上海交通大学博士学位论文

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1 上海交通大学博士学位论文 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 STUDY ON MOLECULAR MECHANISM OF SURVIVIN GENE SILENCING INDUCED BY SURKEX 院 校 : 上海交通大学 院 ( 系 所 ): 药学院 专 业 : 药理学 研 究 生 : 马爱妞 学 号 : 研究方向 : 肿瘤表观遗传药理学 关 键 词 : DNA 甲基化, 基因沉默, 组蛋白修饰, 染色质免疫沉淀, 表观遗传学 KEY WORDS: DNA methylation, gene silencing, histone modifications, chromatin immunoprecipitation, epigenetics 申请学位级别 : 博士 指导教师 : 周向军王永祥教授 资助基金 : 上海市科委重大科技攻关项目资助课题 (No.04DZ19214) 2010 年 2 月

2 上海交通大学博士学位论文 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 摘要 Survivin 是凋亡抑制蛋白家族成员, 具有调控有丝分裂和抑制细胞凋亡的作用 Survivin 在大多数结束分化的正常组织中均未被检测到, 但在几乎所有的肿瘤组织中均过量表达, 并为肿瘤细胞生存所必须 因此, survivin 被公认为是癌症治疗的一个重要靶点 研究发现, 用一正义的短链甲基化寡核苷酸与某一基因启动子区序列互补, 可以诱导该基因启动子区甲基化而抑制基因转录 利用这一机制来抑制致病基因的表达, 应能起到治疗疾病的作用 据此, 我们设计了一个与 survivin 基因启动子区域互补的 22 个碱基的甲基化脱氧寡核苷酸 SurKex, 在早期的工作中, 我们通过体内外的药效学实验已经证明, SurKex 能抑制 survivin mrna 和蛋白的表达, 并对荷瘤鼠肿瘤生长有抑制作用, 且能延长荷瘤鼠的存活时间 同时, 对 SurKex 作用机理也进行了初步研究, 结果表明, 它是通过诱导 survivin 启动子区域发生甲基化而导致基因沉默的 在前期工作的基础上, 本文首先对 SurKex 诱导 survivin 启动子部位甲基化的作用方式进行了更深入的研究, 通过亚硫酸氢钠测序法, 确证了 SurKex 诱导 survivin 启动子部位发生甲基化的方式是靶向 定点诱导 i

3 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 基因沉默时, 与之结合的组蛋白往往会发生一些共价修饰的改变, 所以接下来的研究, 我们主要考察了 SurKex 诱导 survivin 沉默后, 与 survivin 启动子区结合的组蛋白 H3 H4 上特定的赖氨酸残基的甲基化水平及 H3 H4 的乙酰化 / 去乙酰化水平是否发生相应的改变 我们采用染色质免疫沉淀技术, 通过特异性抗体进行分析, 结果表明,SurKex 作用后, 与 survivin 启动子区结合的组蛋白 H3-K9 二甲基化 H3-K27 三甲基化水平升高 ;H4 乙酰化 H4-K16 乙酰化水平降低, 也即去乙酰化水平升高 组蛋白的这些改变, 与基因沉默是呈正相关的 DNA 甲基化和组蛋白的共价修饰, 都是调控基因表达的重要表观遗传学生化事件 关于二者之间的因果关系, 进行调控的先后顺序, 一直是表观遗传学领域研究的热点 在我们的实验中,SurKex 作用后, 既引起 DNA 甲基化, 又引起组蛋白尾部修饰的改变 它们之间是如何彼此协作 控制 survivin 的开或关, 更确切地说, 是 DNA 甲基化指导组蛋白共价修饰的改变, 还是组蛋白共价修饰的改变指导 DNA 甲基化, 是我们接下来的研究要解决的关键问题 我们选用 DNA 甲基化酶抑制剂 5- 氮脱氧胞嘧啶核苷 (5-Aza-CdR) 组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素 A (TSA) 和组蛋白甲基化酶抑制剂 BIX-01294, 分别考察 DNA 甲基化或组蛋白去乙酰化或甲基化作用被相应抑制剂阻断后, 对 SurKex 效应的影响, 以此阐明 DNA 甲基化和组蛋白共价修饰 ( 去乙酰化和甲基化 ) 在 survivin 沉默中的因果关系和调控顺序 具体方法是通过 RT-PCR 考察 ii

4 上海交通大学博士学位论文 survivin mrna 表达情况 Bisulfite sequencing 分析 survivin 启动子区特定 CpG 甲基化情况及染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验考察与 survivin 结合的组蛋白共价修饰情况 实验结果表明,DNA 甲基化是 survivin 沉默中最关键的一步, 但组蛋白去乙酰化和甲基化指导 DNA 甲基化, 它们的作用途径可能与 DNA 甲基化转移酶 1(DNMT1) 有关 最后, 我们想初步验证对上述实验结果的推论是否正确 我们用 TSA 和 BIX 分别阻断组蛋白去乙酰化和甲基化后, 用 RT-PCR 考察对 DNMT1 mrna 表达的影响 结果表明, 组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化被相应的抑制剂阻断后, 都出现了 DNMT1 mrna 表达的降低 由此可见, 组蛋白去乙酰化和甲基化都可能通过上调 DNMT1 mrna 表达而影响 DNA 甲基化 当然, 这可能只是它们作用途径中的一个环节 本课题的研究首先确证了 SurKex 为一种新型的靶向 定点甲基化诱导剂, 它通过诱导 survivin 基因启动子区特定 CpG 位点甲基化而引起 survivin 沉默 ; 其次阐明了 SurKex 在诱导 survivin 沉默的过程中, 除了 DNA 甲基化之外, 组蛋白 H3-K9 二甲基化 H3-K27 三甲基化水平升高, 组蛋白 H4 H4-K16 乙酰化水平降低 ; 接着, 以 SurKex 为工具药, 初步阐明了在 survivin 沉默过程中,DNA 甲基化是最关键的一步, 但组蛋白共价修饰的改变 ( 组蛋白去乙酰化和甲基化 ) 是更优势的事件, 它指导 DNA 的甲基化 ; 最后, 初步证明组蛋白共价修饰的改变 ( 组蛋白去乙酰化和甲基化 ) 是通过影响 DNMT1 mrna 的表达, 来指导 DNA 甲基化 iii

5 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 本课题的研究不但为抗肿瘤药物的设计提供了新的思路, 提供了从 表观遗传学角度靶向治疗癌症的一种新方法, 而且为解决表观遗传学领 域的重大理论问题提供了实验证据 关键词 :DNA 甲基化, 基因沉默, 组蛋白修饰, 染色质免疫沉淀, 表 观遗传学 iv

6 上海交通大学博士学位论文 STUDY ON MOLECULAR MECHANISM OF SURVIVIN GENE SILENCING INDUCED BY SURKEX ABSTRACT Survivin is an inhibitor of apoptosis protein (IAP) family member, it is the apoptosis inhibitor as well as the mitotic regulator. Survivin is absolutely undetectable in normal tissues, but over-expressed in all the most common human cancers. Also, it is required for maintaining cancer-cell viability. Thus, Survivin is considered as a therapeutic target in cancer. According to previous research, in mammalian cells, a short methylated sense oligonucleotide that is complementary to the sequence of the promoter region of a given gene can induce hypermethylation of the promoter region of that gene and thus inhibit that gene transcription. This mechanism might be used to cure diseases by inhibiting the expression of a certain gene harmful to health. By virtue of this, we designed a methylated oligodeoxynucleotide (SurKex, 22 bases) complementary to a region of part promoter of survivin. v

7 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 Our early experiments showed that SurKex can inhibit not only survivin mrna and protein expression, but also tumor growth of tumor-bearing mice, and prolong survival of animal model of nude mice by pharmacodynamics in vivo and in vitro. At the same time, we had a preliminary study on the mechanism of SurKex. The results showed that SurKex could lead survivin gene silencing by inducing DNA methylation of survivin promoter region. In this article, at the basis of our previous research, we first had a further study on methylation mode of survivin promoter inducing by SurKex through bisulfite-sequencing and confirmed that SurKex can lead to methylate survivin promoter in CpG-site specific way, that is targeting induction. When gene silencing, some changes of covalent modifications of histone combined with a certain gene will accordingly happen. Next, we used chromatin immunoprecipitation (ChIP) to investigate the modifications of acetylation/deacetylation or methylation on the specific lysine residue of histone H3, H4 combined with survivin promoter sequence after survivin promoter site-specific methylation was induced by SurKex. The results showed that SurKex increased histone H3-K9 dimethylation H3-K27 trimethylation and decreased H4 H4-K16 acetylation levels. These changes of histone modifications positively related with gene silencing. vi

8 上海交通大学博士学位论文 Although DNA methylation and histone covalent modifications are both important biochemical events of epigenetics in regulating gene expression, there is a hot debate in epigenetics about the order and the causal relationship between them when they regulate gene expression. In our experiment, SurKex not only induced methylation of survivin promoter but also changes of histone tail modifications. Now that how did they collaborate with each other on survivin expression and control survivin on or off precisely? Whether DNA methylation guides histone covalent modifications or histone covalent modifications guide DNA methylation would be a key issue to be solved in our next study. Then we studied the effects on the efficacy of SurKex in blocking DNA methylation, histone deacetylation or histone methylation by DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-CdR), histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) and histone methyltransferase inhibibor BIX respectively. We determined the expression of survivin mrna by RT-PCR, analyzed the site-specific CpG methylation of survivin promoter region by bisulfite sequencing and detected the covalent modifications of histone tails combined with survivin promoter by chromatin immunoprecipitation (ChIP). These results showed that DNA methylation was the crucial step in survivin silencing, but histone deacetylation and vii

9 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 methylation guided DNA methylation, which could play a role through DNMT1. Finally, we would be in an attempt to verify whether our inference was correct or not. We investigated the expression of DNMT1 mrna by RT-PCR in blocking histone deacetylation and methylation by TSA and BIX respectively. The results showed that the expression of DNMT1 mrna was decreased greatly after histone deacetylation or histone methylation being blocked, which revealed that both of them could affect DNA methylation by upregulating the expression of DNMT1 mrna. Of course, this is only a possible means of their roles. In summary, we first confirmed that SurKex is a new type of targeted, site-directed CpG DNA methylation drug candidate, and it could result in survivin silencing by inducing site-specific CpG methylation of survivin promoter region; Next we revealed that SurKex could increase histone H3-K9 dimethylation and H3-K27 trimethylation levels and decrease histone H4 and H4-K16 acetylation levels besides DNA methylation; Then we verified that DNA methylation is a vital step in survivn silencing, but the change of histone covalent modifications (including histone deacetylation and methylation) is more advantage event, and it guide DNA methylation; Finally, we initially proved that histone deacetylation and methylation guide viii

10 上海交通大学博士学位论文 DNA methylation by affecting the expression of DNMT1 mrna. This research provides not only new ideas for the design of antineoplastic drugs and a new method for cancer targeted therapy from cancer epigenetics, but also the experimental evidence for solving the major theoretical problem in the field of Epigenetics. KEY WORDS: DNA methylation, gene silencing, histone modifications, chromatin immunoprecipitation, Epigenetics ix

11 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 简写说明 简写 英文名称 汉语名称 TGS Transcriptional Gene Silencing 转录水平基因沉默 PTGS Post-transcriptional Gene Silencing 转录后水平基因沉默 DNMT DNA methyltransferase DNA 甲基转移酶 SAMe(Adomet) S -adenosine methionine S- 腺苷甲硫氨酸 MeCP methyl CpG-binding protein 甲基化 CpG 序列结合蛋白 MBD methyl CpG-binding domain 甲基化 CpG 结合结构域 5 -Aza-CdR 5-aza--2'-deoxycytidine 5- 杂氮脱氧胞嘧啶核苷 RdDM RNA directing DNA methylation RNA 介导的 DNA 甲基化 MSP methylation specific PCR 甲基化特异性 PCR HMT histonemethyl transferase 组蛋白甲基化转移酶 HAT Histone Acetyltransferase 组蛋白乙酰化转移酶 HDAC Histone deacetylase 组蛋白去乙酰化酶 TSA trichostatin A 曲古抑菌素 A ChIP Chromatin immunoprecitation 染色质免疫沉淀 NCI-H460 human non-small cell lung cancer cell line 人非小细胞肺癌细胞株 x

12 上海交通大学博士学位论文 目录 第一章概论 1 1 基因表达的表观遗传调控 1 2 基因沉默 转录水平基因沉默 转录后水平基因沉默 基因沉默的生物学意义 4 3 DNA 甲基化 DNA 甲基化及其建立 DNA 甲基化转移酶 DNA 甲基化与基因表达 DNA 甲基化与肿瘤 肿瘤基因中的 DNA 甲基化异常与肿瘤发生 DNA 甲基化与肿瘤的治疗 基于抑癌基因启动子区高甲基化而进行的去甲基化治疗 基于肿瘤相关癌基因启动子区低甲基化而进行的甲基化治疗 RNA 介导的 DNA 甲基化 DNA 介导的 DNA 甲基化 DNA 甲基化检测的方法 9 4 组蛋白密码与基因表达 组蛋白甲基化 组蛋白甲基化与基因表达 组蛋白去甲基化 组蛋白甲基化与 DNA 甲基化 组蛋白甲基化与肿瘤 组蛋白乙酰化和去乙酰化与基因表达..15 xi

13 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 组蛋白乙酰化 / 去乙酰化与 DNA 甲基化的关系 组蛋白乙酰化 / 去乙酰化与组蛋白甲基化的关系 组蛋白乙酰化 / 去乙酰化与肿瘤 组蛋白的其他修饰方式 研究组蛋白共价修饰的分析方法 凋亡抑制因子 survivin 与肿瘤 survivin 的分子结构与功能 survivin 与肿瘤 针对 survivin 的肿瘤靶向治疗 18 6 本文的研究内容及意义 前期研究基础 核酸药物 SurKex 的设计 SurKex 的药效学实验 对 SurKex 诱导 survivin 沉默机理的初步探讨 本论文主要研究内容 本论文的研究意义..22 第二章 SurKex 诱导 survivin 启动子部位甲基化的方式 23 1 材料与方法 材料与主要试剂 主要仪器 细胞培养 转染 基因组抽提 亚硫酸氢钠处理基因组 DNA 纯化基因组 DNA 及终止亚硫酸氢钠反应 PCR 扩增目的片断 电泳检测.26 xii

14 上海交通大学博士学位论文 1.10 回收目的条带 TA 克隆 挑取并 PCR 鉴定转化子, 对正确插入的转化子进行扩大培养 测序 结果 讨论...33 第三章 SurKex 对与 survivin 特异结合的组蛋白的共价修饰的影响.33 1 材料与方法 材料与主要试剂 主要仪器 细胞培养 转染 染色质免疫沉淀分析 超声剪切基因组 DNA 免疫沉淀 PCR 扩增结合在免疫沉淀的组蛋白上的 DNA 36 2 结果 超声条件的确定 免疫沉淀实验系统的可靠性验证 SurKex 对 H3 H4 特定位点乙酰化 甲基化修饰的影响 讨论.41 第四章 DNA 甲基化 组蛋白共价修饰在 survivin 沉默中的作用.43 1 材料与方法 材料与主要试剂 主要仪器 细胞培养 转染...44 xiii

15 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 1.5 RT-PCR RNA 抽提 反转录 PCR 电泳 Bisulfite sequencing ChIP 分析 结果 不同抑制剂对 SurKex 抑制 survivin mrna 表达的影响 不同抑制剂对 SurKex 诱导 survivin 启动子区特定 CpG 位点甲基化的影响 不同抑制剂对 survivin 启动子区结合的组蛋白共价修饰的影响 51 3 讨论.53 第五章 组蛋白共价修饰对 DNMT1 表达的影响 55 1 材料与方法 材料与主要试剂 主要仪器 细胞培养 转染 RT-PCR 结果 组蛋白去乙酰化对 DNMT1 表达的影响 组蛋白甲基化对 DNMT1 表达的影响 56 3 讨论...57 第六章总结与展望.57 参考文献.62 附录 附录 xiv

16 上海交通大学博士学位论文 附录 攻读博士学位期间发表的论文.85 致谢.86 xv

17 上海交通大学博士学位论文 第一章概论 1 基因表达的表观遗传调控传统的遗传学理论认为, 基因型决定表型 然而, 同窝出生的纯种小鼠的毛色不同 同卵双胞胎对疾病易感性的差异 克隆动物效率低下等等, 这些差异并不是因为基因型不同所造成的 这些都是与中心法则相悖的遗传现象, 用传统遗传学理论无法解释 随着人类基因组计划的完成和生物技术的发展, 大量隐藏在 DNA 序列之中或之外更高层次的遗传信息被发现, 如基因沉默 (gene silencing),dna 甲基化 (DNA methylation), 组蛋白共价修饰 (histone covalent modifications), 非编码 RNA(non-coding RNA),X 染色体剂量补偿 (X-chromosome dosage compensation), 基因印迹 (gene imprinting) 等 这些更高层次的遗传信息不符合孟德尔遗传规律的核内遗传, 可以用来解释上述传统遗传学遇到的困惑 因为这类遗传信息的变化, 是在基因的 DNA 序列没有改变的情况下, 基因功能却发生了可遗传的变化, 并最终导致了表型的改变 我们把这类遗传信息称为表观遗传信息 由此看来, 基因组应含有两类遗传信息, 一类是提供生命必需蛋白质的模板, 称遗传编码信息 ; 另一类是表观遗传学信息, 它提供了何时 何地 以何种方式去应用遗传信息的指令 [1] 相对于经典的遗传学, 表观遗传学是研究在没有 DNA 序列改变情况下发生的可遗传的基因功能变化 这些变化是有表观遗传修饰所造成的 在真核细胞的正常发育中,DNA 甲基化谱和染色质状态的确定和时空变化受着精细的调控 ; 同时, 在 DNA 甲基化 组蛋白的修饰和染色质高级结构的监控机制之间有着密切联系, 由此调控有关基因的表达 高等真核细胞的正常发育取决于表观遗传学调控机制的准确无误地运行 [2] 该机制的失误可引起包括肿瘤 神经退行性病变 自身免疫病 衰老 多种儿科综合征等在内的多种疾病 [3] 表观遗传调控是指转录前基因在染色质水平上的结构调整, 它是真核基因组一种独特的调控机制, 所以表观遗传调控又被称为以染色质为基础的基因表达调控 与原核生物不同, 真核细胞的基因组 DNA 在细胞核里是以染色质形式存在的 核小体是染色质的基本亚单位 它包含 200 bp 的 DNA, 与组蛋白八聚体形成串珠状 组 - 1 -

18 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 蛋白形成一个内在核心,DNA 缠绕在它的表面 核小体提供了染色质的一级结构, 其长度压缩了 6 倍 染色质二级结构是由一系列核小体盘绕成螺旋并排列形成 30 nm 纤维, 使染色质长度又压缩了 40 倍 最终的压缩由三级结构决定, 即 30 nm 纤维自身的包装, 形成染色体 目前研究认为,30 nm 核小体包装结构的形成对基因表达起着 开或关 的作用 [4] 比如, 在有丝分裂期间,30 nm 的核小体进一步压缩, 压缩比可以达到 倍以上, 相应的有丝分裂期间转录是停止的 而活跃进行基因转录的染色质区段, 核小体通常不稳定或解体 由此可见, 染色质是一个动态的多级包装的蛋白质 -DNA 复合物, 它通过结构改变来调控基因表达 它调控的分子基础至少有两个方面, 即针对 DNA 本身的修饰和对组蛋白的修饰 对 DNA 的修饰主要是 DNA 甲基化, 而对组蛋白的修饰则包括赖氨酸残基乙酰化 丝氨酸残基和苏氨酸残基的磷酸化 谷氨酸残基的 ADP- 核糖基化 赖氨酸残基的泛素化 赖氨酸残基和精氨酸残基的甲基化等 组蛋白的这些修饰被称为 组蛋白密码 (histone code) DNA 甲基化会导致染色体螺旋程度增加, 增强 DNA 的不可接近性, 与基因沉默状态相关 ; 而组蛋白密码可被一系列特定的蛋白质所识别, 并将其转译成一种特定的染色质状态, 以实现对特定基因表达的调节, 扩大了遗传密码的信息储存量 比如, 组蛋白的乙酰化导致染色质去压缩状态, 从而与转录的启动 基因活化和行使功能有关 在细胞生命活动的选择性基因沉默或基因表达过程中, 包裹于染色质中的基因组 DNA 序列一般不发生改变, 但细胞核内的染色质结构可以发生高度动态变化, 使一些特定基因组区域的转录活性呈现相应的改变 这种影响基因转录活性而不涉及 DNA 序列改变的基因表达调控方式称为表观遗传调控 广义上, 基因沉默 DNA 甲基化 组蛋白的共价修饰 染色质重塑,X 染色体失活 非编码 RNA 调控等都属于表观遗传调控的范畴 [5] 对表观遗传中各种因子的突变导致疾病的研究, 将有助我们了解表观遗传机制 基因表达和环境之间的关系, 并期望能纠正或降低那些能够导致疾病的表观基因的不稳定性, 指导疾病的诊治和新药的研发 2 基因沉默 - 2 -

19 上海交通大学博士学位论文 基因沉默 (gene silencing) 是指生物体中特定基因由于种种原因不表达 这种现象是 Peerbolte 在 1986 年首先在转基因植物中发现的, 他发现导入并整合进受体基因组中的外源基因在当代转化体或其后代中表达受抑制 后来, 人们在线虫 真菌 昆虫 原生动物 果蝇 斑马鱼及老鼠中也陆续发现了基因沉默现象 发生沉默的基因可以是外源性转移基因, 也可以是入侵的病毒或宿主内源性基因 大量的研究表明, 环境因子 发育因子 DNA 修饰 组蛋白乙酰化程度 基因拷贝数 位置效应 生物的保护性限制修饰以及基因的过度转录等都与基因沉默有关 基因沉默一般发生在两种水平上 : 转录水平基因沉默 (Transcriptional Gene Silencing,TGS) 和转录后水平基因沉默 (Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS) 2.1 转录水平基因沉默转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核 RNA 合成的失活 它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的 RNA 而导致基因沉默 转录水平基因沉默可以通过有性世代传递, 表现为减数分裂的可遗传性 引起转录水平基因沉默的机制主要有以下两种 :1. 基因及其启动子甲基化 甲基化是活体细胞中最常见的一种 DNA 共价修饰形式, 它通常发生在 DNA 的 CG 和 CNG 序列的碱基上 从所报道的基因沉默例子来看, 几乎所有的基因沉默现象与基因及其启动子的甲基化有关 2. 同源基因间的反式失活 反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其它位点的 DNA 的相互作用而引起的基因沉默 Vaucheret 等的研究表明 : 启动子区域只要有 90 bp 的序列同源, 即可使两个基因间产生反式失活 [6,7] 2. 2 转录后水平基因沉默转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳定转录出 mrna, 但 mrna 不能积累, 或被降解, 或被相应的 RNA 或蛋白质封闭, 使之不能翻译出蛋白质的现象 与转录水平基因沉默不同, 转录后水平基因沉默具有逆转性, 即受抑制基因通过减数分裂可以恢复表达活性, 表现为减数分裂不可遗传性 目前, 人们发现主要有以下几种转录后水平基因沉默现象 :1. 共抑制 共抑制是最常见的转录后水平基因沉默 共抑制现象普遍存在于转基因植物中, 其发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制 - 3 -

20 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 2. 基因压制 外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达, 这一现象被为基因压制 基因压制是可逆的, 而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失 基因压制涉及到可扩散的反式作用分子 3.RNA 干扰 RNA 干扰是利用双链 RNA 可以特异性的降解相应序列的 mrna, 从而特异性的阻断相应基因的表达 RNA 干扰广泛存在于从真菌到植物 从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中 [8] 2.3 基因沉默的生物学意义基因沉默是基因表达调控的一种重要方式, 是生物体的本能反应和自我保护机制 因为无论是转基因 转座子还是病毒, 对生物而言都是诱发突变的外来侵入的核酸 通过基因沉默, 生物体可以限制这些外源核酸的入侵 此外, 基因沉默还与生物的生长发育有关, 它可能通过控制内源基因的表达来调控生长发育 通过对基因沉默的深入研究, 可以帮助人们进一步揭示生物体遗传表达调控的本质, 在基因工程中克服基因沉默, 使外源基因能更好地按照人们的意愿进行表达 在疾病治疗方面, 可以利用基因沉默这一机制人为地抑制某些致病基因的表达 ; 在功能基因组研究方面, 通过有选择地造成某些基因沉默, 可以测知这些基因在生物体基因组中的功能 ; 通过抑制生物代谢过程中的某个环节, 可以获得特定的代谢产物 ; 等等 正是由于基因沉默具有巨大的潜在应用价值, 近年来有关基因沉默的研究也取得了较大的进展 有专家预言, 对于基因沉默的研究将是未来 10 年生物学研究中最激动人心也最有可能产生丰富成果的领域之一 [9] 3 DNA 甲基化 3.1 DNA 甲基化及其建立 DNA 甲基化是最重要的表观遗传调控机制之一, 其作用是使基因表达长期处于沉默状态 在哺乳动物中,DNA 甲基化主要发生在 CpG 二核苷酸的胞嘧啶 (C)5- 位碳原子上, 是一种 DNA 复制后的酶促反应过程 DNA 复制后, 在 DNA 甲基转移酶 (DNA methyltransferase, DNMT) 的作用下, 将 S- 腺苷甲硫氨酸 (S -adenosine methionine, SAM) 分子上的甲基转移到 DNA 分子中胞嘧啶残基的第 5 位碳原子上, 从而变成 5- 甲基胞嘧啶 (5- mc) [10] 随着甲基向 DNA 分子的引入, 改变了 DNA 分子的构象, 引 - 4 -

21 上海交通大学博士学位论文 起染色质结构 DNA 构象 DNA 稳定性及 DNA 与蛋白质相互作用方式的改变, 从而控制基因表达 [11,12] 人类基因组中的 CpG 以两种形式存在, 一种是分散于 DNA 中, 另一种是 CpG 结构高度聚集的 CpG 岛 哺乳动物细胞基因组中大约 3%-5% 的胞嘧啶是以 5- 甲基胞嘧啶的形式存在的, 大约 70%-80% 的 5- 甲基胞嘧啶位于 CpG 中 启动子区的 CpG 岛通常处于非甲基化状态, 基因能正常表达, 当其发生甲基化时, 影响基因转录调控, 使基因表达发生沉寂 与 CpG 岛相反的是, 基因组中散在分布的 CpG 二核苷酸通常处于甲基化状态 DNA 甲基化在维持染色体结构 X 染色体失活 基因印记和肿瘤的发生中起重要作用 [13] 3.2 DNA 甲基化转移酶 (DNA methyl-transferase,dnmt) 目前已知有两类 DNA 甲基转移酶 (DNA methyl-transferase,dnmt) 参与 DNA 甲基化的建立和调节 [14] 一类是重新甲基化的 DNA 甲基转移酶 DNMT3a 和 DNMT3b, 它们主要催化从头甲基化 (de novo methylation), 以非甲基化的 DNA 为模板, 催化新的甲基化位点形成, 在胚胎发育中起重要作用 [15] ; 另一类是维持甲基化的 DNA 甲基转移酶 DNMT1, 它的主要功能是作为 DNA 复制复合物中的组分, 优先以半甲基化 带复制叉样结构的 DNA 作为甲基化底物, 如果模板 DNA 链相应的序列被甲基化, 则 DNMT1 在新合成的 DNA 链中引入甲基基团, 由此维持复制过程中甲基化位点的遗传稳定性 [16] 近年来, 在肿瘤的研究方面, 从 DNA 水平上研究肿瘤的发生发展和变异, 其中对 DNA 甲基转移酶的研究是很重要的课题 目前认为 :DNMT 活性增高是肿瘤细胞具有特征的早期分子改变, 因而受到越来越多的学者关注 [17-19] 3.3 DNA 甲基化与基因表达目前的研究表明,DNA 甲基化与基因的表达一般呈负相关,DNA 甲基化关闭基因的活性 ; 而用 DNA 甲基化酶抑制剂 ( 目前还没用发现体内存在 DNA 去甲基化酶 ) 使抑癌基因去甲基化, 则可激活抑癌基因基因的表达 已有许多假设的作用机制来解释为什么 DNA 甲基化可抑制基因转录, 可归纳为以下 3 种 : 第一种观点认为 : 发生在基因启动子或其附近区域的甲基化可使 DNA 的构象发生变化, 直接阻碍转录因子与启动子结合, 从而使基因不能转录或转录水平降低 - 5 -

22 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 许多转录因子如 AP-2 c-myc/myn CREB 和 E2F 能识别含有 CpG 的序列, 相应的序列被甲基化后, 这些转录因子就不能识别这些序列, 使它们不能与启动子结合 [20-25] 第二种观点认为 : 基因 5 端调控序列甲基化后能与特定甲基化 CpG 序列结合蛋白 (methyl CpG-binding protein, MeCP) 结合, 间接地阻止了转录因子与启动子形成转录复合体 最早被确认的甲基化 CpG 序列结合蛋白是 MeCP1 和 MeCP2, 接着发现 MBD1 MBD2 MBD4 和 Kaiso MeCP1 MBD1 MBD2 和 MBD4 通过甲基化 CpG 结合结构域 (MBD) 与 5mCpG 结合, 而 Kaiso 通过锌指模体与 5mCpG 结合 [26,27] 第三种观点认为 :DNA 甲基化可能会改变染色质的构象, 使染色质凝缩成非活性的高级结构, 从而抑制基因的转录, 或者导致某些基因的隐蔽或另一些基因的暴露, 影响 DNA 与蛋白质因子的结合, 最终影响基因的表达 [28-30] 3.4 DNA 甲基化与肿瘤 DNA 甲基化修饰是基因组表观遗传调控中主要的方式, 已发现人类很多疾病中都存在 DNA 甲基化的异常 [31] 目前研究较多的是肿瘤与 DNA 甲基化的关系, 已发现在肿瘤的发生和发展中存在 DNA 甲基化水平和模式的混乱, 包括基因组总体甲基化水平过低和抑癌基因启动子区域甲基化过高 [32,33] 肿瘤基因中的 DNA 甲基化异常与肿瘤发生肿瘤基因中存在着甲基化差异, 这与肿瘤的发生密切相关 首先, 肿瘤细胞整个基因组存在着普遍低甲基化, 这在肿瘤发生早期是至关重要的, 因为散在 CpG 甲基化的丢失, 使染色体容易发生断裂 异位, 甚至丢失, 从而影响染色体稳定性, 增加癌变机率 [34] 如 ICF 综合症患者的卫星 DNA 被去甲基化, 且该位置常出现重排现象, 这很好地说明了 DNA 低甲基化和染色体稳定性的关系 其次, 肿瘤相关癌基因启动子区的特定位点低甲基化, 这与基因激活 转录密切相关 DNA 低甲基化是一种基因表达的开放结构, 有利于基因高表达, 这也是癌基因转化细胞的必要条件 研究发现特定的癌基因在肿瘤细胞中频繁地被去甲基化, 如睾丸黑素瘤抗原 (MAGE) 家族在成人正常组织中是甲基化的且不表达, 但在许多肿瘤中却呈去甲基化状态, 且高水平表达 [35-37] ; 另外在肠癌中的 S100 钙结合蛋白 A4 基因 (S100A4) [38] 胃癌中的丝氨酸蛋白酶抑制基因(serpinb5) [39] 和卵巢癌中 γ-synuclein(sncg) [40] - 6 -

23 上海交通大学博士学位论文 基因都是被去甲基化且高表达 另外, 去甲基化也会激活与肿瘤浸润有关的基因的 表达, 促使肿瘤向外扩张 [41] 原癌基因甲基化程度越低的肿瘤, 表现出更强的恶性 侵袭能力 与癌基因的低甲基化相反, 肿瘤基因组中抑癌基因和一些生长调节基因 启动子区 CpG 岛为高甲基化状态, 其表达亦关闭 这将导致相关基因的沉默, 从而 直接参与 影响或调控肿瘤疾病的发生 发展过程 在近 20% 的不同肿瘤中发现 P16 的 5 CpG 岛重新甲基化, 但正常组织无此现象 [42] 更多研究表明, 许多肿瘤细胞中 细胞周期调控基因 DNA 修复基因 染色体重塑基因和凋亡基因等, 相应的 CpG 岛 都被异常的高甲基化且失活, 说明 CpG 岛甲基化是人类肿瘤细胞中抑癌基因失活的 共同途径之一 [43,44] DNA 甲基化异常的最终结果是影响基因组的稳定性和细胞增殖分化相关基因的 正常表达, 造成细胞失去对正常过程的控制, 而促进肿瘤的生成和发展 DNA 甲基化与肿瘤的治疗 基于抑癌基因启动子区高甲基化而进行的去甲基化治疗 使 DNA 去甲基化而恢复抑癌基因功能, 是肿瘤基因治疗的新型手段之一 由于 DNA 的甲基化在 DNMT 的催化下发生,DNMT 的抑制剂可使抑癌基因去甲基化 目 前美国 FDA 已批准上市的 DNMT 抑制剂为 5- 氮 -2- 脱氧胞苷 (5 -aza-cdr), 主要用于 白血病的治疗 5 -aza-cdr 为胞嘧啶的类似物, 在 DNA 复制时可以掺入到 DNA 中, 一方面干扰 DNA 对甲基的接受能力, 另一方面则直接抑制 DNMT 活性, 最终导致低 甲基化的 DNA 合成 [45,46] 已证实 5 -aza-cdr 在体内 外均可使大多数高甲基化的抑 [45] 癌基因去甲基化恢复表达而抑制肿瘤 如 Momparler 等报道应用 5 -aza-cdr 治疗 IV [47] 期非小细胞肺癌, 可以提高一部分患者的生存率 Laird 等以 5 -aza-cdr 治疗鼠小 肠肿瘤, 小肠腺肿平均数目由 113 个降为仅 2 个息肉 5- 氮胞苷类可恢复因甲基化而沉默的抑癌基因或生长调节基因的表达而减慢肿 瘤细胞的生长, 但是该类药物具有较高的毒性和诱变性, 其临床应用受到了很大的 限制 基于肿瘤相关癌基因启动子区低甲基化而进行的表观遗传治疗 既然 DNA 甲基化的生物学作用是能使基因长期处于沉默状态, 那么通过诱导癌 - 7 -

24 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 基因启动子区甲基化来抑制癌基因的表达, 应该能起到抑制肿瘤生长的作用 目前, 有两种靶向诱导癌基因甲基化的方法, 尽管离临床应用还有一定的距离, 但这种分 子药物已经显示出了很好的应用前景和开发优势 RNA 介导的 DNA 甲基化 RNA 介导的 DNA 甲基化 (RdDM) 是 RNA 沉默机制之一, 它是通过 dsrna 介导 启动子区 DNA 序列甲基化, 阻碍转录, 而导致转录水平的基因沉默 该现象首次发 [48] 现于植物系统中 1994 年,Wassenegger 等在被一种类病毒感染的植物中检测到 RNA 介导的 DNA 甲基化 后来, 在烟草 拟南芥 矮牵牛花中, 相继发现了这种 RNA 介导的 DNA 甲基化 [49] RdDM 在哺乳动物中虽然报道较少, 但在对肿瘤细胞研究中, 却有人为诱导 RdDM 的报道 Morris [50] [51] 和 Kawasaki 等用 sirna 诱导了人乳腺癌细胞 株 MCF-7 和正常的乳腺上皮细胞中 E-Cadherin 启动子 CpG 岛的甲基化, 同时在转录水 平抑制了 E-Cadherin 的表达 HER-2 在人类乳腺癌中一般过表达, 是一个不良预后的 标志 靶向 HER-2 启动子的 sirna 在 MCF-7 细胞里也诱导了 DNA 甲基化, 并降低了 MCF-7 细胞的增殖能力, 且这个过程可被 DNMT 抑制剂 5-Aza-CdR 所抑制 Castanotto [52] 等用短发夹状 RNA(shRNA) 诱导了 Hela 细胞中 RASSF1A 基因启动子区域甲基化而 导致基因沉默 以上这些实验表明, 用一段特殊设计的 RNA 靶向一个特定的癌基因 启动子区的 CpG 岛, 它可以依靠 DNA 甲基化酶以 DNA 甲基化的方式沉默转录的癌基 因, 来达到抑制肿瘤细胞增殖的目的 DNA 介导的 DNA 甲基化 通过对 DNMTs 的研究发现,DNMT1 的最适底物为带复制叉样结构的半甲基化 [53] 的 DNA Yao 等根据这一理论, 针对 IGF2 基因启动子区域的特定位点, 设计了一 段含 22 个碱基的甲基化的脱氧寡核苷酸 MON1 通过亚硫酸测序发现,MON1 诱导 了 IGF2 启动子区特定的 C 甲基化 体外实验发现, 这段寡核苷酸抑制了肝癌细胞 株 Hep3B 中 IGF2 基因 mrna 和蛋白的表达 他们又将这段寡核苷酸注射到肝脏中移 植了人 Hep3B 细胞的裸鼠体内, 发现这段寡核苷酸能够抑制肿瘤生长, 延长了荷瘤鼠 [54] 的存活期 Ishii 等根据 Yao 等的报道, 针对 GSTP1 基因设计了甲基化正义寡核苷酸, 也同样诱导了 GSTP1 基因启动子区甲基化, 且抑制了该基因的表达 - 8 -

25 上海交通大学博士学位论文 尽管基因启动子的甲基化和基因表达失活之间的关系有待于进一步阐明, 上述这些发现已经表明, 定点诱导 DNA 甲基化在肿瘤患者的分子治疗中有广泛的用途, 而且可能成为未来癌症治疗的新方法 3.5 DNA 甲基化检测的方法由于甲基化的胞嘧啶并不影响 C:G 核苷酸的配对, 且在聚合酶链反应 (PCR) 过程中, 胞嘧啶上的甲基会被丢失 ; 另一方面, 甲基集团很小, 所以检测 DNA 甲基化比检测 DNA 碱基序列相对困难 一般而言,, 可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种 :a 甲基化敏感性内切酶;b 亚硫酸氢盐的修饰;c 特异性识别甲基化修饰 DNA 的抗体或蛋白 ;d 质谱或色谱等精密检测手段 由于受到仪器等条件的制约, 应用比较广泛的是前三种方法 1. 甲基化敏感的限制性内切酶方法甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方法, 主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的 DNA 序列 [55] 由于在真核 DNA 或者哺乳动物 DNA 中, 只有 CG 相连的胞嘧啶能够被甲基化, 因此, 在酶切位点内包含 CG 序列的限制性内切酶就会遇到问题 这种方法所使用的两个经典酶对是 HPa II-Msp I(CCGG) 和 Sma I-Xma I(CCCGGG) 由于第二对限制酶识别序列非常罕见, 所以一般都用 HPa II-Msp I(CCGG) 两个酶都识别 CCGG 序列, 而当其中的胞嘧啶甲基化时,HPa II 不能够将其切开, 利用 Hpa-MspⅠ 的这种属性处理 DNA, 这就使得 HPa II-Msp I 能够作为快速甲基化分析的工具, 随后进行 Southern 或 PCR 扩增分离产物, 明确甲基化状态 这是一种经典的甲基化研究方法, 其优点是 : 相对简单, 成本低廉, 甲基化位点明确, 实验结果易解释 ; 主要缺点是 :a 由于 CG 不仅仅限于 CCGG 序列中, 因此非该序列中的 CG 将被忽略 ;b 存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题 2. NaHSO 3 法 (Sodium bisulfite 法 ) NaHSO 3 可将非甲基化的 C 转化为 U, 后者经 PCR 扩增变成 T 而产生 T:A 配对, 但甲基化的 C 则能抵抗 NaHSO3 的修饰, 这样 DNA 包含的甲基化信息就可转化为 DNA 序列的差异 [56] 由此发展了多种 CpG 岛甲基化检测方法, 如 BSP 测序 PCR(COBRA MSP Methelight 等 ) 芯片杂交技术 (microarray), 此类方法适应于检测已知基因中一个或多个 CpG 岛的几个 CpG 位点 - 9 -

26 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 的甲基化, 属位点特异性 DNA 甲基化检测技术 下面重点介绍一下甲基化特异性 PCR (Methylation Specific PCR, MSP) 和亚硫酸氢盐测序法 (Bisulfite sequencing,bsp sequencing) MSP 和 BSP 测序都是建立在亚硫酸氢钠对 DNA 的修饰基础上的, 胞嘧啶 C 在亚硫酸氢钠的作用下生成 6- 磺酸胞嘧啶, 后者通过水解脱氨生成尿嘧啶 Μ( 见图 1-1,), 而 5- 甲基胞嘧啶 (m 5 C) 则保持不变 图 1-1 亚硫酸氢钠转化反应模式图 Fig.1-1 the bisulfite modified reaction 2.1 MSP 是目前在研究 CpG 岛甲基化中, 应用最广泛的一种技术 它利用亚硫酸氢 盐修饰造成甲基化和非甲基化 DNA 序列差异, 设计出各自特异性引物, 再应用这两 对引物分别进行 PCR, 根据 PCR 产物的有无即可检测出这种差异, 从而确定基因有无

27 上海交通大学博士学位论文 CpG 岛甲基化 该法灵敏度很高, 可检出比例为千分之一的甲基化片段,DNA 需要 量极少, 不需要有特异性酶切位点, 但是此方法引物的设计是关键, 需要同时设计 甲基化引物 M 和非甲基化引物 U, 二者中至少有一个要扩增, 否则即表明 MSP 失败 因此, 设计引物时需要两个已知的 包含多个完全甲基化或非甲基化 CpG 位点的区 域, 但具有上述区域的 CpG 岛并不多, 限制了 MSP 的应用 [57] 2.2 BSP 测序是由 Frommer 等的提出的研究 DNA 甲基化的方法, 其原理 ( 见图 1-2) 是单链 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶可被亚硫酸氢盐脱氨基而转变成尿嘧啶, 而甲 基化的胞嘧啶保持不变 然后, 利用 PCR 技术对所需要的那段序列进行扩增, 将尿 嘧啶全部转化成胸腺嘧啶 最后, 对 PCR 产物进行直接或克隆后测序, 并且与未经 修饰的序列比较, 便可判断该 CpG 位点是否发生甲基化 亚硫酸氢盐转换 PCR 扩增 的基因组 DNA 测序已经成为分析 比较特殊位点甲基化方式的金标准 其优点是可 靠性及精确度都很高, 能检测到目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态, 但是需 要大量的克隆测序, 过程较为繁琐, 费用也比较高 本论文对 survivin 启动子区特定 位点的甲基化检测就是采用的这种方法 3. 芯片技术方法以上所述的 DNA 甲基化研究方法通量都较小, 难以达到全基因 组的高通量的要求 目前对于 DNA 甲基化在人类基因组中的认识十分有限, 一定程 度上说缺少高通量的筛选技术是阻碍基因组水平研究 DNA 甲基化谱系的关键因素, 芯片技术的发展为高通量研究 DNA 甲基化提供了新的方法 [58] 它的方法原理大致可 分为 3 种 :(1) 基于亚硫酸氢盐处理后 C/T 转变的原理 ;(2) 基于甲基化敏感性内切酶 或者甲基化依赖性内切酶的方法 ;(3) 基于 5- 甲基胞嘧啶抗体或者 MBD 的免疫捕获方 法富集甲基化的 DNA 片段 芯片技术因为它的高通量性正在越来越多的被应用于甲 基化谱的研究 相信随着技术的不断进步, 以芯片为核心的甲基化研究方法必将发 挥越来越重要的作用

28 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 图 1-2 Bisulfite seqμencing 原理和流程 Fig.1-2 Bisulfite seqμencing programme 4 组蛋白密码与基因表达组蛋白分为 5 种,H1 为连接组蛋白, 对相邻核小体起连接作用 ; 其它 4 种 (H2A H2B H3 H4) 共同构成核心组蛋白八聚体, 并与其表面缠绕的 146 bp DNA 组成核小体, 核心组蛋白 N 端富含碱性氨基酸,C- 端富含疏水氨基酸, 暴露在组蛋白表面, 这些组蛋白尾部氨基酸残基特定位点可接受酶催化的翻译后修饰, 这些修饰包括乙酰化 (acetylation) 甲基化(methylation) 磷酸化(Phosphorylation) 泛素化 (Ubiquitination) 等, 这些修饰及其排列组合被定义为组蛋白密码 (histone code) 组蛋白密码可以被一些特殊的调节蛋白质或蛋白质复合体所识别进而改变染色质结构从而促进或者抑制基因转录 [59] 单一组蛋白的修饰往往不能独立地发挥作用, 一种修

29 上海交通大学博士学位论文 饰的存在可以指导或抑制同一组蛋白上另一修饰的存在, 形成一个修饰的级联 这些修饰可作为一种标志或语言, 即组蛋白密码, 被一系列特定的蛋白所识别, 从而将这种密码翻译成一种特定的染色质状态以实现对特定基因的调节 该假说认为 : 组蛋白尾部的各种修饰是具有位点特异性的, 各种修饰相对独立, 并且存在着 交叉对话 能够诱导出染色质的特定组成水平 因而不同组蛋白修饰之间的 交叉对话 既决定了组蛋白密码的特异性, 又直接关系到组蛋白密码的多样性 组蛋白修饰作为一种重要的表观遗传标志, 与某些非组蛋白相互关联, 构成了一个调节基因转录的复杂网络 [60,61] 组蛋白修饰方式示意图 注 :P 为磷酸化 ;Ac 为乙酰化 ;Me 为甲基化 4.1 组蛋白甲基化 组蛋白甲基化与基因表达组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶 (histonemethyl transferase,hmt) 完成的 甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸 (Lysine) 和精氨酸 (Arginine) 残基上, 而且赖氨酸残基能够发生单 双 三甲基化, 而精氨酸残基能够单 双甲基化, 这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性和精确性 甲基化的作用位点在赖氨酸 (Lys) 精氨酸(Arg) 的侧链 N 原子上 目前发现, 组蛋白 H3 的第

30 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 36 和 79 位,H4 的第 20 位 Lys(K),H3 的第 2 l7 26 位及 H4 的第 3 位 Arg(R) 都是 甲基化的常见位点 [62] 研究表明, 组蛋白精氨酸甲基化是一种相对动态的标记, 精 氨酸甲基化与基因激活相关, 而 H3 和 H4 精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关 相 反, 赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控中一种较为稳定的标记, 尽管已发现了组蛋 白去甲基化酶 [63,64] 一般认为 H3K4 H3K36 H3K79 的甲基化对应于转录激活, 而 H3K9 H3K27 和 H4K20 的甲基化则与异染色质形成和基因沉默 (gene silencing) 相关 组蛋白去甲基化 组蛋白甲基化一直被认为是不可逆的, 是永久性的表观遗传标记 直到 2004 [63] 年 Shi 等发现了组蛋白去甲基化酶 LSD1, 才使人们认识到组蛋白甲基化过程也具有 动态性 该酶只能作用于 H3K4 位点的单甲基化或者双甲基化去甲基化, 而不能使三 [65] 甲基化的 H3K4 去甲基化 2006 年,Tsukada 等又纯化了一种新的组蛋白去甲基化 酶 JHDM1, 能特异地使单 二甲基化的 H3K36 去甲基化, 且更偏爱使二甲基化去甲 [66] 基化 随后,Klose 等又发现了 JHDM3A, 它可使三甲基化的 H3K9 和 H3K36 去甲 基化 JHDM1 和 JHDM3A 都是含有 Jmjc 域的组蛋白去甲基化酶, 与转录抑制有关 组蛋白甲基化与 DNA 甲基化 [67] 组蛋白甲基化与 DNA 甲基化两者具有功能上的内在联系 如 Kondo 等的实验 表明,H3K9 的甲基化与 DNA 甲基化在基因沉默中具有协同作用, 而 H3K4 的甲基化 拮抗 DNA 甲基化所产生的基因沉默 而在组蛋白甲基化与 DNA 甲基化发生机制上的 关系, 却有着截然相反的两种观点 第一种观点认为, 组蛋白甲基化先于 DNA 甲基 化 比如,Heard [68] [69] 和 Mermoud 等通过对雌性哺乳动物 X 染色体失活的研究中发现, 首先发生 H3K9 甲基化, 然后形成一个失活中心, 继而才出现 DNA 甲基化 H4 的低 乙酰化现象 同样,Tamaru 在链孢霉属中发现,H3K9 甲基化转移酶被抑制后,DNA 的甲基化程度也下调, 且相应的基因也没有被甲基化 [70] 而另一种观点则认为 DNA [71] 甲基化指导组蛋白甲基化 如 Fahrner 等在实验中发现,DNMT 活性被抑制时, 首 先发生 CpG 的去甲基化, 接着基因被激活表达, 最后才出现组蛋白共价修饰的完全 [72] 逆转 Fuks 等的研究认为甲基化 CpG 结合蛋白 MeCP2 的氮端还能与组蛋白甲基化 转移酶结合, 从而指导 H3K9 发生甲基化, 更进一步丰富了 Fahrner 等的假设 组蛋白

31 上海交通大学博士学位论文 甲基化是组蛋白共价修饰的形式之一, 它与 DNA 甲基化一起在调控基因表达的过程 中, 孰先孰后, 是目前表观遗传学理论争论的热点之一 在本研究中, 我们试图对 这一理论进行探讨 组蛋白甲基化与肿瘤 [73] Kim 等通过对 H3K9 位甲基转移酶的研究发现, 该酶可能具有肿瘤抑制功能, 其功能缺失可能参与癌症的发生过程 最近, 美国一项临床研究也发现, 肿瘤组织 中组蛋白甲基化异常的比例很高 另外, 还有报道缺乏甲基的饮食会导致组蛋白甲 基化程度偏低, 这类人群发生肿瘤的比例较正常人群高 这些结果都提示组蛋白甲 基化与肿瘤发生有关 4.2 组蛋白乙酰化和去乙酰化与基因表达 组蛋白乙酰化可使核小体结构发生改变, 并促进转录相关因子结合到染色体 DNA 上 由于乙酰化削弱了组蛋白与 DNA 的结合, 从而使染色质构象处于开放状态, 有利于 DNA 的基因转录和表达 一般情况下, 转录活性区的核小体组蛋白呈高乙酰 化, 而不活跃区呈低乙酰化状态 组蛋白的乙酰化是一可逆的动态过程, 由组蛋白 乙酰化转移酶 (Histone Acetyltransferase, HAT) 和组蛋白去乙酰化酶 (Histone deacetylase, HDAC) 调控 组蛋白乙酰化呈多样性, 核小体上有多个乙酰化位点, 尤 其是 H3 的 K9 K14 K18 K23 和 H4 的 K5 K8 K12 K16 等位点, 但特定基因部 位的组蛋白乙酰化和去乙酰化是以一种非随机的 位置特异的方式进行, 不同的乙 酰化模式决定了特定的空间构象, 这似乎决定了基因不同的表达活性和表达方式 [74] 最近有研究发现, 某些 HAT 复合物含有一些常见的转录因子, 某些 HDAC 复合物含 有已被证实的阻遏蛋白 这些发现支持了高乙酰化与激活基因表达 低乙酰化与抑 制基因表达有关的看法 组蛋白乙酰化 / 去乙酰化与 DNA 甲基化的关系 首先,DNA 甲基化能影响组蛋白乙酰化和去乙酰化 早期的研究认为,DNA 甲 基化与组蛋白去乙酰化和基因沉默有内在的联系 启动子区 DNA 的甲基化, 通过 MeCP2 招募 HDAC 复合物, 使组蛋白去乙酰化, 抑制启动子的活性 [75,76] 其次, 组 蛋白乙酰化 / 去乙酰化影响 DNA 甲基化 研究者考察 HDAC 抑制剂 TSA 对链孢酶中某

32 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 些基因活性的影响, 结果发现,TSA 的处理可选择性地使链孢酶中的某些基因的甲 基化下降 [77] Januchowski 等用 TSA 处理 Jurkat T 细胞, 结果发现 TSA 可以引起 DNMT1 mrna 表达降低 [78] 该实验提示, 组蛋白乙酰化状态的改变可以影响到 DNA 甲基化 [79] 水平 Ou 等用 TSA 处理三种细胞株, 考察高甲基化抑癌基因 E-cadherin 和 RARβ2 表达的变化 结果发现,TSA 不仅能诱导组蛋白乙酰化和去甲基化, 而且能诱导抑 癌基因去甲基化而恢复表达 再次, 组蛋白乙酰化 / 去乙酰化与 DNA 甲基化有协同 [80] 效应 Fuks 等发现,DNMT1 本身与 HDAC 活性相关联 HDAC 能够与 DNMT1 结 合, 在 HDAC 的核抽提物中, 含有 DNMT 活性 ;DNMT1 中的一个转录抑制功能域能 [81] 招募 HDAC 活性 Bakin 等研究在原癌基因 fos 诱导的转化细胞中,DNMT1 是正常 成纤维细胞的 3 倍, 包含的 5mCpG 比正常成纤维细胞多 20% 抑制 DNMT1 的表达 可导致 fos 诱导的细胞转化的逆转, 同样抑制 HDAC, 也能逆转 fos 诱导的细胞转化 组蛋白乙酰化 / 去乙酰化与组蛋白甲基化的关系 越来越多的研究表明, 组成核小体的核心组蛋白尾部的各种修饰之间存在相互 联系 总体而言, 组蛋白 H3K4 的双甲基化和三甲基化 H3K36 和 H3K79 的双甲基 化与组蛋白高乙酰化和基因的激活相关, 而组蛋白 H3K9 二甲基化及三甲基化 H3K27 和 H4K20 二甲基化与组蛋白的低乙酰化和基因表达抑制相关 [82] 组蛋白乙酰化 / 去乙酰化与肿瘤 一般染色质的转录活性区域对应组蛋白的高乙酰化, 而转录静止区域对应组蛋 白的低乙酰化, 体内 HAT 和 HDAC 的平衡在特定条件下被打破, 就会导致基因转录 的失调, 引起原癌基因的激活和抑癌基因的失活, 转而导致细胞增殖失常而引发肿 瘤的发生 ; 同时编码 HAT 和 HDAC 基因的突变甚至本身的参与也与癌症密切相关, 一些肿瘤中发现编码 HAT 的基因易于易位 扩增 过量表达或点突变,HDAC 也介 导产生致癌的易位产物,HDAC 与一些本身就经常发生突变的肿瘤抑制蛋白相互作用 [83-85] 4.3 组蛋白的其他修饰方式 组蛋白的共价修饰除了甲基化 乙酰化外, 还有磷酸化 泛素化 ADP 核糖基 化等 这些修饰更为灵活地影响染色质的结构与功能, 通过多种修饰方式的组合发

33 上海交通大学博士学位论文 挥其调控功能 所以有人称这些能被专一识别的修饰信息为组蛋白密码 这些组蛋白密码组合变化非常多, 因此组蛋白共价修饰可能是更为精细的基因表达调控方式 4.4 研究组蛋白共价修饰的分析方法染色质免疫沉淀法 (Chromatin immunoprecitation, ChIP) 是研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的重要工具, 它可以灵敏地检测目标蛋白与特异 DNA 片段的结合情况, 成为表观遗传信息研究的主要方法 它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质 -DNA 复合物, 并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段, 然后通过免疫学方法沉淀此复合体, 特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段, 通过对目的片断的纯化与检测, 从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息 它能真实 完整地反映结合在 DNA 序列上的调控蛋白, 是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法 该技术用来研究组蛋白与基因表达的关系时, 是通过特异的组蛋白识别标记 ( 如乙酰化 甲基化 ) 抗体, 沉淀富集与组蛋白结合的 DNA 片段, 再经 PCR 或者分子杂交等技术分析, 可了解基因组特定位置组蛋白的修饰状态 根据 组蛋白密码 假说, 组蛋白的各种共价修饰的组合, 会以协同或拮抗的方式诱导特异下游元件的功能 因此,ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用 阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具 5 凋亡抑制因子 survivin 与肿瘤 5.1 survivin 的分子结构与功能 Survivin 于 1997 年由耶鲁大学的 Altieri 等发现, 是凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis proteins, IAP) 家族的一个独特成员, 它与多种亚细胞构件相结合, 其表达也受多种信号途径调控 人 Survivin 由 142 个氨基酸组成, 分子量是 16.5 kda, 是哺乳动物 IAP 家族中最小的成员 Survivin 含有一个杆状病毒 IAP 重复序列以及一个位于 C 末端的 α 螺旋结构, 未发现环指结构或是其他结构域 [86] survivin 基因位于染色体 17q25, 全长 1417 kb

34 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 Survivin 的半衰期为 30 分钟, 其表达具有明显的细胞周期依赖性 这主要是受转录水平的调控, 并且涉及到启动子区域的 CDE/CHR 盒 (cell-cycle-dependent element /cell-cycle gene homology region) [87] Survivin 的主要功能是调控细胞有丝分裂和抑制细胞凋亡 研究认为,survivin 是细胞凋亡与细胞周期检查点之间的界面分子 Survivin 主要通过直接抑制凋亡终末效应器 caspase-3 和 caspase-7 的活性阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程 ; 以及与周期蛋白激酶 cdk4 p34 cdc2 相互作用阻断凋亡信号转导通路这两条途径来抑制细胞凋亡 [88] 5.2 survivin 与肿瘤 Survivin 在胚胎和胎儿器官中广泛高度表达, 在大多数结束分化的正常组织中未 被检测, 但在几乎所有的肿瘤中过量表达, 如肺癌 乳腺癌 结肠癌 胃癌 食道 癌 胰腺癌 肝癌 子宫癌 卵巢癌 淋巴瘤 白血病 软组织瘤 神经胶质瘤 黑色素瘤等 60 余种肿瘤组织或细胞 [86] 对表达 survivin 的肿瘤, 肿瘤病人总体存活 率降低, 复发率升高, 并对化疗等产生抗性 [89] 由于 survivin 在肿瘤组织中过量表达 的高度特异性, 以及它为肿瘤细胞生存所必需, 所以它很可能是将抗凋亡与细胞恶 变直接联系起来的分子, 因此 survivin 被公认为是癌症治疗的一个重要靶点 5.3 针对 survivin 的肿瘤靶向治疗 目前针对 survivin 进行的肿瘤靶向治疗的研究, 主要有以下几种方法 1) 反义寡 [90] 核苷酸 (Antisense Oligodeoxynucleotide, ASODN):Grossman 等单独转染了针对 survivin 的反义寡核苷酸至人 YUSAC2 和 LOX 黑色素瘤细胞株, 诱导了细胞凋亡 Lu [91] 等发现通过抑制 survivin 基因的表达可以增加 NCI-H460 肺癌细胞株对放疗的敏感 [92] 性 Yang 等针对 survivin mrna 的不同位点设计了 3 条 ASODN, 分别转染到 SGC7901 胃癌细胞株, 对细胞增殖和 survivin 蛋白表达进行检测 结果显示 ASODN3 抑制细胞生长最强, 而且在细胞内发现了 survivin mrna 的丢失 这些结果提示靶向 survivin 基因的反义药物是抗肿瘤新药研发的重要方向之一, 但 ASODN 还存在细胞膜 通透性差 易降解, 治疗费用昂贵, 以及血小板减少 血压降低 发热等不良反应, 影响了 ASODN 在临床上的大规模应用 2) RNA 干扰 (RNA interference,rnai):

35 上海交通大学博士学位论文 [93] Carvalho 等首先使用 RNAi 特异性地抑制了 HeLa 细胞的 survivin 的表达 研究发现转 [94] 染了特定 sirna 序列的细胞, 在培养 60 h 后就检测不到 survivin Yonesaka 等研究 显示 : 靶向 survivin 的 sirna 可以增加突变型 P53 的肺癌细胞对阿霉素的敏感性, 且促 进细胞凋亡 与传统的反义技术相比,RNAi 以其高效 高特异性等优点, 展示了其 独特的优势及广泛的应用前景, 但 RNAi 导入率不高 稳定性差, 在实际应用过程中 也遇到了研发瓶颈 另外还有针对 survivin 蛋白的免疫治疗等 [95,96] 由此可见, 虽然 survivin 是一个公认的肿瘤治疗的靶点, 但针对 survivin 的靶向治疗还需要更切实可行 的方法 6 本文的研究内容及意义 DNA 的甲基化和组蛋白的共价修饰改变, 二者共同起作用来决定基因表达的状 态, 决定细胞的生死存亡, 这已经是表观遗传学领域不争的事实 [97] 然而, 这两个 过程是如何彼此协作 控制基因开或关, 更确切的说, 究竟是 DNA 甲基化指导组蛋 白共价修饰改变, 还是组蛋白的共价修饰改变指导 DNA 甲基化, 二者哪一个是更上 游的事件? 目前在表观遗传学领域存在着争论 而我们的研究则有可能揭示出在特 定的基因沉默过程中,DNA 甲基化 组蛋白去乙酰化和组蛋白的特殊位点甲基化, 哪一个事件是表观遗传调控中的上游事件, 或者说它们之间是如何协同起作用而引 起基因沉默的 6.1 前期研究基础 核酸药物 SurKex 的设计 我们在 Yao [53] 的基础上, 以 survivin 为靶基因, 针对其启动子区域中不同的甲基 化位点, 设计并合成了启动子甲基化诱导剂 SurKex 根据 Yao 的设计理论, 这类甲基化诱导剂是一条寡核苷酸链, 由两个结构单元 组成 : 导向元件 (Guiding Element,GE) 和 DNA 灭活元件 (Inactivating Element, IE) 其中 GE 是一条短的正义寡核苷酸链, 它可以与基因组 DNA 模板链互补, 其 作用是引导 DNA 灭活元件到基因组 DNA 特定的核苷酸序列, 通常是靶基因的启动 子附近区域 IE 是一条独特的寡核苷酸链, 在它的 5 端含有一个 CpG 半甲基化的发

36 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 夹结构 与 GE 于靶序列结合后, 它可以诱导 DNA 甲基转移酶使邻近区域 DNA 的 CpG 二核苷酸甲基化, 从而抑制转录的发生 由于 IE / GE 结构中的引导元件是一条 正义链, 因此该寡核苷酸不会与 mrna 转录子结合 该结构的 GE 段与处于复制或 转录状态的基因模板链结合, 形成一个半甲基化的复制叉样结构, 该结构是 DNA 甲 基转移酶 1(DNA Methyltransferase 1, DNMT1) 的最佳底物 DNMT1 是维持双亲印 迹和 X 染色体灭活所必需的一种 DNA 甲基化酶 它与 DNA 复制机制相结合, 通过使 细胞中新合成的 DNA 链甲基化来维持 DNA 的甲基化状态 ( 图 1-3) Yao 的这个理论虽然只是一种假设, 但这类甲基化诱导剂诱导基因沉默的作用分 别在 IGF2 [53] 和 GSTP1 [54] 基因上得到了验证 利用上述原理, 我们设计了抑制靶基因 survivin 表达的核酸药物 SurKex, 以期能诱导 survivin 启动子 DNA 甲基化,SurKex 的作 用位点如图 1-4 所示 图 1-3 DNA 甲基化的诱导 Fig.1-3 Indμced DNA methylation

37 上海交通大学博士学位论文 Oligo drug (DNA methylation compound) is composed of two components, an inactivating element (IE) and a guiding element (GE). The GE places IE at a specific region of a pathogenic gene to initiate DNA methylation. DNA hypermethylation suppresses gene expression to block the production of proteins that are involved in disease. Dnmt1 = DNA methyltransferase. tctaaacttag m cgccctggg m ca 图 1-4 SurKex 的作用位点 Fig.1-4 SurKex targeted region Survivin gene contains 4 exons and 3 introns. The regions critical to promoter activity are underlined and SurKex compounds containing compliment elements target a specific promoter region SurKex 的药效学实验在前期的实验中, 我们用 SurKex 转染人非小细胞肺癌细胞株 NCI-H460 后, 并在分子水平上检测对 survivin 表达的影响 结果表明,SurKex 在 5.0 μm 转染浓度下, 对 survivin mrna 和蛋白表达的抑制率达到 90% 以上 ; 我们用 NCI-H460 细胞皮下接种裸鼠, 建立移植瘤肺癌模型, 在整体动物水平上, 考察 SurKex 的抑瘤作用 结果表明, 18 mg/kg 的 SurKex 对 NCI-H460 肺癌裸鼠模型肿瘤体积的增长以及实验结

38 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 束时的肿瘤重量具有明显的抑制作用 这些药效学实验结果表明,SurKex 通过诱导 survivin 沉默而起到了抑瘤作用 对 SurKex 诱导 survivin 沉默机理的初步探讨在前期的实验中, 我们采用亚硫酸氢钠测序法对 survivin 基因启动子部位的特定片断进行序列分析, 发现 SurKex 作用后, 引起 survivin 基因启动子特定位点的一个胞嘧啶 C 发生了甲基化, 初步表明 SurKex 是通过诱导 survivin 启动子区甲基化而引起 survivin 沉默 6.2 本论文主要研究内容本文的研究内容主要分为四个部分 第一部分是在前期工作的基础上, 进一步确证 SurKex 诱导 survivin 启动子部位甲基化的作用方式, 即是定点 多点或是随机甲基化 第二部分是以 SurKex 作为工具药, 研究在 survivin 沉默的过程中, 与 survivin 启动子部位结合的组蛋白, 其特异位点的乙酰化和甲基化修饰是否受到影响 第三部分是采用 DNA 甲基化酶抑制剂 组蛋白去乙酰化酶抑制剂和组蛋白甲基化酶抑制剂, 来进一步揭示在 survivin 沉默过程中,DNA 甲基化 组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化这些表观遗传学重要生化事件之间发生的先后顺序 第四部分是考察组蛋白去乙酰化及组蛋白甲基化指导 DNA 甲基化可能的作用途径 6.3 本论文的研究意义在引起基因沉默的过程中, 沉默信号 (DNA 甲基化 组蛋白修饰 染色质重塑 ) 是如何进行的? 它们发生的顺序如何? 这是目前表观遗传学理论研究的热点 本文通过对甲基化诱导剂 SurKex 诱导 survivin 沉默机制的研究, 可以揭开在特定基因 survivin 沉默的过程中,DNA 甲基化和组蛋白共价修饰之间, 何者是更优势的事件, 对表观遗传学的重大理论问题提供实验证据 同时, 对基于以肿瘤表观遗传靶标作为癌症预防与治疗的药物的设计和研发, 有着重要的理论意义和潜在的临床应用价值 再者, 我们对甲基化诱导剂 SurKex 作用机制的阐明, 使其可以作为工具药, 为以后表观遗传学的研究提供有效的技术工具

39 上海交通大学博士学位论文 第二章 SurKex 诱导 survivin 启动子部位甲基化的方式虽然在前期的实验中, 我们发现 SurKex 作用后,survivin 基因启动子区的 14 个 CpG 中, 其中的一个 C 发生了甲基化, 但还需要进一步确证 SurKex 诱导的甲基化是位点特异性 ( 固定位点的单个 CpG 或多个 CpG) 还是随机发生, 所以本部分实验主要考察 SurKex 诱导 survivin 启动子部位甲基化的方式 1 材料与方法 1.1 材料与主要试剂 NCI-H460 细胞株 ( 中科院上海细胞所细胞库, 中国 ) SurKex(A m CGGG TCCCG m CGATT CAAAT CT)(MWG-Biotech AG, 德国 ), 随机序列寡核苷酸 Random (ATGCT m CGGAACCTTT m CGVAGGA)(Syngen, 美国 ) survivin 甲基化引物 (5 - agaag gtcgc ggggg gtgga tcgtt taaga, 5 -acaaa aaaca acgtc gaaac accca tacc ),survivin 非甲基化引物 (5 -agaag gttgt ggggg gtgga ttgtt taiga, 5 -acaaa aaaca acatc aaaac accca tacc )( 上海鼎安生物科技有限公司, 中国 ) Opti-MEM 培养基 Lipofectamine2000 转染试剂 胎牛血清 (Invitrogen, 美国 ),DNAzsol-E S.O.C 培养基 ( 上海申能博彩生物技术有限公司, 中国 ),2 Taq PCR Master mix TOP10 感受态细胞 TA 克隆试剂盒 IPTG(50 mg/ml) X-gal(20 mg/ml)( 天根生物技术有限公司, 中国 ), 溴化乙锭 (Ameresco, 美国 ), 琼脂糖凝胶回收试剂盒 (TaKaRa, 日本 ),Wizard DNA clean-up system( Promega, 美国 ),Sodium bisulfite Hydroqμinone(Sigma, 美国 ), 氨苄青霉素钠 硫酸链霉素 ( 上海鼎国生物技术有限公司, 中国 ),LB 琼脂糖 氯仿 异丙醇 乙醇 ( 上海化学试剂有限公司, 中国 ) 1.2 主要仪器 SMA3000 微量核酸蛋白分析仪 ( 北京华大基因研究所, 中国 ),PTC-100 PCR 仪 (MJ, 美国 ),Mini-Cell GT 电泳装置 Power Pac 200 电源 (BIO-RAD, 美国 ), BioDoc-It 凝胶成像仪 (ΜVP, 美国 ),HZQ-C 空气浴振荡器 ( 东明医疗仪器, 中国 ), HSS-1B 恒温浴槽 ( 成都仪器, 中国 ),Thermomixer compact(eppendorf, 德国 ), WH-Z 微型旋涡混合仪 ( 沪西分析仪器, 中国 ),5415D 离心机 (eppendorf, 德国 )

40 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 1.3 细胞培养人非小细胞肺癌 (Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC) 细胞株 NCI-H460 培养于含 10% FBS 100 μg/ml 氨苄青霉素钠 40 μg/ml 硫酸链霉素的 RPMI-1640 培养基中, 在 37 5%CO2 的环境下生长 1.4 转染将处于指数生长期 ( 密度约 75%, 经台盼蓝排斥实验检测, 活细胞率 >95%) 的 NCI-H460 细胞经 0.25% 胰蛋白酶消化后, 用培养液收集, 在 24 孔板中以 10 5 个 / 孔的浓度铺板,37 培养过夜 将 SurKex 和 Random 溶于无菌 PBS(pH 7.4) 中, 并经针头式过滤器 (0.22 µm) 过滤 在 Eppendorf 管 A 中加入室温下的 Opti-MEM 培养基 100 μl, 再加入 2 μl lipofectamine2000 转染试剂, 混匀后室温放置 5 分钟 在 Eppendorf 管 B 中加入室温下的 Opti-MEM 培养基 135 μl, 加入 15 μl SurKex 的 PBS 溶液, 混匀 混合 A B 两管, 反复抽吸混匀, 室温放置 30 分钟 各组转染浓度见表 2-1 表 2-1 每组的转染浓度 Table 2-1 transfection concentration of each group Well No. Group Conc. In Tube B Conc.Final (μm) (μm) 1 Lipofectamine 0 2 μl 2 Random SurKex 吸去 24 孔板中的培养基, 用 500 μl RPMI 1640 洗涤细胞 每孔逐滴加入 250 μl A B 管混合液, 轻微摇晃混匀 37 培养 12 小时后, 吸去转染混合液, 再向每孔 加入 500 μl 含 10%FBS 的 RPMI 1640 培养基,37 继续培养 48 小时 1.5 基因组抽提

41 上海交通大学博士学位论文 移除 24 孔板中的培养基, 每孔加入 1ml DNAzsol-E 裂解细胞, 混匀后将裂解液转移至 Eppendorf 管,65 保温 45 分钟 ( 间或混匀 ) 加入 500 μl 氯仿 / 异戊醇 (24: 1), 室温间或振荡 5 分钟,12000 rpm/min 离心 5 分钟 上清转移至新 Eppendorf 管中, 加入 0.5 ml 无水乙醇, 混匀, 室温放置 5 分钟,12000 rpm/min 离心 10 分钟 弃上清, 沉淀用 70% 乙醇洗一次,12000 rpm/min 离心 5 分钟 吸走上清, 室温干燥 10 分钟, 加 50μl TE, 室温放置 30 分钟待其完全溶解 1.6 亚硫酸氢钠处理基因组 DNA 将上述 DNA 适当稀释后, 用 SMA3000 微量核酸蛋白分析仪测定 DNA 浓度, 用 TE 调浓度为 ng/μl, 取 50 μl; 加入 5 μl 新配置的 3 M NaOH( 最终浓度为 0.3 M), 37 孵育 25 分钟 ; 加入 510 μl 40.5% 的亚硫酸氢钠 (sodium bisulfite),30 μl 10 mm 对苯二酚 (Hydroqμinone),15 μl ddh 2 O, 使总体积为 610 μl; 铝箔包好, 轻柔混匀, 55,16 小时 1.7 纯化基因组 DNA 及终止亚硫酸氢钠反应 用 Wizard DNA clean-up system(promega, 美国 ) 试剂盒对上述处理过的基因 组 DNA 进行纯化 具体步骤按试剂盒说明书进行 首先在上述处理过的 DNA 中加入 1ml resin, 颠倒混匀数次, 然后将 DNA 收集至收集柱中, 再用 80% 异丙醇 2 ml 冲洗 残留在装置中的 DNA, 将收集柱放置 1.5 ml EP 管中,1000 rpm,2 分钟, 去除残余 异丙醇 将收集柱放置到新的 1.5 ml EP 管中, 加入预热 (65-70 )ddh 2 O 50 μl, 放 置 2 分钟,1000 rpm,1 分钟洗脱 DNA 在上步收集的 DNA 溶液中, 加入 5.5 μl 3 M NaOH, 于 37 放置 20 分钟 ; 加入 35 μl 8 M 乙酸胺, 中和 ; 加 300 μl 预冷的无水乙醇, 混匀,-20 冰箱过夜 室温 rpm,10 分钟, 弃上清 ;70% 乙醇洗沉淀,14000 rpm,2 分钟, 小心 吸走上清 ; 室温干燥 DNA, 加 35 μl ddh O 溶解 DNA,-20 保存 PCR 扩增目的片断 在 0.2 ml 的 PCR 管中, 建立 12 μl 的反应体系, 依次加入 :

42 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 DNA 模板 : 4 μl Forward primer(10µm): 0.5 μl Reverse primer(10µm): 0.5 μl ddh O: 1 μl 2 2 PCR Taq Master Mix: 6 μl PCR 扩增反应程序为 : 95 3 min, sec, sec, 35cycles sec, min 1.9 电泳检测按 2 % 的胶浓度, 将琼脂糖加入到 0.5 TBE 溶液中, 微波炉中高火 2 min, 使其溶解后, 待降温至 65 左右加入溴化乙锭 (50 μg /100 ml 胶 ), 制胶 取 10 μl PCR 反应产物上样 DNA ladder 6 μl 上样 在 0.5 TBE 电泳缓冲液中, 以恒定电压 100 V 电泳 30 min, 用凝胶成像仪观察记录结果 1.10 回收目的条带 紫外灯下切出含有目的条带的琼脂糖凝胶, 按照胶回收试剂盒 (TaKaRa, 日本 ) 说明书操作 : 称量胶块重量, 计算体积 (1mg=1μl), 切碎胶块, 收集至 EP 管中, 加 入 3 个胶块体积量的 DR-I buffer, 于 75 放置 6-10 分钟加热融化胶块, 间或混匀 加入 1/2 DR-I buffer 体积量的 DR-II buffer 以及终浓度为 20% 的异丙醇, 混匀 ; 将 混合液转移至安放于收集管中的离心柱中,12000 rpm,1 分钟, 弃滤液 ; 加入 500 μl RinseA 于离心柱中,12000 rpm,30 秒, 弃滤液 ; 加入 700 μl RinseB 于离心柱中, rpm,30 秒, 弃滤液 ; 再用 700 μl RinseB 重复一次 ; 将离心柱安置于新 EP 管 中, 在离心柱膜中央加入 25 μl 预热 65 ddh O, 室温放置 2 分钟 ;12000 rpm,2 分

43 上海交通大学博士学位论文 钟洗脱 DNA 1.11 TA 克隆 连接反应 取一干净 EP 管, 建立 10μl 的连接反应体系, 如下 : 上述胶回收的 PCR prodμct pbs-t vector 1.5 μl 1 μl 10*T4 DNA ligation buffer 1 μl T4 DNA ligase sterile water 1 μl 5.5 μl 将上述连接反应液置于 PCR 仪内, 于 16 过夜转化 : 取感受态细胞 TOP μl 置于冰浴上融化, 吸上述连接反应液 5 μl 到含有 TOP10 的 EP 管中, 用枪头温柔混匀, 置于冰上 30 min;42 90 秒, 注意不要摇动, 立即转移至冰上 ; 加入 500 μl 的 S.O.C 培养基, 置于 37 振荡 (150 rpm) 摇床培养 1 h; 取 100 μl 涂布于 LB agar plates( 含有 100 μg/ml Ampicillin),LB agar plates 预先涂有 32 μl IPTG(50 mg/ml) 40 μl X-gal(20 mg/ml); 细菌培养箱 37 过夜 1.12 挑取并 PCR 鉴定转化子, 对正确插入的转化子进行扩大培养取出上述过夜培养的培养皿, 用灭菌枪头每组挑取 18 个白色单菌落, 放入事先加有 200 μl LB 的 1.5 ml EP 管中, 置于 37 振荡 (150 rpm) 摇床培养 1-2 h, 然后分别吸出 1μl 做菌落 PCR 电泳后, 挑出与标带位置相同的菌落, 再加入放有 2 ml LB 的 15 ml 离心管中,190 rpm 振荡摇床过夜培养 1.13 测序 将上述正确插入的 扩大培养后的转化子送上海鼎安生物科技有限公司测序

44 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 2 结果在这部分研究中, 主要用 SurKex 5.0 µm 的转染浓度处理 NCI-H460 细胞, 并以转染试剂 lipofectamine 和同浓度的 Random 随机寡核苷酸序列作对照, 转染 60 小时之后收集每组基因组 DNA, 并采用 Bisulfite sequenceing 方法,( 具体步骤如上 所述, 主要是利用亚硫酸氢钠对 DNA 碱基的修饰作用, 它能将所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应转变成尿嘧啶, 但 5- 甲基胞嘧啶不发生转变, 所以经过 PCR, 克隆, 到最后测序结果中只要有 C 显示的地方则提示原来该位点即是甲基化的 ) 来分析目的 DNA 片断的中 CpG 位点的甲基化状况 图 2-1 为亚硫酸氢钠处理后的 survivin 启动子区特定序列的 PCR 扩增电泳结果, PCR 扩增产物为 144 bp 图 2-2 为图 2-1 胶回收后的电泳图 M H2O L R S 200 bp 100 bp 144 bp 图 2-1 亚硫酸钠处理过的 survivin 基因启动子的扩增 Fig.2-1 Amplified of bisulfite-modified survivin promoter by PCR

45 上海交通大学博士学位论文 M H2O L R S 200 bp 100 bp 144 bp 图 2-2 PCR 目的片断回收结果 Fig.2-2 Recovery of PCR prodμct 将回收的 PCR 目的片断克隆后, 依据蓝白斑筛选原理, 即 TOP10 菌株含 LacZ 基因, 编码的 β 半乳糖苷酶能分解生色底物 X-gal(5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β-d- 半乳糖苷 ) 产生蓝色, 从而使菌株变蓝, 当外源 DNA 插入后,LacZ 基因不能表达, 菌株呈白色, 以此来筛选重组细菌 我们每组挑取 18 个白色菌落, 进行菌落 PCR, 根据电泳结果选定 10 个克隆, 继续过夜悬浮培养扩增, 然后将菌液直接送去测序 每组菌落 PCR 结果为图 2-3, 其中每间隔六个孔加一标带, 根据与标带的电泳水平距离, 确定含插入目的片断的 10 个克隆 如图所示我们从转染试剂 Lipofectamine 对照组中挑取 2,3,5,7,8,9,12,13,16,18 等 10 个克隆, 从随随机序列 Random 对照组中挑取 6,7,8,9,10,12,14,15,16,17 等 10 个克隆, 从 SurKex 组中挑取 5,6, 7,8,11,12,15,16,17,18 等 10 个克隆

46 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 A M M B M M C M M 图 2-3 每组 18 个克隆的 PCR 电泳结果 (A: 转染试剂 Lipofectamine 对照组 ;B: 随机序列 Random 对照组 ;C:SurKex 组 ) Fig. 2-3 PCR electrophoresis of 18 clones for each group ( A: Lipofectamine group; B: Random guoup; C: SurKex group) 基因组 DNA 先经亚硫酸氢钠处理后, 再利用 PCR 技术对目的片段进行扩增, 此时目的片段中不发生甲基化的 C 将全部转化成胸腺嘧啶 T, 最后对 PCR 产物进行胶回收, 再进行克隆, 然后抽取进行测序 将三组的测序图谱去掉两端的 pbs-t 质粒后, 剩余的插入序列的测序结果中只要有 C 显示的, 则提示该位点 C 在原始序列中是甲基化修饰的 对每组测序的 10 个克隆进行序列比对, 比较插入的 144 bp 碱基序列中的 14 个 CG 位点的甲基化情况, 结果发现 Lipofectamine 组和 Random 组的 10 个克隆中, 插入序列的 14 个 CG 位点中的 C 都是 T 显示, 而 SurKex 组的 10 个克隆中, 有 5 个克隆插入序列的 14 个 CG 处的 C 全是 T 显示, 而另外 5 个克隆的测序图谱显示, 第 11 个 CG 位点处的 C 仍是 C 显示 而该位点的 C 正是 SurKex 序列的互补区域 结果表明,SurKex 能引起 survivin 启动子区相应互补配对的靶序列的 C 定点发生甲基化, 且甲基化效率为 50% Lipofactamine Random 和 SurKex 三组的测序图谱见附 1, 图 2-4A 表示了 survivin 启动子区的部分序列,SurKex 的碱基配对互补区域和以箭头表示的正 反向

47 上海交通大学博士学位论文 引物, 以及在引物之间的 14 个 CG 位点 ( 下划线表示, 其中深黑色标注的 C 为发 生甲基化的 m C) 图 2-4B 表示了三组 CG 位点甲基化结果的统计情况, 灰色部分表示 该 CG 位点 C 为甲基化 图 2-4 A survivin 启动子区的部分序列 Fig.2-4 A Partial sequence of surviving promoter

48 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 SurKex: tctaaacttag m cgccctggg m ca SurKex: tctaaacttag m cgccctggg m ca SurKex: tctaaacttag m cgccctggg m ca SurKex: tctaaacttag m cgccctggg m ca 图 2-4 B survivin 启动子区 CG 位点甲基化情况 Fig.2-4 B Methylation of CG in survivin promoter

49 上海交通大学博士学位论文 3 讨论基因组 DNA 经亚硫酸氢钠处理后, 单链 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变, 再利用 PCR 技术对目的片段进行扩增, 将尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶 最后, 对 PCR 产物进行克隆再测序 测序结果中只要有 C 显示的, 则提示该位点 C 在原始序列中是甲基化修饰的 Lipofectamine 转染试剂对照组的 10 个克隆插入序列测序结果中无位点出现 C, 一方面说明 NCI-H460 细胞中, 位于 survivin 启动子中的该 14 个 CG 位点的 C 普遍都是无甲基化修饰的 ; 同时也说明亚硫酸氢钠处理是完全的 Random 随机寡核苷酸序列虽然碱基组成上与 SurKex 类似, 但从其 10 个克隆测序结果看,14 个位点都是 T 显示, 结果与 Lipofectamine 对照组一样, 说明随机序列寡核苷酸序列不能使 survivin 启动子特定位点甲基化 SurKex 处理组的 10 个克隆插入序列测序结果中, 有 5 个克隆的测序结果中同一 CG 位点出现了 C, 说明 SurKex 特异性的定点诱导了 NCI-H460 细胞中的 survivin 启动子中该位点的甲基化 这部分的实验共重复三次, 甲基化效率有两次为 50%, 一次为 40%, 可能是转染效率的误差所导致的 因为转染时细胞分散的状态 细胞密度及细胞活力等, 都可能影响到转染效率的差异 第三章 SurKex 对与 survivin 特异结合的组蛋白的共价修饰的影响基因沉默时, 除了 DNA 发生甲基化外, 与特定 DNA 结合的组蛋白, 其一些共价修饰也会发生相应的改变 本部分实验主要考察 SurKex 作用后, 与 survivin 启动子区特异结合的组蛋白 H3 H4 的甲基化和乙酰化修饰的改变情况 1 材料与方法 1.1 材料与主要试剂 SurKex(A m CGGG TCCCG m CGATT CAAAT CT)(MWG-Biotech AG, 德国 ), 随机序列寡核苷酸 Random(ATGCT m CGGAACCTTT m CGVAGGA)(Syngen, 美国 ),

50 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 Opti-MEM 培养基 Lipofectamine2000 转染试剂 胎牛血清 (Invitrogen, 美国 ),2 Taq PCR Master mix( 天根生物技术有限公司, 中国 ), 溴化乙锭 (Ameresco, 美国 ), anti-h3k9me2 (05-685) anti-h3k27me3 (07-499) anti-h4k20me3 (07-463) anti-h3ace (06-599) anti-h4ace (06-598) anti-h4k16ace 抗体 (07-329) 及染色质免疫沉淀试剂盒 (Upstate, 美国 ) 37% 甲醛 ( 上海医药集团, 中国 ) 1.2 主要仪器 SMA3000 微量核酸蛋白分析仪 ( 北京华大基因研究所, 中国 ),PTC-100 PCR 仪 (MJ, 美国 ),Mini-Cell GT 电泳装置 Power Pac 200 电源 (BIO-RAD, 美国 ), BioDoc-It 凝胶成像仪 (ΜVP, 美国 ),HZQ-C 空气浴振荡器 ( 东明医疗仪器, 中国 ), HSS-1B 恒温浴槽 ( 成都仪器, 中国 ),Thermomixer compact(eppendorf, 德国 ), WH-Z 微型旋涡混合仪 ( 沪西分析仪器, 中国 ),5415D 离心机 5417R 低温离心机 (Eppendorf, 德国 ),Soniprep150 细胞超声破碎仪 (MSE, 英国 ) 1.3 细胞培养方法同第二章 转染细胞以 10 5 个 / 孔的浓度接种在 10 cm 培养皿中,37 培养过夜 转染方法及转染浓度同第二章 染色质免疫沉淀分析按照 Upstate 公司的 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit (Catalog:17-371) 进行操作 该部分实验主要分为三部分进行 超声剪切基因组 DNA 本部分实验重点是 DNA 剪切条件的优化 (1) 细胞转染完成并培养 60 小时后, 在培养基中直接加入终浓度为 1% 的福尔马林使 DNA 和与之相互作用的蛋白交联,37 孵育 10 分钟 ( 如在 10 ml 培养基中加入 37% 的福尔马林 270 μl ) ; (2) 加 Glycine( 终浓度为 125 mm, 加 3.75 ml 1M Glycine/25 ml 培养基 ),25,5 分钟, 终止交联反应 ;

51 上海交通大学博士学位论文 (3) 离心后尽可能多地吸弃培养基, 用冰冷的 PBS 洗涤细胞 3-4 次 ; (4)2000 rpm, 4 分钟,4, 收集细胞, 吸弃 PBS, 此时收集的细胞可储存于 -70 冰箱中 ; (5) 预热 SDS 裂解缓冲液 (1%SDS, 5 mm Tris,pH 8.1) 到室温, 以溶解沉淀的 SDS, 然后加入蛋白酶抑制剂 ((1 mm PMSF,1μg/ml 抑蛋白酶肽和 1μg/ml 抑胃酶肽 ), 注意 : 用之前将蛋白酶抑制剂加入,PMSF 在水溶液中的半衰期大约为 30 分钟 ; (6) 用 200 μl SDS 裂解缓冲液重悬细胞沉淀, 冰上孵育 10 分钟 (200 μl SDS 裂解缓冲液是针对 个细胞而言的, 如果细胞多的话, 可适当多加缓冲液, 然后分装成 200 μl 的等份, 以保证每 200 μl buffer 中含有 个细胞 ); (7) 将裂解液超声, 使 DNA 的长度保持在 bp 之间, 保持样品在冰上 ( 注意, 如果超声的条件一旦被优化确定下来, 以后的免疫沉淀实验就采用这个超声条件 ) (8) 加 8µl 5 M NaCl, 65 4 小时以解除蛋白与 DNA 的交联 ; (9) 酚 / 氯仿抽提后琼脂糖凝胶电泳 ( 如 5,10 和 20 µl) 来检测 DNA 的剪切效率 免疫沉淀本部分实验主要是通过各种抗组蛋白抗体的加入, 对交联的蛋白 /DNA 进行免疫沉淀, 富集特异性组蛋白 /DNA- 抗体复合物 如果超声条件优化之后, 超声后进行下面的操作, 对于阴性 / 背景对照, 在下面第 5 步中制备一个不加抗体的免疫沉淀对照样品 (1)4,13000 rpm( 高速 ),10 分钟离心超声的样品 ( 此步包含染色质的上清可以立即冻在液氮中, 然后可在 -70 储存几个月 ); (2)260 nm 测上清的 OD 值, 然后取等量的上清到一个新的 2 ml 的离心管中进行下面的沉淀实验 如果下面要进行 PCR, 此步可以取出一部分样品作为 Input, 对每个进行 PCR 的样品进行定量, 该样品也需要 65 4 小时解除交联 ; (3) 用 ChIP dilution Buffer(0.01 % SDS, 1.1%Trition X-100, 1.2 mm EDTA}, 16.7 mm Tris, ph8.1, 167 mm NaCl, 加蛋白酶抑制剂 ) 将上清稀释 10 倍 (200 µl 上清加 1800 µl ChIP dilution buffer );

52 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 (4) 为了减少非特异性背景, 预先加入 80 µl 蛙鱼精 DNA/ 蛋白 G 琼脂糖 - 50% 匀浆, 4, 摇动 30 分钟 -3 小时 ; (5) 短暂的离心去除琼脂糖沉淀 (4, 1000 rpm, 1 分钟 ), 收集上清 ; (6) 将上述处理后的样品被分为两等份, 一部分加 2.5 µg 抗体,4, 摇动过夜, 另一部分作为没有抗体的对照 ; (7) 加 30µl 鲑鱼精 DNA/ 蛋白 G 琼脂糖 -50% 匀浆,4, 摇动 3 小时, 从而收集抗 体 / 蛋白复合物, 此步也包括没有抗体的对照样品 ; (8) 轻微离心收集琼脂糖 ( rpm,4,1 分钟 ), 小心吸弃含有未结合的非 特异性 DNA 的上清 用下列缓冲液洗蛋白 G 琼脂糖 / 抗体 / 蛋白复合物 5-10 分钟, 每 次 1 ml, 按顺序洗 : A. 低盐免疫复合物洗涤缓冲液 ( 0.1%SDS, 1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mm Tris, ph 8.1, 150 mm NaCl ), 洗一次 ; B. 高盐免疫复合物洗涤缓冲液 (0.1%SDS, 1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mm Tris, ph 8.1, 500 mm NaCl ), 洗一次 ; C. LiCl 免疫复合物洗涤缓冲液 (0.25 M LiCl, 1% NP40, 1% 脱氧胆酸钠,1 mm EDTA, 10 mm Tris, ph 8.0 ), 洗一次 ; D. 1 TE, 洗两次 ; 经过上述处理后的样品为蛋白 G 琼脂糖 / 抗体 / 组蛋白复合物, 这个复合物将 用于 PCR 实验 PCR 扩增结合在免疫沉淀的组蛋白上的 DNA 片段 本部分主要通过洗脱并逆交联蛋白 /DNA- 抗体复合物, 释放出游离 DNA, 然后 进行 PCR 扩增 (1) 制备新鲜的洗脱缓冲液 (1% SDS, 0.1 M NaHCO ); 3 (2) 上面第 8 步所沉淀下来的蛋白 G 琼脂糖 / 抗体 / 蛋白复合物用 250 µl 洗脱缓冲液 将组蛋白复合物与抗体分离 短暂的漩涡混匀, 室温摇动至少 15 分钟, 离心, 小心 将上清部分转移到另一个离心管中, 然后重复洗脱, 将两次洗脱液混在一起, 总体 积约为 500 µl;

53 上海交通大学博士学位论文 (3) 加 20 µl 5 M NaCl, 65, 4 小时, 从而逆交联 这步样品可以储存在 -20, 第二天继续进行 注意 : 逆交联时不要忘了 Input 样品 ; (4) 在洗脱液中加入 10 µl 0.5 M EDTA, 20 µl 1M Tris-HCl, ph 6.5 和 2 µl 10 mg/ml 蛋白酶 K, 45 孵育 1 小时 ; (5) 用 Wizard DNA clean-up system(promega, 美国 ) 试剂盒对上述处理过的基因组 DNA 进行纯化 具体操作参照第二章 1.7 步骤 ; (6) 用水重悬沉淀 ; (7)PCR 扩增 ; (8) 电泳检测 扩增程序及电泳条件参照第二章 结果 ChIP 实验的流程如图 3-1 所示 染色质免疫沉淀实验可以检测与染色质结合的蛋白, 同时还可以检测组蛋白或其它蛋白的修饰, 如乙酰化, 甲基化或磷酸化等, 这些都依赖于所使用的抗体的特异性来达到其相应的目的 在本实验中通过甲醛交联将 DNA- 蛋白 蛋白 - 蛋白以及 RNA- 蛋白之间的相互作用固定于活体状态 然后通过超声将基因组 DNA 剪切为 bp 大小, 根据实验目的选择不同的抗体进行免疫沉淀, 这样不仅与此抗体有特异相互作用的蛋白被沉淀下来, 同时与此蛋白相互作用的 DNA 和其它的蛋白也一同沉淀下来, 经过一系列洗涤和洗脱之后, 蛋白可以利用 Western blot 进行分析 ; 而逆交联解除 DNA- 蛋白之间的相互作用, 以所得到的 DNA 为模板进行 PCR 分析, 由结果可以判断是否存在特定的蛋白与 DNA 发生相互作用

54 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 图 3-1 染色质免疫沉淀实验流程 Fig. 3-1: Experimental procedure of ChIP 2.1 超声条件的确定 甲醛交联后的染色质对限制性酶和 DNase I 高度抵抗, 因此通常使用超声使得染色质断裂 超声波是使用机械力断裂染色质, 容易引起升温或产生泡沫, 这都会引起蛋白质变性, 进而影响 ChIP 的效率 所以在超声波断裂染色质时, 要在冰上进行, 且要设计时断时续的超声程序, 保证低温 总超声时间也不要太长, 以免蛋白降解 打断后的染色质片段的长度主要集中在 bp 左右为宜

55 上海交通大学博士学位论文 我们将甲醛交联后的细胞用 PBS 洗涤, 然后进行一系列不同频率和不同次数的超声剪切, 不同条件剪切后的染色质进行琼脂糖凝胶电泳, 根据电泳结果选择合适的剪切条件 电泳结果见图 3-2 超声的频率和次数如图所示,Marker 是 100 bp ladder, 从上到下每条 marker 的分子量分别为 1500,1000, 900, 800,700,600,500, 400, 300,200 和 100 bp Lane1-3 分别为在不同超声条件下剪切后的核抽提物,Lane 4 为未经超声的核抽提物 我们最终确定了超声次数相对较少 超声条带相对比较集中的 Lane 3 的超声条件, 即超声频率为 70, 超声 3 次, 每次 30 秒, 中间间隔 1 分钟 在以后的实验中, 均采用 Lane 3 的超声条件 Marker 1500 bp 1000 bp 100 bp 超声频率 : 超声次数 : 图 3-2 确定超声条件 Fig. 3-2 Determination of the ultrasound condition 2.2 免疫沉淀实验系统的可靠性验证由于 ChIP 实验操作步骤多, 过程繁琐, 在进行正式实验之前, 有必要先验证一下实验系统的可靠性 实验分为四组 :Lane 1 为不含 DNA 的上清组 (No DNA), 经过免疫沉淀过程, 但不加抗体的对照 Lane 2 为总 DNA 上样组 input( 未经免疫沉淀, 含全部基因组 DNA, 上样量为 10%);Lane 3 为不加抗体的阴性对照组 (No Ab); Lane 4 为加 anti-rna 聚合酶的实验组 (Ab) PCR 扩增产物为 NADPH, 引物由试剂盒提供

56 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 M No DNA input No Ab Ab 图 3-3 免疫沉淀系统的可靠性验证 Fig. 3-3 Reliability validation of the immunoprecipitation system 实验结果如图 3-3 所示 由实验结果可以看出,input 组和 Ab 组有 NADPH 的特异性扩增, 而 No DNA 和 No Ab 组没有特异性扩增 Input 组是总 DNA 上样量对照, 该组有扩增, 说明实验样品中基因组没有问题 No DNA 组既没有样品也没有抗体, 其目的是验证实验过程中所用的各种缓冲液是否污染 该组没有特异性扩增, 证明缓冲液没有被污染, 因此在下面的实验中我们就没有做 No DNA 这一对照组 而 No Ab 是指有样品而没有抗体的对照, 此对照的目的是验证抗体的特异性 该组没有得到特异的扩增条带, 因此可以认为抗体的特异性较强, 并且验证此实验体系可用 接下来的实验我们将采用这个实验体系进行特异性抗体的免疫沉淀 2.3 SurKex 对 H3 H4 特定位点乙酰化 甲基化修饰的影响超声条件确定及实验系统的可靠性验证之后, 我们进行了正式实验 研究表明, 在基因沉默时, 不但 DNA 发生甲基化, 与沉默的基因启动子区特异性结合的组蛋白, 其特定赖氨酸位点的乙酰化 甲基化修饰也会发生相应的改变 所以我们分别加入了抗 H3K9 二甲基化 (H3K9 Me2) 抗 H3K27 三甲基化 (H3K27 Me3) 抗 H4K20 三甲基化 (H4K20 Me3) 抗 H3 乙酰化 (H3K9 K14 Ace) 抗 H4 乙酰化 (H4K5 K8 K12 K16 Ace) 及抗 H4K16 乙酰化 (H4K16 Ace) 的抗体, 想了解 SurKex 对 H3 H4 特定位点乙酰化 甲基化修饰的影响 实验结果见图 3-4 由实验结果可以

57 上海交通大学博士学位论文 看出,SurKex 作用后,survivin 启动子区特异性结合的组蛋白 H3K9 二甲基化 H3K27 三甲基化水平升高,H4 整体乙酰化及 H4K16 乙酰化水平降低, 也即去乙酰化水平 升高, 而对 H4K20 三甲基化和 H3 乙酰化水平没有影响 L R S Input No Ab Anti-H3K9Me2 Ab Anti-H3K27Me3 Ab Anti-H4Ace Ab Anti-H4K16Ace Ab Anti-H4K20Me3 Ab Anti-H3Ace Ab 图 3-4 SurKex 对 survivin 启动子区特异性结合的组蛋白特定位点共价修饰的影响 Fig. 3-4 Effects of SurKex on the covalent modifications of histone, Specifically binding to survivin promoter region 3 讨论研究表明, 组蛋白 H3K9 H3K27 H4K20 甲基化,H3 H4 去乙酰化 ( 特别是 H4K16) 与异染色质形成和基因沉默呈正相关, 所以我们选了这些特异性抗体, 来考察 SurKex 对这些特异性修饰的组蛋白是否有影响 从我们的结果可以看出,SurKex 作用后主要升高了 H3 的甲基化 降低了 H4 乙酰化, 对 H4 甲基化及 H3 乙酰化没有影响 而这些修饰的改变, 与 survivin 沉默也是呈正相关的 综合第二章和第三章的实验结果可知,SurKex 诱导 survivin 沉默时, 不但 survivin 启动子区发生了 CpG 位点特异性的甲基化, 而且与 survivin 启动子区特异性结合的组蛋白, 其特定位点的乙酰化和甲基化修饰也发生了相应的改变 由此可见,DNA 甲基化 组蛋白共价修饰改变共同参与了 survivin 沉默过程 在基因沉默过程中,DNA 甲基化和组蛋白共价修饰改变, 这两个过程是如何彼此协作 控制基因开或关, 更确切地说, 究竟是 DNA 甲基化指导组蛋白共价修饰改变, 还是组蛋白的共价修饰改变指导 DNA 甲基化, 二者哪一个是更上游的事件?

58 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 目前在表观遗传学领域存在着激烈的争论 有研究认为 DNA 甲基化是一个优势事件, 理由是在研究沉默的肿瘤抑制基因重 新激活中, 发现 DNA 甲基化抑制剂如 5-aza-CdR 比 HDAC 抑制剂扮演更重要的角 色 [98] 另外, 还有用 DNA RNA 诱导基因甲基化而引起基因沉默的报道 [50-52,99,100] 这些都支持了 DNA 甲基化是基因沉默的上游事件 [79] 还有的研究认为组蛋白乙酰化 / 去乙酰化是一个上游事件 Ou 等用 HDAC 抑制 剂 TSA 能引起 T24 和 MDA-MB231 细胞基因组整体甲基化水平降低和抑癌基因 P16 的 启动区甲基化水平降低,mRNA 水平升高 Januchowski [78] 等用 TSA 处理淋巴瘤 Jurkat [101] T 细胞 E6-1, 发现 DNMT1 的 mrna 和蛋白表达水平均降低 Wu 等用组蛋白去乙 酰化酶抑制剂 depsipeptide 在多种细胞株上证明组蛋白去乙酰化可以降低 p16 SALL3 及 GATA4 基因启动子区 CpG 和 H3K9 甲基化水平而恢复这些基因的表达 这些实验 结果一定程度上都支持组蛋白乙酰化 / 去乙酰化指导 DNA 甲基化 [102] Smallwood 等最近研究认为组蛋白甲基化是表观遗传调控的上游事件 他们 认为异染色质蛋白 HP1 介导了组蛋白甲基化转移酶 (HMTs) 和 DNA 甲基转移酶 (DNMTs) 之间的对话, 这些酶之间的协同作用, 诱导了基因沉默 他们在体外研 究中发现, 组蛋白甲基转移酶 G9a 引起组蛋白 H3K9 二甲基化后, 为 HP1 提供了一个 合适的结合位点 ;HP1 结合后, 一方面募集更多的 DNMT1, 另一方面又促进了 DNMT1 的酶活性, 升高了 DNA 的甲基化水平, 从而导致基因沉默 由上述争论可以看出, 关于基因沉默过程中, 所参与的这些表观遗传学生化事 件之间的因果关系, 仍是一个 鸡和蛋 的问题, 它们参与调控的先后顺序, 仍有待 于更加深入全面的研究 在接下来的实验中, 我们以 SurKex 作为 survivin 沉默的工 具药, 通过一系列酶的抑制剂, 分别阻断 DNA 甲基化 组蛋白去乙酰化和组蛋白甲 基化, 以此分析它们在 survivin 沉默中的作用, 为表观遗传学的理论研究提供最直接 的实验证据

59 上海交通大学博士学位论文 第四章 DNA 甲基化 组蛋白共价修饰在 survivin 沉默中的作用本章试图详细揭示 DNA 甲基化 组蛋白去乙酰化和甲基化在 survivin 沉默中的关系和发生顺序 本项目通过对 DNA 甲基化诱导剂 SurKex 诱导 survivin 沉默的表观遗传学机理的深入研究, 旨在进一步揭示 DNA 甲基化 组蛋白共价修饰改变在诱导基因沉默过程中, 哪一个是优势事件, 它们之间的因果关系如何, 或者它们之间是如何相互作用的 所以, 研究内容主要分为三个方面 : A. SurKex 转染细胞后, 加入去乙酰化酶抑制剂 TSA, 考察 TSA 能否逆转 SurKex 诱导甲基化的作用 抑制 survivin 基因表达的情况以及组蛋白修饰的一些相应改变, 以明确组蛋白去乙酰化在基因沉默中的作用 B. SurKex 转染细胞后, 加入组蛋白甲基化酶 G9a 的抑制剂 BIX-01294, 考察 BIX 能否逆转 SurKex 诱导甲基化的作用 抑制 survivin 基因表达的情况以及组蛋白修饰的一些相应改变, 以明确组蛋白特殊位点甲基化在基因沉默中的作用 C. SurKex 转染细胞后, 加入 DNA 甲基化酶抑制剂 5-aza-CdR, 考察 5-aza-CdR 能否逆转 SurKex 诱导 survivin 沉默的作用以及 SurKex 甲基化作用被阻断后, 组蛋白的去乙酰化 甲基化修饰还能否发生, 用以明确 SurKex 究竟是直接引起 DNA 甲基化而诱导的沉默, 还是先引起了组蛋白修饰的改变而诱导了基因沉默, 也就是说用以揭示 DNA 甲基化是否是 survivin 基因沉默的先决条件 该部分实验内容可图示如下 :

60 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 1 材料与方法 1.1 材料与主要试剂 β-actin cdna 引物 (5 -gggaa ttcaa aactg gaacg gtgaa gg,3 -ggaag cttat caaag tcctc ggcca ca) survivin cdna 引物 (5 - ctaca ttcaa gaact ggcct,3 - cagct ccttg aagca gaaga a)( 上海鼎安生物科技有限公司, 中国 ) Trizol(Invitrogen, 美国 ),Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H - )Kit(TaKaRa, 日本 ) 5-Aza-CdR TSA(Sigma, 美国 ),BIX-01294( 由上海交通大学药学院傅磊教授实验室合成 ) 5-Aza-CdR 用纯水配成 5 mm 储存液并用针头式滤器过滤,TSA 和 BIX 均用无水乙醇溶解, 并配成 5 mm 的储存液, 分装后于 -80 冻存 其他所用试剂和材料同前二 三章 1.2 主要仪器同前二 三章 1.3 细胞培养同第二章 转染细胞培养好后, 同时铺 24 孔板和 10 cm 培养皿,SurKex 的转染方法和转染浓度同第二章 孔板细胞用于抽提 RNA 和 DNA, 分别进行 RT-PCR 和测序实验, 10 cm 培养皿细胞用于 ChIP 分析 SurKex 转染同时, 分别加入终浓度为 1µM 的 5-Aza-CdR 100 nm 的 TSA 和 5 µm 的 BIX 待转染 12 小时移走转染混合液后, 重新在培养基中加入相应浓度的抑制剂, 再继续培养 48 小时 1.5 RT-PCR RNA 抽提 (1) 向 24 孔细胞培养板中, 每孔加入 0.5 ml Trizol, 室温放置 5 min, 使其充分裂解 (2) 12,000 rpm 离心 5 min, 弃沉淀 (3) 按 200 µl 氯仿 /ml Trizol 加入氯仿, 振荡混匀后室温放置 15 min 注 : 禁用漩涡振荡器, 以免基因组 DNA 断裂

61 上海交通大学博士学位论文 (4) 4 12,000g 离心 15 min 吸取上层水相, 至另一离心管中 注 :1) 千万不要吸取中间界面 2) 若同时提取 DNA 和蛋白质, 则保留下层酚相 存于 4 冰箱, 若只提 RNA, 则弃下层酚相 (5) 按 0.5 ml 异丙醇 /ml Trizol 加入异丙醇混匀, 室温放置 5-10 min (6) 4 12,000g 离心 10 min, 弃上清,RNA 沉于管底 (7) 按 1ml 75% 乙醇 /ml Trizol 加入 75% 乙醇, 温和振荡离心管, 悬浮沉淀 (8) 4 8,000g 离心 5min, 尽量弃上清 (9) 室温晾干 注 :RNA 样品不要过于干燥, 否则很难溶解 (10) 用 50 µl DEPC-H2O 溶解 RNA 样品,55-60, 5-10 min (11) 测 O.D 值定量 RNA 浓度 反转录 按照 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H - )Kit(TaKaRa, 日本 ) 进行, 总 RNA 的使用量为 200 ng 1st-Strand cdna 合成的实验操作方法 : (1) Microtube 管中配制下列模板 RNA/ 引物混合液, 全量 6 μl 试剂名称 使用量 模板 RNA Oligo(dT)12-18 Primer(50 μm) 1 ng~1 μg* 1 μl 或 Random Primers(25 μm) 或 Specific Primer(10 μm) RNase free dh2o up to 6 μl * Total RNA 的使用量一般为 1 ng~1 μg;mrna 的使用量一般为 10 pg~1 μg (2) 70 保温 10 分钟后迅速在冰上急冷 2 分钟以上 (3) 离心数秒钟使模板 RNA/ 引物的变性溶液聚集于 Microtube 管底部

62 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 (4) 在上述 Microtube 管中配制下列反转录反应液 试剂名称 使用量 上述模板 RNA/ 引物变性溶液 5 M-MLV Buffer dntp Mixture( 各 10 mm) RNase Inhibitor(40 U/μl) RTase M-MLV(RNase H )(200 U/μl) RNase free dh2o 6 μl 2 μl 0.5 μl 0.25 μl 0.25 μl~1 μl* up to 10 μl * 当起始模板 RNA 量 >500 ng 时,RTase M-MLV(RNase H ) 的使用量应 >0.25 μl (5) 42 保温 1 小时 * * 以 Random Primers 作为反转录引物时应先进行 30,10 分钟反应, 然后再在 42 条件保温 1 小时 (6) 70 保温 15 分钟后冰上冷却, 得到的 cdna 溶液可直接用于 2nd-Strand cdna 的合成或者 PCR 扩增等,PCR 扩增时 cdna 溶液的使用量建议使用 1 μl~5 μl PCR (1) 按下列组成配制 PCR 反应液, 全量 10 μl 试剂名称 使用量 上述 cdna 溶液 Forward Primer(10 μμ) Reverse Primer(10 μμ) ddh2o 2 Taq PCR MasterMix Total Volume 2 μl 0.5 μl 0.5 μl 2 μl 5 μl 10 μl (2) PCR 反应条件如下 : 94,3 min

63 上海交通大学博士学位论文 94,20 sec 60,20 sec 32 cycles 72,30 sec 72,10 min 电泳 同第二章 Bisulfite sequencing 具体方法参见第二章 ChIP 分析 具体方法参见第三章 结果 2.1 不同抑制剂对 SurKex 抑制 survivin mrna 表达的影响在这部分实验中, 我们应用 DNA 甲基化酶抑制剂 5-Aza-CdR 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 TSA 和组蛋白甲基化酶抑制剂 BIX-01294, 分别阻断 DNA 甲基化 组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化, 通过 RT-PCR 考察它们各自作用被阻断后, 对 survivin mrna 表达的影响 实验结果见图 4-1 图 4-1A 4-1B 和 4-1C 分别表示 5-Aza-CdR TSA 和 BIX 处理后对 SurKex 抑制 survivin mrna 表达的影响 由图 4-1A 可以看出,5-Aza-CdR 单独作用时, 对 survivin mrna 的表达没有影响, 与 PBS 对照组几无差别 ; 而 SurKex 单独作用几乎完全抑制了 survivin mrna 的表达, 与前期实验结果一致 而当 5-Aza-CdR 与 SurKex 同时转染细胞之后,SurKex 抑制 survivin 表达的作用被大大减弱 换言之,5-Aza-CdR 几乎逆转了 SurKex 对 survivin 表达的抑制作用

64 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 PBS SurKex Aza Sur/Aza survivin (144bp) actin (96bp) 图 4-1A 5-Aza-CdR 对 SurKex 抑制 survivin 表达的影响 Fig 4-1A Effect of 5-Aza-CdR on survivin mrna expression inhibited by SurKex 图 4-1B 所示为 TSA 对 SurKex 抑制 survivin mrna 表达的影响 由图 4-1B 可以看出,TSA 组与 PBS 对照组对 survivin mrna 表达没有差别, 说明 TSA 组单独给药对 survivin mrna 表达没有影响 ;SurKex 单独转染, 对 survivin mrna 的表达有很强的抑制作用 ( 与 PBS 对照组比较 ), 这与前期实验结果一致 而当 TSA 与 SurKex 同时转染细胞之后,SurKex 抑制 survivin mrna 表达的作用被大大减弱 换言之, TSA 也在很大程度上逆转了 SurKex 对 survivin 表达的抑制作用 PBS SurKex TSA Sur/TSA survivin (144bp) actin (96bp) 图 4-1B TSA 对 SurKex 抑制 survivin 表达的影响 Fig 4-1B Effect of TSA on survivin mrna expression inhibited by SurKex 图 4-1C 所示为组蛋白甲基化酶 G9a 抑制剂 BIX 对 SurKex 抑制 survivin mrna 表达的影响 由图 4-1C 可以看出,BIX 单独作用时, 对 survivin mrna 的表达没有影响, 与 PBS 对照组几无差别 ; 而 SurKex 单独作用则几乎完全抑制了 survivin mrna 的表达, 与前期实验结果一致 而当 BIX 与 SurKex 同时转染细胞之后,SurKex 抑制 survivin 表达的作用被大大减弱 换言之,BIX 几乎逆转了 SurKex 抑制 survivin mrna 表达的作用

65 上海交通大学博士学位论文 PBS SurKex BIX Sur/BIX survivin (144bp) actin (96bp) 图 4-1C BIX 对 SurKex 抑制 survivin 表达的影响 Fig 4-1C Effect of BIX on survivin mrna expression inhibited by SurKex 2.2 不同抑制剂对 SurKex 诱导 survivin 启动子区特定 CpG 位点甲基化的影响在这部分实验中, 我们应用 DNA 甲基化酶抑制剂 5-Aza-CdR 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 TSA 和组蛋白甲基化酶抑制剂 BIX-01294, 分别阻断 DNA 甲基化 组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化, 通过亚硫酸氢钠测序来考察它们各自作用被阻断后, 对 SurKex 诱导 survivin 启动子区特定 CpG 位点甲基化的影响 图 4-2 为每组菌液 PCR 图 A M M B M M C M M D M M E M M

66 SurKex 诱导 survivin 基因沉默的分子机理研究 F M M G M M 图 4-2 菌液 PCR (A-G 分别为 SurKex,Aza,Sur/Aza,TSA,Sur/TSA,BIX 和 Sur/BIX 组 ) Fig 4-2 PCR electrophoresis of 18 clones for each group (A: SurKex, B: Aza, C: Sur/Aza, D: TSA, E: Sur/TSA, F: BIX, G: Sur/BIX) 我们从 SurKex 组中挑出与标带位置相同的 菌落, 从 Aza 组中挑出与标带位置相同的 菌落, 从 Sur/Aza 中挑出与标带位置相同的 菌落, 从 TSA 组中挑出与标带位置相同的 菌落, 从 Sur/TSA 组中挑出与标带位置相同的 菌落, 从 BIX 组中挑出与标带位置相同的 菌落, 从 Sur/BIX 组中挑出与标带位置相同的 菌落, 经扩大培养后, 送往上海鼎安生物技术公司进行测序 图 4-3 为每组测序结果的统计图 我们以每组 10 个 (SurKex 组为 12 个 ) 正确插入的克隆进行统计, 由图 4-3 可以看出,SurKex 组 12 个克隆有 6 个发生甲基化 ( 甲基化效率为 50%), 三个抑制剂组以及抑制剂与 SurKex 共转染组, 与 PBS 对照组一样,10 个克隆均没有甲基化发生 测序结果表明, 三种抑制剂均逆转了 SurKex 定点诱导 survivin 启动子特定 CpG 发生甲基化的作用

67 上海交通大学博士学位论文 图 4-3 三种抑制剂对 SurKex 诱导 survivin 启动子区特定位点 CpG 甲基化的影响 Fig 4-3 Effects of three inhibitors on site-specific CpG methylation of survivin promoter induced by SurKex 2.3 不同抑制剂对 SurKex 诱导的 survivin 启动子区特异结合的组蛋白共价修饰的影响在这部分实验中, 我们应用 DNA 甲基化酶抑制剂 5-Aza-CdR 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 TSA 和组蛋白甲基化酶抑制剂 BIX-01294, 分别阻断 DNA 甲基化 组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化, 通过 ChIP 分析来考察它们各自作用被阻断后, 与 survivin 启动子区结合的组蛋白, 其共价修饰是否受到相应的影响 实验结果见图 4-4 图 4-4A 4-4B 和 4-4C 分别表示在 5-Aza-CdR TSA 和 BIX 作用下, 对 SurKex 诱导的 survivin 启动子区特异结合的组蛋白共价修饰的影响 由图 4-4 可以看出,SurKex 作用后, 与 survivin 启动子区结合的组蛋白 H3K9 二甲基化 H3K27 三甲基化水平升高, 组蛋白 H4 H4K16 乙酰化水平降低 (SurKex 组 ), 这与前期结果 ( 第三章 ChIP 结果 ) 相一致 ( 图 4-4B 中 PBS 组和 SurKex 组是加样时次序颠倒所致 ); 而 5-Aza-CdR 阻断 DNA 甲基化 (Sur/Aza 组 ) TSA 阻断组蛋白去乙酰化 (Sur/TSA 组 ) 及 BIX 阻断组蛋白甲基化 (Sur/BIX 组 ) 作用后, 均导致 SurKex 作用丧失, 引起组蛋白 H3K9 二甲基化 H3K27 三甲基化水平降低,