2015医学版第二期

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鬼月酆
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1 第期 05 年 4 月 Journal of Lanzhou University(Medical Sciences) Vol.4 No. Apr. 05 文章编号 :000-8 (05) 大黄素诱导对内质网应激相关蛋白表达及肝癌 HepG 细胞凋亡的影响党中峰党雅梅陈城蔡伟郭应芳杨华那光伟何科基. 甘肃省肿瘤医院腹外二科甘肃兰州甘肃省人民医院病理科甘肃兰州摘要 : 目的研究大黄素对肝细胞癌 HepG 细胞作用后内质网应激 (ERS) 相关蛋白表达的影响方法采用不同浓度大黄素 ( μmol/l) 处理 HepG 细胞 48 h 通过四甲基偶氮唑蓝比色法测定大黄素对肿瘤细胞增殖的影响流式细胞术检测大黄素对 HepG 细胞的凋亡率采用蛋白印迹法检测葡萄糖调节蛋白 78 (GRP78) C/EBP 同源蛋白 (CHOP) 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶- (caspase-) 及 caspase- 活化断裂后产生的活性片段的表达结果大黄素以浓度依赖的方式抑制 HepG 细胞的增殖促进细胞凋亡大黄素处理 HepG 细胞后内质网分子伴侣蛋白 GRP78 的表达明显增高 ; 内质网相关凋亡分子 CHOP 和 caspase- 的含量也显著增高 caspase- 活性增强结论大黄素可能通过内质网应激相关途径诱导 HepG 细胞凋亡关键词 : 大黄素 ; 增殖 ; 内质网应激 ;HepG 细胞中图分类号 :R737 文献标识码 :A doi: /j.issn Emodin induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in hepatocellular carcinoma HepG cell line Dang Zhong-feng Dang Ya-mei Chen Cheng Cai Wei Guo Ying-fang Yang Hua Na Guang-wei He Ke-ji. Second Department of Abdominal Surgery Tumour's Hospital of Gansu Province Lanzhou China. Department of Pathology People's Hospital of Gansu Province Lanzhou China Abstract:Objective To investigate the effect of emodin on the expression of endoplasmic reticulum stress (ERS)- associated proteins in hepatocellular carcinoma HepG cells. Methods After treatment with various concentrations of emodin( μmol/l) tumor cell viability and apoptosis were measured by MTT (methyl thiazolyl tetrazolium )and flow cytometry assays respectively. The GRP78 (glucose-regulated protein 78) CHOP(C/EBP homologous protein) caspase- were analysed by Western Blotting. Results Emodin inhibited the proliferation of HepG cells promoted their apoptosis in the concentration- depandent manner and enhanced the expression of ERS chaperone GRP78 in HepG cells. Emodin treament also increased the expression of the two known essential ERS-associated apoptotic proteins CHOP and caspase- and elevated 收稿日期 :03--0 基金项目 : 甘肃省中医药管理局科研项目 (GZK-04-7) 作者简介 : 党中峰 (974-) 男甘肃天祝人主治医师硕士研究方向为腹部肿瘤 @qq.com; 党雅梅 (973-) 女甘肃天祝人主任医师博士研究生研究方向为肿瘤诊断治疗 dangyamei008@63.com 通信联系人

2 第期党中峰等 : 大黄素诱导对内质网应激相关蛋白表达及肝癌 HepG 细胞凋亡的影响 caspase- activation in HepG cells. Conclusion Emodin induces apoptosis in hepatocellular carcinoma HepG cells probably involving the induction of ERS associated proteins. Key words: Emodin; proliferation; endoplasmic reticulum stress; HepG cells 内质网应激 (endoplasmic reticulum stress ERS) 是指由于多种原因导致的内质网中发生蛋白错误折叠以及未折叠蛋白在内质网腔内的聚集以及 Ca + 平衡的失调 [-] ERS 是细胞抵抗外来应激的一种生理反应出现一定程度的 ERS 有利于维持和保护细胞的正常功能 ; 若应激过强细胞的保护机制不能同外来损伤相抗衡则会诱导细胞凋亡的出现 ERS 反应性细胞凋亡是一种既不同于 Fas 受体介导的外源性凋亡又不同于细胞线粒体介导的内源性凋亡的一种新的凋亡途径 [3-4] 已有的研究表明有多种肿瘤的发生与 ERS 诱导的细胞凋亡有关 [5-6] 大黄素 (emodin) 化学名称为 6- 甲基三羟基蒽醌是从大黄属鼠李属蓼属和番泻叶等中药中提取出的一种蒽醌类单体化合物具有抗肿瘤抗病毒免疫调节等多种生物学效应 [7] 能够抑制肝癌细胞的增殖并诱导其凋亡 [8-9] 本研究将探讨大黄素的抗肿瘤活性是否与 ERS 蛋白的上调相关材料与方法. 药品与试剂大黄素 ( 中国药品生物制品检定所纯度 > 98% 批号为 );DMEM 高糖培养基 ( 美国 Hyclone 公司 ); 四甲基偶氮唑蓝 (methyl thiazolyl tetrazolium MTT)( 美国 Sigma 公司 ); 细胞凋亡检测试剂盒 ( 上海舜百生物科技有限公司 ); 兔抗人葡萄糖调节蛋白 78 (glucose-regulated protein 78GRP78) C/EBP 同源蛋白 (C/ EBP homologous proteinchop) 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 - (caspase-) 抗体 ( 美国 Santa Cruz 公司 ). 细胞培养人肝癌 HepG 细胞 ( 购自中国科学研究院上海细胞库 ) 培养于含 0% 小牛血清 00 U/mL 青霉素和 00 U/mL 链霉素的 DMEM 培养液中在 37 5% CO 饱和湿度条件下培养取处于对数生长期的细胞用于实验.3 MTT 法检测细胞存活率取处于对数生长期的 HepG 细胞制成细胞悬液以个细胞 / 孔 (00 μl) 接种于 96 孔培养板中培养 6 h 贴壁后弃去原有培养液依次 caspase- CHOP 和 GRP78 分别加入含 μmol/l 大黄素的培养液同时设置 DMEM 培养液作为对照空白组无细胞其余处理相同在 37 5% CO 条件下继续培养 48 h 每孔加入 0 μl MTT 储存液 (5 mg/ml) 4 h 后弃去孔内培养基每孔加入二甲基亚砜 00 μl 振荡器温和振荡 5 min 用酶标仪于 570 nm 处测定各孔的光密度值 (optical densityod) 每组设 3 个复孔实验重复 3 次取平均数细胞存活率采用以下公式计算 : 细胞存活率 (%) = 实验组 OD 值 / 对照组 OD 值 00%.4 流式细胞仪检测细胞凋亡接种 ml 细胞于 6 孔板中细胞密度为 0 4 /ml 过夜培养后分别加入含相应浓度药物的培养液培养 48 h 后收集细胞先后用 Annexin-V 和 PI 染色采用流式细胞仪检测计算样本中凋亡细胞占细胞总数的百分比.5 蛋白印迹法检测蛋白表达各组样品处理如前述采用十二烷基硫酸钠裂解液 (00 mmol Tris-ClpH 6.84% 十二烷基硫酸钠 0% 甘油 ) 裂解并收集细胞所有操作均在冰上完成细胞样品于 r/min 离心 0 min 收集上清用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定样品蛋白浓度样本煮沸变性后取 40 μg 总蛋白选择 0% 分离胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳完毕后将蛋白质通过湿法转至硝酸纤维素膜用含 5% 脱脂奶粉的封闭液于室温下孵育 h 后加 00 稀释的一抗于 4 孵育过夜用含 5% 吐温 -0 的磷酸盐缓冲液洗膜 3 次每次 5 min 再分别加入 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 h 磷酸盐缓冲液洗膜 3 次每次 5 min 电化学发光显

3 5 色 Bio-Rad 凝胶成像系统采集图像 Gel-pro 4.0 分析光密度以 β-actin 为内参对照组目标蛋白相对含量为计算各组蛋白的相对表达量.6 统计学分析 Graph Pad 5.0 软件包进行统计分析各因素之间采用单因素方差分析组间采用 Newman- Keuls 检验分析以 P<0.05 为差异用统计学意义结果. 大黄素对 HepG 细胞增殖的影响不同浓度大黄素处理 HepG 细胞 48 h 采用 MTT 法对各组细胞活力进行检测结果显示随着大黄素浓度的增加细胞活力逐渐降低 (P< 0.05) 见图 a:p < 0.05; b:p < 0.0 图不同浓度大黄素处理 HepG 细胞后的细胞凋亡率加 caspase- 活化断裂后 4 kd 活性片段 (cleaved caspase-) 在 50 μmol/l 和 00 μmol/l 大黄素存在时含量也提高图 a:p < 0.05; b:p < 0.0 不同浓度大黄素处理 HepG 细胞后的细胞活力. 大黄素对 HepG 细胞凋亡的影响在加入不同浓度大黄素处理 HepG 细胞 48 h 后采用流式细胞术对各组细胞进行凋亡检测结果显示随着大黄素浓度的增加细胞凋亡率逐渐升高 (P<0.05) 见图.3 大黄素对 HepG 细胞内质网相关凋亡分子活性的影响采用蛋白印迹比色法检测内质网相关凋亡蛋白 caspase- CHOP 和 GRP78 的含量见图 3 结果显示随着大黄素浓度的逐渐增加 caspase- CHOP 和 GRP78 的含量逐渐增加 CHOP 和 caspase- 的含量在 0 μmol/l 大黄素存在时增加 GRP78 则在 00 μmol/l 大黄素存在时含量增图 3 不同浓度大黄素对 HepG 细胞 ERS 表达的影响 3 讨论肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一其恶性度高早期不易诊断而丧失手术机会肝癌细胞对化疗不敏感且易发生耐药常规化疗药物对正常细胞的损害均导致肝细胞癌的治疗困难重重 [0-] 中草药高效低毒的抗肿瘤作用也越来越得到国际社会的承认 [] 研究表明大黄素具有抗肿瘤活性其机制可能与诱导肿瘤细胞凋

4 第期党中峰等 : 大黄素诱导对内质网应激相关蛋白表达及肝癌 HepG 细胞凋亡的影响 53 亡逆转肿瘤细胞多药耐药抑制癌基因表达影响肿瘤细胞周期等有关 [3-4] 有关 ERS 与细胞凋亡之间联系的研究受到密切关注 ERS 反应性细胞凋亡在肿瘤发生发展过程中起着关键性作用通过干预诱导肿瘤细胞产生 ERS 所介导的凋亡是一种新的治疗思路 GRP78 是特异性存在于内质网膜上的一种蛋白质因其与蛋白质折叠修饰的密切关系被称为内质网分子伴侣其表达水平的上调被认为是细胞发生 ERS 的标记 [5] caspase- 位于内质网腔内并在内质网内活化蛋白水解酶是内质网特 [6-7] 有的 caspase 其活化是凋亡的中心环节 CHOP 的激活是 ERS 反应的直接结果 ERS 发生时 CHOP 可通过转录抑制抗凋亡因子 B 细胞淋巴瘤 / 白血病 - 蛋白的表达引起细胞凋亡 [8-9] 当发生 ERS 时细胞内非折叠蛋白反应以及内质网内钙失衡使 caspase- 活化断裂产生 4 kd 的活性片段诱导 GRP78 CHOP 等分子伴侣相关蛋白表达增加继而激活非细胞色素 C 依赖的 caspase-9 和 caspase-3 引起级联反应诱导凋亡本研究将大黄素作用于 HepG 细胞后通过 MTT 法发现大黄素对 HepG 细胞生长抑制作用有明显的浓度依赖性蛋白印迹法检测到 GRP78 CHOP 与 caspase- 的表达增强 caspase- 活性增高说明大黄素可激活 ERS 提示大黄素抑制 HepG 细胞增殖可能是通过 ERS 通路诱导细胞凋亡来实现的参考文献 [] Groenendyk J Agellon L B Michalak M. Coping with endoplasmic reticulum stress in the cardiovascular system [J]. Annual Review of Physiology 03 75(6): [] Gardner B M Pincus D Gotthardt K et al. Endoplasmic reticulum stress sensing in the unfolded protein response [J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 03 5(3): 369. [3] Liu D Zhang M R Yin H C. Signaling pathways involved in endoplasmic reticulum stress- induced neuronal apoptosis [J]. International Journal of Neuroscience 03 3(3): [4] Tabas I Ron D. Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress [J]. Nature Cell Biology 0 3(3): [5] Clarke R Cook K L Hu R et al. Endoplasmic reticulum stress the unfolded protein response autophagy and the integrated regulation of breast cancer cell fate [J]. Cancer Research 0 7(6): [6] Schonthal A H. Endoplasmic reticulum stress and autophagy as targets for cancer therapy [J]. Cancer Letters (): [7] 苏河田宏伟马云涛等. 大黄素联合 5- 氟尿嘧啶对人胃癌细胞 MKN45 增殖抑制及诱导凋亡 [J]. 兰州大学学报 : 医学版 0 37(4): 0-3. [8] Wei W T Lin S Z Liu D L et al. The distinct mechanisms of the antitumor activity of emodin in different types of cancer (Review) [J]. Oncology Reports 03 30(6): [9] Yu J Q Bao W Lei J C. Emodin regulates apoptotic pathway in human liver cancer cells [J]. Phytotherapy Research 03 7(): [0] Lau W Y Sangro B Chen P J et al. Treatment for hepatocellular carcinoma with portal vein tumor thrombosis: the emerging role for radioembolization using yttrium- 90 [J]. Oncology 03 84(5): [] Hernandez-Gea V Toffanin S Friedman S L et al. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma [J]. Gastroenterology 03 44(3): [] Li X Yang G Y Li X X et al. Traditional Chinese medicine in cancer care: a review of controlled clinical studies published in chinese [J]. PloS One 03 8(4): e [3] Shrimali D Shanmugam M K Kumar A P et al. Targeted abrogation of diverse signal transduction cascades by emodin for the treatment of inflammatory disorders and cancer [J]. Cancer Letters 03 34(): [4] Singh K B Trigun S K. Apoptosis of Dalton's lymphoma due to in vivo treatment with emodin is associated with modulations of hydrogen peroxide metabolizing antioxidant enzymes [J]. Cell Biochemistry and Biophysics 03 67(): [5] Jones P G Nawoschik S P Sreekumar K et al. Tissue distribution and functional analyses of the constitutively active orphan G protein coupled receptors GPR6 and GPR78 [J]. Biochimica Et Biophysica Acta (6): [6] Wang H X Zhang D M Zeng X J et al. Upregulation of cytochrome P450 J3/-epoxyeicosatrienoic acid inhibits apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes by a cas-

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马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼,

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat