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1 基础研究 运动干预对实验性高同型半胱氨酸血症大鼠过氧化及 * 血管内皮功能的影响 王 雁 任爱华 翁秀妹 章淑萍 摘要目的 : 探讨运动干预对实验性高同型半胱氨酸血症 (hyperhomocysteinemia,hhcy) 大鼠过氧化及血管内皮功能的影响 方法 : 将 4 只大鼠随机分为 6 组, 每组各 只 对照组 (n= 只 ) 给予普通饲料喂养 ; 高蛋氨酸组 (n=40 只 ) 在此基础上加 3% 的蛋氨酸, 再根据运动强度分为模型组 叶酸组 HHcy 运动组 ( 低强度组 中强度组 高强度组 ), 只 / 组, 持续 6 周 检测各组大鼠血清同型半胱氨酸 (Hcy) 血浆丙二醛 (MDA) 含量和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX) 超氧化物歧化酶 (SOD) 活性, 测定一氧化氮 (NO) 一氧化氮合酶(NOS) 内皮素 (ET-) 水平 结果 : 干预后 周,HHcy 运动组血清 Hcy 水平明显下降, 且显著低于模型组 (6.09±4.5 vs..±3.μmol/l)(p< 0.05); 干预后 6 周,HHcy 运动组血清 Hcy 水平与对照组无显著性差异 (7.±0.64 vs. 6.63±.27μmol/L)(P> 0.05), 各组血清 Hcy 水平依次为叶酸组 (6.63±.27μmol/L)> 低强度组 (7.62±0.73μmol/L)> 中强度组 (6.9± 0.37μmol/L)> 高强度组 (6.9±0.34μmol/L)(P); 干预后 6 周,HHcy 运动组 MDA 均显著下降,SOD 活力和 GSH-PX 含量明显升高 (P), 中 高强度运动组各过氧化指标与对照组无显著性差异 (P>0.05); 与对照组比较, 干预后 6 周模型组 叶酸组和低强度组 ET- 明显升高 (6.64± ± ±9.09 vs 49.4±.09 pg/ml),nos(.52±2.09.3± ±4.20 vs 33.9±6.67U/ml) NO(.9±0..±0.4.±0.4 vs 2.29± 0.2μg/L) 明显下降 (P), 而中强度组 高强度组中 ET- NOS 与对照组比较, 差异无显著性意义 (P>0.05); HHcy 运动组 叶酸组 NO 均明显高于模型组 (P) 结论 : 高蛋氨酸饮食可诱发大鼠 HHcy, 而中 高强度运动干预有助于降低 HHcy 大鼠血清 Hcy 水平, 改善氧化应激状态, 减轻内皮功能损伤 关键词运动干预 ; 高同型半胱氨酸血症 ; 动脉粥样硬化 ; 过氧化 ; 血管内皮功能中图分类号 :R54.4, R493 文献标识码 :A 文章编号 :00-2(206) Influence of exercise intervention on peroxidation and vascular endothelial function for experimental hy perhomocysteinemia rats/wang Yan, REN Aihua, WENG Xiumei, et al.//chinese Journal of Rehabilita tion Medicine, 206, 3(): Abstract Objective: To explore the influence of exercise intervention on peroxidation and vascular endothelial function for experimental hyperhomocysteinemia (HHcy) rats. Method: Forty- eight male rats were randomly and equally divided into six groups. Control group (n=) was given with ordinary feed. Being fed with 3% methionine on this basis, high methionine group (n=40) was divided into model group, folic acid group, HHcy exercise group (low intensity group, middle intensity group and high intensity group)( rats per group for 6 weeks intervention)according to exercise intensity. Serum homocysteine (Hcy), content of plasma malondialdehyde (MDA), activity of glutathione peroxidase (GSH-PX) and DOI:0.3969/j.issn * 基金项目 : 浙江省自然科学基金资助项目 (LY2H700) 浙江医院心脏康复中心, 杭州灵隐路 2 号,03 作者简介 : 王雁, 女, 硕士, 副主任医师 ; 收稿日期 :

2 206 年, 第 3 卷, 第 期 superoxide dismutase (SOD) were detected, and the level of nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS), endothelin (ET-) was measured. Result: At weeks after intervention, the level of serum Hcy in the HHcy exercise group was significantly reduced, and lower than that in the model group (6.09±4.5 vs..±3.μmol/l) (P). At 6 weeks after intervention, the level had no significant difference when compared with the control group (7.±0.64 vs. 6.63±.27μmol/L) (P>0.05). The level of serum Hcy was in this order: folic acid group (6.63±.27μmol/L) > low intensity group (7.62 ± 0.73μmol/L) > middle intensity group (6.9 ± 0.37μmol/L) > high intensity group (6.9±0.34μmol/L) (P). At 6 weeks after intervention, the content of MDA in the HHcy exercise group was reduced, and activity of SOD and GSH-PX was increased (P). There were no significant difference on the peroxide index between the middle and high intensity group compared with the control group (P> 0.05). Compared with the control group, the level of ET- in the model group, folic acid group and low intensity group was increased (6.64±2.29, 5.6±0.32, 59.±9.09 vs 49.4±.09pg/ml), and the level of NOS (.52±2.09,.3±4.65, 7.0±4.20 vs 33.9±6.67U/ml) and NO (.9±0.,.±0.4,.±0.4 vs 2.29± 0.2μg/L) was reduced (P), while there was no significant difference on the the level of NOS and NO between middle intensity group, high intensity group and control group (P>0.05). The levels of NO in the HHcy exercise group and folic acid group were significantly higher than those in the model group (P). Conclusion: High methionine diet can induce HHcy in rats, and middle and high intensity exercise intervention can reduce the level of serum Hcy, improve oxidative stress state, and reduce the injury of endothelial function. Author's address Dept. of Cardiac Rehabilitation, Zhejiang Hospital, Hangzhou, 03 Key word exercise intervention; hyperhomocysteinemia; atherosclerosis; peroxidation; vascular endothelial function 高同型半胱氨酸血症 (hyperhomocysteinemia, HHcy) 是心血管疾病 (cardiovascular disease, CVD) 的独立危险因素已成为共识, 尽管其具体的致病机制尚未完全阐明, 但 HHcy 的细胞毒性作用导致内皮细胞功能损伤加重, 血管痉挛及血小板活化等一系列反应, 从而诱导动脉粥样硬化 (atherosclorosis, [ 2] AS) 的发生 发展 现有大量研究已证实, 运动有助于通过降低高血压 高血脂等方式改善 CVD 传统危险因子, 从而延缓 AS, 但运动干预对 HHcy 所致血管 AS 的效果的研究仍较少, 且对运动负荷的 [3 4] 选择尚无统一认识 本研究通过建立 HHcy 大鼠模型, 分析运动干预对实验性 HHcy 的疗效, 以及不同运动强度与过氧化反应及内皮功能的关系, 旨在为 HHcy 预防和治疗提供理论依据 材料与方法. 实验动物及分组健康雄性 周龄 Wistar 大鼠 4 只, 清洁级, 体质量 200 0g, 平均 (237.5±2.7)g, 由中国科学院上海实验动物中心提供 习服饲养后 周, 随机分为 2 组 : 正常饮食对照组 ( 对照组, 只 ) 和高蛋氨酸饮食组 ( 高蛋氨酸组 40 只 ).2 建立 HHcy 大鼠模型饲料在制成颗粒以前, 将原料分为两部分, 一部分直接加工成普通饲料, 另一部分按 3% 的比例添加蛋氨酸, 制成颗粒饲料 除对照组外, 高蛋氨酸组大鼠喂饲 3% 高蛋氨酸饲料饮食, 持续 周 周后其血浆 Hcy 浓度达对照组 2 倍以上表明制模成功 40 只 HHcy 大鼠分为模型组 叶酸组 (4mg/kg d 灌胃 ) HHcy 运动组 ( 低强度组 中强度组 高强度组 ) (4mg/kg d 灌胃 ), 只 / 组, 持续 6 周 实验动物操作过程均严格遵照我院动物伦理委员会规程进行.3 运动设备本实验采用动物跑台训练法 动物跑台共有 3 条跑道, 跑道之间用有机玻璃隔开, 跑道长 5cm, 宽.5cm; 跑速范围是 0 70m/min, 数码管显示 ( 最大 9999m), 速度最大为 70m/min; 跑道后有声 光 电刺激装置, 刺激电压 V 可调, 红外线控制发光 发声, 防止大鼠偷懒, 迫使大鼠完成规定的负荷量, 每天由专人在同一时间对大鼠训练 209

3 .4 运动方案 所有 HHcy 大鼠建模成功后进行 3d 的适应性跑 [5] 步训练, 速度 0m/min,0min/d 参照 Bedford 等 方法, 建立低 中 高强度运动跑台运动训练模型, 大 鼠每周训练 5d, 每天训练 次, 每次由专人在同一时 间对大鼠进行训练 见表.4. 低强度组 : 运动速度 0 5m/min, 持续 min, 运动强度 35% 40%VO 2max.4.2 中强度组 : 第 周速度为 5m/min, 时间 min, 每周增加运动强度, 第 周速度为 m/min, 时间 min; 运动强度 64% 76%VO 2max.4.3 高强度组 : 进行大强度间歇跑台训练 第 周速度为 20m/min,min; 每周增加运动强度, 第 周速度为 50m/min, 时间 min; 每次大强度跑 5min, 间歇 5min, 继续依次训练 3 次, 运动强度 > 0%VO 2max.4.4 对照组及模型组 : 正常笼内生活, 不运动.5 检测指标.5. Hcy 和过氧化指标测定 : 各组大鼠安静时眼 眶取血, 采血后置于含 2% EDTA-Na 2 抗凝管中, 00r/min 离心 0min 后留取上层血清置于 -70 冰 实验周期 ( 周 ) 表 大鼠训练负荷安排 跑速 (m/min) 低强度中强度高强度 时间 (min) 低强度中强度高强度 箱保存待检 采用高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography, HPLC) 测定血清 Hcy 浓度, 采用硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛 (malondialdehyde, MDA), 黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD),5,5- 二硫代双 (2- 硝基苯甲酸 )DTNB 法检测谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-PX), 均严格按照试剂盒说明书进行操作.5.2 血管内皮功能测定 : 一氧化氮 (NO) 采用硝酸还原酶法检测 ; 一氧化氮合酶 (NOS) 采用化学比色法检测 ; 内皮素 (endothelin-, ET-) 采用双抗体夹心 ELISA 法检测.6 统计学分析运用 SPSS.0 版统计软件进行数据分析, 组间比较采用重复测量方差分析和 t 检验 2 结果 2. 各组干预前后 Hcy 水平变化干预前, 模型组和 HHcy 运动组血清 Hcy 水平均显著高于对照组 (P), 而模型组和 HHcy 运动组比较, 差异无显著性意义 (P>0.05); 干预后 周 6 周,HHcy 运动组血清 Hcy 水平均较干预前显著降低, 且明显低于模型组 (P); 干预后 6 周,HHcy 运动组血清 Hcy 水平与对照组比较, 差异无显著性意义 (P>0.05) HHcy 运动组内比较, 干预前, 不同运动强度组血清 Hcy 水平比较, 差异均无显著性意义 (P> 0.05); 干预后 6 周, 血清 Hcy 水平依次为叶酸组 > 低强度组 > 中强度组 > 高强度组, 差异均有显著性意义 (P) 见表 各组血清过氧化指标比较 表 2 各组干预前后 Hcy 水平变化 (x±s,μmol/l) 干预前 干预后 周 干预后 6 周 F P 对照组模型组 HHcy 运动组叶酸组低强度组中强度组高强度组 ± ± ± ± ± ± ±4.65 与干预前比较 :P; 与对照组比较 :2P 6.60±.2.± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± >0.05 >

4 206 年, 第 3 卷, 第 期 干预后 6 周, 与对照组比较, 模型组 叶酸组和 低强度组 MDA 明显升高,SOD 及 GSH-PX 明显下 降, 差异均有显著性意义 (P), 而中强度组 高 强度组与对照组之间 MDA 比较, 差异无显著性意 义 (P>0.05) 中强度组 高强度组各过氧化指标均 显著优于模型组 叶酸组及低强度组, 差异均有显著 性意义 (P), 且高强度组 SOD GSH-PX 活性 较中强度组明显增强, 差异均有显著性意义 (P< 0.05) 见表 各组血管内皮功能指标比较 干预后 6 周, 与对照组比较, 模型组 叶酸组和 低强度组 ET- 明显升高,NOS NO 明显下降, 差异 均有显著性意义 (P), 而中强度组 高强度组 中 ET- NOS 与对照组比较, 差异无显著性意义 (P>0.05) 不同运动强度组 叶酸组 NO 比较均无 显著性差异 (P>0.05), 但均明显高于模型组, 差异 有显著性意义 (P) 见表 4 对照组 模型组 叶酸组 低强度组 中强度组 高强度组 3 讨论 表 3 各组血清过氧化指标比较 (x±s) 与对照组比较 :P; 与模型组比较 :2P; 与叶酸组比较 :3P; 与低强度组比较 :4P 对照组 模型组 叶酸组 低强度组 中强度组 高强度组 MDA(nmol/ml) 5.± ± ± ± ± ± SOD(U/L) 39.7± ±5.3.3± ±5.2 GSH-PX(μmol/L) 2.4± ± ± ± ± ± ± ± 表 4 各组血管内皮功能指标比较 (x±s) ET-(pg/ml) 49.4± ± ± ± ± ± NOS(U/ml) 33.9± ±2.09.3± ± ± ± NO(μg/L) 2.29±0.2.9±0..± ± ± ± 与对照组比较 :P; 与模型组比较 :2P; 与叶酸组比较 :3P; 与低强度组比较 :4P 大量研究已证实,HHcy 是 AS 的独立危险因 素, 与 CVD 有密切关系, 可诱导血管内皮细胞炎性 损伤 过氧化及血管平滑肌细胞增殖 [6] 目前对于 HHcy 的防治主要集中于叶酸 维生素等非特异性治疗以促进 Hcy 代谢, 但其对已经形成的 AS 则难以逆转 小剂量叶酸虽然可降低血清 Hcy 水平, 但对 [7] 预防 AS 的进展和并发症无明显作用 运动作为有效预防 AS 的手段之一, 现已在临床实践中广泛应用, 适宜的运动不仅可预防蛋氨酸摄入过量所致 Hcy 升高, 还能改善体内氧化应激水平, 提高抗 AS 的能力, 但何种强度及持续多长时间的运动更有效 [] 尚无统一认识 本研究在建立 HHcy 大鼠模型的基础上, 设置三种不同强度的跑台训练, 并与叶酸治疗比较, 结果显示, 干预 周时,HHcy 运动组血清 Hcy 水平已开始出现明显下降, 且明显低于模型组 (P); 干预后 6 周,HHcy 运动组血清 Hcy 水平基本降至对照组水平 对于不同强度运动干预而言, 血清 Hcy 水平由高到低依次为叶酸组 > 低强度组 > 中强度组 > 高强度组 (P), 说明适宜的运动, 尤其是中高强度的运动可有效预防因蛋氨酸摄入过量所致血浆 Hcy 水平升高, 且其效果优于服用叶酸 目前认为其可能与运动增强 Hcy 代谢有关, 但具体机制仍 [9] 不十分明确 运动过程中, 体内肌酸大量合成, 甲基被大量消耗, 导致 S- 腺苷 - 蛋氨酸向 Hcy 的转换 同时, 中等及以上强度运动降低血浆蛋氨酸水平, 促进内源性蛋氨酸的合成, 当叶酸与 VitB 2 供应充足 [0] 时可减少 Hcy 蓄积 本研究还发现, 经过 6 周的运动干预,HHcy 运动组 MDA 均呈显著下降趋势, 同时抗氧化酶 SOD 活力及 GSH-PX 含量明显升高, 尤其是中 高强度运动使上述过氧化指标基本恢复至对照组水平, 说明中 高强度的有氧运动可改善体内氧化应激状态, 提高抗氧化和氧自由基的清除能力而预防血管内皮损伤 有研究发现, 低运动负荷训练后 MDA SOD 与安静状态比较无显著性差异, 而中等负荷训练则可 [] 明显降低 MDA 含量, 提升 SOD 活力 血管内皮功能异常是 AS 及 CVD 的始动因素, Hcy 可引起内皮功能损伤 血管内皮功能主要由 NO 介导, 后者由 NOS 催化而成,ET- 已被视为血管 [2] 内皮功能具有代表性的指标 本研究中, 运动使各血管内皮功能指标明显改善, 尤其是中高强度有氧运动使 ET- NOS 表达基本接近对照组, 但叶酸 2

5 在调节 ET- NOS 的表达方面效果并不明显, 说明 运动干预有助于改善 HHcy 大鼠的内皮功能, 为防 治 HHcy 所致血管内皮功能障碍提供了一定理论依 [3] 据 Choi JK 等对大鼠进行 6 周跑台运动后, 发现 运动组大鼠主动脉弓内皮细胞 NOS 活性明显提高, 其表达水平也明显高于对照组, 提示适宜的运动训 练可提高内皮 NOS 的活性, 增加 HHcy 状态下内皮 源性 NO 的合成 综上所述, 高蛋氨酸饮食可诱发大鼠 HHcy, 而 运动干预对 HHcy 的治疗效果呈正相关, 中高强度 有氧运动更有助于降低 HHcy 大鼠血清 Hcy 水平, 改善氧化应激状态, 减轻内皮功能损伤 参考文献 [] Tehlivets O. Homocysteine as a risk factor for atherosclerosis: is its conversion to s- adenosyl- L- homocysteine the key to deregulated lipid metabolism?[j]. J Lipids, 20, 23(5):. [2] Antoniades C, Antonopoulos AS, Tousoulis D, et al. Homocysteine and coronary atherosclerosis: from folate fortification to the recent clinical trials[j]. Eur Heart J, 2009, (): 6 5. [3] Joubert LM, Manore MM. The role of physical activity level and B- vitamin status on blood homocysteine levels[j]. Med Sci Sports Exerc, 200, 40(): [4] 钟兴明, 何榕. 运动 高同型半胱氨酸血症与动脉粥样硬化 [J]. 中 国康复医学杂志,20,26(9): 92. [5] Bedford TG, Tipton CM, Wilson NC, et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[j]. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol, 979, 47(6): [6] Zhang D, Fang P, Jiang X, et al. Severe hyperhomocysteinemia promotes bone marrow-derived and resident inflammatory monocyte differentiation and atherosclerosis in LDLr/CBSdeficient mice[j]. Circ Res, 202, (): [7] 李玲, 李新, 王林, 等. 普罗布考联合叶酸 维生素 B2 对高同型半 胱氨酸血症大鼠内皮功能的影响 [J]. 天津医药,203,4(5): [] 钟兴明, 尤少华, 王秀杰, 等. 跑台运动训练对 apoe 基因敲除小鼠 高同型半胱氨酸血症及氧化应激的影响 [J]. 中国康复医学杂志, 20,26(0): [9] Pattyn N, Cornelissen VA, Eshghi SR, et al. The effect of exercise on the cardiovascular risk factors constituting the metabolic syndrome: a meta- analysis of controlled trials[j]. Sports Med, 203, 43(2):2 33. [0] Wong WT, Ng CH, Tsang SY, et al. Relative contribution of individual oxidized components in ox- LDL to inhibition on endothelium- dependent relaxation in rat aorta[j]. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 20, 2(3): [] 周亮, 申伟华, 李香华, 等. 不同强度有氧运动对动脉粥样硬化大 鼠血液 NO 信号及相关因素的影响 [J]. 山东体育学院学报, 2009,(): [2] Li X, Wang X, Guo Y, et al. Regulation of endothelial nitric oxide synthase and asymmetric dimethylarginine by matrine attenuates isoproterenol- induced acute myocardial injury in rats[j]. J Pharm Pharmacol, 202, 64():07. [3] Choi JK, Moon KM, Jung SY, et al. Regular exercise training increases the number of endothelial progenitor cells and decreases homocysteine levels in healthy peripheral blood[j]. Korean J Physiol Pharmacol, 204, (2):

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