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1 2013 年 8 月 Vol. 31 No. 8 August 2013 Chinese Journal of Chromatography 724 ~ 728 研究论文 DOI: / SP. J 超高效液相色谱串联质谱法测定鸡肉中的利巴韦林和金刚烷胺云环 ꎬ 崔凤云 ꎬ 严华 ꎬ 刘鑫 ꎬ 何悦 ꎬ 张朝晖 ( 北京出入境检验检疫局技术中心 ꎬ 北京 ) 摘要 : 建立了超高效液相色谱串联质谱 (UPLC MS / MS) 同时测定鸡肉中利巴韦林和金刚烷胺的分析方法 ꎮ 样品用 1% ( 体积分数 ) 三氯乙酸溶液乙腈 (1 1ꎬ v / v) 溶液提取 ꎬ 经 Supelco LC SCX 固相萃取柱净化后用 Acquity UP LC BEH Hillic 柱 (150 mm 2 1 mmꎬ 1 7 μm) 分离 ꎬ 以甲醇和 0 1% ( 体积分数 ) 甲酸作为流动相进行梯度洗脱 ꎬ 电喷雾正离子 (ESI + ) 模式电离 ꎬ 多反应监测 ( MRM) 模式进行检测 ꎮ 结果表明 ꎬ 利巴韦林和金刚烷胺在 10 0 ~ μg / L 范围内线性关系良好 (r )ꎮ 方法的定量限 ( 信噪比为 10) 为 4 0 μg / kgꎬ 在 μg / kg 添加水平的回收率为 78% ~ 102 5%ꎬ 相对标准偏差 ( n = 6) 在 2 2% ~ 7 6% 之间 ꎮ 该方法快速灵敏准确 ꎬ 适合于鸡肉中利巴韦林和金刚烷胺的同时快速高灵敏度的分析检测 ꎮ 关键词 : 超高效液相色谱串联质谱 ꎻ 利巴韦林 ꎻ 金刚烷胺 ꎻ 鸡肉中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2013) Determination of ribavirin and amantadine in chicken by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry YUN Huan ꎬ CUI Fengyunꎬ YAN Huaꎬ LIU Xinꎬ HE Yueꎬ ZHANG Zhaohui (Technology Center of Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureauꎬ Beijing ꎬ China) Abstract: A method for the determination of ribavirin and amantadine in chicken has been developed by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( UPLC MS / MS). After extracted by 1% ( volume percentage) trichloroacetic acid solution acetonitrile (1 1ꎬ v / v) and purified by a Supelco LC SCX cartridgeꎬ the samples were loaded onto an Acquity UPLC BEH Hillic column (150 mm 2 1 mmꎬ 1 7 μm)and separated with gradient elu tion. The electrospray was operated in the positive mode and the samples were monitored by the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The limits of quantification (LOQsꎬ S / N = 10) of ribavirin and amantadine were 4 0 μg / kg. The calibration curves showed good linearity in the range of μg / Lꎬ and the correlation coefficients (r 2 ) were not lower than When the spiked levels were 4 0ꎬ 8 0 and 20 0 μg / kgꎬ the recoveries of ribavirin and amanta dine in chicken ranged from 78% to 102 5%ꎬ with the relative standard deviations ( RSDs) of 2 2% - 7 6%. The results indicate that the method is simpleꎬ rapidꎬ sensitive and suitable for the qualitative and quantitative analyses of ribavirin and amantadine in chicken samples. Key words: ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( UPLC MS / MS) ꎻ ribavirinꎻ amantadineꎻ chicken 2012 年 12 月我国爆发速生鸡事件 ꎬ 曝光鸡在饲养过程中被违规喂食利巴韦林金刚烷胺等抗病毒药物 ꎮ 违禁抗病毒药物的滥用不仅造成鸡肉风味和品质的下降 ꎬ 更会导致细菌耐药性的发生和药物残留 ꎬ 并通过食物链影响人类健康和破坏生态平衡 ꎬ 造成严重不良后果 ꎮ 美国食品药物管理局 (FDA) 早于 2005 年就禁止将人类抗病毒药物用于畜禽类 ꎻ 我国农业部公告第 560 号中也明确规定抗病毒药物为禁用兽药 ꎮ 测定利巴韦林的方法主要有放射免疫法 [1] 气通讯联系人. Tel:(010) ꎬE mail:yunh@ bjciq. gov. cn. 基金项目 : 国家质检总局科研项目 (2013IK146). 收稿日期 :

2 第 8 期云环 ꎬ 等 : 超高效液相色谱串联质谱法测定鸡肉中的利巴韦林和金刚烷胺 725 相色谱质谱法 [2] 液相色谱法 [3-5] 液相色谱质谱 [6-9] 法等 ꎻ 目前我国测定肉类制品中金刚烷胺的相 [10] 关报道很少 ꎬ 且集中在液相色谱法和气相色谱法 [11] [12ꎬ13] ꎬ 仅有 2 篇文献采用了液相色谱串联质谱法 ꎮ HPLC 法灵敏度较低且无法提供结构信息 ꎻ GC MS 法需衍生后气化 ꎬ 样品处理方法复杂 ꎮ 液相色谱串联质谱法可提供待测物的结构信息 ꎬ 具有较高的灵敏度和选择性 ꎬ 是同时测定上述两种组分的理想方法 ꎮ 本文利用三氯乙酸乙腈作提取液 ꎬ 同时充分利用其能使蛋白质变性的作用 ꎬ 实现提取净化同时完成 ꎮ 样品中的利巴韦林和金刚烷胺经三氯乙酸乙腈溶液提取和 Supelco LC SCX 小柱净化后 ꎬ 采用 BEH Hillic 色谱柱进行分离 ꎬ 液相色谱质谱联用仪检测 ꎮ 该方法和现有文献报道方法相比更为简便快速 ꎬ 能同时测定两个组分 ꎬ 极大地节省了检测时间和成本 ꎬ 对鸡肉中两种药物成分的实际测定结果验证了该方法的高灵敏度和可靠性 ꎬ 结果令人满意 ꎮ 1 实验部分 1. 1 仪器与试剂 UPLC Xevo TQ MS 型超高效液相色谱串联质谱仪 ( 美国 Waters 公司 )ꎻ Milli Q 超纯水系统 ( 美国 Millipore 公司 )ꎻ 微孔滤膜 (0 20 μmꎬ 美国 Pall 公司 )ꎻ 超声波清洗器 ( 江苏昆山超声仪器有限公司 )ꎻ 小型高速离心机 ( 德国 Sigma 公司 )ꎻ Aspecxl 多通道固相萃取仪 ( 法国 Gilson 公司 )ꎻ Supelco LC SCX 固相萃取小柱 (3 mlꎬ 美国 Supelco 公司 )ꎮ 利巴韦林标准品 (25 mgꎬ 中国药品生物制品检定所 )ꎻ 金刚烷胺标准品 ( 纯度 99%ꎬ 德国 Dr. Eh renstorfer 公司 )ꎻ 三氯乙酸氨水 ( 色谱级 ꎬ 美国 TEDIA 公司 )ꎻ 乙腈甲醇 ( 色谱纯 ꎬ 美国 Fisher 公司 )ꎻ 实验用水均由 Milli Q 超纯水系统制备 ꎮ 1. 2 标准溶液的配制标准储备液 : 分别准确称取利巴韦林和金刚烷胺 10 mg 于 10 ml 容量瓶中 ꎬ 用甲醇溶解并定容 ꎬ 得质量浓度为 1 g / L 的标准储备液 ꎬ 于 - 18 下避光存储 ꎮ 混合标准中间液 : 分别取上述标准储备液各 1 mlꎬ 用甲醇水 (1 1ꎬ v / v) 溶液配制成质量浓度为 10 mg / L 的标准中间溶液 ꎬ 于 4 下避光存储 ꎮ 1. 3 UPLC MS 分析条件 UPLC 条件色谱柱 :Acquity UPLC BEH Hillic 色谱柱 (150 mm 2 1 mmꎬ 1 7 μmꎻ 美国 Waters 公司 )ꎮ 流动相 A 为 0 1% ( 如无特殊说明均为体积分数 ) 甲酸溶液 ꎬ 流动相 B 为甲醇 ꎮ 梯度洗脱程序 :0 ~ 1 0 minꎬ 20% A ~ 80% Aꎻ 1 0 ~ 2 0 minꎬ 80% Aꎻ 2 0 ~ 2 1 minꎬ 80% A ~ 20% Aꎻ 2 1 ~ 3 0 minꎬ 20% Aꎮ 流速 0 3 ml / minꎻ 柱温 35 ꎻ 进样体积 5 0 μlꎮ MS / MS 条件电喷雾离子源正离子模式 (ESI + )ꎻ 检测方式 : 多反应监测 (MRM)ꎻ 电喷雾电压 :3 6 kvꎻ 雾化气温度 :400 ꎻ 滞留时间 :0 202 sꎻ 监测离子对锥孔电压和碰撞能量等参数见表 1ꎮ 表 1 利巴韦林和金刚烷胺的多反应监测质谱参数 Table 1 MS parameters in multiple reaction monitoring ( MRM) mode for ribavirin and amantadine Analyte Precursor ion (m / z) Daughter ion (m / z) Cone voltage / V Collision energy / ev Ribavirin Amantadine Quantitative ion 样品提取和净化称取 5 00 g 鸡肉样品于 50 ml 离心管中 ꎬ 加入 10 ml 1% 三氯乙酸溶液乙腈溶液 (1 1ꎬ v / v)ꎬ 充分漩涡混匀 ꎬ 超声提取 30 minꎮ 于 r / min 高速离心 10 minꎬ 取上清液加载至已依次用 3 ml 甲醇 4 ml 0 1% 甲酸溶液活化过的 SCX 柱中 ꎬ5 ml 5% 氨水甲醇溶液洗脱 ꎮ 收集洗脱液用氮气吹干 ꎬ1 ml 5% 氨水甲醇溶液溶解定容 ꎮ 过 0 2 μm 微孔滤膜 ꎬ 滤液供 UPLC MS / MS 分析 ꎮ 2 结果与讨论 2. 1 提取和净化条件的选择和优化提取溶剂的选择 Fig. 1 由化学结构式可知利巴韦林与金刚烷胺均属极性化合物 ( 见图 1)ꎬ 在纯有机溶剂中溶解度较小 ꎬ 一般选用稀酸溶液有机溶剂水的混合溶液极性较强的有机溶剂或缓冲溶液作提取溶液 ꎮ 本实验对比了乙腈甲醇甲酸乙腈甲酸甲醇三氯乙酸乙腈三氯乙酸甲醇等提取溶液 ꎬ 发现选用 1% 三氯图 1 利巴韦林和金刚烷胺的化学结构式 Chemical structures of ribavirin and amantadine

3 726 色谱第 31 卷乙酸乙腈 (1 1ꎬ v / v) 可获得更高的提取效率 ꎮ 同时可利用三氯乙酸使蛋白质变性的功能 ꎬ 使蛋白质构象发生改变 ꎬ 暴露出较多的疏水性基团从而聚集沉淀 ꎬ 在提取的同时实现初步净化 ꎮ 净化方法的选择尝试无需固相萃取小柱 ꎬ 直接采用液液分配实现净化 ꎮ 鸡肉样品中的脂肪蛋白质等干扰多 ꎬ 为达到更低的检出限 ꎬ 提取液需能兼顾净化和浓缩双重功能 ꎮ 两种目标分析物均为极性化合物 ꎬ 易溶于水 ꎬ 采用水相提取后很难经液液再分配进入有机相 ꎬ 无法实现再浓缩 ꎬ 故考虑有机相直接提取浓缩 ꎮ 比较了乙腈甲醇酸化乙腈和酸化甲醇等溶剂 ꎬ 发现甲醇会提取到过多的脂肪蛋白质等干扰物且浓缩耗时过长 ꎻ 而酸化乙腈提取效率较好 ꎬ 并可经正己烷萃取除脂净化而不影响提取效率 ꎮ 但由于未经 SPE 净化 ꎬ 在 UPLC MS / MS 上有较大的基质抑制效应 ꎮ 因此选用 SPE 方法并对实验条件进行了优化 ꎮ 采用常规的 C18 小柱净化 ꎬ 发现利巴韦林和金刚烷胺基本无保留 ꎮ 对比 Oasis WCX Oasis MCX Supelco LC SCX 3 种离子交换柱 ꎮ 结果显示在 WCX 柱中二者均不保留 ꎻMCX 柱中金刚烷胺可保留但利巴韦林不保留 ꎻSCX 柱中的二者均可保留 ꎮ 这是由于利巴韦林与金刚烷胺均为弱碱性化合物 ꎬ 需要与强阳离子交换柱结合净化 ꎮ WCX 为弱阳离子柱故无保留 ꎬ 而利巴韦林结构式中的共轭效应使其碱性弱于金刚烷胺 ꎬ 需要更强的阳离子交换柱 SCX 才能结合 ꎮ 同时 ꎬ 还尝试利用物理吸附作用考察了硅胶柱和氧化铝柱的净化效果 ꎮ 结果显示利巴韦林可在氧化铝柱中保留 ꎬ 金刚烷胺可在硅胶柱中部分保留 ꎬ 但二者无法在同一小柱上同步保留 ꎮ 综上 ꎬ 选用 SCX 作为固相萃取净化柱 ꎬ 可以实现两个组分的同步净化 ꎮ 在离子交换柱中 ꎬ 碱性化合物通过离子交换得到 H + 从而结合在 SCX 固相萃取小柱上 ꎬ 可提供酸性环境使其中和呈分子态从而洗脱下来 ꎬ 也可提供更强的碱性环境通过竞争结合固定相使待测物进入洗脱液 ꎮ 比较了甲酸水氨水乙腈甲醇的洗脱效果 ꎮ 结果显示在 SCX 小柱上 ꎬ 甲醇即可实现对利巴韦林的洗脱 ꎬ 而金刚烷胺的洗脱需要碱性条件 ꎬ 最终选用 5% 氨化甲醇作洗脱液 ꎮ 2. 2 液相色谱条件的选择和优化色谱柱的选择尝试常用的 C18 色谱柱对利巴韦林和金刚烷胺进行分离 ꎬ 发现其对利巴韦林基本无保留 ꎬ 利巴韦林直接在死时间出峰 ꎮ 亲水色谱 (HILIC) 是一种用来改善强极性物质在反相色谱中保留情况的色谱技术 ꎬ 通过采用强极性固定相 ꎬ 结合高比例有机相低比例水相组成的流动相来实现分离 ꎮ 针对利巴韦林和金刚烷胺的极性分子特点 ꎬ 选择 Waters UPLC BEH Hillic 色谱柱 (150 mm 2 1 mmꎬ 1 7 μm)ꎮ 结果显示利巴韦林和金刚烷胺均可很好地分离 ꎮ 本实验也测试了 HSS T3 色谱柱 ꎬ 发现分离效果也较好 ꎬ 但质谱响应值只是 BEH Hillic 柱的 1 / 30ꎮ 液相色谱条件的优化实验表明流动相水相中是否加入醋酸铵缓冲盐对结果无影响 ꎻ 而当流动相中的有机相由乙腈变为甲醇时 ꎬ 分析物响应值增高 5 倍 ꎬ 峰形变好 ꎮ 流速由 0 3 ml / min 变为 0 25 ml / min 时 ꎬ 分析物峰形变宽且有分叉 ꎮ 进样体积为 3 μl 时峰窄但有锯齿 ꎬ5 μl 时峰形较好 ꎬ10 μl 时峰形无变化 ꎮ 综上 ꎬ 选用甲醇 0 1% 甲酸水作流动相体系 ꎬ 流速 0 3 ml / minꎬ 进样体积 5 μlꎮ 洗脱梯度鸡肉中脂肪蛋白质等杂质含量较多 ꎬ 如果在待测组分出峰后迅速将流动相组成降成初始流动相组成 ꎬ 虽能节省分析时间 ꎬ 但容易将蛋白质等大分子物质保留在色谱柱中 ꎬ 使色谱柱的使用寿命降低 ꎮ 因此 ꎬ 在利巴韦林出峰 (1 45 min) 后将流动相中甲醇的比例从 20% 线性增至 80%ꎬ 冲洗色谱柱约 0 9 min 后再逐渐恢复至初始梯度 ꎬ 避免了长期使用时杂质在色谱柱中产生沉淀积累影响分离效果 ꎮ 定容溶液实验发现 ꎬ 当样品中利巴韦林含量相等时 ꎬ 定容溶液为甲醇水时的响应值是纯水时的 4 倍 ꎬ 符合 Hillic 柱的工作原理 ꎮ 定容溶液中加入氨水可使金刚烷胺与利巴韦林的分离更好 ꎬ 因此样品经固相萃取净化浓缩后的定容溶液采用 5% 氨化甲醇 ꎮ 2. 3 质谱电离条件的选择 ESI 电离是将离子从溶液中转移至气相的过程 ꎬ 待测成分在溶液中成为离子状态可提高生成气相离子的效率 ꎬ 从而提高检测灵敏度 ꎮ 根据溶液化学的原理 ꎬ 利巴韦林和金刚烷胺在酸性条件下易结合质子形成正离子 ꎬ 因此选择正离子电离模式 ꎬ 并在流动相中加入甲酸以提供质子 ꎮ 质谱扫描中可见利巴韦林 [M + Na] + 峰信号较强 ꎬ 但考虑到结合稳定性 ꎬ 仍对 [M + H] + 峰进行扫描 ꎮ 驻留时间 (dwell time) 影响检测的精确度和灵敏度 ꎮ 当驻留时间为 0 1 s 时 ꎬ 利巴韦林出峰呈锯齿状 ꎻ 增大驻留时间至 sꎬ 得到的离子的准确度提高 ꎬ 重现性增加 ꎬ 峰形明显变好 ( 见图 2)ꎮ

4 第 8 期云环 ꎬ 等 : 超高效液相色谱串联质谱法测定鸡肉中的利巴韦林和金刚烷胺 727 Fig. 2 图 2 利巴韦林标准品驻留时间为 (a)0 1 s 和 (b)0 202 s 时的 MRM 色谱图 MRM chromatograms of ribavirin standard with dwell times of (a) 0 1 s and (b) s 2. 4 线性范围定量限回收率和精密度分别配制利巴韦林和金刚烷胺的质量浓度为 μg / L 的系列混合标准溶液进行测定 ꎮ 以定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归计算 ꎬ 在 10 0 ~ μg / L 范围内两种药物成分的线性关系良好 (r )ꎮ 取空白鸡肉样品 ꎬ 添加不同质量浓度的利巴韦林和金刚烷胺 ꎬ 前处理后由高至低检测直到信噪比等于 10(S / N = 10)ꎬ 确定鸡肉中利巴韦林和金刚烷胺的定量限为 4 0 μg / kgꎮ 用鸡肉试样进行添加回收率和精密度试验 ꎮ 添加水平为 μg / kgꎬ 添加混合后静置使标准溶液被样品充分吸收 ꎮ 然后按照本方法进行样品处理和测定 ꎬ 每个添加水平测定 6 次 ꎬ 结果见表 2ꎮ 其中添加水平为 8 0 μg / kg 的空白鸡肉的 MRM 色谱图见图 3ꎮ 表 2 鸡肉中利巴韦林和金刚烷胺的回收率和相对标准偏差 (n = 6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations ( RSDs ) of ribavirin and amantadine in chicken (n = 6) Analyte Spiked / (μg / kg) Recovery / % RSD / % Ribavirin Amantadine Fig. 3 图 3 空白鸡肉中添加利巴韦林与金刚烷胺的 MRM 色谱图 (8 0 μg / kg) MRM chromatograms of blank chicken spiked with ribavirin and amantadine (8 0 μg / kg)

5 728 色谱第 31 卷 2. 5 方法的应用将建立的方法应用于 10 份实际鸡肉样品的检测 ꎬ 检出其中 1 份含有 10 8 μg / kg 金刚烷胺 ꎬ 其他样品均未检出 ꎮ 3 结论基于高效液相色谱串联质谱技术 ꎬ 建立了一种快速有效的鸡肉中利巴韦林和金刚烷胺的检测方法 ꎬ 获得了满意的分离效果和检测灵敏度 ꎮ 回收率精密度和定量限均满足残留分析的要求 ꎮ 该方法尝试应用 SCX 净化和 Hillic 分离实现了利巴韦林和金刚烷胺的同时检测 ꎬ 与单组分检测相比节省了人力时间和经济成本 ꎬ 提高了检测效率 ꎮ 参考文献 : [1] Austin R Kꎬ Trefts P Eꎬ Hintz M. Antimicrob Agents Che motherꎬ 1983ꎬ 24(5): 696 [2] Roboz Jꎬ Suzuki R. J Chromatogrꎬ 1978ꎬ 160: 169 [3] Homma Mꎬ Jayewardene A Lꎬ Gambertoglio Jꎬ et al. Antimi crob Agents Chemotherꎬ 1999ꎬ 43(11): 2716 [4] Cui C Fꎬ Chen C Hꎬ Lin H Dꎬ et al. Chinese Journal of Veter inary Drug ( 崔成富 ꎬ 陈创华 ꎬ 林海丹 ꎬ 等. 中国兽药杂志 )ꎬ 2011ꎬ 45(9): 32 [5] Page Tꎬ Connor J D. Int J Biochemꎬ 1990ꎬ 22: 379 [6] Yeh L Tꎬ Nguyen Mꎬ Lourenco Dꎬ et al. J Pharm Biomed Analꎬ 2005ꎬ 38: 34 [7] Yeh L Tꎬ Nguyen Mꎬ Dadgostari Sꎬ et al. J Pharm Biomed Analꎬ 2007ꎬ 43: 1057 [8] Zhu Y Lꎬ Shao D Jꎬ Jiang T Mꎬ et al. Chinese Journal of Vet erinary Drug ( 朱永林 ꎬ 邵德佳 ꎬ 蒋天梅 ꎬ 等. 中国兽药杂志 )ꎬ 2008ꎬ 42(7): 22 [9] Qiang X Yꎬ Zhu J Bꎬ Xu Mꎬ et al. Progress in Pharmaceutical Sciences ( 强晓妍 ꎬ 朱监宝 ꎬ 徐敏 ꎬ 等. 药学进展 )ꎬ 2012ꎬ 36 (9): 413 [10] Zhu S Pꎬ Zhong Hꎬ He Fꎬ et al. Central South Pharmacy ( 朱胜平 ꎬ 钟华 ꎬ 何飞 ꎬ 等. 中南药学 )ꎬ 2005ꎬ 3(4): 209 [11] Lou Y Jꎬ Chen Sꎬ Tao Q F. Chin J Pharm Anal ( 楼永军 ꎬ 陈爽 ꎬ 陶巧凤. 药物分析杂志 )ꎬ 2011ꎬ 31(3): 493 [12] Yun Hꎬ Zhang Z Hꎬ Luo S Lꎬ et al. Modern Instruments ( 云环 ꎬ 张朝晖 ꎬ 罗生亮 ꎬ 等. 现代仪器 )ꎬ 2009ꎬ 15(85): 42 [13] Liu Z Cꎬ Yang Fꎬ Yu K Jꎬ et al. Chinese Journal of Chroma tography ( 刘正才 ꎬ 杨方 ꎬ 余孔捷 ꎬ 等. 色谱 )ꎬ 2012ꎬ 30(12): 1253

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI