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1 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2009, February 25; 25(2): journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN cjb@im.ac.cn 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 综 述 工 业 微 生 物 中 NADH 的 代 谢 调 控 秦 义, 董 志 姚, 刘 立 明, 陈 坚 江 南 大 学 工 业 生 物 技 术 教 育 部 重 点 实 验 室, 无 锡 摘 要 : NADH 是 微 生 物 代 谢 网 络 中 的 一 种 关 键 辅 因 子 调 节 微 生 物 胞 内 NADH 的 形 式 与 浓 度 是 定 向 改 变 和 优 化 微 生 物 细 胞 代 谢 功 能, 实 现 代 谢 流 最 大 化 快 速 化 地 导 向 目 标 代 谢 产 物 的 重 要 手 段 之 一 以 下 在 详 尽 总 结 了 NADH 生 理 功 能 的 基 础 上, 从 生 化 工 程 ( 添 加 外 源 电 子 受 体 不 同 氧 化 还 原 态 底 物 及 NAD 合 成 前 体 物, 调 节 培 养 环 境 和 氧 化 还 原 电 势 ) 和 代 谢 工 程 ( 过 量 表 达 NADH 代 谢 相 关 酶 缺 失 NADH 竞 争 途 径 及 引 入 NADH 外 源 代 谢 途 径 ) 两 方 面 分 析 归 纳 了 NADH 代 谢 调 控 策 略, 进 而 凝 练 出 调 控 NADH/NAD + 比 率 调 节 微 生 物 细 胞 代 谢 功 能 研 究 方 面 亟 待 解 决 的 3 个 科 学 问 题 及 可 能 的 解 决 途 径 关 键 词 : NADH, 形 式 与 浓 度, 调 控 策 略, 工 业 微 生 物 Manipulation of NADH metabolism in industrial strains Yi Qin, Zhiyao Dong, Liming Liu, and Jian Chen The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi , China Abstract: Nicotinamide adenine nucleotide (NADH), the key cofactor in the metabolic network, plays an essential role in biochemical reaction and physiological function of industrial strains. Manipulation of NADH availability and form is an efficient and easy way to redirect the carbon flux to the target metabolites in industrial strains. We reviewed the physiological function of NADH. Detailed strategies to manipulate NADH availability are addressed. NADH manipulation to enhance metabolic function of industrial strains was discussed and potential solutions were suggested. Keywords: NADH, availability and form, manipulation strategy, industrial strain 利 用 源 于 生 物 质 的 己 糖 或 戊 糖 为 原 料 生 产 重 要 生 物 基 化 学 品 的 工 业 发 酵, 是 工 业 生 物 技 术 的 核 心 研 究 领 域 之 一 在 利 用 微 生 物 过 量 合 成 生 物 基 化 学 品 的 过 程 中, 需 要 考 虑 的 问 题 是 : 如 何 优 化 或 改 变 微 生 物 的 代 谢 网 络 和 表 达 调 控 网 络, 以 提 高 目 标 代 谢 产 物 的 产 量 和 积 累 速 度 或 合 成 新 的 代 谢 物? 实 际 上, 对 微 生 物 代 谢 过 程 的 理 解 开 发 和 利 用 是 否 能 达 到 或 者 超 过 化 学 加 工 水 平, 是 提 高 发 酵 过 程 经 济 性 的 关 键 基 因 工 程 技 术 的 进 步, 为 菌 株 改 良 和 生 理 学 特 性 的 认 识 提 供 了 比 传 统 诱 变 技 术 更 为 合 理 的 Received: August 4, 2008; Accepted: November 13, 2008 Supported by: the National Outstanding Youth Foundation of China (No ); the National Natural Science Foundation of China (Nos , ), the National High-tech Research Development Plan of China (863 Program) (No. 2006AA02Z201), and the Major State Basic Research Development Program of China (973 Program) (No. 2007CB714303). Corresponding author: Jian Chen. Tel: ; Fax: ; jchen@jiangnan.edu.cn Liming Liu. mingll@jiangnan.edu.cn 国 家 杰 出 青 年 基 金 (No ), 国 家 自 然 科 学 基 金 (Nos , ), 国 家 863 计 划 (No. 2006AA02Z201) 和 国 家 973 项 目 (No. 2007CB7l4303) 资 助

2 162 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2009 Vol.25 No.2 手 段 基 因 工 程 所 采 取 的 主 要 手 段 是 : 1) 阻 断 目 标 代 谢 产 物 的 降 解 途 径 ; 2) 强 化 目 标 代 谢 产 物 的 生 物 合 成 途 径 ; 3) 解 除 生 物 合 成 途 径 的 代 谢 调 节 这 些 手 段 在 提 高 目 标 代 谢 产 物 的 产 量 产 率 和 生 产 强 度 方 面 已 被 证 实 是 非 常 有 效 的 然 而, 并 不 是 从 途 径 中 任 意 选 择 某 个 基 因 进 行 过 量 表 达 或 基 因 敲 除 就 能 够 实 现 代 谢 工 程 的 目 标 举 例 来 说, 提 高 糖 酵 解 速 度 是 所 有 以 糖 质 原 料 为 底 物 的 工 业 发 酵 过 程 共 同 关 心 的 问 题 但 单 独 或 者 共 同 过 量 表 达 糖 酵 解 途 径 的 限 速 酶 的 基 因, 并 不 能 显 著 提 高 酵 解 速 度 同 时, 在 代 谢 流 改 造 过 程 中, 目 标 代 谢 产 物 的 得 率 降 低 副 产 物 大 量 积 累 的 问 题 也 日 益 显 现 [1] 上 述 问 题 的 实 质 在 于 : 除 了 采 用 代 谢 工 程 重 构 代 谢 网 络 外, 还 应 当 在 对 微 生 物 代 谢 网 络 结 构 和 工 程 进 行 准 确 分 析 的 基 础 上, 重 视 细 胞 表 达 调 控 网 络 的 研 究 也 就 是 说, 不 仅 要 定 向 改 变 代 谢 流 的 方 向 并 使 通 量 最 大 化, 还 要 定 向 改 变 和 优 化 微 生 物 的 功 能 而 调 节 微 生 物 细 胞 内 辅 因 子 的 形 式 和 浓 度 是 改 变 和 优 化 微 生 物 功 能 的 关 键 性 因 素 之 一 1998 年, 荷 兰 Delft 大 学 Hugenholtz J 研 究 小 组 在 乳 酸 乳 球 菌 (Streptococcus lactis) 中 过 量 表 达 来 源 于 变 异 链 球 菌 (Streptococcus mutans) 编 码 NADH 氧 化 酶 的 nox-2 基 因, 使 NADH 氧 化 酶 活 性 提 高 150 倍, 导 致 重 组 菌 迅 速 转 入 混 合 酸 发 酵, 且 转 换 程 度 取 决 于 NADH 氧 化 酶 酶 活 水 平 [1] 由 于 NADH 是 碳 代 谢 和 氮 代 谢 的 关 键 辅 因 子, 这 一 研 究 借 助 于 基 因 工 程 手 段 直 接 操 纵 NADH 等 辅 因 子 在 微 生 物 细 胞 内 的 含 量 和 形 式, 比 改 进 代 谢 网 络 中 若 干 节 点 处 的 酶 活 性 对 碳 代 谢 流 的 影 响 更 为 有 效 [2] 而 这 种 过 量 表 达 多 种 碳 代 谢 途 径 所 共 享 的 NADH 氧 化 酶 系 统, 在 NADH 层 面 上 调 控 碳 代 谢 流 的 策 略, 形 成 了 代 谢 工 程 的 一 个 重 要 分 支 辅 因 子 工 程 辅 因 子 工 程 是 采 用 分 子 生 物 学 的 手 段, 改 造 细 胞 内 辅 因 子 的 再 生 途 径, 调 控 微 生 物 细 胞 内 辅 因 子 的 形 式 和 浓 度, 定 向 改 变 和 优 化 微 生 物 细 胞 代 谢 功 能, 实 现 代 谢 流 最 大 化 快 速 化 地 导 向 目 标 代 谢 产 物 辅 因 子 工 程 所 涉 及 的 辅 因 子 有 : ATP/ADP/AMP NADH/NAD + NADPH/NADP + 乙 酰 辅 酶 A 及 其 衍 生 物 维 生 素 和 微 量 元 素 其 中, NADH/NAD + 作 为 重 要 的 辅 因 子 全 程 参 与 了 微 生 物 细 胞 内 300 多 个 氧 化 还 原 反 应 [3,4] ( 图 1) 以 下 在 详 尽 分 析 NADH 和 NAD + 及 其 比 率 的 生 理 作 用 的 基 础 上, 从 生 化 工 程 和 代 谢 工 程 两 个 方 面 详 述 了 NADH NAD + 含 量 及 其 比 率 的 调 控 策 略, 并 就 NADH 调 节 研 究 中 遇 到 的 难 题, 提 出 了 可 能 的 手 段 1 NADH 生 理 代 谢 功 能 NADH 作 为 重 要 的 辅 因 子, 参 与 了 微 生 物 细 胞 内 300 多 个 氧 化 还 原 反 应 [3 6], 其 生 理 代 谢 功 能 体 现 在 : 1) 调 控 能 量 代 谢 : NADH 通 过 线 粒 体 内 的 电 子 传 递 链, 利 用 氧 作 为 最 终 电 子 受 体, 产 生 大 量 ATP [7, 8] ; 2) 调 节 微 生 物 胞 内 氧 化 还 原 状 态 : NADH/NAD + 比 率 反 映 了 微 生 物 细 胞 内 的 氧 化 还 原 状 态 ; 3) 调 控 碳 代 谢 流 : NADH 通 过 自 身 或 所 产 生 的 ATP 激 活 或 抑 制 代 谢 途 径 中 关 键 酶 的 活 性 实 现 对 碳 代 谢 流 流 向 及 其 通 量 的 调 控 ; 4) 调 节 线 粒 体 功 能 : NADH 通 过 影 响 线 粒 体 通 透 性 [9] 控 制 线 粒 体 膜 上 的 电 压 依 从 性 [10] [11] 阴 离 子 通 道 和 增 加 线 粒 体 膜 电 位 等 途 径 改 变 线 粒 体 活 性 ; 5) 调 控 细 胞 生 命 周 期 [12] 分 析 NADH 的 生 理 功 能 表 明, 调 控 NAD (H/ + ) 代 谢 能 有 效 地 调 节 微 生 物 细 胞 的 生 长 及 其 代 谢 功 能 [13] 调 控 NAD (H/ + ) 代 谢 的 方 式 包 括 外 源 和 内 源 两 种 ( 表 1): 外 源 调 节 主 要 是 指 采 用 生 化 工 程 的 方 法, 通 过 添 加 外 源 电 子 受 体 [14] [15] 不 同 还 原 态 碳 源 和 NAD + 前 体 物 [16], 改 变 溶 氧 [17] [18] 温 度 及 胞 外 氧 化 还 [19] 原 电 位 等 实 现 对 NADH 代 谢 的 调 控 ; 而 内 源 调 节 则 是 指 通 过 代 谢 工 程 的 策 略 调 节 与 NAD(H/ + ) 代 谢 相 关 酶 的 活 性, 如 删 除 NADH 竞 争 代 谢 途 径 或 构 建 NAD (H/ + ) 代 谢 途 径 [20] 2 基 于 生 化 工 程 的 NADH 代 谢 调 控 好 氧 条 件 下, 微 生 物 以 分 子 氧 为 最 终 电 子 受 体, 通 过 线 粒 体 内 的 电 子 传 递 链 将 NADH 氧 化 为 NAD +, 而 在 微 氧 或 者 厌 氧 条 件 下, NADH 的 氧 化 则 主 要 通 过 发 酵 途 径 实 现 与 电 子 传 递 链 比 较, 发 酵 途 径 氧 化 NADH 效 率 较 低, 导 致 胞 内 NADH/NAD + 比 率 升 高 [22,24] 为 了 在 微 氧 或 厌 氧 条 件 维 持 微 生 物 细 胞 内 最 佳 的 NADH/NAD + 比 率 或 为 进 一 步 调 节 微 生 物 代 谢 功 能, 以 促 进 目 标 代 谢 产 物 的 生 产, 通 常 采 用 添 加 电 子 受 体 改 变 底 物 氧 化 还 原 状 态 和 调 节 环 境 条 件 等 策 略 以 实 现 对 NADH/NAD + 比 率 的 调 节

3 秦 义 等 : 工 业 微 生 物 中 NADH 的 代 谢 调 控 163 图 1 辅 因 子 NADH/NAD + [3,4] 全 程 参 与 微 生 物 细 胞 合 成 各 类 代 谢 产 物 Fig. 1 NADH/NAD + was involved in 300 metabolic reactions [3,4]. 表 1 NADH 代 谢 调 控 方 式 Table 1 The manipulation strategies of NADH Manipulation strategies Results/conclusion Ref erence Biochemical engineering Feeding external electron acceptors Acetaldehyde Decreased NADH/NAD + ratio [7] Fumarate or nitrate Decreased NADH/NAD + ratio [21] Acetoin Decreased NADH level [22, 23] Pyruvate, citrate, O 2, or fructose Decreased NAD(P)H level [24] Furfural Decreased NADH level [25] Carbon sources with different oxidation states Sorbitol Increased NADH availability [15] Gluconate Decreased NADH/NAD + ratio [3] NAD + precursor Nicotinic acid Increased NAD + level [7] Culture conditions Lower temperature Increased NADH/NAD + ratio [18] Increased dissolved oxygen level Increased NADH availability [17] Extracellular oxidoreduction potential Decreased NAD + /NADH ratio at relatively oxidative environment [26] Metabolic engineering Overexpressing enzymes association with NADH metabolism Nicotinic acid phosphoribosyltransferase Increased NAD + levels and decreased NADH/NAD + ratio [27] Eliminating NADH competition pathways Inactivating aldehyde dehydrogenase Increased NADH availability [28] Deactivating adhe, ldha and ack-pta, simultaneously Increased NADH availability [29] Introducing heterogeneous NADH metabolic pathways H 2 O-NADH oxidase Decreased NADH level and NADH/NAD + ratio [30] Alternative oxidase Decreased NADH/NAD + ratio [31] NAD + -dependent formate dehydrogenase Increased NADH availability [3, 5]

4 164 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2009 Vol.25 No 添 加 外 源 电 子 受 体 调 控 NADH 代 谢 已 有 研 究 表 明, 醛 酮 酸 分 子 氮 或 硝 酸 盐 均 能 作 为 外 源 电 子 受 体, 加 速 NADH 氧 化, 维 持 细 胞 处 于 最 佳 氧 化 还 原 状 态 (NADH/NAD + 比 率 ) [21, 25, 32, 33] 在 利 用 异 型 发 酵 乳 酸 菌 发 酵 己 糖 生 产 有 机 酸 的 过 程 中, 添 加 一 定 的 外 源 电 子 受 体 ( 果 糖 丙 酮 酸 或 柠 檬 酸 等 ) 有 效 地 加 速 了 NAD(P)H 代 谢 速 度, 降 低 副 产 物 赤 藻 糖 醇 和 甘 油 的 积 累, 显 著 加 速 乳 酸 菌 的 生 长 [24] 另 一 方 面, 在 利 用 Saccharomyces cerevisiae TMB3001 和 Fusarium oxysporum 发 酵 木 糖 生 产 乙 醇 的 过 程 中 添 加 乙 偶 姻 作 为 外 源 电 子 受 体, 有 效 地 增 加 了 胞 内 NAD + [22, 23, 含 量, 提 高 了 乙 醇 的 产 率 25] 光 滑 球 拟 酵 母 呼 吸 缺 陷 型 突 变 菌 株 在 电 子 传 递 链 阻 断 条 件 下, 添 加 4 mmol/l 的 外 源 电 子 受 体 乙 醛, 将 NADH/NAD + 降 低 到 0.22, 使 葡 萄 糖 消 耗 速 度 和 丙 酮 酸 产 量 提 高 了 26.3% 和 22.5% [7] 机 会 致 病 菌 Pseudomonas aeruginosa PA14 能 以 吩 嗪 作 为 外 源 电 子 受 体 以 有 效 降 低 胞 内 NADH 水 平 [32] 2.2 添 加 不 同 还 原 态 底 物 对 NADH 代 谢 的 调 控 碳 源 根 据 其 在 代 谢 过 程 中 所 产 的 NADH 量 不 同 而 分 为 1 0 和 +1 氧 化 态 ( 图 2) 美 国 Rice 大 学 San KY 研 究 小 组 在 稀 释 率 为 0.1 h 1 恒 化 厌 氧 培 养 系 统 中 发 现, 随 着 碳 源 氧 化 态 的 增 大, NADH/NAD + 比 率 从 0.51( 葡 萄 糖 酸 ) 增 加 到 0.75( 葡 萄 糖 ) 和 0.94( 山 梨 醇 ), 导 致 中 心 代 谢 流 产 物 乙 醇 ( 消 耗 2 mol NADH) 对 乙 酸 ( 不 消 耗 NADH) 的 比 率 随 之 改 变 以 葡 萄 糖 酸 葡 萄 糖 和 山 梨 醇 为 碳 源 时, 乙 醇 对 乙 酸 (Et/Ac) 比 率 分 别 为 和 3.62 而 在 好 氧 条 件 下, 这 一 比 率 为 0 0 和 0.81 [3] 基 于 上 述 发 现, Sánchez AM 在 恒 化 培 养 系 统 中 以 不 同 氧 化 态 碳 源 为 调 节 NADH 含 量 的 手 段, 以 研 究 NADH 对 碳 代 谢 流 流 向 和 通 量 的 影 响 [5] 而 在 琥 珀 酸 的 发 酵 过 程 中 添 加 山 梨 醇, 增 加 重 组 E. coli 胞 内 NADH 的 含 量, 使 琥 珀 酸 的 产 量 和 产 率 分 别 提 高 了 96% 和 81% [15] 2.3 NAD + 合 成 前 体 促 进 胞 内 NAD(H/ + ) 代 谢 微 生 物 细 胞 利 用 自 身 合 成 的 或 从 培 养 基 中 吸 收 的 烟 酸 烟 碱 作 为 前 体, 在 磷 酸 核 糖 转 移 酶 的 作 用 下 经 3 步 反 应 合 成 NAD + ( 图 3) 为 此, Liu LM 等 在 光 滑 球 拟 酵 母 发 酵 生 产 丙 酮 酸 过 程 添 加 8 mg/l NAD + 合 成 前 体 烟 酸, 使 葡 萄 糖 消 耗 速 度 和 丙 酮 酸 产 量 分 别 增 加 了 48.4% 和 29% [7] 此 外, 烟 碱 核 糖 通 过 烟 碱 核 糖 激 酶 的 磷 酸 化 作 用 和 腺 苷 裂 解 酶 的 腺 苷 酰 作 用 合 成 NAD +[16,34], 从 而 为 提 高 胞 内 NADH 和 NAD + 含 量 提 供 了 新 的 思 路 ( 图 3) 2.4 环 境 条 件 对 NADH 代 谢 的 调 控 微 生 物 细 胞 所 处 的 外 部 环 境 条 件, 如 溶 氧 温 度 的 变 化 导 致 与 之 相 关 的 NADH ATP 合 成 和 消 耗, 从 而 使 微 生 物 细 胞 内 的 物 质 代 谢 途 径 发 生 显 著 变 化 [35] 在 氧 限 制 的 条 件 下 Aspergillus niger 主 要 通 过 依 赖 于 NAD + 的 甘 露 醇 -1- 磷 酸 脱 氢 酶 实 现 NADH 的 氧 化 [35] 当 溶 氧 水 平 从 1% 增 加 到 10% 时, T. glabrata IFO 0005 胞 内 NADH 浓 度 增 加 了 50%, 继 续 增 加 溶 图 2 Fig. 2 葡 萄 糖 山 梨 醇 及 葡 萄 糖 酸 的 氧 化 还 原 状 态 The difference of the oxidation state of carbon source.

5 秦 义 等 : 工 业 微 生 物 中 NADH 的 代 谢 调 控 165 图 3 球 拟 假 丝 酵 母 中 NAD + 生 物 合 成 途 径 Fig. 3 Pathways of NAD + biosynthesis in Candida glabrata. 氧 水 平, 则 不 能 增 加 胞 内 NADH 含 量 [17] 而 在 高 溶 氧 的 条 件 下, 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 脱 氢 酶 苹 果 酸 酶 和 依 赖 NADP + 的 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 活 性 和 表 达 量 明 显 上 调, 而 TCA 循 环 中 合 成 NADH 的 相 关 酶 的 活 性 明 显 抑 制 [36,37] Singh R 发 现, 高 溶 氧 条 件 下 荧 光 假 单 胞 菌 调 整 NAD + 激 酶 和 NADP + 磷 酸 化 酶, 以 增 加 胞 内 NADPH 的 供 给, 限 制 NADH 的 合 成 [36] 根 据 不 同 溶 氧 条 件 下 细 胞 代 谢 对 NADH 的 需 求, Liu L 等 在 高 浓 度 溶 氧 条 件 下 添 加 外 源 电 子 受 体 乙 醛 对 细 胞 的 碳 和 能 量 代 谢 并 不 产 生 影 响, 但 在 低 溶 氧 条 件 下 (20%) 会 降 低 NADH/NAD + 的 比 率, 导 致 丙 酮 酸 产 量 产 率 和 生 产 强 度 与 没 有 添 加 乙 醛 的 对 照 组 比 较, 分 别 提 高 了 68% 44% 和 45% [7] 在 温 度 调 控 胞 内 NADH 方 面, 王 翠 华 等 发 现 较 低 的 发 酵 温 度 能 维 持 较 高 的 胞 内 NADH/NAD + 水 平 [18] 2.5 氧 化 还 原 电 势 (ORP) 的 改 变 对 NADH 代 谢 的 调 控 氧 化 还 原 电 位 作 为 反 映 微 生 物 培 养 环 境 氧 化 还 原 状 态 的 物 理 参 数, 通 过 影 响 电 子 传 递 链 中 具 有 金 属 活 性 位 点 的 关 键 酶 活 性, 影 响 NADH/NAD + 比 率, [19, 26, 38, 进 而 影 响 微 生 物 代 谢 途 径 39] Du 等 通 过 改 变 Klebsiella pneumoniae 发 酵 液 的 氧 化 还 原 电 位, 使 胞 内 NAD + /NADH 比 率 >4, 显 著 提 高 了 细 胞 的 比 生 长 速 率 和 1,3- 丙 二 醇 的 产 量 [26] 3 基 于 代 谢 工 程 的 NADH 代 谢 调 控 根 据 微 生 物 细 胞 内 NADH 合 成 与 代 谢 的 途 径, 利 用 DNA 重 组 技 术 加 强 削 弱 删 除 或 者 构 建 新 的 与 NADH 代 谢 相 关 的 代 谢 途 径, 从 而 实 现 胞 内 NADH 含 量 的 调 控 3.1 过 量 表 达 NADH 代 谢 相 关 酶 调 控 NADH 代 谢 在 促 进 NAD + 合 成 方 面, 发 现 E. coil 中 由 pncb 基 因 编 码 的 烟 酸 磷 酸 核 糖 转 移 酶 (NAPRTase; EC ) 催 化 生 成 烟 酸 单 核 苷 酸 (NAMN) 的 反 应 是 NAD 回 补 途 径 中 的 关 键 限 速 步 骤 过 量 表 达 pncb 基 因, 导 致 胞 内 NAD + NADH 和 总 NAD + 分 别 提 高 了 81.8% 29.8% 和 41.7%, 而 NADH/NAD + 比 率 降 低 了 41.6% [27] ; 类 似 地, 在 过 量 表 达 未 突 变 及 操 纵 子 区 突 变 的 pncb 基 因 突 变 株 E. coil DH10B 中, NAD (H/ + ) 水 平 相 应 地 提 高 了 26% 和 216% [3] Heuser F 等 通 过 在 E. coli 中 同 时 过 量 表 达 编 码 烟 酸 转 磷 酸 核 糖 激 酶 和 NAD 合 成 酶 的 pncb 和 nade 基 因, 使 NAD(H) 和 NADP(H) 总 量 分 别 增 加 7 倍 和 2 倍 [40] 在 过 量 表 达 依 赖 于 NAD + 的 脱 氢 酶 方 面, Cordier H 等 在 酿 酒 酵 母 中 过 量 表 达 编 码 胞 质 依 赖 NAD + 的 乙 醛 脱 氢 酶 基 因 ALD3, 实 现 了 NADH 高 效 再 生 ; 与

6 166 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2009 Vol.25 No.2 此 同 时, 敲 除 编 码 依 赖 于 NAD + 的 乙 醇 脱 氢 酶 基 因 ADH1, 有 效 地 降 低 了 胞 内 NADH 消 耗, 使 甘 油 产 率 和 生 产 强 度 在 好 氧 条 件 下 分 别 达 到 0.46 g/g 和 3.1 mmol/(g g) [20] 而 在 酿 酒 酵 母 中 过 量 表 达 内 源 苹 果 酸 酶, 解 决 了 酿 酒 酵 母 中 NADH 和 NADPH 之 间 的 不 能 自 由 转 换, 实 现 了 木 糖 还 原 酶 木 糖 醇 脱 氢 酶 氧 化 还 原 的 平 衡, 促 进 了 酿 酒 酵 母 高 效 利 用 木 糖 [41, 为 碳 源 发 酵 生 产 乙 醇 42] 3.2 缺 失 竞 争 利 用 NADH 途 径 调 控 NADH 代 谢 如 图 4 所 示, 在 利 用 工 业 微 生 物 发 酵 生 产 目 标 代 谢 产 物 的 过 程 中, 如 何 缺 失 或 削 弱 NADH 竞 争 代 谢 途 径, 将 NADH 导 向 目 标 代 谢 途 径, 是 代 谢 工 程 研 究 的 主 要 内 容 之 一 [28,43,44] 在 利 用 Klebsiella pneumoniae 以 甘 油 为 底 物 合 成 1,3- 丙 二 醇 的 代 谢 途 径 中, 敲 除 竞 争 利 用 NADH 的 乙 醛 脱 氢 酶, 增 加 NADH 导 向 1,3- 丙 二 醇 氧 化 还 原 酶 的 通 量, 使 1,3- 丙 二 醇 生 产 强 度 达 到 mmol/(l h) [28] 图 4 丙 酮 酸 节 点 处 NADH 竞 争 代 谢 途 径 Fig. 4 The NADH competing pathway at pyruvate node. 在 葡 萄 糖 发 酵 生 产 甘 油 的 过 程 中, Geertman JMA 等 综 合 采 用 了 维 持 1,6- 磷 酸 果 糖 激 酶 和 磷 酸 丙 糖 异 构 酶 活 性 削 弱 与 甘 油 竞 争 NADH 的 代 谢 途 径 和 加 强 线 粒 体 基 质 氧 化 分 解 速 度 等 策 略, 以 及 添 加 甲 酸 促 进 胞 质 NADH 生 成 速 度, 使 酿 酒 酵 母 生 产 甘 油 产 率 突 破 理 论 值 (1 mol 甘 油 /mol 葡 萄 糖 ), 达 到 1.08 mol/mol 葡 萄 糖 [43] 类 似 地, Sánchez AM 通 过 删 除 E. coil 中 竞 争 利 用 NADH 的 乙 醇 及 乙 酸 合 成 途 径, 并 过 量 表 达 丙 酮 酸 羧 化 酶, 使 琥 珀 酸 产 率 达 到 1.31 mol/mol 葡 萄 糖 [44] 在 此 基 础 上 开 启 对 NADH 需 求 较 小 的 乙 醛 酸 循 环 途 径, 将 琥 珀 酸 对 NADH 需 求 量 从 2 mol 降 为 1.5 mol, 实 现 了 葡 萄 糖 到 琥 珀 酸 的 高 效 转 化 [29] 3.3 引 入 外 源 代 谢 途 径 调 控 NADH 代 谢 调 控 胞 内 NADH 代 谢 的 另 一 重 要 策 略 是 在 微 生 物 细 胞 内 引 入 外 源 氧 化 还 原 代 谢 相 关 酶, 改 变 胞 内 NADH 生 成 或 氧 化 途 径, 从 而 改 变 NADH/NAD + 的 比 率, 实 现 微 生 物 细 胞 内 氧 化 还 原 状 态 的 调 控 胞 质 NADH 需 通 过 穿 梭 途 径 进 入 线 粒 体, 实 现 NADH 再 氧 化 如 能 在 胞 质 中 表 达 形 成 水 的 NADH 氧 化 酶, 可 直 接 将 胞 质 中 的 NADH 氧 化 为 NAD +, 提 高 NADH 氧 化 速 度 和 效 率 de Felipe FL 等 将 来 源 于 Streptococcus mutans 中 的 NADH 氧 化 酶 过 量 表 达 于 Lactococcus lactis 中 (NADH 氧 化 酶 活 性 提 高 了 150 倍 ), 在 胞 质 中 实 现 NADH 的 直 接 氧 化, 提 高 了 NADH 氧 化 速 度 和 效 率, 显 著 降 低 NADH/NAD + 的 比 率, 使 乳 酸 菌 从 单 一 的 乳 酸 发 酵 转 为 混 合 酸 发 酵 [1] 同 样, 在 Saccharomyces cerevisiae 中 过 量 表 达 来 源 于 乳 酸 菌 (Lactococcus lactis) 编 码 形 成 水 的 NADH 氧 化 酶 noxe 基 因, 导 致 胞 内 NADH 和 NADH/NAD + 分 别 下 降 5 和 6 倍, 而 葡 萄 糖 消 耗 速 度 增 加 了 10% [30] 此 外, 在 线 粒 体 内 表 达 更 高 氧 化 效 率 的 NADH 选 择 性 氧 化 酶, 将 NADH 氧 化 途 径 从 电 子 传 递 链 导 向 选 择 性 氧 化 酶 途 径, 显 著 降 低 NADH/NAD + 比 率 和 ATP 含 量 [31] 为 了 提 高 厌 氧 条 件 下 NADH 氧 化 效 率, Costenoble R 等 在 一 株 Gpd1p 和 Gpd2p 双 重 缺 陷 的 Saccharomyces cerevisiae 中, 引 入 源 于 E. coli 的 编 码 依 赖 NADH 的 1- 磷 酸 甘 露 醇 脱 氢 酶, 实 现 了 NADH 氧 化 途 径 的 转 变 [45] 除 加 速 NADH 氧 化 外, 某 些 代 谢 产 物 合 成 过 程 中 需 要 大 量 的 NADH, 因 此, 如 何 提 高 NADH 生 成 效 率 是 提 高 目 标 代 谢 产 物 生 产 效 率 的 关 键 因 素 为 此, Zhao HM 等 过 量 表 达 来 源 于 Pseudomonas stutzeri 的 亚 磷 酸 脱 氢 酶 (PTDH), 在 催 化 亚 磷 酸 氧 化 为 磷 酸 的 同 时 将 NAD + 还 原 为 NADH [46,47] 类 似 地, Berríos-Rivera 将 来 源 于 Candida boidinii 依 赖 NAD 的 甲 酸 脱 氢 酶 取 代 E. coli 中 不 依 赖 任 何 辅 因 子 的 甲 酸 脱 氢 酶, 构 建 了 一 条 NADH 高 效 再 生 途 径, 使 NADH 合 成 效 率 从 每 摩 尔 葡 萄 糖 提 高 到 了 4 摩 尔

7 秦 义 等 : 工 业 微 生 物 中 NADH 的 代 谢 调 控 167 ( 好 氧 条 件 ) 和 3 摩 尔 ( 厌 氧 条 件 ) [4,48,49] 4 结 论 与 展 望 综 上, 针 对 微 生 物 细 胞 的 氧 化 还 原 状 态, 目 前 的 研 究 主 要 通 过 添 加 外 源 电 子 受 体 和 不 同 氧 化 还 原 态 底 物 调 节 氧 化 还 原 电 势 缺 失 NADH 竞 争 途 径 及 引 入 NADH 外 源 代 谢 途 径 等 策 略 调 节 胞 内 NADH/NAD + 比 率 而 调 节 碳 代 谢 流 然 而, 将 调 控 胞 内 NADH/NAD + 作 为 技 术 手 段 以 优 化 微 生 物 细 胞 生 理 代 谢 功 能 以 促 进 微 生 物 合 成 目 标 产 物 的 代 谢 流 最 大 化 和 快 速 化 或 合 成 新 的 代 谢 产 物 的 研 究 则 更 少 就 调 控 NADH/NAD + 比 率 以 加 强 微 生 物 细 胞 代 谢 功 能 还 有 3 个 关 键 科 学 问 题 亟 待 解 决 : 首 先, 如 何 采 用 系 统 生 物 学 和 高 通 量 的 方 法 定 量 研 究 NADH/NAD + 比 率 对 微 生 物 代 谢 组 学 流 量 组 蛋 白 质 组 和 转 录 组 的 影 响 ; 其 次, 在 掌 握 碳 代 谢 流 和 辅 因 子 流 的 变 化 规 律 基 础 上, 揭 示 NADH/NAD + 比 率 控 制 代 谢 流 流 向 和 通 量 分 配 的 作 用 机 制, 透 彻 理 解 微 生 物 细 胞 的 调 控 网 络 与 代 谢 网 络 之 间 的 关 系 ; 再 次, 发 展 基 于 NADH/NAD + 比 率 的 碳 代 谢 流 最 大 化 快 速 化 地 导 向 目 标 代 谢 产 物 的 策 略? 最 新 发 展 起 来 的 系 统 生 物 学 和 高 通 量 测 定 技 术, 为 研 究 不 同 NADH/NAD + 比 率 下 代 谢 指 纹 代 谢 通 量 蛋 白 表 达 转 录 水 平 和 信 号 转 导 的 改 变, 阐 明 微 生 物 细 胞 调 控 网 络 与 代 谢 网 络 之 间 的 关 系, 揭 示 胞 内 NADH/NAD + 比 率 与 控 制 微 生 物 功 能 的 生 理 学 机 制 奠 定 了 坚 实 基 础 ; 同 时, 已 公 布 的 650 株 微 生 物 的 全 基 因 组 序 列 (updated, 2008 年 2 月 20 日 ) 以 及 不 断 增 加 的 模 式 微 生 物 的 转 录 组 数 据 蛋 白 质 组 数 据 和 代 谢 组 数 据, 为 从 功 能 基 因 与 蛋 白 网 络 调 控 适 应 等 方 面 透 彻 理 解 微 生 物 代 谢 与 调 控 网 络, 提 供 了 丰 富 的 背 景 信 息 REFERENCES [1] de Felipe FL, Kleerebezem M, de Vos WM, et al. Cofactor engineering: A novel approach to metabolic engineering in Lactococcus lactis by controlled expression of NADH oxidase. J Bacteriol, 1998, 180(15): [2] Hugenholtz J, Kleerebezem M. Metabolic engineering of lactic acid bacteria: Overview of the approaches and results of pathway rerouting involved in food fermentations. Curr Opin Biotechnol, 1999, 10(5): [3] San KY, Bennett GN, Berrios-Rivera SJ, et al. Metabolic engineering through cofactor manipulation and its effects on metabolic flux redistribution in Escherichia coli. Metab Eng, 2002, 4(2): [4] Berrios-Rivera SJ, Bennett GN, San KY. Metabolic engineering of Escherichia coli: Increase of NADH availability by overexpressing an NAD(+)-dependent formate dehydrogenase. Metab Eng, 2002, 4(3): [5] Saanchez AM, Bennett GN, San KY. Effect of different levels of NADH availability on metabolic fluxes of Escherichia coli chemostat cultures in defined medium. J Biotechnol, 2005, 117(4): [6] Bakker BM, Overkamp KM, van Maris AJA, et al. Stoichiometry and compartmentation of NADH metabolism in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev, 2001, 25(1): [7] Liu LM, Li Y, Shi ZP, et al. Enhancement of pyruvate productivity in Torulopsis glabrata: Increase of NAD(+) availability. J Biotechnol, 2006, 126(2): [8] Senior A. ATP synthesis by oxidative-phosphorylation. Physiol Rev, 1988, 68(1): [9] Zoratti M, Szabo I. The mitochondrial permeability transition. Biochim Biophys Acta, 1995, 1241(2): [10] Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science, 1998, 281(5381): [11] La Piana G, Marzulli D, Gorgoglione V, et al. Porin and cytochrome oxidase containing contact sites involved in the oxidation of cytosolic NADH. Arch Biochem Biophys, 2005, 436(1): [12] Lin SJ, Ford E, Haigis M, et al. Calorie restriction extends yeast life span by lowering the level of NADH. Genes Dev, 2004, 18(1): [13] Ying W. NAD(+) and NADH in cellular functions and cell death. Front Biosci, 2006, 11: [14] Roustan JL, Sablayrolles JM. Impact of the addition of electron acceptors on the by-products of alcoholic fermentation. Enzyme Microb Technol, 2002, 31(1-2): [15] Lin H, Bennett GN, San KY. Effect of carbon sources differing in oxidation state and transport route on succinate production in metabolically engineered Escherichia coli. J Ind Microbiol Biotechnol, 2005, 32(3): [16] Ma B, Pan SJ, Zupancic ML, et al. Assimilation of NAD(+) precursors in Candida glabrata. Mol Microbiol, 2007, 66(1): [17] Qiang H, Shimuzu K. Effect of dissolved oxygen concentration on the intracellular flux distribution for pyruvate fermentation. J Biotechnol, 1999, 68(2/3): [18] Wang CH, Li YY, Chen CH, et al. Effects of temperature on the kinetics and level of energy charge and

8 168 ISSN CN /Q Chin J Biotech February 25, 2009 Vol.25 No.2 oxidation-reduction state in pyruvate biosynthesis. Chin J Biotech, 2006, 22(2): 王 翠 华, 李 友 元, 陈 长 华, 等. 温 度 对 丙 酮 酸 生 物 合 成 动 力 学 能 荷 和 氧 化 - 还 原 度 的 影 响. 生 物 工 程 学 报, 2006, 22 (2): [19] Husson F, Tu VP, Santiago-Gomez M, et al. Effect of redox potential on the growth of Yarrowia lipolytica and the biosynthesis and activity of heterologous hydroperoxide lyase. J Mol Catal B: Enzym, 2006, 39(1-4): [20] Cordier H, Mendes F, Vasconcelos I, et al. A metabolic and genomic study of engineered Saccharomyces cerevisiae strains for high glycerol production. Metab Eng, 2007, 9(4): [21] de Graef MR, Alexeeva S, Snoep JL, et al. The steadystate internal redox state (NADH/NAD) reflects the external redox state and is correlated with catabolic adaptation in Escherichia coli. J Bacteriol, 1999, 181(8): [22] Panagiotou G, Christakopoulos P. NADPH-dependent D-aldose reductases and xylose fermentation in Fusarium oxysporum. J Biosci Bioeng, 2004, 97(5): [23] Panagiotou G, Christakopoulos P, Villas-Boas SG, et al. Fermentation performance and intracellular metabolite profiling of Fusarium oxysporum cultivated on a glucosexylose mixture. Enzyme Microb Technol, 2005, 36(1): [24] Zaunmuller T, Eichert M, Richter H, et al. Variations in the energy metabolism of biotechnologically relevant heterofermentative lactic acid bacteria during growth on sugars and organic acids. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 72(3): [25] Wahlbom CF, Hahn-Hagerdal B. Furfural, 5-hydroxymethyl furfural, and acetoin act as external electron acceptors during anaerobic fermentation of xylose in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng, 2002, 78(2): [26] Du CY, Yan H, Zhang YP, et al. Use of oxidoreduction potential as an indicator to regulate 1,3-propanediol fermentation by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69(5): [27] Berrios- Rivera SJ, San KY, Bennett GN. The effect of NAPRtase overexpression on the total levels of nad, the NADH/NAD(+) ratio, and the distribution of metabolites in Escherichia coli. Metab Eng, 2002, 4(3): [28] Zhang YP, Li Y, Du CY, et al. Inactivation of aldehyde dehydrogenase: A key factor for engineering 1,3-propanediol production by Klebsiella pneumoniae. Metab Eng, 2006, 8(6): [29] Sanchez AM, Bennett GN, San KY. Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng, 2005, 7(3): [30] Heux S, Cachon R, Dequin S. Cofactor engineering in Saccharomyces cerevisiae: Expression of a h2o-forming NADH oxidase and impact on redox metabolism. Metab Eng, 2006, 8(4): [31] Vemuri GN, Eiteman MA, McEwen JE, et al. Increasing NADH oxidation reduces overflow metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USV, 2007, 104(7): [32] Price-Whelan A, Dietrich LE, Newman DK. Pyocyanin alters redox homeostasis and carbon flux through central metabolic pathways in Pseudomonas aeruginosa pa14. J Bacteriol, 2007, 189(17): [33] Panagiotou G, Christakopoulos P, Olsson L. The influence of different cultivation conditions on the metabolome of Fusarium oxysporum. J Biotechnol, 2005, 118(3): [34] Tempel W, Rabeh WM, Bogan KL, et al. Nicotinamide riboside kinase structures reveal new pathways to nad+. PLoS Biol, 2007, 5(10): [35] Diano A, Bekker-Jensen S, Dynesen J, et al. Polyol synthesis in aspergillus niger: Influence of oxygen availability, carbon and nitrogen sources on the metabolism. Biotechnol Bioeng, 2006, 94(5): [36] Singh R, Mailloux RJ, Puiseux-Dao S, et al. Oxidative stress evokes a metabolic adaptation that favors increased NADPH synthesis and decreased NADH production in Pseudomonas fluorescens. J Bacteriol, 2007, 189(18): [37] Bonarius HPJ, Houtman JHM, Schmid G, et al. Metabolic-flux analysis of hybridoma cells under oxidative and reductive stress using mass balances. Cytotechnology, 2000, 32(2): [38] Riondet C, Cachon R, Wache Y, et al. Extracellular oxidoreduction potential modifies carbon and electron flow in Escherichia coli. J Bacteriol, 2000, 182(3): [39] Elliott SJ, Leger C, Pershad HR, et al. Detection and interpretation of redox potential optima in the catalytic activity of enzymes. BBA-Bioenergetics, 2002, 1555(1-3): [40] Heuser F, Schroer K, Lutz S, et al. Enhancement of the NAD(P)(H) pool in Escherichia coli for biotransformation. Eng Life Sci, 2007, 7(4): [41] Hou J, Shen Y, Bao XM. Research progress in cofactor engineering of xylose metabolism in recombinant Saccharomyces cerevisiae. China Biotech, 2006, 26(2): 侯 进, 沈 煜, 鲍 晓 明. 酿 酒 酵 母 木 糖 代 谢 工 程 中 辅 酶 工 程 的 研 究 进 展. 中 国 生 物 工 程 杂 志, 2006, 26 (2): [42] dos Santos MM, Raghevendran V, Kotter P, et al.

9 秦 义 等 : 工 业 微 生 物 中 NADH 的 代 谢 调 控 169 Manipulation of malic enzyme in Saccharomyces cerevisiae for increasing NADPH production capacity aerobically in different cellular compartments. Metab Eng, 2004, 6(4): [43] Geertman JMA, van Maris AJA, van Dijken JP, et al. Physiological and genetic engineering of cytosolic redox metabolism in Saccharomyces cerevisiae for improved glycerol production. Metab Eng, 2006, 8(6): [44] Sanchez AM, Bennett GN, San KY. Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant. Biotechnol Prog, 2005, 21(2): [45] Costenoble R, Adler L, Niklasson C, et al. Engineering of the metabolism of Saccharomyces cerevisiae for anaerobic production of mannitol. FEMS Yeast Res, 2003, 3(1): [46] Metcalf WW, Wolfe RS. Molecular genetic analysis of phosphite and hypophosphite oxidation by Pseudomonas stutzeri wm88. J Bacteriol, 1998, 180(21): [47] Vrtis JM, White AK, Metcalf WW, et al. Phosphite dehydrogenase: An unusual phosphoryl transfer reaction. J Am Chem Soc, 2001, 123(11): [48] Jormakka M, Byrne B, Iwata S. Formate dehydrogenase-a versatile enzyme in changing environments. Curr Opin Struct Biol, 2003, 13(4): [49] Berrios-Rivera SJ, Bennett GN, San KY. The effect of increasing NADH availability on the redistribution of metabolic fluxes in Escherichia coli chemostat cultures. Metab Eng, 2002, 4(3): 生 物 工 程 学 报 对 摘 要 的 写 作 要 求 1. 研 究 报 告 摘 要 : 基 本 要 素 包 括 研 究 目 的 方 法 结 果 和 结 论 ( 不 用 单 列 标 题 书 写 ) 目 的 (Purpose): 主 要 说 明 作 者 写 此 文 章 的 目 的, 或 说 明 本 文 主 要 要 解 决 的 问 题 ; 方 法 (Methods): 重 点 说 明 作 者 的 主 要 工 作 过 程 及 使 用 的 方 法 应 用 性 文 章 如 需 要, 可 注 明 条 件 使 用 的 主 要 设 备 和 仪 器 结 果 (Results): 本 文 最 后 得 出 的 结 果 ( 实 验 数 据 部 分 ) 结 论 (Conclusions): 如 系 基 础 研 究, 应 写 明 本 文 的 创 新 之 处, 及 文 章 在 讨 论 部 分 表 述 的 观 点 ; 如 系 应 用 性 研 究, 应 尽 可 能 提 及 本 文 结 果 和 结 论 的 应 用 范 围 和 应 用 情 况 或 应 用 前 景 2. 综 述 摘 要 : 包 括 论 述 内 容 的 发 展 水 平 自 己 的 评 论 及 展 望, 尤 其 要 注 意 结 合 自 己 的 研 究 工 作 3. 英 文 摘 要 的 撰 写 要 点 : 英 文 摘 要 的 内 容 应 与 中 文 摘 要 一 致, 但 比 中 文 摘 要 更 详 尽 英 文 摘 要 完 成 后, 务 必 请 英 文 较 好 且 专 业 知 识 强 的 专 家 审 阅 定 稿 后 再 返 回 编 辑 部 凡 不 符 合 要 求 的, 即 使 学 术 上 可 以 达 到 刊 出 的 水 平, 本 刊 也 将 推 迟 发 表 (1) 建 议 使 用 第 一 人 称, 尽 量 不 使 用 第 三 人 称 和 被 动 语 态 (2) 建 议 用 主 动 语 态, 被 动 语 态 表 达 拖 拉 模 糊 尽 量 不 用, 这 样 可 以 免 好 多 长 句, 以 求 简 单 清 晰 (3) 尽 量 使 用 清 晰 简 练 的 短 句, 避 免 很 长 的 句 子 注 意 正 确 使 用 英 文 写 作 习 惯 和 语 法 (4) 摘 要 应 当 使 用 过 去 时 态, 语 法 正 确, 句 子 通 顺 (5) 摘 要 中 避 免 使 用 缩 写 语, 除 非 是 那 些 人 人 皆 知 的 ( 如 DNA ATP 等 ), 或 者 确 实 是 非 常 长, 而 且 出 现 多 次 的 短 语 才 允 许 用 缩 写 语, 并 且 在 第 一 次 出 现 时 要 写 出 全 称 (6) 在 英 语 摘 要 中, 不 要 使 用 任 何 汉 字 字 符, 包 括 标 点 括 号 温 度 希 腊 字 母 等 (7) 句 子 的 开 头 处 最 好 不 要 使 用 数 字