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辙顶毛
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1 广西医科大学学报 JOURNAL OFGUANGXIMEDICAL UNIVERSITY 2018 May ;35(5) 623 新生树鼠句乙型肝炎病毒感染模型体内 IL-10 及 IL-18 的表达 * 范倪 1, 陆玉秀 2, 唐艳萍 1, 李科志 1, 何盼 1, 曹骥 1, 杨春 1 (1. 广西医科大学附属肿瘤医院, 南宁 ;2. 广西医科大学第三附属医院南宁 ) 摘要目的 : 观察新生树鼩乙型肝炎病毒 (HBV) 感染模型外周血及肝组织白介素 (IL)-10 及 IL-18 的表达方法 : 对 16 只新生期树鼩接种人 HBV,6 只未接种病毒的新生期树鼩为用 PCR- 荧光探针法检测血清 HBV-DNA 含量, 电化学发光免疫分析法检测乙肝标志物确定感染组 (HBsAg 阳性或 HBV-DNA 阳性 )分别于接种后第 8 第 12 第 16 第 20 第 24 周, 用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 法检测外周血 IL-10 IL-18 水平变化, 接种后第 24 周用实时荧光定量 PCR(qPCR) 法检测肝组织 IL-10 IL-18mRNA 相对表达量结果 : 接种后第 8 周,HBsAg 阳性 5 只,HBV-DNA 阳性 9 只乙肝标志物及 HBV- DNA 均为阴性 HBV-DNA 组接种后第 12 第 16 第 20 周血清 IL-10 水平明显高于 (P<0.05),血清 IL-10 水平高于, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 接种后第 12 第 16 第 20 周,树鼩血清 IL-18 水平明显高于 (P<0.05); 接种后第 8 第 12 第 16 第 20 周,树鼩血清 IL-18 水平明显高于 (P < 0.05) 与比较,和 IL-10 mrna 相对表达量均显著升高, IL-18 mr- NA 相对表达量显著升高 ( 均 P<0.05) 结论:IL-10 IL-18 在树鼩体内 HBV 感染模型中的表达水平升高, 两者在 HBV 感染慢性化过程中起重要作用关键词慢性乙型肝炎 ;IL-10;IL-18; 树鼩 ; 乙型肝炎病毒中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : X(2018) DOI: /j.cnki /r TheexpresionsofIL-10andIL-18inneonataltreeshrewwithhepatitisBinfection FanNi 1,LuYuxiu 2,Tang Yanping 1,LiKezhi 1,HePan 1,CaoJi 1,Yang Chun 1.(1.The Afiliated Tumor HospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2.TheThirdAfiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530031,China) Abstract Objective:Toinvestigatetheexpressionsofinterleukin(IL)-10andIL-18inneonataltreeshrew withhepatitisbinfection.methods:sixteenneonataltreeshrewswereinfectedwithhumanhepatitisbvirus (HBV),and6non-vaccinatedtreeshrewswereusedascontrols.Serum HBV-DNAlevelandthe mrna expressionsofil-10andil-18inlivertissuesweredetectedbyreal-timefluorescencequantitativepcr (qpcr).thelevelsofil-10andil-18inserum were measuredbyenzyme-linkedimmunosorbentassay (ELISA).Results:Of16treeshrews,5caseswereHBsAgpositiveand9caseswereHBV-DNApositive.At week12,16and20afterinfectionofhbv,hbv-dnapositivetreeshrewshad markdelyhigherlevelsof IL-10andIL-18thancontrols(P <0.05),butnosignificantdiferenceinIL-10levelbetweenthe HBsAg positivesandcontrols(p>0.05).after12,16and20weeksofinfection,theserumil-18levelwasnotably increasedinhbsagpositivetreeshrewscomparedwiththecontrols(p<0.05).themrnaexpressionsof IL-10andIL-18wereup-regulatedinHBsAgorHBV-DNApositivesthanthatincontrols,andwerehigher in HBsAgpositives(P<0.05).Conclusion:IL-10andIL-18werehighlyexpressedintreeshrewsinfectedby HBV,whichplaysanimportantroleintheprocessofchronicHVBinfection. Keywords chronichepatitisb;il-10;il-18;treeshrews;hbv * 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ) 通信作者, cxl_yang@163.com 收稿日期 : 机体感染乙型肝炎病毒 (hepatitisb virus, HBV) 后可有不同的表现形式和预后, 分为急性感染阶段慢性感染阶段无症状携带病毒肝硬化及 [1] 肝癌等急性感染性乙型肝炎通常呈自限性过

2 624 程, 病毒在机体内很快被清除, 常被称为免疫清除 ; 慢性乙型肝炎感染阶段机体可产生免疫耐受, 乙肝病毒在体内保持持续复制状态 ; 无症状携带病毒者临床表现轻微或无症状, 病毒可持续复制也可处于静止期目前认为免疫调节失衡是慢性乙型肝炎的主要致病机制, 其主要表现为 Th1/Th2 免疫失衡 [2] Th1 细胞可分泌干扰素 (IFN)-γ 白介素 (IL)-2 IL- 18 等, 诱发细胞免疫直接清除病原体如病毒细菌寄生虫等, 同时导致肝细胞损伤 Th2 细胞可分泌 IL-10 IL-6 等免疫因子, 诱导 B 淋巴细胞的体液免疫反应, 抑制 Th1 所诱导的免疫损伤, 使病毒持续复制, 使机体产生免疫耐受当 Th1/Th2 平衡向 Th2 倾斜时, 即 Th2 细胞处于高分泌状态, 抑制 Th1 细胞因子的产生及其对病原体的直接清除作用, 机体形成免疫耐受, 病毒持续复制, 机体的慢性感染持续存在本研究通过观察新生期树鼩接种人 HBV 后 24 周内外周血 IL-10 IL-18 水平的变化, 探讨 Th1/Th2 细胞因子在树鼩慢性乙型肝炎发病机制中的作用 1 材料与方法 1.1 感染血源选用 HBsAg HBeAg 和 HBcAb3 项指标均为阳性且 HBV-DNA 拷贝数 copies/ml (HBV 基因亚型为 C 型 ) 的慢性乙型肝炎患者的血清作为感染源, 患者同意并签署知情同意书, 分离血清, 分装后置于 -80 冰箱中保存 1.2 动物来源及处理本实验 22 只新生期树鼩均为成年树鼩 ( 购自昆明动物研究所 ) 雄雌合笼后自然受孕所产出的幼仔, 随机分为和感染组 (n=16), 感染组于出生后第 1 第 3 天分别接种 300μLHBV 感染者血清, 不作任何处理饲养环境保持 25~ 28, 湿度 60% ~80%, 每日清洁 2 次 [3] 本实验所有动物处置均符合动物伦理学要求 1.3 样本采集血清采集分别于接种后第 8 第 12 第 16 第 20 第 24 周经股静脉采血约 1.2mL, 室温下静置 30min,4 3000r/min 离心 15 min, 取血清, 置于 -80 冰箱中保存肝组织采集接种后第 24 周, 肌肉注射氯胺酮 (0.1mL/100g) 和腹腔注射 0.1% 戊巴比妥钠 (0.3 ml/100g) 全身麻醉后, 开胸, 取肝组织约 100mg, 一部分立即放入液氮中, 之后置于 -80 冰箱中保存 ; 另一部分置于 10% 中性福尔马林液中固定 1.4 观察指标肝组织病理学观察 10% 中性福尔马林液中固定 24h 后, 常规脱水透明浸蜡石蜡包埋, 4μm 连续切片, 行苏木精伊红 (HE) 染色, 显微镜下观察肝组织病理学形态乙肝标志物及 HBV-DNA 病毒载量检测用电化学发光免疫分析法定量检测乙肝标志物, 在本院检验科完成, 试剂盒购自北京科美生物技术公司 ; 用 PCR- 荧光探针法检测血清 HBV-DNA 含量, 在本院实验研究部完成, 试剂盒购自中山达安生物技术有限公司血清 IL-10 IL-18 蛋白水平的检测取血清, 平衡至室温后, 采用 ELISA 检测血清中 IL-10 IL-18 的水平 ELISA 检测试剂盒购自深圳雅安达科技生物有限公司, 严格按照试剂盒说明书进行操作荧光定量 PCR(qPCR) 法检测肝组织 IL- 10 IL-18 mrna 相对表达量提取肝组织总 RNA, 逆转录成 cdna, 采用美国安捷伦 Mx3000p 型 PCR 仪进行 PCR 扩增反应, 反应条件 :95 预变性 30s;95 变性 5s 60 退火 34s,95 延伸 15s, 共 40 个循环 ; 添加熔解曲线以 GAPDH 为内参, 采用 2 - Ct 法计算目的基因的相对表达量引物序列见表 1 表 1 引物序列基因名称序列产物长度 /bp IL-10 上游 5 -CACCTACTTCCCAGCCAACC 下游 5 -TCAGCAGAGACTCACTCAGCAAC-3 IL-18 上游 5 -CTGACAGTAATAAATCCCAGGTCAA 下游 5 -AAGGAAAGAGTTTTGTTCTCACAGG-3 GAPDH 上游 5 -AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 下游 5 -GGGGCCATCCACAGTCTTC-3

3 范倪, 等. 新生树鼩乙型肝炎病毒感染模型体内 IL-10 及 IL-18 的表达统计学方法使用 SPSS19.0 统计软件对数据进行分析处理, 计量资料以均数 ± 标准差 ( x±s ) 表示, 组间比较采用两独立样本 t 检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 树鼩血清 HBV 感染标志物和 HBV-DNA 检测情况接种后第 8 周, 可检测出 1 次 HBsAg 阳性树鼩 5 只 (31.25%), 为, 1 次 HBV- DNA 阳性树鼩 9 只 (56.25%), 为 HBV-DNA 阳性组 2.2 树鼩血清 IL-10 水平 HBV-DNA 组接种后第 12 第 16 第 20 周血清 IL-10 水平明显高于 (P <0.05);血清 IL-10 水平高于, 但差异无统计学意义 (P>0.05), 见表树鼩血清 IL-18 水平接种后第 12 第 16 第 20 周,树鼩血清 IL-18 水平明显高于 (P<0.05); 接种后第 8 第 12 第 16 第 20 周,树鼩血清 IL-18 水平明显高于 (P <0.05), 见表 3 表 2 树鼩血清 IL-10 水平 ( μg /L, x±s ) 组别 8 周 12 周 16 周 20 周 24 周与比较, * P< ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±18.36 * 37.16±17.46 * 33.42±21.41 * 35.55±41.37 表 3 树鼩血清 IL-18 水平 ( μg /L, x±s ) 组别 8 周 12 周 16 周 20 周 24 周与比较, * P< ± ± ± ± ± ± ±13.63 * 76.00±29.20 * 70.03±28.69 * 80.17± ±54.21 * 37.00±51.80 * ±53.60 * ±75.68 * ± 树鼩肝组织中 IL-10 IL-18 mrna 相对表达量 qpcr 结果显示 : 树鼩接种人 HBV 后第 24 周, 和肝组织中 IL- 10mRNA 相对表达量均较明显升高 (P < 0.05);IL-18 mrna 在和 HBV- DNA 阳性组中的表达均高于,与比较差异具有统计学意义 (P <0.05), 见表肝组织病理学观察 HE 染色后显微镜下观察, 发现较肝组织病理形态学无明显变化,仅 1 只 (1/5) 可见少量单核或淋巴细胞浸润, 2 只 (2/9) 有炎性改变, 无炎性改变, 见图 1 表 4 树鼩肝组织中 IL-10 及 IL-18mRNA 相对表达量 ( x±s ) 组别 IL-10 IL-18 与比较, # P< ± ± ±3.004 # 4.668±2.455 # 4.996±4.123 # 3.310±2.763

626 A: ;B: ;C: 图 1 树鼩肝组织病理学改变 (HE, 400) 3 讨论慢性乙型肝炎的致病机制主要是免疫反应介导的损伤 Th1 类细胞主要分泌 IFN-γ IL-2 IL-3 IL-18 等细胞因子, 介导细胞免疫, 直接清除病原体 ; Th2 类细胞主要分泌 IL-10 IL-4 IL-5 IL-6 等, 刺激 B 淋巴细胞增生, 产生相应抗体, 诱导体液免疫反应,

4 626 A: ;B: ;C: 图 1 树鼩肝组织病理学改变 (HE, 400) 3 讨论慢性乙型肝炎的致病机制主要是免疫反应介导的损伤 Th1 类细胞主要分泌 IFN-γ IL-2 IL-3 IL-18 等细胞因子, 介导细胞免疫, 直接清除病原体 ; Th2 类细胞主要分泌 IL-10 IL-4 IL-5 IL-6 等, 刺激 B 淋巴细胞增生, 产生相应抗体, 诱导体液免疫反应, 对免疫损伤及感染慢性化有重要影响 [4] 在慢性乙型肝炎患者体内,Th1/Th2 细胞比例及其分泌的细胞因子失衡可能是 HBV 感染慢性化的主要机制 [5] IL-18 是由活化的巨噬细胞 T 细胞 NK 等细胞产生的一类免疫调节因子 [6-7] IL-18 介导免疫损伤, 促进 Th1/Th2 免疫平衡向 Th1 方向发展, 诱导 IFN-γ IL-2 等产生, 从而抑制病毒复制, 促进病毒消除过程并有利于肝功能恢复 ; 同时激发宿主对 HBV 的免疫应答, 促进非特异性免疫, 可导致一定程度的肝损伤 [8-9] 有临床研究显示, 慢性乙肝患者不同时期血清 IL-18 水平均明显高于健康人群 [10] IL-10 主要由 Th2 细胞产生, 具有抗炎和诱导免疫耐受双重作用 [11] IL-10 在免疫反应中主要起抑制作用, 通过抑制 Th1 细胞产生 IFN-γ IL-2 等免疫因子, 从而达到抑制 Th1 细胞应答的目的 [12] 有研究显示, 在慢性乙肝患者体内, 外周血 IL-10 蛋白较健康人群表达量升高 [13] 本研究显示, 接种 HBV 的新生树鼩血清 IL- 10 IL-18 分泌持续高于, 说明人 HBV 成功感染新生树鼩, 并激活树鼩体内的免疫应答 HBV 感染树鼩后,IL-18 水平升高可能导致 Th1 细胞分泌 IFN-γ 等水平上升, 从而抑制 HBV 复制, 促进病毒消除过程 ; 体内相关免疫细胞大量分泌 IL-10, 又可能抑制 Th1 细胞因子的释放, 使病毒清除过程受阻宿主体内 Th2 细胞免疫反应增强可能是促进 HBV 慢性感染的重要因素此外, 本研究发现, 树鼩感染 HBV 后第 24 周肝组织 IL-10 IL-18 mrna 相对表达量高于, 进一步验证 IL-10 IL-18 在乙肝慢性感染过程中可能起重要作用的推测感染组肝组织病理形态学改变不明显, 仅偶见单核细 [14] 胞淋巴细胞浸润等炎性小灶, 与 Wang 等观察结果相似, 考虑树鼩肝组织对 HBV 病毒的免疫应答反应较弱, 免疫损伤轻微慢性乙型肝炎症状持续半年 ( 即 24 周以上 ) 可诊断为慢性乙肝感染 [15] 本研究中,IL-10 和 IL-18 在新生树鼩感染 HBV 后 24 周内均呈较高水平, 两者之间的拮抗关系不明显,Th1/Th2 失衡不明显, 可能的原因为 : 第一, 观察时间较短, 细胞因子尚处于相互拮抗的动态平衡阶段, 细胞因子之间的优势应答未显现 ; 第二, 影响体内免疫因子分泌的因素众多,IL-10 IL-18 水平变化并不能互相影响分泌状态本研究通过观察新生树鼩感染 HBV 后 IL-10 IL-18 水平变化, 发现新生树鼩可出现与人感染 HBV 相似的免疫应答,Th1/Th2 细胞因子可能在 HBV 感染慢性化过程中起到重要作用有研究表明, 利用外源 IL-10 干扰机体免疫平衡, 可抑制 HBV 感染 [16] 而外源性 IL-18 是否能够提高机体细胞免疫能力, 诱导 IFN-γ 释放, 从而减低外源给予 IFN-γ 所引起的不良反应,IL-10 及 IL-18 是否有可能成为监测早期 HBV 感染的指标, 仍有待进一步研究本研究树鼩体内 HBV 感染模型的建立为今后进一步研究人慢性乙型肝炎的致病机制及防治药物的研发奠定基础参考文献 : [1] BISWASA,PANIGRAHIR,PAL M,etal.Shiftinthe hepatitisbvirusgenotypedistributioninthelastdec- adeamongthehbvcarriersfromeasternindia:possi- bleefectsonthediseasestatusandhbvepidemiology [J].JMedVirol,2013,85(8): [2] JAFARZADEH A,SHOKRIF.TH1andTH2responsesareinfluencedbyHLAantigensinhealthyneonates vaccinatedwithrecombinanthepatitisbvaccine[j].iran JAlergyAsthmaImmunol,2012,11(4): [3] 梁亮, 李瑗, 杨春, 等. 树鼩实验室繁殖及育幼的

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中华医学会肝病学分会中华医学会感染病学分会 Ó Ñ Ñ Ñ Ñ Ò Ò Ò Ó Ó Ò Ó Ñ Ò Ò Ó Ò Ò Ñ Ò Ñ Ñ Ò Ò Ñ Ñ Ñ Ò Ó Ò Ò Ñ Ó Ò Ò Ó Ó Ñ Ó Ó Ó Ò Ò Ó Ò Ó Ó Ò Ò Ò Ñ Ó Ò Ñ Ò Ò Ñ Ò Ò Ò Ó Ò Ô 中华医学会肝病学分会中华医学会感染病分会慢性乙型肝炎防治指南年更新版中华实验和临床感染病杂志