农学农业基础科学

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1 中国农学通报 2015,31(12): Chinese Agricultural Science Bulletin 木薯内标准基因定性 CR 方法分析李美英 1,2 易小平 1,2 杨小亮 1,2 贺萍萍 1,2 谢翔 1,2 刘恩平 3 郭安平 1,2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物技术与遗传资源利用重点实验室海口农业部转基因植物及植物用微生物环境安全监督检验测试中心海口中国热带农业科学院科技信息研究所海口摘要内标准基因对于转基因植物及其产品的定性定量 CR 检测起着决定性的作用木薯内标准基因的系统研究是木薯转基因成分检测的基础在木薯的 DFCI( html)数据库中选择了有可能作为木薯内标基因的一些 EST 序列包括亲环蛋白 2(cyclophilin type 2 DB934316) 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因 B 亚单位(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit TC445)GADH Actin 基因 TC2158 与 TC3381 的拼接序列 Alpha-tubulin(TC8072)基因 olyubiquitin (TC9946) 亚麻苦苷酶(linamarase TC1540)6 个基因序列设计了 7 对定性 CR 的引物(C2 Actin GADH UBQ2 Tublinα1 Tublinα2 和 LAM1) 并进行了种内一致性稳定性和种间特异性测试分析结果表明只有木薯的 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因 B 亚单位的 GADH 定性 CR 引物扩增系统在木薯的 22 个不同品种中都能够得到一致性稳定性的扩增结果在大戟科其他植物及其他非大戟科植物没有发现非特异性扩增产物另外 6 个基因 C2 Actin UBQ2 Tublinα1 Tublinα2 和 LAM1 的定性 CR 引物扩增系统在大戟科其他植物及非大戟科植物中都有非特异性的扩增产物因此 GADH 定性 CR 引物扩增系统初步符合内标准基因的种内一致性稳定性种间特异性的特点可应用于转基因木薯成分定性 CR 检测关键词木薯内标准基因定性 CR 种内一致性种间特异性中图分类号 S19 文献标志码 A 论文编号 Analysis of Cassava Endogenous Reference Genes by Using Qualitative olymerase Chain Reaction (CR) Li Meiying, Yi Xiaoping1,2, Yang Xiaoliang1,2, He ingping1,2, Xie Xiang1,2, Liu Enping3, Guo Anping1,2 1,2 (1Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory of Biology 2 and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Haikou ; Environmental Safety Supervision and Inspection Center for Genetically Modified lants and Microorganism Used in lants, 3 Ministry of Agriculture, Haikou ; Institute of Scientific and Technical Information, Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences, Haikou ) Abstract: Endogenous Reference Gene is a determining factor in detection the transgenic plants and products by using Qualitative olymerase Chain Reaction (CR) and Real- Time Quantitative methods. The system research in cassava endogenous reference genes could lay a foundation for detection of genetically modified cassavas and derived products. Several possible endogenous reference genes of cassava including cyclophilin type 2 (DB934316), Glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase B subunit (GADH, TC445), Actin (the 基金项目海南省自然科学基金转基因木薯内标准基因的有效选择及验证 (311082) 第一作者简介李美英女 1974 年出生山东菏泽人副研究员博士研究方向植物转基因生物安全与植物分子生物学通信地址海口市龙华区学院路 4 号热带生物技术研究所 Tel limeiying@itbb.org.cn 通讯作者郭安平男 1962 年出生湖南益阳人研究员博士研究方向转基因植物环境安全研究以及转基因主要热带农作物安全管理技术方法与标准的研究通信地址海口市龙华区学院路 4 号热带生物技术研究所 Tel gap211@126.com 收稿日期修回日期

2 中国农学通报 http // 194 edited sequences of TC2158 and TC3381), Alpha- tubulin (TC8072), olyubiquitin (TC9946), linamarase (TC1540) were selected from DFCI ( of cassava ESTS, and 7 pairs primers (C2, Actin, GADH, UBQ2, Tublinα1, Tublinα2 and LAM1) were designed, then their internal consistency were assayed in 22 different cassava varieties and their species specific was also detected in other 12 non-cassava euphorbiaceae species and 20 non-euphorbiaceae species. For GADH the identical amplification products were obtained with the DA samples from 22 different cassava varieties, no amplification products were observed in other 12 non- cassava euphorbiaceae species and 20 non- euphorbiaceae species. As for another 6 pairs primers (C2, Actin, UBQ2, Tublinα1, Tublinα2 and LAM1), the non- specificity amplification products were observed in the non- cassava euphorbiaceae species or non- euphorbiaceae species. These results indicated the GADH CR amplification system was species specific and internal consistency and could be used as the endogenous reference genes for the detection of genetically modified cassavas and derived products. Key words: cassava; endogenous reference gene; Qualitative olymerase Chain Reaction (CR); internal consistency; species specific 0 引言与报道木薯是中国长江以南地区目前最具有开发前景的根据内标准基因的特点在木薯内标准基因研究能源作物长期以来依靠传统育种手段来改变淀粉中笔者首先通过查阅文献寻找木薯的 EST 数据库品质耗时长需要大量人力物力难以满足淀粉加工在木薯的 DFCI( [1-2] 业的急切需求近几年国内外木薯转基因技术不断 plant.html)数据库中选择了有可能作为木薯内标基因发展和完善在木薯营养成分的生物强化品质改良的一些 EST 序列包括亲环蛋白 2(cyclophilin type 2 [1-2] 抗病和耐储藏等方面取得了很大的进展转基因木 DB934316) 3- 磷酸甘油醛脱氢酶基因 B 亚单位薯的推广与研发将加快推动木薯产业技术体系的发 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit 展也为工业化应用提供技术平台和新原料转基因 TC445)GADH Actin 基因 TC2158 与 TC3381 的拼接木薯产品的大规模开发与利用离不开转基因木薯产品序列 Alpha- tubulin(tc8072) 基因 olyubiquitin 检测技术的支撑 (TC9946) 亚麻苦苷酶(linamarase TC1540)6 个基因 [3-6] 植物的内标准基因指的是植物中具有种间特异性序列使用 BLAST( 种内非特异性和恒定低拷贝数等特征的一类基因[7-8] cgi)来比对该基因序列与其他作物基因序列的同源性而内标准基因对于转基因植物及其产品的定量检测情况从而确定一段在木薯中相应保守而在其他物种起着决定性的作用没有合适的内标准基因就不可能中几乎没有同源序列的基因作为木薯的内标准基因的对转基因植物及其产品进行定量分析也不能确定转候选基因通过设计相应的定性 CR 的引物进行种基因植物及其产品的准确转基因含量通过检测内标内一致性种间特异性等系统的研究来选择有效的符准基因可以确定整个实验体系的稳定性和可靠性转合内标准基因特点和要求的定性 CR 的扩增系统为基因植物及其产品的成分来源混合样品中的转基因转基因木薯定性检测及其标准的研制打基础植物含量的分析目前广泛商业化的转基因作物的 1 材料与方法内标准基因已经得到系统深入的研究开发和应用如 1.1 试验材料 [7-8] 玉米的 Invertase Ⅰ zein zssiibadh 和 hmg 等基因 [7,9] 油菜的 HMG I/Y FatA CruA BnACCg8 和 ACC 水稻的 LD SS GOS9 和 ppi-f [7,12-13] [7,10-11] 木薯 Ku5O 华南 124 泰国种南植 199 阿根廷 7 号 18R 华南 8 号 HSQ-003 7G-2 Q12 高淀粉 IAC B1-1 CH-19 7G-1 BV-S Andera CH- 转基因木薯的育种开发及应用离不开对转基因 15 FB4 RoYong-9 HB-60 C1 转基因品系和 C3 转木薯及其加工品的监管转基因木薯成分定性 CR 及基因所用对照野生材料采自中国热带农业科学院热定量 CR 检测技术是对转基因木薯监管的支撑技术带生物技术研究所文昌试验基地内大戟科类其他植在支撑技术建立之前就需要对木薯的内标准基因进行物如变色木 (Codiaeum variegatum L.) 叶下珠系统的研究目前还没有木薯内标准基因的相关研究 (hyllanthus urinaria Linn.) 虎刺梅 (Euphorbia milii

3 李美英等木薯内标准基因定性 CR 方法分析 195 Ch.) 油桐 [Vernicia fordii (Hemsl.)] 橡胶树 [Hevea 种间特异性测试选择变色木叶下珠虎刺梅 brasiliensis (Willd. ex A. Juss.)] 蓖麻 (Ricinus 橡胶树蓖麻巴豆铁苋菜重阳木红背桂地 communis L.) 巴豆 (Croton tiglium L.) 铁苋菜 (Acalypha australis L.) 重阳木 [Bischofia polycarpa 锦草和一串红等其他大戟科植物玉米水稻甘蔗西红柿胡萝卜番木瓜甘薯箩摩决明子胡椒鸡蛋 (Levl.)] 红背桂(Excoecaria cochinchinensis Lour.) 地花海南红豆香樟咖啡九里香鹅掌柴大叶桃花心锦草 (Euphorbia humifusa) 一串红 (Salvia splendens 木三角梅大豆和拟南芥等非大戟科植物作为种间特 Ker-Gawl.)及非大戟科类植物甘薯(sweet potato) 箩摩异性测试材料基因组 DA 的抽提[14] CR 反应体系 (Metaplexis hemsleyana) 决明子[Senna tora (L.)] 胡椒与 CR 扩增程序与相同 (iper nigrum L.) 鸡蛋花 (lumeria rubra L. cv. 2 结果与分析 Acutifolia) 海南红豆[Ormosia pinnata (Lour.) Merr.] 2.1 木薯内标准基因特异序列的搜集与整理与引物香樟 (Cinnamomum bodinieri) 咖啡 (coffee) 九里香设计 (Murraya exotica L.) 鹅掌柴 [Schefflera heptaphylla 在木薯 EST 数据库 DFCI( (Linn.) Frodin] 与大叶桃花心木 (Swietenia harvard.edu/tgi/plant.html)中选择下载有可能作为木薯 macrophylla King)三角梅(Bougainvillea glabra)采自中内标基因的一些 EST 序列包括亲环蛋白 2 国热带农业科学院与海南医学院院内栽培的观赏植 (cyclophilin type DB934316) 3-磷酸甘油醛脱氢酶基物大豆拟南芥玉米水稻甘蔗和番木瓜为农业部因转基因植物及植物用微生物环境安全评价监督检验测 dehydrogenase B subunit TC445)GADH Actin 基因试中心海口试验用材料西红柿和胡萝卜在城金市 TC2158 与 TC3381 的拼接序列 Alpha- tubulin B 亚单位 (Glyceraldehyde- 3- phosphate 场购买 (TC8072) 基因 olyubiquitin(tc9946) 亚麻苦苷酶 1.2 试验方法 (linamarase TC1540)6 个基因序列在木薯的 6 个可基因序列的查询引物设计与筛选木薯内标准能的内标准基因序列进行引物设计引物名称及序列基因 EST 序列在木薯 EST 数据库 DFCI( 见表 1 根据引物退火温度筛选的结果 7 对引物的退 dfci.harvard.edu/tgi/plant.html)中查询根据文献的报火温度如下 C2 和 Actin 为 56 GADH 为 54 道选择适合作为内标准基因的木薯 EST 序列利用 UBQ2 为 55 Tublinα1 和 Tublinα2 为 57 LAM1 为 primer 5.0 结合 BLAST( 58 Blast.cgi)分析来进行引物设计以提取的华南 8 号 2.2 种内一致性测试与种间特异性测试的叶片 DA 分别稀释到 55.2 ng/µl 和 27.6 ng/µl 做结果表明 C2 Actin GADH UBQ2 Tublinα1 为引物 CR 扩增退火温度筛选的模板 CR 反应体 Tublinα2 和 LAM1 等引物扩增系统在木薯不同品种系为 10 Buffer 5.0 µl dt (10 mmol/l each) 0.5 µl Ku5O 华南 124 泰国种南植 199 阿根廷 7 Taq DA 聚合酶(5 U/µL) µl 上下游引物终浓号 18R 华南 8 号 HSQ-003 7G-2 Q12 IAC B1- 度为 0.4 µmol/l 模板 1.0 µl 总体积为 25 µl CR 扩 1 CH-19 7G-1 BV-S Andera CH-15 FB4 RoYong-9 增程序为 94 5 min s 退火温度 (50~60 ) 45 s s 共 35 个循环进行扩增 HB-60 C1 转基因品系和 C3 转基因所用对照野生材料均得到很好的一致性扩增结果如图 1 表种内一致性测试选择 Ku5O 华南 124 泰国所示种南植 199 阿根廷 7 号 18R 华南 8 号种间特异性测试结果表明 C2 在大戟科植物变 HSQ-003 7G-2 Q12 IAC B1-1 CH-19 7G-1 BV-S 色木橡胶树蓖麻和巴豆非大戟科植物甘蔗中 Andera CH-15 FB4 RoYong-9 HB-60 C1 和 C3 为种都有非特异性扩增扩增产物大小与在木薯中扩增的内一致性测试的试验材料基因组 DA 的抽提采用产物大小一致 Actin 引物扩增系统在大戟科植物变色 CTAB 方法提取的 DA 用 anodrop2000c 木橡胶树巴豆地锦草和一串红非大戟科植 (Thermo scientific)型核酸测定仪检测 DA 的浓度和物九里香都有非特异性扩增产物 Tublinα1 在大戟科纯度 DA 浓度调整到 25 ng/µl 后用于 CR 检测植物变色木橡胶树和蓖麻非大戟科植物甘蔗 CR 反应体系与相同 CR 扩增程序的退火温度胡萝卜番木瓜胡椒鸡蛋花和大豆中有非特异性扩对于每对引物各不相同具体见 2.1 的分析其余步骤同增产物 Tublinα2 在大戟科植物变色木和橡胶树非大戟科植物甘蔗西红柿胡萝卜番木瓜胡椒鸡蛋花 [14] [14]

4 196 中国农学通报表 1 研究所用 CR 引物及其序列序列靶基因 C2 GADH Actin Alpha-tubulin UBQ LAM 引物名称 C2F C2R GADHF GADHR ACTIF ACTIR Tublinα1F Tublinα1R Tublinα2F Tublinα2R UBQ2F UBQ2R LAM1F LAM1R 引物序列 (5-3 ) TTCAGAACTCGGTCGTTATGC CCAAGAATCACACAAACAAGGTC GTGTCCCAACACCTAACGTATCG AGAGTCAATGGTGGAGGAAACATCTGA GAAGTCCTGTTCCAACCATCT AACCACCGCTAAGCACTATGT TACCGCCAGCTCTTCCATCCAGAG ATAATCAACAGACAAACGCTCAAG TACCGCCAGCTCTTCCATCCAGAG ATAATCAACAGACAAACGCTCAAG CAATTGGAGGATGGAAGGACCTTA TATGTTATAATCTGCTAGCGTCCG TGGAGTTTTTGCCCCTGGTC AGGCTGTTTTGGCTGCTTGC A1 A22 分别指 Ku5O 华南 124 泰国种南植 199 阿根廷 7 号 18R 华南 8 号 HSQ-003 7G-2 Q12 IAC B1-1 CH-19 7G-1 BV-S Andera CH-15 FB4 RoYong-9 HB-60 C1 和 C3 22 种木薯品种的材料 ;K1 为 DA 提取的空白对照 ;K2 为 CR 反应的空白对照 ;M 为 Marker 图 1 内标准基因 C2 Actin GADH Tublinα1 Tublinα2 UBQ2 和 LAM1 在木薯不同品种间的 CR 扩增结果三角梅和大豆中有非特异性扩增产物 ;UBQ2 在大戟科植物的橡胶树和非大戟科植物中的箩摩也有非特异性扩增产物,LAM1 在大戟科植物的橡胶树中也有非特异性扩增产物, 这表明以上这 6 对引物扩增系统都不符合内标准基因引物在种间扩增的特异性要求, 因此不能够作为木薯内标准基因扩增系统 ( 见图 2 表 2) 结果表明 GADH 引物扩增系统在木薯不同品种中都能够得到一致性的扩增产物, 在大戟科其他植物变色木叶下珠虎刺梅橡胶树蓖麻巴豆铁苋菜重阳木红背桂地锦草和一串红及其玉米水稻甘蔗西红柿胡萝卜番木瓜甘薯箩摩决明子

5 Ku50 华南 124 泰国种南植 199 阿根廷 7 号 18R 华南 8 号 HSQ-003 7G-2 Q12 IAC B1-1 CH-19 7G-1 BV-S Andera CH-15 FB4 RoYong-9 HB-60 C1 C3 变色木叶下珠虎刺梅油桐橡胶树蓖麻巴豆铁苋菜重阳木红背桂地锦草一串红玉米水稻甘蔗西红柿胡萝卜番木瓜 C2 C2-F C2-R Actin ACTI-F ACTI-R GADH GADH-F GADH-R Tublinα Tublinα1-F Tublinα1-R Tublinα2-F Tublinα2-R UBQ UBQ3-F UBQ3-R LAM LAMF1 LAMR1 表 2 定性 CR 方法种内种间特异性检测结果李美英等 : 木薯内标准基因定性 CR 方法分析 197

6 中国农学通报 http // 198 续表 2 C2 Actin GADH Tublinα UBQ LAM C2-F ACTI-F GADH-F Tublinα1-F C2-R ACTI-R GADH-R Tublinα1-R Tublinα2-F UBQ3-F LAMF1 Tublinα2-R UBQ3-R LAMR1 甘薯箩摩决明子胡椒鸡蛋花海南红豆香樟咖啡九里香鹅掌柴大叶桃花心木三角梅大豆拟南芥注表示扩增结果为阳性表示扩增结果为阴性 B1 B12 分别为变色木叶下珠虎刺梅橡胶树蓖麻巴豆铁苋菜重阳木红背桂地锦草和一串红 12 种大戟科其他的植物 C1 C20 分别为玉米水稻甘蔗西红柿胡萝卜番木瓜甘薯箩摩决明子胡椒鸡蛋花海南红豆香樟咖啡九里香鹅掌柴大叶桃花心木三角梅大豆和拟南芥 20 种非大戟科植物 K-为经过实验室验证的非转基因水稻和玉米的混合样品 K+为华南 8 号 20 ng/µl 的 DA 样品 K1 为 DA 提取的空白对照 K2 为 CR 反应的空白对照 M 为 Marker 图 2 内标准基因 C2 Actin GADH Tublinα1 Tublinα2 UBQ2 和 LAM1 在大戟科植物其他的植物以及非大戟科植物中的 CR 扩增结果

7 李美英等 : 木薯内标准基因定性 CR 方法分析 199 胡椒鸡蛋花海南红豆香樟咖啡九里香鹅掌柴大叶桃花心木三角梅大豆和拟南芥等非大戟科植物中均没有非特异性扩增产物出现, 初步符合内标准基因的特点要求 ( 图 1 图 2 表 2) 3 结论与讨论转基因植物的内标准基因研究对于转基因植物的 [15] 安全管理及标示具有重要意义转基因木薯的研究尽管已经取得很大进展, 作为检测转基因木薯用的内标准基因还未有相关研究报道在本研究中选择了木薯的 6 个基因作为筛选内标准基因的候选基因 (GADH Actin 基因 Alpha- tubulin 基因, olyubiquitincyclophilin type 2 和 linamarase 基因 ), 结果表明只有 GADH 的引物扩增系统具有较高的特异性, 能初步满足木薯的内标准基因的要求这对于转基因木薯的生物安全管理具有重要意义根据笔者的试验结果 C2 Actin Tublinα1 Tublinα2 UBQ2 和 LAM1 在木薯不同品种间扩增效率都相对较高, 但在大戟科类其他植物及非大戟科植物中能够检测到扩增产物如 C2 在变叶木橡胶树蓖麻巴豆和甘蔗中有扩增产物出现 ;Actin 在变叶木橡胶树巴豆地锦草和一串红中胡萝卜有扩增产物出现 ;Tublinα1 Tublinα2 UBQ2 和 LAM1 也在大戟科植物和非大戟科植物中有扩增产物出项, 表明这些引物扩增系统不能满足内标准基因特异性要求, 不适合作为木薯的内标准基因来应用引物扩增系统在物种间特异性不好, 对混合样品的检测时就不能够充分的说明所检样品的来源本研究初步发现 GADH 引物扩增特异性较高, 可以初步满足木薯的内标准基因的要求, 要进一步应用还需要进行更深入的研究参考文献 [1] 许泳清, 李华伟, 汤浩, 等.6 个木薯品种生长发育及产量性状的初步研究 [J]. 江西农业学报,2011,23(3): [2] 陈冠喜, 李开绵, 叶剑秋, 等.6 个木薯品种光合特性的研究 [J]. 中国农学通报,2009,25(12): [3] Zhang, Wang W Q, Zhang G L, et al. Senescence- inducible expression of isopentenyl transferase extends leaf life, increases drought stress resistance and alters cytokinin metabolism in cassava [J]. J Integr lant Biol,2010,52(7): [4] Zhao S S, Dufour D, Sánchez T, et al. Development of waxy cassava with different Biological and physico- chemical characteristics of starches for industrial applications[j]. Biotechnol Bioeng,2011,108(8): [5] Sayre R, Beeching J R, Cahoon E B, et al. The BioCassava plus program: biofortification of cassava for sub- Saharan Africa[J]. Annu Rev lant Biol,2011(62): [6] Failla M L, Chitchumroonchokchai C, Siritunga D, et al. Retention during processing and bioaccessibility of β- carotene in high β- carotene transgenic cassava root[j]. J Agric Food Chem,2012,60 (15): [7] Huang H, Cheng F, Wang R, et al. Evaluation of four endogenous reference genes and their real-time CR assays for common wheat quantification in GMOs detection[j]. LoS One,2013,8(9):e [8] Xue B, Guo J, Que Y, et al. Selection of suitable endogenous reference genes for relative copy number detection in sugarcan[j]. Int J Mol Sci,2014,15(5): [9] Lin Y, Zhang C, Lan H, et al. Validation of otential Reference Genes for qcr in Maize across Abiotic Stresses, Hormone Treatments, and Tissue Types[J]. LoS One,2014,9(5):e [10] Hernández M, Rýo A, Esteve T. A rapeseed specific gene, Acetyl- CoA Carboxylase, can be used as a reference for qualitative and real-time quantitative CR detection of transgenes from mixed food samples[j]. J Agric Food Chem,2001(49): [11] Weng H B, Yang L T, Liu Z L, et al. ovel reference gene, Highmobility- group protein I/Y, used in qualitative and real- time quantitative polymerase chain reaction detection of transgenic rapeseed cultivars[j]. J AOAC Int,2005(88): [12] Jiang L, Yang L, Zhang H, et al. International collaborative study of the endogenous reference gene, SS, used for qualitative and quantitative analysis of genetically modified rice[j]. J Agric Food Chem,2009(9): [13] Ding J Y, Jia J W, Yang L T, et al. Validation of a Rice Specific Gene, Sucrose hosphate Synthase, Used as the Endogenous Reference Gene for Qualitative and Real- Time Quantitative CR Detection of Transgenes[J]. J Agric Food Chem,2004(52): [14] 农业部科技发展中心. 农业转基因生物安全标准 ( 第 1 版 )[S]. 北京 : 中国农业出版社 : [15] Venturelli G L, Brod F C, Rossi G B, et al. A Specific Endogenous Reference for Genetically Modified Common Bean (haseolus vulgaris L.) DA Quantification by Real- Time CR Targeting Lectin Gene[J]. Mol Biotechnol, 2014,56(11):

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