3-利用甲基化芯片及转录组测序方法筛选哈萨克族食管癌DNA异常甲基化谱

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1 论利用甲基化芯片及转录组测序方法筛选哈萨克族食管癌 DNA 异常甲基化谱 1,2 2,3 1 陈艳, 邓彦超, 李磊 (1. 新疆医科大学公共卫生学院, 新疆乌鲁木齐 ;2. 新疆食管癌研究所, 新疆乌鲁木齐 ;3. 新疆医科大学第一附属医院, 新疆乌鲁木齐 ) 14 Mar. Vol.26 No.2 Screening aberrant methylation in esophageal squamous cell carcinoma for Kazakhs by methylation chip and transcription group sequencing 1,2 2,3 1 CHEN Yan,DENG Yan-chao,LI Lei (1. Public Health College, Xinjiang Medical University, Urumqi ; 2. Xinjiang Institute for Esophageal Cancer Research, Urumqi ; 3. First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi , Xinjiang, China) 摘要目的 : 筛选新疆哈萨克族食管鳞癌 DNA 异常甲基化谱, 为深入研究食管癌的发生机制提供线索方法 : 采用 Illumina Human Methylation 450K 甲基化芯片, 对 6 例哈萨克族食管癌组织及其癌旁正常组织进行全基因组甲基化检测, 筛选 DNA 异常甲基化基因 ; 利用 Hiseq2000 测序平台, 对 2 例哈萨克族食管癌组织及其癌旁正常组织进行 RNA 水平检测, 建立 mrna 文库, 并与 DNA 甲基化结果进行关联分析, 筛选 DNA 异常甲基化谱, 同时对这些基因进行生物信息学分析结果 : 食管癌组织中含高甲基化基因 227 个, 低甲基化基因 6 个 ; 癌组织 mrna 表达量在 ~8 192, 癌旁正常组织在 ~1 024 DNA 异常甲基化基因与表达谱关联分析, 呈负相关关系 ( 即 DNA 高甲基化 mrna 低表达, 或 DNA 低甲基化 mrna 高表达 ) 的启动子区域基因共 20 个, 包括启动子区域 CpG 岛高甲基化且表达下调 10 个位点 10 个基因, 低甲基化且表达上调 11 个位点 10 个基因生物信息学分析表明这些基因参与甲酰四氢叶酸分解代谢及调控细胞增殖等生物学过程, 涉及一碳代谢通路及诱导细胞凋亡通路等结论 : 初步建立了新疆哈萨克族食管癌 DNA 异常甲基化谱, 为哈萨克族食管癌的发病机制研究提供了新的思路关键词 DNA 甲基化 ; 食管癌 ; 哈萨克族 ; 生物信息学分析中图分类号 :R735.1 文献标志码 : A 文章编号 : X(2014) doi: /j.issn x ABSTRACT OBJECTIVE: To screen the aberrant methylation genes in esophageal squamous cell carcinoma for Kazakh ethnic group in Xinjiang. The aberrant methylation pattern would provide a clue for in-depth study on esophageal squamous cell carcinoma mechanism. METHODS:We used Illumina Human Methylation 450K chip to carry out the genome-wide methylation screening on 6 cancer tissues and 6 adjacent normal tissues of esophageal squamous cell carcinoma in Kazakh people, to explore aberrant the methylation genes. Genome-wide sequencing were carried out on 2 cancer tissues and 2 adjacent normal tissues by Hiseq2000. Meanwhile,mRNA database was established. With the association study between the methylation profile and expression profile,aberrant DNA methylation genes were identifed and were uploaded to the GoMiner and the KEGG database,completing the bioinformatic analysis. RESULTS:There were 227 hypermethylated genes and 6 hypomethylated genes in cancer tissue,mrna expression varied from to in cancer tissues and from to in adjacent normal tissues. The association study indicated that there were 10 loci,10 down-regulated genes hypermethylated in promoter region in the negative group. Additionally,there were 11 loci,10 up-regulated genes in the negative group. Using GoMiner to do GO analysis on aberrant DNA methylation genes,revealed that ALDH1L1 ralated to folinic acid catabolism and CAPN1 was associated with positive regulation of cell proliferation. During pathyway analysis,we found that ALDH1L1 was involved in one carbon metabolism and CAPN 收稿日期 : ; 修订日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 作者简介 : 陈艳 (1970- ), 女, 江苏人, 博士, 教授, 研究方向 : 生化与分子毒理

2 第 26 卷第 2 期 14 3 月论 participated in the apoptosis process. CONCLUSION:The aberrant DNA methylation profiles were estabilsed and provided a clue for further studies on ESCC of Kazakh ethnic group. KEY WORDS DNA methylation;escc;kazakh ethnic group;bioinformmatic analysis 中国是世界上食管癌 (esophageal squamous cell 关联分析建立哈萨克族食管癌患者的异常甲基化谱, [1] carcinoma,escc) 发病率和死亡率最高的国家, 而新疆是我国食管癌高发区之一, 尤以哈萨克族 ( 以下简称哈族 ) 人群死亡率最高 (88.7/10 万 ), 其中托里县哈族死 1 材料与方法亡率高达 155.9/10 万, 远高于同地区其他民族 (22.3/ 1.1 研究对象并为其发病机制研究提供理论依据 [2] 10 万 ) 此外, 哈族食管癌的病死率 (33.90/10 万 ) 比其组织标本来源于新疆医科大学第一附属医院他少数民族高 2~31 倍 ( 苗族 1.09/10 万, 回族 13.14/ 年经临床病理检查确诊的 8 例哈族食管鳞癌 [3] 10 万 ), 比全国平均病死率 (14.59/10 万 ) 高 2.3 倍食管患者, 患者术前均未接受任何化疗或放疗, 每位患者癌的发生是一个多步骤, 多因素参与的复杂的生物学过程, 其分子生物学本质是细胞内遗传调控的紊乱和表观遗传调控 DNA 甲基化是表观遗传学上研究最深取癌组织 ( 病例组 ) 和癌旁正常组织 ( 对照组 ), 每块组织大小为 0.5 cm 0.5 cm, 实验取材均取得患者知情同意标本离体后迅速置于 -196 液氮保存待用入的一种机制, 是在 DNA 甲基化转移酶的作用下, 基 1.2 全基因组甲基化检测因组 CpG 二核苷酸的胞嘧啶 5' 碳原子共价键结合 1 个甲基因组 DNA 的提取采用 QIAamp DNA Mini Kit [4] 基基团如某区域 CpG 序列的密度比平均密度高提取 6 例食管癌组织及癌旁正常组织标本总 DNA, ~20 倍,G+C 含量大于 50%, 其长度大于 200 个碱保存备用基, 这些区域命名为 CpG 岛大约 50% 的人类基因中 DNA 亚硫酸氢盐修饰 DNA 样品采用 DNA 含有 CpG 岛, 常位于基因上游调控区的启动子, 这些基因为管家基因或组织特异表达基因在正常的细胞 CpG 岛甲基化修饰试剂盒 (EZ DNA Methylation Kit) 进行亚硫酸氢钠修饰中 CpG 岛通常是处于非甲基化状态但是, 在癌细胞全基因组扩增片段化以及纯化亚硫酸盐处中, 肿瘤相关基因启动子的这些区域发生了高甲基化, 这个现象被认为是肿瘤发生过程中最为重要的表 [5] 观遗传学改变理后, 每个样本进行碱变性 - 全基因组的扩增 (whole- genome amplified,wga), 并且进行酶切片段化片段化后的样本用 PCR 纯化试剂盒进行纯化 DNA 甲基化在基因表达调控中扮演着重要角色, 杂交 DNA 经亚硫酸盐处理扩增片段化及是一种复制后调节方式, 可控制基因表达维持机体正常发育控制染色体完整性控制基因重组和维持纯化后, 直接应用于芯片在杂交过程中,WGA- DNA 分子与芯片微珠上位点特异性的 DNA 探针进行退 [6-7] 基因组结构稳定性近年研究发现, 在多种人类肿火每个 CpG 位点对应两个微珠类型, 一个对应甲基瘤基因组中, 广泛的低甲基化和部分区域的高甲基化共存是 DNA 甲基化水平的特征 5 端 CpG 岛甲基化致抑癌基因失活是引起细胞恶性转化的重要步骤食管 [8] [9] 癌的发生发展与一些基因如 p16 FHIT RASSF1A [10] [11] [12] 化 (C) 状态, 另一个对应未甲基化 (T) 状态利用 DNP- 生物素标记的 ddntp 进行单碱基的延伸, 以实现位点特异性的引物退火延伸后, 芯片进行荧光染色扫描, 检测 PTEN hmlh1 等基因启动子甲基化频率升高 1.3 转录组文库建立有关然而, 这些研究大多相互独立且仅涉及几个特采用 Trizol RNA 提取试剂盒提取 2 例癌组织及癌旁定基因的异常甲基化分析, 未在全基因组水平上做过正常组织 RNA mrna 纯化, 片段化, 逆转录, 分析另外, 由于基因组部分区域的高甲基化特别是 dscdna 合成末端补平, 加接头进行 PCR 扩增, 扩抑癌基因高甲基化与 mrna 低表达基因沉默, 癌基增条件如下 :98 30 s;15 个循环 s,60 因或原癌基因低表达与 mrna 高表达基因激活密切相关因此, 本研究通过甲基化芯片技术以及 Hiseq 30 s,72 30 s;72 5 min;4 保存割胶纯化 (250~ 350 bp),qiagen 回收试剂盒纯化采用 2000 测序平台, 检测哈萨克族食管癌组织及癌旁正常 Illumina cbot 进行簇生成 (cbot),illumina Hiseq2000 进行组织中全基因组甲基化状态 mrna 表达水平, 通过测序 0 9 5

论 1.4 统计学方法甲基化数据导入 Genome Studio Methylation Module v1.

ontology) 分析采用 GoMiner 数据库, 通路分析采用 KEGG 数据库 14 Mar. Vol.26 No.2 2 结果 2.1 DNA 甲基化检测结果 2.1.1 芯片灰度扫描分析使用 iscan 软件对芯片进行灰度扫描, 结果表明, 芯片成像完整, 无高信号和低信号的团块和划痕说明芯片的杂交, 洗涤, 扫描步 1~6 列为病例组,7~12 列为对照组 ; 每行代表 1 个 DMR 甲基化位点.

2 转录组检测结果指标, 取值范围为 [0,1] 对 DMR 甲基位点的 β 值聚 2.2.1 RNA 质检电泳结果结果发现所有样本均未出类分析发现, 病例组中存在较多高甲基化位点, 而对现降解或总量不足的情况, 能够满足 cdna 文库建立的照组中存在较多低甲基化位点, 见图 1 条件采用特定引物分别对 4 例样本进行扩增, 扩增的 2.1.3 甲基化差异分析全基因组中存在差异甲基化条带大小均清晰可见 ( 图略 ) 位点 2 674 个, 高甲基化差异位点多数存在于病例组 2.

3 论 1.4 统计学方法甲基化数据导入 Genome Studio Methylation Module v1.8 软件中进行数据分析, 采用层次聚类算法 (hierarchical clustering) 对差异甲基化区域 (differential methylation regions,dmr) 甲基化位点进行聚类分析转录组数据采用 Illumina Hiseq2000 测序平台进行数据分析 DNA 异常甲基化基因与表达谱关联分析采用 Pearson 相关性检验生物信息学分析, GO(gene ontology) 分析采用 GoMiner 数据库, 通路分析采用 KEGG 数据库 14 Mar. Vol.26 No.2 2 结果 2.1 DNA 甲基化检测结果芯片灰度扫描分析使用 iscan 软件对芯片进行灰度扫描, 结果表明, 芯片成像完整, 无高信号和低信号的团块和划痕说明芯片的杂交, 洗涤, 扫描步 1~6 列为病例组,7~12 列为对照组 ; 每行代表 1 个 DMR 甲基化位点. 蓝色 : 完全甲基化 ; 黄色 : 完全非甲基化. 图 1 样本和 DMR 甲基化位点聚类分析骤质量控制良好 ( 图略 ) 聚类分析 Illumina 甲基化芯片扫描并计算分验矫正后, 共筛选出差异显的 DNA 甲基化基因析给出的 β 值, 表示甲基化探针相对非甲基化探针信 TBC1D24 NFATC1 SLC5A10 等 40 个 ( 表略 ) 号的比率, 可作为衡量样本各 CpG 位点甲基化程度的 2.2 转录组检测结果指标, 取值范围为 [0,1] 对 DMR 甲基位点的 β 值聚 RNA 质检电泳结果结果发现所有样本均未出类分析发现, 病例组中存在较多高甲基化位点, 而对现降解或总量不足的情况, 能够满足 cdna 文库建立的照组中存在较多低甲基化位点, 见图 1 条件采用特定引物分别对 4 例样本进行扩增, 扩增的甲基化差异分析全基因组中存在差异甲基化条带大小均清晰可见 ( 图略 ) 位点个, 高甲基化差异位点多数存在于病例组差异表达分析结果采用负伯努利分布来对重中, 共个位点 ( χ =1 068, P< ),227 个基复样本的片段数目变异进行建模经过多重假设检验因 ( χ = 1 050,P< ); 低甲基化位点多存在于校正, 发现差异表达的基因共个癌组织中对照组中, 共 127 个位点 ( χ = 328.5,P< ), RNA 表达量为 ~8 192, 癌旁正常组织表达量为 6 个基因 ( χ = 339.9,P< ) 后经多重假设检 ~1 024, 见图 2 癌旁组织 -log2(frkm) 癌旁组织 -log2(frkm) 癌组织 -log2(fpkm) 癌组织 -log2(fpkm) 图 2 差异显基因和异构体表达值分布对比图 2.3 DNA 异常甲基化基因与表达谱关联分析 DNA 甲基化基因 - 基因表达谱关联性分析主要是针对差异 DMR 与上下游基因表达差异情况的关联性所进行的分析将 DNA 甲基化基因 - 表达谱关联性分为 0 9 6

4 第 26 卷第 2 期 14 论 3 月正相关组和负相关组, 正相关组表示 DNA 高甲基化或低甲基化水平分别对应上下游临近基因表达谱上调或下调的改变 ; 相反的, 负相关组表示 DNA 高甲基化或低甲基化水平分别对应上下游临近基因表达谱下调或上调的改变由于 DNA 甲基化与 mrna 表达的负相关关系在甲基化与疾病的研究中有重要意义, 所以在结果中只列出负相关关系的结果结果表明, 负相关组中甲基化水平差异与靶基因表达差异性的关联性呈显 -16 负相关 ( 图 3), 相关系数 r= ,p< 在启动子区域发生高甲基化且表达下调有 10 个位点, 10 个基因 ( 表 1); 病例组中低甲基化且表达上调有 11 个位点,10 个基因 ( 表 2) log(case/control)-expression Level log(case/control)-methylation 图 3 负关联组甲基化 - 表达谱关联水平分布图表 1 在病例组中呈高甲基化且表达下调的基因和位点甲基化状态表达情况基因 mrna Loci β P log2(case/control) P RAPGEFL NM_ chr17: ALDH1L NM_ chr3: KIAA NM_ chr1: TP53AIP NM_ chr11: TRIM NM_ chr11: LRRFIP NM_ chr2: PAX NM_ chr14: DUOXA NM_ chr15: CAPN NM_ chr11: HSPB NM_ chr19: 表 2 在病例组中呈低基化且表过上调的基因和位点基因甲基化状态表达情况 mrna Loci β P log2(case/control) P ADAMTS NM_ chr5: ATP10A NM_ chr15: DCHS NM_ chr11: RASA NM_ chr13: GNA NM_ chr7: CECR NM_ chr22: BAI NM_ chr8: COL23A NM_ chr5: FRMD4A NM_ chr10: NID NM_ chr14: FRMD4A NM_ chr10: 生物信息学分析结果 DUOXA2 基因未参与已知的生物学过程, 见表生物学功能分析结果利用 GoMiner 数据库对信号通路分析采用 KEGG 数据库对负关联组负关联组中的 DNA 异常甲基化基因进行 GO 分析, 结果中 DNA 异常甲基化基因进行信号通路分析发现, 表达发现, 多数基因参与分子功能, 代谢过程, 细胞组成下调组即 DNA 高甲基化低表达组中 ALDH1L1 基因参等多个生物过程如 ALDH1L1 基因主要参与甲酰四氢与一碳化合物分解代谢信号通路, 见图 4 CAPN1 基叶酸分解代谢等生物学过程,LRRFIP1 基因主要参与因参与细胞凋亡, 内质网蛋白加工等信号通路, 见图负调控转录等生物学过程,CAPN1 基因主要参与蛋白 5 表达上调组即低甲基化高表达组中未发现基因水解等生物学过程 RAPGEFL1,TP53AIP1,KIAA1522, 参与任何已知信号通路 0 9 7

5 论表 3 DNA 异常甲基化基因参与的主要生物过程基因生物过程 RAPGEFL1 ALDH1L1 甲酰四氢叶酸分解代谢一碳化合物分解代谢辅助因子结合生物合成 KIAA1522 TP53AIP1 TRIM29 调节蛋白负调节 Wnt 信号通路细胞骨架结合蛋白 LRRFIP1 双链 RNA 结合 RNA 聚合酶 II 转录因子转录抑制因子负调控转录 PAX9 发育齿质发育不全少牙畸形细胞核 DUOXA2 CAPN1 细胞质合成合成钙蛋白酶正调控细胞增殖钙离子结合 HSPB6 应答未折叠蛋白结合蛋白眼晶状体蛋白折叠 ADAMTS16 胞外基质金属内肽酶金属离子结合蛋白水解 ATP10A 阳离子运输调控细胞形状膜 ATP 酶 DCHS1 钙依赖细胞附着融源细胞附着蛋白结合钙离子结合 RASA3 结合蛋白 GTP 酶激活因子细胞内信号转导级联 GNA12 信号转导因子 G 蛋白偶联受体蛋白信号转导途径信号转导 GTP 酶 CECR2 分子复合膜泡介导运输胞质分裂 BAI1 周围神经系统发育细胞间连接融入质膜 G 蛋白偶联受体 COL23A1 磷酸运输细胞质 FRMD4A 细胞质结合蛋白细胞骨架蛋白结合 NID2 基底膜结合蛋白胶原结合细胞附着 14 Mar. Vol.26 No.2 ALDH1L1 CAPN1 图 4 一碳化合物分解代谢通路图图 5 细胞凋亡信号通路图 3 讨论 450K 磁珠芯片, 该芯片是近年发展的用于分析 DNA 甲近年来发展起来的微阵列 (microarray) 技术, 即基基化的新手段该芯片具有以下特点 :1 操作流程简 [13] 因芯片技术, 应用于特定基因甲基化分析该技术单, 无需繁锁的免疫共沉淀的过程 ;2 直接检测到发以一种系统整体的方法进行研究, 打破了一种疾生甲基化的准确位点 ;3 通量高, 一次可检测 12 个以病一种基因的陈旧模式, 整体宏观的研究生物体上的样品基因的表达及功能其方法包括 DNA 样本的亚硫酸氢此次实验 mrna 文库采用 Illumina 公司 HiSeq2000 测钠处理, 特异性 PCR, 样本在芯片上点样和最后的统序平台建立 HiSeq2000 具有超高通量高灵敏度高计分析方法方便快捷高效自动化程度高, 可精确率广泛的应用领域的特点它的出现突破了转同时对多个基因以至于基因组不同 CpG 位点的甲基化录文库建立难耗时长的瓶颈, 能够快速的建立转录水平进行定量分析应用芯片的高通量检测基因组甲组文库运用 DNA 异常甲基化基因联合表达谱关联分基化, 会大大加速甲基化研究发展, 提升研究效率, 析的方法能够提高所筛选基因的准确性, 降低芯片技并很有可能发展成人类疾病诊断预防和治疗的有效术所带来的假阳性率将 DNA 异常甲基化基因与表达工具此次实验采用 Illumina s Infinium Methylation 谱关联分析所筛选出的基因异常甲基化而表达下调的 0 9 8

6 第 26 卷第 2 期基因, 在 mrna 水平上进行验证并进一步进行肿瘤抑业科学,2007,35(20): 制基因功能验证的方案已在多种肿瘤表观遗传学研究 [5] 吕斌斌, 彭剑雄. DNA 甲基化与基因沉默及肿瘤 [J]. 国际检 [14] 中得到运用周晓莹等通过鼻咽癌异常甲基化基因验医学杂志,2006,27(1):524. 与表达谱的关联分析, 得出鼻咽癌甲基化谱 ;2006 年 [6] Salozhin S,Prokhorchuk E,Georgiev G. Methylation of DNA- [15] one of the major epigenetic markers[j]. Biochemistry:Moscow, Ibanez 等运用此方法筛选出肾细胞癌 DNA 异常甲基化 2005,70(5): [16] 谱, 同年 Dannenberg 等也运用此方法发现了肝癌 [7] Santos K,Mazzola T,Carvalho H. The prima donna of DNA 的异常甲基化谱但在食管癌的表观遗传学研究 epigenetics:the regulation of gene expression by DNA 中尚无关于 DNA 异常甲基化谱的报道 methylation[j]. Braz J Med Biol Res,2005,38(10):1531- 癌症的发生与细胞间信号转导细胞周期调控细胞凋亡等过程有关此次研究对哈萨克族食管癌 [8] 余炜伟, 王立东, 齐义军, 等. 食管鳞癌组织中 p16 基因缺 DNA 异常甲基化谱中的 20 个基因进行了 GO 分析发现, 失及甲基化检测 [J]. 郑州大学学报 : 医学版, 2006, 多个基因参与细胞凋亡信号转导代谢调控等多个 41(2): 生物学过程 ALDH1L1 基因主要参与甲酰四氢叶酸分 [9] Lee EJ,Lee BB,Kim JW,et al. Aberrant methylation of [17] fragile histidine triad gene is associated with poor prognosis in 解代谢, 一碳化合物分解代谢, 辅助因子结合, 生 early stage esophageal squamous cell carcinoma[j]. Eur J 物合成等生物学过程 ;LRRFIP1 基因主要参与负调控 Cancer,2006,42(7): 转录, 调控转录 RNA 聚合酶 Ⅱ 启动子, 双链 RNA 结 [10] 丛德刚, 王胜发. 食管癌组织 RASSF1A 基因启动子区甲基合, RNA 聚合酶 Ⅱ 转录抑制因子等生物学过程 ; 化检测及其临床意义 [J]. 中华医学杂志,2008,87(41): CAPN1 主要参与蛋白水解, 正调控细胞增殖, 钙蛋白酶等生物学过程 [11] 葛晖. P73,PTEN 基因多态性及其启动子区 CpG 岛高甲采用 KEGG 数据库对 DNA 异常甲基化谱中基因进基化与食管癌生物学行为的相关性研究 [D]. 石家庄 : 河北行通路分析, 发现涉及与信号通路相关的基因有 2 个医科大学,2007: 即 ALDH1L1 和 CAPN1 ALDH1L1 参与一碳代谢过程 [12] Vasavi M,Ponnala S,Gujjari K,et al. DNA methylation in esophageal diseases including cancer:special reference to 一碳代谢过程在 DNA 甲基化中起着关键作用, 在叶酸 hmlh1 gene promoter status[j]. Tumori,2006,92(2):155- 缺乏的情况下, 其主要循环形式 5- 甲基 - 四氢叶酸水 162. 平低下, 这样会导致半胱氨酸向甲硫氨酸转化效率降 [13] Adorj NP,Distler J,Lipscher E,et al. Tumour class 低, 使得可用的 S- 腺苷甲硫氨酸很快消耗完毕, 导致 prediction and discovery by microarray-based DNA methylation [18] 甲基集团供应不足, 出现 DNA 低甲基化 CAPN1 在 analysis[j]. Nucleic Acids Res,2002,30(5): 细胞凋亡过程中起作用目前已经发现细胞凋亡通路 [14] 周晓莹. 鼻咽癌甲基化谱的建立 [D]. 南宁 : 广西医科大学, 有 3 条主要的信号通路 : 线粒体信号通路, 死亡受体 2009:254. 通路和内质网通路在动物细胞中, 线粒体通路最为 [15] Ibanezde C,Dulaimi E,Hoffman AM,et al. Identification of 普遍, 钙离子浓度的升高参与了凋亡早期信号转导和 novel target genes by an epigenetic reactivation screen of renal [19] cancer[j]. Cancer Res,2006,66(10): 凋亡的执行阶段这些研究结果为深入研究哈萨克 [16] Dannenberg L,Edenberg H. Epigenetics of gene expression in 族食管癌的发生机制提供了新的研究方向 human hepatoma cells:expression profiling the response to 参考文献 [1] 赵凤娟, 云妙英, 张严, 等. 新疆哈萨克族食管癌研究进展 [J]. 中央民族大学学报 : 自然科学版,2009,18(3): [2] 陈湘川, 庞丽娟, 李锋. 新疆哈萨克族食管癌研究进展 [J]. 农垦医学,2007,28(5): [3] 刘玲, 张景萍, 李卉, 等. 哈萨克族食管癌中 cdc42 启动子区 CpG 岛及全基因共构建真核表达载体 [J]. 新疆医科大学学报,2010,33(7): [4] 白丽荣, 时丽冉. 表观遗传学及其相关研究进展 [J]. 安徽农 14 3 月 inhibition of DNA methylation and histone deacetylation[j]. BMC Genomics,2006,7(1): [17] Hoeferlin LA,Oleinik NV,Krupenko NI,et al. Activation of p21-dependent g1/g2 arrest in the absence of DNA damage as an antiapoptotic response to metabolic stress[j]. Genes & Cancer,2011,2(9): [18] 张朋, 王少康, 孙桂菊. 食物, 营养与食管癌关系的研究进展 [J]. 肿瘤,2011,31(8): [19] 唐海林, 苏琦. 钙离子信号与细胞凋亡关系的研究进展论 [J]. 南华大学学报 : 医学版,2008,34(5):

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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