲 松 钠 对 人 肠 道 菌 群 均 有 明 显 的 抑 制 作 用, 而 中 高 剂 量 的 头 孢 曲 松 钠 抑 菌 作 用 较 强, 不 适 于 生 脉 散 对 体 外 人 肠 道 菌 群 失 衡 调 整 作 用 的 研 究 低 剂 量 作 用 后, 对 菌 群 有 明 显 抑 制, 且 增 长 趋 势 较 明 显, 有 利 于 进 一 步 研 究 生 脉 散 对 肠 道 菌 群 的 调 节 因 此 确 定 3 9μg/mL 为 体 外 抗 生 素 诱 导 人 肠 道 菌 群 失 衡 的 质 量 浓 度 Figure1 Bacteriostasisofceftriaxoneagainsthumanfecalbacterisin vitro( x±s,n=3) 珋 选 择 性 培 养 基 的 平 板 计 数 肠 道 菌 群 在 含 有 3 9μg/mL 头 孢 曲 松 钠 的 培 养 基 中 培 养 不 同 时 间 后, 菌 群 经 过 选 择 性 培 养 分 析 结 果 见 图 2 头 孢 曲 松 钠 处 理 抑 制 了 大 部 分 的 菌 群, 双 歧 杆 菌 乳 杆 菌 梭 菌 肠 球 菌 和 肠 杆 菌 在 6h 均 出 现 显 著 下 降 之 后 开 始 自 行 恢 复, 在 培 养 至 24h 时, 乳 酸 杆 菌 梭 菌 和 肠 杆 菌 仍 显 著 低 于 正 常 水 平 (P<0 01), 肠 球 菌 和 双 歧 杆 菌 与 正 常 组 无 显 著 差 异 微 生 态 学 观 点 认 为 菌 群 失 衡 表 现 为 原 来 的 菌 群 ( 敏 感 菌 ) 大 部 分 被 抑 制, 只 有 少 数 菌 种 ( 耐 药 菌 ) 大 量 繁 殖 或 外 来 细 菌 占 据 优 势, 成 为 优 势 菌 群 而 引 起 新 的 感 染 [13] 结 合 本 实 验 结 果 可 知, 肠 道 菌 群 大 部 分 被 抑 制, 肠 球 菌 和 肠 杆 菌 异 常 增 殖, 因 此 该 浓 度 的 头 孢 曲 松 钠 作 用 可 导 致 体 外 人 肠 道 菌 群 出 现 失 衡 Figure2 Efectofceftriaxoneonfecalbacterisinfermentationbrothat6h(A),12h(B)and24h(C)( 珋 x±s,n=3) P<0 0001vscontrolgroup
4 98 学 报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2016,47(1): 第 47 卷 3 2 生 脉 散 对 头 孢 曲 松 钠 造 成 人 肠 道 菌 群 失 衡 的 的 调 节 作 用 生 脉 散 对 肠 杆 菌 肠 球 菌 的 调 节 作 用 结 果 显 示, 在 人 肠 道 菌 群 体 外 失 衡 模 型 中, 生 脉 散 能 显 著 抑 制 肠 杆 菌 和 肠 球 菌 的 数 量 ( 表 1) 头 孢 曲 松 钠 作 用 后, 菌 群 出 现 失 衡 状 态, 对 头 孢 曲 松 钠 天 然 耐 药 的 肠 球 菌 和 肠 杆 菌 开 始 大 量 繁 殖 与 模 型 组 相 比, 在 不 同 培 养 时 间 点, 生 脉 散 中 高 剂 量 组 均 能 显 著 抑 制 肠 球 菌 和 肠 杆 菌 的 数 目 (P<0 001), 生 脉 散 低 剂 量 组 与 模 型 组 则 无 显 著 性 差 异 同 时, 正 常 生 脉 散 组 较 正 常 组 无 显 著 性 差 异 中 高 剂 量 组 均 对 一 些 肠 道 致 病 菌 ( 如 肠 杆 菌 和 肠 球 菌 ) 有 一 定 的 抑 制 作 用, 同 时 药 物 自 身 对 正 常 菌 群 无 显 著 性 影 响 Table1 EfectofShengmaiSan(SMS)onthenumberofEnterobacteriaceae,EnterocociandClostriadiuminthemodelofintestinalfloraimbalance inducedbyceftriaxone( x±s,n=3) 珋 Bacteria Group Numberofbacteria h Enterobacteriaceae Control 5 50± ±0 12 ### 8 79±0 05 ### 8 79±0 05 ### Model ± ±0 08 Model+SMS(5 5mg/mL) ± ±0 11 Model+SMS(11 2mg/mL) 0 0 ### 5 33±0 10 ### Model+SMS(16 5mg/mL) 0 0 ### 4 30±0 01 ### Control+SMS(11.2mg/mL) 7 43±0 15 ### 9 11±0 01 ### 9 02±0 13 ### Enterococi Control 3 26± ±0 12 ### 4 88±0 03 ## 6 21±0 27 Model 2 74± ± ±0 21 Model+SMS(5 5mg/mL) 0 ### 4 58± ±0 15 Model+SMS(11 2mg/mL) 0 ### 0 ### 5 28±0 18 ## Model+SMS(16 5mg/mL) 0 ### 0 ### 4 56±0 28 ### Control+SMS(11.2mg/mL) 4 89±0 26 ### 6 50±0 15 ### 6 40±0 15 Clostridium Control 6 19± ±0 ### 8 41±0 ### 8 38±0 03 ### Model 3 24± ± ±0 33 Model+SMS(5 5mg/mL) 4 26±0 35 ### 5 28±0 42 # 7 30±0 36 ## Model+SMS(11 2mg/mL) 4 55±0 13 ### 5 40±0 11 # 7 72±0 06 ### Model+SMS(16 5mg/mL) 4 84±0 10 ### 5 06± ±0 02 ### Control+SMS(11.2mg/mL) 6 95±0 15 ### 8 41±0 02 ### 8 44±0 06 ### P<0 01, P<0 001vscontrolgroup; ## P<0 01, ### P<0 001vsmodelgroup 生 脉 散 对 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 的 调 节 作 用 在 人 肠 道 菌 群 体 外 失 衡 模 型 中, 原 本 属 于 优 势 菌 群 的 双 歧 杆 菌 和 乳 杆 菌 数 目 急 剧 下 降, 且 不 易 得 到 恢 复 ( 表 2) 与 模 型 组 相 比, 生 脉 散 低 中 高 剂 量 组 均 能 显 著 促 进 乳 杆 菌 的 增 殖 (P<0 01) 在 培 养 0~12h, 生 脉 散 低 中 高 剂 量 组 对 双 歧 杆 菌 的 作 用 不 显 著 (P>0 05) 培 养 至 24h 时, 与 模 型 组 相 比, 生 脉 散 高 剂 量 组 对 双 歧 杆 菌 有 显 著 性 抑 制 作 用 (P<0 01) 同 时, 生 脉 散 对 照 组 较 正 常 组 无 显 著 性 差 异 低 中 高 剂 量 组 均 对 一 些 肠 道 有 益 菌 ( 如 乳 酸 杆 菌 ) 有 一 定 的 促 进 增 殖 作 用 生 脉 散 低 中 剂 量 组 双 歧 杆 菌 的 数 目 无 显 著 影 响, 但 生 脉 散 高 剂 量 组 对 双 歧 杆 菌 有 一 定 的 抑 制 作 用, 可 能 是 因 为 五 味 子 含 量 增 加, 其 抑 菌 作 用 增 强 的 原 因 [14], 同 时 药 物 自 身 对 正 常 菌 群 无 显 著 性 影 响 生 脉 散 对 梭 菌 的 调 节 作 用 与 模 型 组 相 比, 生 脉 散 低 中 高 剂 量 组 均 能 显 著 促 进 梭 菌 的 增 殖 (P<0 01), 但 培 养 至 24h 时, 仍 显 著 低 于 正 常 组 (P<0 05)( 表 1) 梭 菌 属 有 80 多 种, 多 为 非 致 病 菌, 其 中 丁 酸 梭 菌 可 用 于 因 肠 道 紊 乱 引 起 的 各 种 消 化 道 症 状 及 相 关 的 腹 泻 消 化 不 良 等 [15] 同 时 生 脉 散 对 照 组 较 正 常 组 无 显 著 性 差 异 低 中 高 剂 量 组 均 对 梭 菌 具 有 促 进 增 殖 的 作 用, 但 仍 未 恢 复 至 正 常 状 态 同 时 药 物 自 身 对 正 常 菌 群 无 显 著 性 影 响 3 3 生 脉 散 对 培 养 人 肠 道 菌 群 产 生 SCFA 的 影 响 生 脉 散 对 照 组 厌 氧 培 养 24h 的 短 链 脂 肪 酸 气
5 第 47 卷 第 1 期 花 海 莹, 等 : 生 脉 散 对 人 肠 道 菌 群 失 衡 的 调 节 作 用 99 相 色 谱 图 见 图 3 Table2 EfectofSMSonthenumberofBifidobacteriaandLactobaciliinthemodelofintestinalfloraimbalanceinducedbyceftriaxone( x±s,n=3) 珋 Bacteria Group Numberofbacteria h Bifidobacteria Control 4 50± ±0 17 ### 5 30±0 25 ### 4 94±0 45 Model 3 27± ± ±0 28 Model+SMS(5 5mg/mL) 3 24± ± ±0 72 Model+SMS(11 2mg/mL) 3 33± ± ±0 35 Model+SMS(16 5mg/mL) 3 06± ± ±0 02 ## Control+SMS(11.2mg/mL) 5 88±0 03 ### 5 12±0 40 ### 5 14±0 17 Lactobacili Control 5 63± ±0 07 ### 8 19±0 01 ### 8 41±0 05 ### Model 3 20± ± ±0 21 Model+SMS(5 5mg/mL) 3 84±0 14 ### 5 18±0 44 # 7 28±0 24 ### Model+SMS(11 2mg/mL) 4 02±0 05 ### 5 39±0 15 ## 7 70±0 01 ### Model+SMS(16 5mg/mL) 3 59±0 19 # 5 21±0 12 # 7 55±0 04 ### Control+SMS(11.2mg/mL) 6 73±0 13 ### 8 89±0 03 ### 8 61±0 03 ### P<0 01, P<0 001vscontrolgroup; ## P<0 01, ### P<0 001vsmodelgroup Figure3 GCchromatogramofshortchainfatyacidinanaerobicfer mentationbrothwithsmsat24h 厌 氧 培 养 不 同 时 间 点 的 丙 酸 ( 图 4 A) 丁 酸 ( 图 4 B) 乙 酸 ( 图 4 C) 的 含 量 测 定 各 组 在 6 ~ 24h 的 时 间 段 内, 生 成 SCFA 的 量 是 不 断 增 加 的, 在 24h 取 得 最 大 值 与 模 型 组 相 比, 培 养 至 12h 时, 生 脉 散 低 中 剂 量 组 对 丁 酸 的 生 成 有 促 进 作 用 (P<0 01) 与 模 型 组 相 比, 在 培 养 24h 时, 生 脉 散 对 照 组 和 生 脉 散 低 中 高 剂 量 组 丙 酸 和 乙 酸 含 量 均 有 显 著 性 差 异 不 同 剂 量 组 均 能 显 著 性 的 增 加 短 链 脂 肪 酸 的 含 量, SCFA 的 生 成 降 低 肠 道 内 的 ph 和 氧 化 还 原 电 位, 可 以 防 止 潜 在 肿 瘤 的 发 生 和 抑 制 腐 败 菌 的 增 殖 [16] Figure4 ProductionofSCFAinanaerobicfermentationbrothat0,6,12and24h( 珋 x±s,n=3) P<0 01, P<0 001vsmodelgroup 讨 论 肠 道 菌 群 包 括 益 生 菌 和 潜 在 致 病 菌, 正 常 情 况 下 两 类 菌 保 持 平 衡, 当 平 衡 被 打 破, 一 些 潜 在 致 病 菌 大 量 繁 殖 或 者 转 移 到 肠 道 以 外 的 其 他 部 位, 就 会 引 起 感 染 从 而 造 成 身 体 疾 病, 严 重 的 甚 至 会 引 起 死 亡 [17] 本 研 究 通 过 头 孢 曲 松 钠 改 变 体 外 人 肠 道 菌 群 的 结 构, 造 成 双 歧 杆 菌 乳 杆 菌 和 梭 菌 数 目 的 减 少, 肠 球 菌 和 肠 杆 菌 的 异 常 增 殖 以 及 代 谢 异 常 给 予
6 100 学 报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2016,47(1): 第 47 卷 生 脉 散 后, 低 中 高 剂 量 组 对 乳 杆 菌 梭 菌 增 殖 具 有 促 进 作 用, 且 中 高 剂 量 组 对 肠 球 菌 肠 杆 菌 有 明 显 抑 制 作 用, 高 剂 量 组 对 双 歧 杆 菌 也 具 有 抑 制 作 用, 因 此 生 脉 散 中 剂 量 组 对 失 衡 的 肠 道 菌 群 有 明 显 的 正 向 调 整 作 用 短 链 脂 肪 酸 为 碳 链 1~6 的 有 机 脂 肪 酸, 人 体 内 的 短 链 脂 肪 酸 主 要 为 乙 酸 丙 酸 和 丁 酸, 这 3 种 约 占 总 短 链 脂 肪 酸 的 85% [18] 研 究 发 现 乙 酸 可 能 是 降 低 血 液 胆 固 醇 的 真 正 原 因 [19], 动 物 实 验 显 示 丙 酸 盐 可 以 抑 制 肝 和 结 肠 内 低 密 度 胆 固 醇 的 合 成 [20] 本 研 究 结 果 表 明 生 脉 散 能 显 著 提 高 培 养 肠 道 菌 群 SCFA 的 含 量, 尤 其 是 乙 酸 和 丙 酸 的 生 成 量 SCFA 的 生 成 对 人 体 维 持 大 肠 的 正 常 生 理 功 能, 降 低 肠 道 ph, 抑 制 腐 败 菌 的 增 殖, 改 善 肠 道 微 环 境 具 有 重 要 意 义 以 上 结 果 提 示, 生 脉 散 对 失 衡 的 人 肠 道 菌 群 的 正 向 调 节 作 用 以 及 对 SCFA 代 谢 的 调 节, 可 能 是 其 发 挥 药 效 作 用 的 重 要 环 节 之 一 参 考 文 献 [1] QinJ,LiR,RaesJ,etal.Ahumangutmicrobialgenecatalogue establishedbymetagenomicsequencing[j].nature,2010,464 (7285):59-65 [2] WrightRS,AndersonJW,BridgesSR.Propionateinhibitshepato cytelipidsynthesis[j].expbiolmed,1990,195(1):26-29 [3] WangZ,PengY,LiXB.EfectofSijunzidectionontheintestinal floradisturbanceintworatmodelsofpi deficiencysyndrome [J].ChinJIntegrTraditWestMed( 中 国 中 西 医 结 合 杂 志 ), 2009,29(9): [4] WangG,MaSX,HuXJ,etal.Efectsofpolysaccharidesfrom RadixCodonopsisonthegrowthofBifidobacteriaandE.coliin vitro[j].chinjmicroecol( 中 国 微 生 态 学 杂 志 ),2010,22(3): [5] WangYQ,ZhangJQ,LiuCH,etal.Screeningandidentifyingthe myocardial injury protective ingredients from Sheng Mai San [J].PharmBiol,2013,51(10): [6] WangLY,WangS,WangY,etal.EfectofMDG 1onoralglu cosetoleranceandintestinalmicroecologicalbalanceindiabetic mice[j].worldchinjdig( 世 界 华 人 消 化 杂 志 ),2011,19 (19): [7] WangHY,HuaHY,LiuXY,etal.Invitrobiotransformationof redginsengextractbyhumanintestinalmicroflora:metabolites identificationandmetabolicprofileelucidationusinglc Q TOF/ MS[J].JPharmBiomedAnal,2014,98(2014): [8] MaLP,ZhaoJF,WangLJ,etal.Prebioticfunctioninvitroof alpha galactooligosac charidesfrom StachysfloridanaSchutl.ex Benth[J].FoodSciTechnol( 食 品 科 技 ),2013,38(5): [9] MooreW,HoldemanLV.Humanfecalflora:thenormalfloraof 20Japanese Hawaians[J].ApplMicrobiol,1974,27(5): [10] ZhuNY,BeiYJ,ZhengTL,etal.Comparisonofbacteriaflorasin intestinesofhealthyanddiseasedchinesesoft sheledturtles (Pelodiscussinensis)andinaquaticwater[J].ActaAgricZhe jiangensis( 浙 江 农 业 学 报 ),2014,26(5): [11] LiuXH,LiSM,XiongYL.Researchprogresonefectandmech anism ofshortchainfatyacidforintestinaltract[j].parenter EnteralNutr( 肠 外 与 肠 内 营 养 ),2012,19(1):56-58 [12] JiaYQ,YeFY,WangS,etal.Extractionanddeterminationof short chainfatyacidsinbiologicalsamples[j].resexplorlab ( 实 验 室 研 究 与 探 索 ),2012,31(7): [13]TangH.Entericdysbacteriosiscausedbyantibioticandmodula tionoftheintestinalmicroflorabylactobacilusspp( 抗 生 素 所 致 肠 道 菌 群 失 衡 及 乳 杆 菌 对 其 调 节 作 用 的 研 究 )[D]. Chongqin:ThirdMilitrayMedicalUniversity,2007 [14] YanSY,LinSQ,FuJ,etal.Evaluationofbacteriostaticactivity ofextractfromschisandrawchinensisfructus[j].chinjexpmed Formul( 中 国 实 验 方 剂 学 杂 志 ),2014,20(10): [15] HiromiS,MasaakiS,TadaoM,etal.Preventionofantibiotic asociateddiarheainchildrenbyclostridiumbutyricummiyai RI[J].PediatrInt,2003,45(1):86-90 [16]SchneiderSM,Girard PipauF,FilippiJ,etal.EfectsofSaccha romycesboulardionfecalshort chainfatyacidsandmicroflora inpatientsonlong termtotalenteralnutrition[j].worldjgas troenterol,2005,11(39):6165 [17] GumaerF,CaselasF,BoruelN,etal.Roleofmicroecologyin chronicinflammatoryboweldiseases[j].eurjclinnutr,2002, 56(4):S34-38 [18] MortensenPB,ClausenMR.Short chainfatyacidsinthehuman colon:relationtogastrointestinalhealthanddisease[j].scandj Gastroenterol,1996,31(S216): [19] SacksFM,BrayGA,CareyVJ,etal.Comparisonofweight los dietswithdiferentcompositionsoffat,protein,andcarbohydrates [J].NEnglJMed,2009,360(9): [20] AlvaroA,SolaR,RosalesR,etal.Geneexpresionanalysisofa humanenterocytecellinerevealsdownregulationofcholesterol biosynthesisinresponsetoshort chainfatyacids[j].iubmb Life,2008,60(11):
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