图书在版编目 数据 酶与酶工程 袁勤生主编 版 上海 华东理工大学出版社 普通高等教育生物类专业规划教材 酶 袁 酶学高等学校教材 酶工程高等学校教材 中国版本图书馆 数据核字 第 号 普通高等教育 十一五 国家级规划教材现代生物化学工程丛书 酶与酶工程 第二版 主 编 袁勤生 责任编辑 焦婧茹 责

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3 图书在版编目 数据 酶与酶工程 袁勤生主编 版 上海 华东理工大学出版社 普通高等教育生物类专业规划教材 酶 袁 酶学高等学校教材 酶工程高等学校教材 中国版本图书馆 数据核字 第 号 普通高等教育 十一五 国家级规划教材现代生物化学工程丛书 酶与酶工程 第二版 主 编 袁勤生 责任编辑 焦婧茹 责任校对 金慧娟 封面设计 王晓迪 裘幼华 出版发行 华东理工大学出版社有限公司地 址 上海市梅陇路 号 电 话 营销部 编辑室 传 真 网 址!"#$$#%&$'# &% 电子邮箱!"#$$#%&$'# &% 官方微博 # # % (#%&$'!"#$$ 印 刷 常熟华顺印刷有限公司 开 本 (() (( 印 张 字 数 千字 版 次 年 月第 版 年 月第 版印 次 年 月第 次 书 号 定 价 元 本书如有印装质量问题 请到出版社营销部调换

4 本书编委会 主 编 袁勤生 华东理工大学生物工程学院 教授 博导 副主编 赵 健 华东理工大学生物工程学院 教授 王凤山 山东大学药学院 教授 博导 编委 以姓氏笔画为序 王凤山 山东大学药学院 教授 博导王富军 上海中医药大学 副教授李素霞 华东理工大学生物工程学院 副教授吴兴中 复旦大学上海医学院 教授 博导张兴群 东华大学化工与生物工程学院 副教授张晓彦 华东理工大学生物工程学院 博士范立强 华东理工大学生物工程学院 副教授郑伟娟 南京大学生命科学学院 教授胡红雨 中科院上海生物化学与细胞研究所 研究员 博导赵 健 华东理工大学生物工程学院 教授袁勤生 华东理工大学生物工程学院 教授 博导

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6 前 言 世纪生命学科日新月异的发展 促进了酶与酶工程的发展 酶与酶工程的发展过程其实就是人类如何认识酶 改造酶和构建新酶 又如何利用酶的过程 酶与酶工程并非是一门纯粹的学科 它与基因工程 蛋白质工程 细胞工程 发酵工程及生物技术等密切相关 共同形成了相互渗透交叉的不可分割的整体 为适应当前新技术的发展 我们在原书基础上重新编写了 酶与酶工程 这本专业书籍 本书除保留原书的基本内容外 还增加了许多新的内容 由于酶与酶工程涉及的内容十分广泛 故我们在编写过程中对章节的安排 内容的新颖性 深度和广度作了适当的调整 特别增加了酶的研究方法和应用方面的内容 这样使本书既有酶学的基础理论 又有研究热点和最新的研究进展 全书分三篇共 章 第 章至第 章为酶理论篇 第 章至第 章为酶工程篇 是本书的重点 主要内容有酶的分离工程 非水介质中酶的催化反应 组合生物催化 酶的固定化技术 新酶的发现与筛选 生物酶工程 化学酶工程 酶抑制剂设计与药物开发以及酶的信号传导等内容 第 章至第 章为酶应用篇 重点介绍酶在工业 医药 食品 环境 能源上的应用以及极端酶的开发应用 本书的参编者大多是原编委 新增加的编委山东大学王凤山教授 南京大学郑伟娟教授 复旦大学吴兴中教授和东华大学张兴群副教授 他们都是这个领域的著名专家 他们目前都承担着繁重的科研教学工作 还专门挤出时间积极参与本书的撰写工作 在此表示衷心的感谢 另外 本书主编的研究生也参与了书稿的电脑输入 图表制作和文稿校对 因此本书是集体智慧的结晶 也是集体创作的成果 由于作者较多 各人从事研究的内容又不同 因此文字风格 表达方式会不一致 再加上本人琐事繁忙和学术水平有限 书中难免出现错漏或不足之处 恳切希望广大读者批评指正

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8 第一篇酶理论 1 1 酶与酶工程 酶学研究概况 从分子水平研究酶的结构与功能 用分子生物学方法改进酶的催化特性及设计新酶 酶结构与功能关系的研究 基因工程酶 酶的蛋白质工程构建 构建新酶 核酶 抗体酶 模拟酶和分子印迹酶 核酶 抗体酶 模拟酶 分子印迹酶 酶工程中的若干研究热点 非水介质中的酶反应 组合生物催化 生物催化的重要课题 酶法拆分 开辟酶生物转化合成的新途径 开发极端环境条件下的新酶种 发挥酶和微生物在环境整治中的作用 9 参考文献 10

9 2 酶与酶工程 2 酶的分类与命名 酶的系统分类和命名 同工酶 多酶系统 酶的辅因子 酶的理化特性 酶的高效性 酶的专一性 酶容易失活 酶的活性调节 新型酶 19 参考文献 19 3 酶的作用与机理 酶活性中心的概念 影响酶催化效率的因素 邻近效应与定向效应 底物形变和诱导契合 酸碱共同催化 共价催化 疏水环境的影响 金属催化 酶的活性部位柔性的假说 酶的活性丧失和整体构象变化的关系 酶活性部位的柔性 酶活性部位柔性和整体结构刚性的实例 辅因子在酶促反应中的作用 金属激活酶和金属酶 辅酶 29 参考文献 37 4 酶的催化反应动力学 酶的活性 酶活力的表示方法 酶活力单位 酶促反应动力学 底物浓度对酶促反应速率的影响 酶浓度对酶促反应速率的影响 温度对酶促反应速率的影响 48

10 目 录 ph 对酶促反应速率的影响 激活剂对酶促反应速率的影响 抑制剂对酶促反应速率的影响 多底物反应的动力学 多底物反应的类型 多底物反应的酶促动力学 酶抑制动力学 抑制作用的类型 可逆抑制作用的分类 可逆抑制作用的酶促反应动力学 不可逆抑制剂 可逆抑制剂 64 参考文献 65 5 酶的活性调节 通过配体诱导酶构象改变的活性调节 配体和蛋白质的结合 变构酶 通过酶共价结构改变的活性调节 共价结构不可逆改变的活性调节 共价结构可逆改变的活性调节 代谢途径中酶活性的调节 磷酸果糖激酶 磷酸化酶 酶的转换 酶合成的调节 酶降解的调节 94 参考文献 95 第二篇酶工程 97 6 酶的分离工程 酶分离纯化的一般原则 建立一个可靠和快速的测活方法 酶原料的选择 酶的提取 酶的提纯 酶的纯度检验 酶提取方法的选择 101

11 4 酶与酶工程 生物材料的破碎 抽提方法 酶纯化方法的选择 调节酶溶解度的方法 根据酶分子大小 形状不同的分离方法 根据酶分子电荷性质的分离方法 根据酶分子的极性进行分离的方法 根据酶分子的专一性结合的方法 酶的结晶 对各种纯化方法的评价 127 参考文献 非水介质中酶的催化反应 非水介质中酶的催化反应及其特征 非水介质中酶的结构与性质 非水介质中酶的结构 非水介质中的酶学性质 微水有机溶剂的影响与反应介质工程 水的作用及其调控 有机溶剂的影响与反应介质工程 酶的选择与催化剂工程 酶在非水介质中的催化反应 酯酶和脂肪酶的酯合成反应 转酯反应及酸酐水解反应 糖苷键的水解核形成 C-N 键反应 肽的合成 C-C 键形成 还原反应 氧化反应 C-X 的反应 卤化反应 异构化反应 150 参考文献 组合生物催化 组合生物催化的理论和特点 理论基础 组合生物催化的特点 组合生物催化中的酶 生物催化组合合成 用于组合生物催化反应中酶的特点 155

12 目 录 组合生物催化的类型 非水介质中的生物催化 酶作为组合合成的脱保护工具 固定化酶催化 组合生物催化实例 构建小分子库 构建天然产物库 展望 165 参考文献 酶的固定化技术 概述 酶的固定化 微生物酶的固定化 微生物生活细胞的固定化 细胞器及动植物细胞的固定化 酶的固定化方法 酶的固定化方法 微生物的固定化方法 整细胞的固定化方法 细胞器的固定化方法 动植物细胞的固定化 固定化酶 ( 细胞 ) 的性质及评价指标 固定化酶 ( 细胞 ) 的性质 固定化酶 ( 细胞 ) 的评价指标 固定化酶 ( 细胞 ) 反应器 填充床反应器 (PBR) 恒流搅拌罐反应器 (CSTR) 流化床反应器 空心纤维反应器 其他类型反应器 192 参考文献 新酶的发现和筛选 新酶的来源 微生物新酶的获得途径及优劣比较 从市场供应的酶库中筛选 从微生物菌种保藏库筛选 从自然界筛选产酶微生物 196

13 6 酶与酶工程 从基因克隆库中筛选 新酶筛选的策略 新酶筛选的一般规律 生物反应过程中的用酶设计 建立高效的筛选方法 从自然界中筛选产酶微生物的一般方法与步骤 样品采集 富集培养 纯种分离 初筛 复筛 高产菌株的选育 从基因组 DNA 筛选酶的方法 基于机理的新酶设计 206 参考文献 生物酶工程 酶的基因克隆和异源表达 酶基因克隆的基本步骤 酶基因克隆的常用方法 酶的异源表达 酶理性设计与定点突变 酶的遗传修饰与理性设计 酶定点突变方法 酶的定向进化 酶分子定向进化的基本原理 酶分子定向进化的策略 定向进化的应用 酶的半理性设计 融合蛋白和融合酶 融合蛋白与融合酶简介 融合蛋白与融合酶的构建策略 融合蛋白与融合酶的制备 融合蛋白与融合酶的应用 249 参考文献 化学酶工程 酶的化学修饰 酶的化学修饰反应 254

14 目 录 影响酶化学修饰的主要因素 修饰程度和修饰部位的测定 酶化学修饰的应用 酶的亲和修饰 酶化学修饰的专一性控制 酶化学修饰实例 SOD 的化学修饰 模拟酶 环糊精模拟酶模型 大环聚醚及其模拟酶 胶束体系及其模拟酶 聚合物及其模拟酶 金属卟啉及其模拟酶 肽酶 氧化酶的模拟 过氧化物酶的模拟 SOD 的模拟 分子印迹酶 分子印迹概念 分子印迹技术的分类 分子印迹聚合物的制备 分子印迹酶 304 参考文献 酶抑制剂设计与药物开发 天冬氨酸蛋白酶类抑制剂 血管紧张素转化酶 HIV 蛋白酶抑制剂的设计 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶抑制剂 抑制剂的设计 丝氨酸蛋白酶抑制剂 体内凝血过程中丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用 Xa 因子的抑制剂 组合肽库法 半胱氨酸蛋白酶 半胱氨酸蛋白酶在人体内的病理学作用 溶酶体半胱氨酸蛋白酶 (LCP) 溶酶体半胱氨酸蛋白酶的结构和作用机理 322

15 8 酶与酶工程 酶原激活 溶酶体半胱氨酸蛋白酶的天然抑制剂 半胱氨酸蛋白酶抑制剂的设计 肽基醛型半胱氨酸蛋白酶抑制剂 缩氨基脲型半胱氨酸蛋白酶抑制剂 酶抑制剂研究进展 酶抑制剂药物的现状 酶抑制剂药物的研发模式 酶抑制剂药物研究展望 328 参考文献 酶的信号传导 鸟嘌呤核苷三磷酸水解酶 (GTPase) 的信号传导 G 蛋白的基本特征 结构特点 活化的作用机制 GTPase 参与的信号传导 核苷酸环化酶的信号传导 腺苷酸环化酶 (AdenylylCyclase,AC) 的信号传导 鸟苷酸环化酶的信号传导 磷脂酶介导的信号传导 磷脂酶的概述 磷脂酶的结构 磷脂酶参与的信号传导 349 参考文献 353 第三篇酶应用 酶在工业上的应用 工业酶的应用现状 工业酶制剂的来源及特点 工业酶制剂国内外产业化现状 酶在轻工业上的应用 酶在原料处理方面的应用 酶在轻工业产品制造上的应用 酶在化工方面的应用 酶在其他方面的应用 加酶洗涤剂 加酶牙膏 366

16 目 录 加酶饲料 加酶护肤品 367 参考文献 酶在医药上的应用 酶类药物 与治疗胃肠道疾病有关的酶类药物 与治疗炎症有关的酶类药物 与溶解血纤维有关的酶类药物 具有抗肿瘤作用的酶类药物 药典收载的酶类药物 诊断用酶 根据体液内酶活力的变化诊断疾病 用酶测定体液中某些物质量的诊断疾病 酶在药物制造方面的应用 青霉素酰化酶制造半合成抗生素 β 酪氨酸酶制造多巴 核苷磷酸化酶制造阿糖腺苷 无色杆菌蛋白酶制造人胰岛素 多核苷酸磷酸化酶生产聚肌胞 378 参考文献 酶在食品工业上的应用 酶在食品保健方面的应用 食品除氧保鲜 食品灭菌保鲜 酶在淀粉类食品生产方面的应用 葡萄糖的生产 果葡糖浆的生产 环状糊精的生产 酶在蛋白质类食品生产方面的应用 氨基酸的生产 明胶的生产 干酪的生产 肉类的嫩化 酶在果蔬类食品生产方面的应用 柑橘罐头防止白色浑浊 果蔬制品的脱色 酶在果汁生产中的应用 385

17 10 酶与酶工程 酶在甜味剂生产中的应用 385 参考文献 极端酶的开发与应用 嗜热极端酶 嗜热极端菌 嗜热极端酶的种类及应用 嗜热极端酶的耐热机理研究 嗜冷极端酶 嗜冷极端微生物 低温酶 低温酶耐冷或嗜冷机理的研究 嗜盐酶 嗜盐微生物 嗜盐酶及其应用 嗜盐酶的耐盐机理 嗜碱菌及碱性酶的研究和应用 嗜碱菌 碱性酶 酸性酶 嗜酸极端微生物 酸性酶的种类及应用 耐压酶类 耐压菌和嗜压菌 嗜压酶和耐压酶 耐有机溶剂酶 耐重金属微生物及相应酶 结论和展望 407 参考文献 酶在环境治理方面的应用 酶与环境保护 酶在环境污染治理中的应用 酶在废水处理工程中的应用 酶在石油和工业废油处理工程中的应用 酶与白色污染治理 酶与环境监测 酶与污染土壤修复 412 参考文献 418

18 目 录 酶在能源方面的应用 燃料乙醇及其生产 燃料乙醇简介 发酵法生产燃料乙醇的原料 发酵法生产燃料乙醇的酶 发展中的燃料乙醇生产用酶制剂 氢气及生物制氢 生物法制氢 生物燃料电池 生物燃料电池的工作原理 生物燃料电池的分类 酶生物燃料电池 生物柴油及其制备 生物柴油的理化性能与制备 生物酶催化生物柴油制备 生物酶催化生物柴油制备的制约因素 固定化脂肪酶制备生物柴油 全细胞催化剂用于生物柴油制备 生物工程技术改造脂肪酶和超临界流体中的酶催化 脂肪酶催化生产生物柴油研究中存在的问题 437 参考文献 437

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21 酶与酶工程 酶 * +,(# 是由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质 一切生命活动都是由代谢的正常运转来维持的 而代谢中的各种反应都是在酶的参与下进行的 从这个意义上说 没有酶就没有生命 因此研究酶的结构与功能 性质及作用机理对于阐明生命现象的本质具有十分重要的意义 酶学研究概况 要准确地说出酶是在什么时候 由谁首先发现的是很困难的 人们很早就感觉到酶的存在 但是真正认识它 利用它还是近百年的事 从我国记载的资料得知 多年前的夏禹时代酿酒已盛行 酒是酵母发酵的产品 约 年前 古人利用含淀粉酶的麦曲将淀粉降解为麦芽糖 制造了饴糖 用曲治疗消化不良症也是我国人民的最早发现 曲富含消化酶和维生素 至今仍是常用的健胃药 在国外 人们对酶的认识也与发酵和消化现象有关 年! 曾将肉块放入小巧的金属笼内 然后让鹰把小笼吞下去 过一段时间后 他把小笼取出来 发现笼内的肉块消失了 这可能是酶催化试验的开端 年 -,# 和 #"$ 从麦芽的水抽提物中 用酒精沉淀得到一种遇热不稳定的活性物质 它可促使淀粉水解成可溶性的糖 他们把这种物质称之为淀粉酶 / -$'-$# 酶 的概念源自希腊文 意为 在酵母中 0#-$' 虽然酶的提出是针对酵母 但也适用于所有的非有机酵素 尽管人们利用微生物中的酶已有几千年的历史 但直到 年 &%1 #" 发现了不需要完整细胞的酶也表现出活力 酶学的研究才真正开始 世纪初 酶学得到了迅速发展 一方面发现了很多的酶 另一方面在物理 化学技术发展的影响下 年 %1-#. $ 和 # '# 总结了前人的工作 根据中间学说提出了酶促反应动力学原理 米氏学说 这一学说的提出 对酶反应机理的研究是一个重大突破 年 &((#" 从刀豆中得到脲酶结晶 这是第一个酶结晶 并证实这种结晶催化尿素水解 产生 和氨 提出酶本质就是一种蛋白质 但这个观点直到若干年后获得了胃蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶的结晶才被普遍接受 &((#" 因此而获得 年的诺贝尔化学奖 现已发现生物体内存在的酶有 多种 而且每年都有新酶发现 迄今为止 数百种酶已纯化达到了均一纯度 大约有 多种酶得到了结晶 由于蛋白质分析 分离技术的飞速发展 特

22 酶与酶工程 第二版 别是在运用 射线衍射分析等方法后 人们相继弄清了溶菌酶 个氨基酸残基 胰凝乳蛋白酶 个氨基酸残基 羧肽酶 个氨基酸残基 多元淀粉酶 个氨基酸残基 等的结构和作用机理 世纪 年代 酶被发现有相当的柔性 因此 $1.- 提出了诱导契合理论 以解释酶的催化理论和专一性 同时也发现了某些酶的催化活性与生理条件变化有关 年 及其同事提出了变构模型 用以定量解释有些酶的活性可以通过结合小分子 效应物 进行调节 从而提供了认识细胞中许多酶调控作用的基础 年首次报道了由氨基酸单体化学合成牛胰岛素核酸酶 虽然这是一个很大的进展 但其纯度和活性很低 化学合成只是证明了酶和非生物催化剂没有区别 / 重组技术用于酶学研究得到了高度重视 用定点突变法在指定的位点突变 可以改变酶的催化活性与专一性 有助于认识酶的作用机理 并为设计特定需要的酶奠定了基础 如乳酸脱氢酶的专一性可以通过在活性部位引入 个特定的氨基酸侧链突变成为苹果酸脱氢酶 最近发现除了经典酶以外 某些生物分子也有催化活性 年 #%1 小组发现 四膜虫的 " 前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工 催化得到成熟的 " 产物 就是说 本身可以是一个生物催化剂 被称之为 +,(# 考察酶研究的历程可知 对酶的研究一直沿着两个方向发展 理论研究和应用研究 前者主要指酶的分子结构 理化性质及催化作用机理的研究 后者主要指酶的生产 应用及酶工程研究 酶研究不仅深刻影响生物化学乃至整个生物学领域 而且促进了化学和药物研究的发展 不难看出 随着科学的发展 人们对酶有了更深的认识 本章拟从以下几个方面探讨酶的研究热点 从分子水平研究酶的结构与功能 结构研究中最难的是研究酶的动态结构 如何追踪酶的动态变化仍然是至今未能很好解决的大问题 现在采用 停留法 是以毫秒计 而使用温度或其他跳跃方法虽可以把时间分辨精度提高到微秒水平 但仍很难真实地观察酶的动态结构 酶的结构与功能研究是酶学研究的核心问题 长期以来主要集中在化学结构与功能关系的研究上 世纪 年代 出现了基因定点突变技术 可以很方便地采用分子生物学的方法研究酶的结构与功能的关系 年代 开展了酶的空间结构与功能关系的研究 并证实酶活性部位的构象变化先于整体构象变化 并与活性丧失同步 这一点已被甘油醛 磷酸脱氢酶 核糖核酸酶和肌酸激酶的活性部位引入荧光或自旋探测剂的结果所证实 用分子生物学方法改进酶的催化特性及设计新酶 酶结构与功能关系的研究 以基因手段及蛋白质定点突变修饰改进酶的特性及设计新酶种是一个革命性导向 而成败的基础在于对自然酶精确的静态及动态结构与催化功能的深入认识 也依赖于对基因模板

23 酶与酶工程 分子结构与蛋白质合成机制的大量了解 但人类对这一关键问题的研究并未深化 在实验研究设计中往往带来很大的盲目性 片面性和偶然性 因而必须首先对功能基因组充分了解 必须阐明酶催化的分子机理 酶分子结构与构象变化的关系 结构与立体专一性 稳定性与变性态 体内多酶系统的定位及高效率催化等 基因工程酶对重要实用性的酶进行基因突变 重组 克隆与高效表达 构建优良的工程菌 以及酶的分子设计与定点突变化学修饰 以改造酶的结构组分 活性 稳定性 特异性及催化功能等 开辟酶的新用途是目前生物技术发展的主流方向 开发工业用基因工程酶 如美国 21# " %'3 #"4 5-(.# 公司用重组 / 技术发展高稳定性 高活力的脂肪酶应用于去污工业 丹麦 6 公司克隆 淀粉酶基因重组工程菌 7 使产酶速度提高 倍 产酶量超过 倍 活力达 万 6 单位 毫升 此外 还构建了耐热的 淀粉酶 脂肪酶工程菌用于工业生产 针对我国酶工业及医药工业的重大应用问题 我国已开展了有 淀粉酶适合于乙醇发酵的基因工程菌 淀粉酶基因克隆到枯草杆菌中得到表达 此外 用 / 重组技术 使葡萄糖异构酶在 中表达 热稳定性提高到 8 以上 在细胞中酶蛋白含量为 8 此外 我国还开展了多聚糖酶 青霉素酰化酶 尿激酶原 单链尿激酶 葡激酶 链激酶 超氧化物歧化酶 凝乳酶 聚酮合成酶 色氨酸合成酶 硫霉素生物合成酶 溶菌酶等的研究工作 在 世纪 我们应认真选择一些具有重大应用前景 酶源少又有特殊用途的酶进行基因改良 使其在环境治理 药物合成等方面发挥作用 酶的蛋白质工程构建用定点突变 化学修饰技术改进工业 医药 环境用酶的催化特性与功能是不容忽视的研究领域 已引起人们的极大关注 例如 脂肪嗜热芽孢杆菌中性蛋白酶 其结构类似于 21#"3 (.,$ 27 两大结构域 以 螺旋连接 将连接处 5., 改为 7#& 使得这种突变酶提高活力 洗涤效果好 安全致敏性为 -" $ #"9 酶的 对丝氨酸蛋白酶的定位突变或活性部位单向性化学修饰 也改善了酶的稳定性及氨解 水解比值 使酶催化适合于药物多肽的合成 六个点突变的 & '. $ 其稳定性提高了 倍 活力提高了 倍 而 & '. $ 突变酶的稳定性提高了 倍 我国进行了以医用为主的蛋白质或酶的蛋白质工程 如胰岛素 尿激酶原 天花粉蛋白 胰蛋白酶及抑制剂 枯草杆菌蛋白酶 凝乳酶 葡萄糖异构酶及金属硫蛋白等 对这些天然酶的改造 已奠定了很好的技术基础 定点突变技术只对某些氨基酸进行替换 删除 添加或修饰 但并不能够从根本上动摇酶的高级结构 这种位点突变对酶功能的改建存在一定局限性 而在认识基因组功能 进行基因位点突变并通过多代遗传后 将会构建出非天然的全新设计功能酶和蛋白质 当然也可以用 扩增进行任意无序突变 重组筛选和传代获得全新结构的功能酶 例如在非水溶剂中催化的工程酶 这是 世纪人类对自然的艰巨挑战

24 酶与酶工程 第二版 构建新酶 核酶 抗体酶 模拟酶和分子印迹酶 核酶广义地说 核酶包括酶和脱氧核酶两类 其生化本质分别是小分子的 和 / 核酶最早由美国. "- 大学的 #%1 和.'(- 发现 是一种小分子 具有自身催化剪接功能 又称催化 或 催化剂 因此 他们于 年获得诺贝尔化学奖 核酶的发现开辟了生化研究的一个崭新领域 突破了酶是蛋白质这一传统概念 此后 科学家们陆续发现了多种天然和人工合成的核酶 这些酶具有水解酶 激酶 氨基乙酸转移酶等各种酶活性 当前已有多种核酶类药物进入临床或临床前期试验 其主要机理是作为分子剪刀使相关病毒 或 / 受到破坏 从而发挥抗病毒及抗肿瘤作用 脱氧核酶还可以用于抑制有害基因的表达 该类药物的优点是几乎不引起抗体的免疫反应 抗体酶抗体酶是一类具有催化活性的免疫球蛋白 其可变区被赋予了酶的属性 故也被称为催化抗体 它催化的反应多达十余种 如氧化还原反应 酰基转移反应 金属螯合反应 闭环反应 有机酯 碳酸酯水解反应 立体选择性的内酯反应 酰胺键的生成反应等 抗体酶的制备方法很多 有诱导法 引入法 拷贝法 化学修饰法 分子印迹法 基因工程法等 其机理均源于酶反应的过渡态理论 实际上 抗体酶活性中心就是一种天然酶的过渡态类似物 抗体酶的催化效能可接近天然酶 单链抗体酶还具有相对分子质量小 免疫原性低 容易透过组织膜 易从血液中清除以及不在肾中积累等优点 它的另一个重要特点是可以利用抗体能与抗原结合的特异性制备杂合抗体 因此也是研究抗体导向的靶向药物的一种重要手段 抗体导向的抗体酶药物前体治疗 ',3/ "#%'# +,(# " "&9 21#"-!, 3 / 2 通过在肿瘤细胞附近靶向激活药物前体 使之转化为细胞毒性物质直接作用于肿瘤细胞的治疗 图 图 示意图

25 酶与酶工程 模拟酶模拟酶又称人工合成酶, +,(#$ 是利用有机化学方法设计和合成的一些较天然酶更简单的非蛋白质分子 以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程 模拟主要从三方面进行 整体模拟 活性中心模拟 类似简单模拟 模拟酶在结构上必须具有两个特殊部位 底物结合位点和催化位点 按照模拟酶的属性可将其分为主客体酶 胶束酶 肽酶和分子印迹酶等 其中主客体酶中几种比较成功的模型有环糊精酶模型 冠醚酶模型 杂环化合物与卟啉类模型等 以环糊精酶模型为例 环糊精,%. #:'" / 是由多个 / 型葡萄糖以 糖苷键聚合成环状 磷酸吡哆醛与磷酸吡哆胺是转氨酶的辅酶 将磷酸吡哆胺连在 环糊精的 % 原子上 可以模拟转氨酶 在模拟酶方面 固氮酶的模拟最令人瞩目 如过渡金属 ;# 等 的氮配合物 过氧化氢酶的金属 ;#& 等 配合物 虽然现在模拟酶的催化活性仅有少量能达到天然酶的活性 但是随着蛋白质结构学和化学技术的发展 一定会有更好的模拟酶替代天然酶应用于工业生产 那时人们就可以用化学的方法构建出各种性能高效的模拟酶 为生产和生活服务 分子印迹酶从分子水平上模拟酶的功能是当今最富挑战性的课题之一 &. 研究小组在 年首次报道成功地制备出分子印迹聚合物 印迹分子 " '.#%&.# 也叫做模板分子 2#(!.-'#2 当它与带有官能团的单体分子接触时 会形成多重的作用点 待聚合后 这类作用点就会被固定下来 模板分子除去后 聚合物中就形成了与模板分子在空间上互补的多重作用位点的结合部位 这就是分子印迹实验技术 利用分子印迹技术产生对底物的特异性结合部位 将催化官能团以确定的排列引入结合部位 从而制备出具有催化活性的聚合物 就是分子印迹酶 当以天然的生物材料 如蛋白质和糖类物质为骨架 在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔时 则称为生物印迹 图 - 6 等利用枯草杆菌蛋白酶的抑制剂 %2," 在水溶液中与这种酶作用 印迹后干燥 再用有机溶剂去除抑制剂后放入无水有机溶剂中 结果发现 经过抑制印迹的酶活性比无抑制剂存在时的冷冻干燥酶要高 倍 图 非水相生物印迹酶制备示意图

26 酶与酶工程 第二版 大量研究表明 适当的设计印迹分子和具有催化基团的功能单体 将稳定过渡态和催化基团的准确定向结合起来是提高模拟酶活性的关键 目前利用此技术已成功地制备出具有酶水解 转氨 脱羧 酯合成 氧化还原等活性的分子印迹酶 生物印迹酶的研究还处于初始阶段 利用以蛋白质等为骨架的印迹酶会更接近于天然酶 酶工程中的若干研究热点 酶工程是生物技术的一个重要组成部分 酶工程是指在一定的生物反应器内 利用酶的催化作用 进行物质转化的技术 其应用范围已遍及工业 医药 化学分析 环境保护 能源开发和生命科学理论研究等各个方面 近年来 美国 欧盟国家和日本 在酶工程研究和应用方面发展非常迅速 继续在酶工程领域居于领先地位 在进入 世纪知识经济时代的今天 我们一定要紧紧跟踪国际酶工程领域的最新动向 本着 有所为 有所不为 的原则 明确我们的研究方向 制订我们的研究计划 为此 根据我们的一些认识和体会 简要介绍国际上酶工程若干热点课题 供有关人员在选题时作参考 非水介质中的酶反应在传统概念中 酶是催化水溶性底物的反应 在有机溶剂中不仅不能反应 还会引起酶蛋白的变性 但实验证明 这种想法是片面的 许多酶在无水或含微水 8 的有机溶剂中 酶不仅能催化特殊反应 而且反应稳定性会显著提高 由于酶的反应介质的改变 使酶具备了不少水相中所不具备的特点 如 有利于疏水性底物的反应 能明显提高酶的热稳定性 能催化在水中不能进行的反应 能改变反应的平衡点 具有可控制的底物专一性 可防止由水引起的副反应 易于实现固定化 产物易回收 便于清除产物和底物的抑制作用 可避免微生物污染等 目前已证实在非水介质中酶可催化 键的形成 键的反应 键的形成 氧化反应 异构化反应等 由于有机相酶催化反应的诸多特点 故受到研究人员的广泛关注 目前已有不少比较成熟的工业应用 如脂肪酶 酯酶用于生产精细化工产品 有机相中用酶法拆分生产手性药物等 组合生物催化组合生物催化 ( -' " -. %-'-.,$ $ 是酶催化 化学催化和微生物转化在组合化学中的应用 即通过对先导化合物的生物转化产生库 组合生物催化技术的应用大大加快了产生新化合物的速度 经过良好设计的组合化学库还可以大大提高化合物结构的多样性 生物催化的重要课题 酶法拆分手性化合物因分子内含有一个或多个不对称碳原子而具有不同的性质 有时同一药物的两个对映体的药效和毒性甚至可相差几十到几百倍 有鉴于此 美国 ; 申明 外消旋药物不得作为单一化合物对待 新药上市要尽可能以单一手性异构体形式出售 消旋药物申请时需要同时提供两个对映体的全部数据 这一政策极大地促进了手性药物的发展 目前化学合成的市售药物有 种 具有手性的药物有 种 以单一手性药物出售的仅为 种 到 手性药物销售额已达到市售总额的 8 市售金额超过 亿美元 其经济效益巨大

27 酶与酶工程 生物催化最重要的特性是专一性 包括立体专一性 强 因此酶工程将在手性药物合成和手性拆分方面大有用武之地 开辟酶生物转化合成的新途径 酶或微生物细胞作为催化剂用于手性药物及有机物的合成工业已初见成效 酶合成的专一性及选择性较化学合成具有明显优势 是有机合成化学领域的一个重大进展 酶或微生物催化的立体异构性 如羟化 环氧化 水解 对映体拆分 药物中间体合成 其中一些反应用化学法是难以进行的 已实现工业化或准工业化的酶法或微生物法合成包括 类固醇合成 类萜合成 生物碱合成 半合成抗生素合成 核苷酸类合成 胺及日用化学品合成等 此外 酶法修饰的蛋白质 多肽 脂蛋白 多糖 糖酯类及多核苷酸等药用生物大分子具有很高的医疗保健价值 酶法合成亦已渗透到非天然物质的合成与转化 应用于化学和电子工业 例如微生物或脂肪合成光学纯药物的中间体 手性醇 高特异性脱氢酶用于酮对映体的选择性还原 氯过氧化物酶用于合成手性过氧化物及醇 过氧化物酶亦用于抗生素专一的功能基的氧化及合成物甲醛的聚酚 原料用于合成抗氧化剂 紫外线吸收剂及环氧化物 固定化葡萄糖苷转移酶直接合成可溶于非水相中的 / 丁基葡萄糖苷及其酯衍生物 生产纯度高 生物可降解的非离子表面活性剂 可用于无刺激性化妆品 用氧腈水解酶 醛缩酶 丙酮酸脱羧酶及醛连接酶催化 键合成以生产精细化合物 大多数醇脱氢酶及羟类固醇脱氢酶 催化羟酮基的氧化还原制备药物 信息素 甾类 三羧酸配合物及合成纤维素等 乙内酰脲酶 氨甲酰酶及氨基酸脱氢酶从相遇的乙内酰脲还原氧化酮酸到纯 7 氨基酸作为药物 多肽不对称合成的模板原料 微生物内酯水解酶专一水解 / 泛解酰内酯到 / 泛酸 是制备四粒添加剂及药物的手性原料 活性部位导向性修饰丝氨酸蛋白酶活性部位 $ 基上甲基化变为蛋白合成酶用于不可逆的大肽链合成 醛缩酶合成多种糖及衍生物 环化核酶合成表面 活性剂烷基 糖苷 还有酶法合成低卡路里糖及健康食品 异麦芽寡糖 糖基化转移酶可合成有医用价值的糖基化蛋白质 此外 氧酶合成链烯氧化物 乙醇氧化酶用于醛合成 仲醇脱氢酶用于合成酮 脱羧酶催化合成邻苯三酚 这些都是酶促生产化工原料的成功例证 开发极端环境条件下的新酶种 近来 人们从生产实践的需要出发 非常重视发现新的酶种 特别注意从极端环境条件下生长的微生物内筛选新的酶种 其中主要研究嗜热微生物 21#"(!1.#$ 嗜冷微生物 $,%1"!1.#$ 嗜盐微生物 -.!1.#$ 嗜酸微生物 %!1.#$ 嗜碱微生物. -. 3!1.#$ 嗜压微生物 -"!1.#$ 等 目前 人们已经发现能够在 条件下生长的嗜热微生物 能够在 条件下生长的嗜冷微生物 能够在! 为 条件下生长的嗜酸微生物 能够在! 为 条件下生长的嗜碱微生物 能够在饱和食盐溶液 含盐 8 或 (.7 中生长的嗜盐微生物 能够在 - 条件下生长的嗜压微生物等 这就为新酶种和酶的新功能的开发 提供了广阔的空间 其中人们对嗜热微生物的研究最多 耐高温的 淀粉酶和 / 聚合酶等也已获得广泛的应用 发挥酶和微生物在环境整治中的作用 环境污染已成为制约人类社会发展的主要瓶颈之一 我国年废水排放量达 亿吨 年废弃二氧化硫和烟尘排放量达 万吨 工业固体废物达 亿吨 垃圾围城 蓝天绿水

28 酶与酶工程 第二版 不再 我国环境污染的规模已经达到十分严重的地步 美国也有大量被污染的土地 淡水和海水区域 据估计 在美国仅恢复被污染的土地就要耗资 亿美元 生物技术是解决环境问题的一种基本工具 它能提供保护以及恢复环境的新途径 微生物在环境治理方面能发挥举足轻重的作用 最成熟的活性污泥废水处理技术就是依靠微生物酶的作用 人们已经证实微生物是自然界基本的循环器 微生物及其酶系可以有效分解纤维素 木质素 脂肪 烷烃 芳香烃 某些人工多聚物等 因此微生物可以在造纸 石油化工 纺织印染 食品加工 炸药 冶金 杀虫剂 除草剂 洗涤剂 电镀 生物污水等被污染环境中发挥巨大作用 参考文献 袁勤生 赵健 酶与酶工程 上海 华东理工大学出版社 张今 曹梳桂 罗贵民 等 分子酶学工程导论 北京 科学出版社 %1( / " % < -&'#"#'-. &$'" -. %-'-.,$ $' -,- ' ( "" -'&"# 邹承鲁 酶学研究现状与展望 中国生物化学与分子生物学报 7 "# 9 #'-. #'-9# (#%1-.# 9 9$ &"%# # +,(# $% 6#",< &" -.-'-.,$ $ '1#" #. #'-. #%# '!" 9"#$$ '1# #$ 9 - $, '1#$ $ -"' % -.# +,(#2#'"-1# ".'-( "- #'-./ "#%'# #6.&' # %-'-.,' %-%' 6 ',&$ 9'1# -""#.$%-. -'&"#. / #'-./# 6 #$ 9 %-'-.,$'$&""! 1#(. 李校 袁辉 基因工程药物的制备原理与应用 广州 暨南大学出版社 #.#" #'-.* +,(#$ "%1#( %-.$, '1#$ $-'&"#

29 酶的分类与命名 酶的种类繁多 结构 性质各异 这给酶的研究和分类带来很大的困难 仅在生物体内发现的酶就达 多种 而且还不断有新的酶被发现和合成 因此对酶进行科学的分类和命名十分重要 酶的系统分类和命名 目前国际上通用的酶的分类方法是国际生物化学和分子生物学联合会 '#" -' -. = %1#( $'",-.#%&.-". 9,= 的命名委员会 (# %.-'&"# (3 ( '## 于 年提出的系统分类法 根据酶催化的化学反应的性质 将酶分为六大类 分别 用数字 表示 表 表 酶的分类 编号 酶的分类 催化反应的性质 氧化还原酶类 : "# &%'-$#$ 氧化还原反应 转移酶类 2"- $ #"-$#$ 分子间基团转移 水解酶类, ".-$#$ 水解反应 裂合酶类 7,-$#$ 消除反应 产生双键 异构酶类 $ (#"-$#$ 分子内的重排反应 连接酶类 7 9-$#$ 依赖于 2 水解的分子之间的合成反应 在每一个酶的大类中 再根据底物中被作用的基团或键的特点 分为若干亚类 如第一大类氧化还原酶类中又依次分为作用于 基团的第一亚类 作用于醛基或酮基的第二亚类等 几个亚类 也依次用阿拉伯数字表示 每一个亚类中再按照反应的特点分为若干亚亚类 如第一大类氧化还原酶类中作用于 基团的第一亚类 又根据接受电子的受体不同分为以 / > 或 / > 为受体的第一亚亚类 以细胞色素为受体的第二亚亚类等 个亚亚类 同样依次用阿拉伯数字表示 每一种酶根据其催化反应的性质和反应的特征归入各亚亚类中 依次排序 也用阿拉伯数字表示其在亚亚类中的顺序号 这样根据系统分类

30 酶与酶工程 第二版 法 每一种酶都在这个分类表中有一个确定的位置 属于特定的类 亚类 亚亚类中的特定排序 如果分别用 个阿拉伯数字表示该酶所属的类 亚类 亚亚类以及在亚亚类中的特定排序 则每一个酶都可以获得一组独有的 由 个阿拉伯数字组成的编号 编号前加上 * 表示酶学委员会 * +,(# (( $$ 的缩写 构成酶的特征编号 如甘油脱氢酶 5.,%#"./#3 1, " 9# -$# 的编号是 * 表示该酶属于氧化还原酶类 作用于底物的 基团 以 / > 或 / > 为电子受体 在这一亚亚类中排在第 个 酶的这种系统分类的原则是相当严格的 一种酶只可能有一个编号 新发现的酶可以按照这一分类系统得到适当的编号 从酶的编号也可以了解酶催化反应的性质和作用特点 因此得到了科学界的普遍认可 = 于 年公布酶的系统分类报告后 在 年之前经过数次修改和补充 年以后则利用网络进行及时更新 1'! %1#(?(&.-%& & ( 年之前 酶的命名非常混乱 往往是沿用习惯名 缺乏系统性和科学性 常常出现一酶数名或一名数酶的情况 给科学研究和交流带来很大的不便 为了改变这种状况 = 建议 每一种酶都给予一个系统名和一个习惯名 系统名要求明确标明酶的底物和催化反应的性质 因此系统名由底物名称和催化反应类型两部分组成 如葡萄糖异构酶 如果有两个或两个以上的底物 则需要标明所有底物名称 不同底物名称之间用 隔开 如乳酸 / > 脱氢酶 如果底物之一是水 则通常水可以略去不写 如乙酰胆碱 水乙酰水解酶通常写作乙酰胆碱乙酰水解酶 习惯名有的是根据酶作用的底物来命名的 如催化淀粉水解的淀粉酶 催化蛋白质水解的蛋白酶等 有的还加上酶的来源以区别不同来源的同一类酶 如胃蛋白质酶 胰蛋白酶等 有的根据酶催化反应的性质来命名 如水解酶 氧化酶 还原酶等 有的则根据酶的底物结合反应性质来命名 如乳酸脱氢酶 葡萄糖氧化酶等 绝大多数酶的英文习惯名以 -$# 为后缀 如 7 9-$# 连接酶, ".-$# 水解酶 等 但少数例外 如 #!$ 胃蛋白质酶 2",!$ 胰蛋白酶 等 习惯名的命名没有统一的原则 缺少系统性 但是一般比较简单 直观 使用方便 所以直到现在还在使用 但是酶学委员会规定 在以酶为主要论题的文章中 首先要将酶的编号 系统命名和来源标示清楚 然后可以按照个人习惯 使用习惯名或系统名 同工酶 生物体内有些酶可以催化相同的化学反应 但是分子结构 理化性质都不同 这样的酶称为同工酶或同功酶 $ +,(# 或 $ # +,(# 产生同工酶的原因有多种 = 建议只将其中由于编码基因不同而产生的不同分子结构的酶称为同工酶 也称基因性同工酶或原级同工酶 有同一基因编码 但经历不同的转录后加工或不同的翻译后加工而产生的结构不同的酶称为次级同工酶 在生物体中 一种酶的同工酶在不同组织 器官中的分布和含量不同 形成组织特异性的同工酶谱 反映各组织的不同功能 不同的同工酶由于对底物的亲和力不同 并受不同因素的调节 常表现出不同的生理功能 因此同工酶只是做相同的 工作 催化同一个反应 却不一定有相同的功能 最典型的同工酶是乳酸脱氢酶 7/ 同工酶 7/ 是由 肌肉型 心肌型 两种肽

31 酶的分类与命名 链组成的四聚体 在脊椎动物的不同组织中发现有 种 7/ 同工酶 其亚基组成分别为 和 这些酶在体内分布不同 如 主要分布在骨骼肌中 主要分布在心肌中 功能也不同 如 主要在骨骼肌中催化丙酮酸还原为乳酸 主要在心肌中催化乳酸脱氢生成丙酮酸 酶的系统分类和命名无法区分不同的同工酶 为了更准确地描述某种同工酶需要指明同工酶的类型 多酶系统 有些酶由一条多肽链组成 如牛胰核糖核酸酶 溶菌酶等 有些酶虽然由几条多肽链组成 但是肽链间通过二硫键共价相连 如胰凝乳蛋白酶由 条肽链组成 肽链间通过 对二硫键连接成一个整体 这些酶都称为单体酶 (#" %* +,(# 有些酶由两个或两个以上的亚基组成 亚基之间依靠次级键相连 亚基可以是相同的 也可以是不同的 如己糖激酶由 个相同亚基组成 而琥珀酸脱氢酶由 个 亚基 个 亚基组成 这样的酶称为寡聚酶. 9 (#" %* +,(# 有的时候若干种酶依靠非共价键结合在一起 依次催化一系列相关的反应 酶学委员会建议将这样一组酶称为多酶复合物 &.' # +,(# (!.#: 或者多酶体系 &.' # +,(#,$3 '#( 如催化脂肪酸合成的 种酶和 种非酶载体蛋白共同组成脂肪酸合成酶系 多酶复合物要注意与多功能酶区别 多功能酶是指一种酶蛋白具有多种催化活性 如逆转录酶具有依赖于 的 / 聚合酶活性 依赖于 / 的 / 聚合酶活性以及核糖核酸酶 等多种活性 多酶复合物中的每一种酶都有一个系统编号 而多功能酶则是同一种酶具有对应于不同催化活性的多个系统编号 酶的辅因子 从酶的化学组成来看 有些酶完全由蛋白质组成 属于单纯蛋白质 称为单纯酶 (!.# * +,(# 如脂肪酶 胰蛋白酶等 有些酶除了蛋白质组分外 还结合一些对热稳定的非蛋白质小分子或金属离子 属于缀合蛋白质 * +,(# 如细胞色素氧化酶结合了小分子铁卟啉 琥珀酸脱氢酶结合了黄素腺嘌呤二核苷酸 ; / 等 缀合酶中的蛋白质部分称为脱辅酶! # +,(# 非蛋白质部分统称为辅因子 -%3 ' " 脱辅酶与辅因子结合形成的完整复合物称为全酶. # +,(# 根据辅因子的性质及其与脱辅酶结合的紧密程度的不同 辅因子分为三类 辅酶 # +,(# 辅基 " $'1#' % 5" &! 和金属离子 通常辅酶是指与脱辅酶结合比较松散 很容易通过透析等物理方法去除的有机小分子 如辅酶 和辅酶 等 辅基是指以共价键与脱辅酶紧密结合 不能通过透析等物理方法去除 必须经过一定的化学处理才能与脱辅酶分开的小分子化合物 如细胞色素氧化酶中的铁卟啉等 辅酶与辅基的差别只在于它们与脱辅酶结合的牢固程度不同 并无严格的界限 因此虽然在定义上是比较明确的 但在实际使用过程中 常常有混淆 很多维生素或维生素的衍生物可以充当酶的辅酶或辅基 与金属离子紧密结合的酶也被称为金属酶 常见的充当辅因子的金属离子有铜 铁 锌 镁 锰等

32 酶与酶工程 第二版 在化学反应中 脱辅酶部分决定酶催化的专一性和高效率 辅因子则负责传递电子 原子或化学基团 酶的理化特性 酶作为一种生物催化剂 既有一般化学催化剂的共性 也有作为生物催化剂的特性 酶与一般催化剂的共性是 用量少而催化效率高 只能改变化学反应的速度 不改变化学反应的平衡点 酶本身在化学反应前后也不改变 可以降低反应的活化能 但是作为生物催化剂 酶具有下列特性 催化效率更高 具有高度的专一性 酶容易失活 酶活力受调控 酶活力与辅因子有关等 酶的高效性以 (. 为单位进行比较 酶的催化效率比化学催化剂高 倍 比非催化反应高 倍 以过氧化氢的分解反应为例 (. 过氧化氢酶可以催化 ) (. 的分解 而 (.;# > 只能催化 ) (. 的分解 相差 倍 酶催化反应的高效率与其能大幅度降低反应的活化能有关 在一个化学反应体系中 各个分子所含能量不同 只有具有较高能量 处于活化状态的分子即活化分子才能在分子碰撞时发生化学反应 反应物中活化分子所占比例越高 反应速率越快 在一定温度下使 (. 底物全部进入活化态所需要的自由能称为活化能 %3 ' 6-' * #"9, 反应的活化能越高 反应体系中被活化的分子数越少 反应速率越慢 而催化剂可以与反应物结合 形成过渡态化合物 降低图 酶促反应可以降低反应的活化能反应的活化能 从而加快反应速率 图 与非酶催化剂相比 酶可以更多地降低反应活化能 如上述过氧化氢分解反应 没有催化剂存在时 反应的活化能为 <(. 反应速率为 有铁催化剂存在时 反应的活化能为 <(. 反应速率为 ) 过氧化氢酶催化反应时 反应的活化能降低到 <(. 反应速率则提高到 ) 酶的专一性酶的专一性!#% % ', 是指酶对催化的反应和参与反应的底物有严格的选择性 即一种酶只能催化一种或一类反应 作用于一种或结构相似的一类底物 一般催化剂没有这样严格的选择性 如氢离子可以催化淀粉 脂肪 蛋白质等多种物质的水解 而不同的淀粉酶只能催化淀粉中不同糖苷键的水解 不同的蛋白酶只能催化蛋白质中相应肽键的水解 不同的脂肪酶只能催化脂肪中相关酯键的水解 酶作用的专一性是酶最重要的特点之一 也是酶与一般催化剂最主要的差别 不同的酶专一性不同 有的酶只能作用于一种底物 底物结构有细微变化 酶就不能作用 如脲酶只能作用于尿素 而不能作用于尿素的各种衍生物 图 这种专一性称为绝对专一性 $.&'#!#% % ',

33 酶的分类与命名 图 脲酶的绝对专一性 有的酶专一性比较低 可以作用于结构相似的一类化合物 这种专一性称为相对专一性 #.#-' 6#!#% %3 ', 相对专一性分为两种类型 一种称为 族专一性 或 基团专一性 指一种酶只作用于含有特定功能基团的底物分子 这种酶作用于特定的化学键 并且对键两端的基团有一定的要求 一般对其中一个基团要求严格 对另一个要求不严格 如 / 葡萄糖苷酶可以催化 糖苷键的水解 并且要求键的一端必须是葡萄糖残基 对另一端的 基团则要求不严 因此该酶可以催化各种 / 葡萄糖苷衍生物的水解 图 另一种相对专一性称为 键专一性 指一种酶只作用于含有特定化学键的底物分子 对键两端的基团没有严格要求 如酯酶催化酯键的水解 对底物中酯键两端的 基团没有任何限制 图 键专一性比基团专一性的专一程度更低 图 葡萄糖苷酶的基团专一性 图 酯酶的键专一性 有些酶还具有立体专一性 '#"# $!#% % ', 即当底物具有立体异构体时 酶只能作用于其中的一种异构体 酶的立体异构专一性包括旋光异构专一性和几何异构专一性两类 前者是指当底物具有旋光异构体时 酶只能作用于其中的一种 如 7 氨基酸氧化酶只能催化 7 氨基酸氧化 对 / 氨基酸没有作用 葡萄糖氧化酶只能催化 / 葡萄糖的氧化 不能作用于 / 葡萄糖 后者是指当底物具有几何异构体时 酶只能作用于其中的一种 如延胡索酸水化酶只能作用于反丁烯二酸 不能作用于顺丁烯二酸 酶的立体专一性还表现在有些酶能够区分从有机化学角度看属于对称分子中的两个等同的基团 只催化其中的一个基团 而不作用于另一个 如甘油激酶催化甘油与 2 分子的反应 甘油是一个对称分子 两个 基团从有机化学角度看完全等同 但是同位素标记实验证明甘油激酶可以区分这两个基团 只催化其中一个 基团发生磷酸化 图 图 甘油激酶的立体异构专一性 以 / > 为辅酶的脱氢酶也具有这样的立体异构专一性 脱氢酶从底物中脱下的氢被加在 / > 的尼克酰胺环的 位上 用同位素氚进行的标记实验证明 不同的脱氢酶对

34 酶 与 酶 工 程 #第 二 版 $ (# )MGb 尼克酰胺 环 10 位 上 的 氢 具 有 严 格 的 选 择 性( 如 酵 母 乙 醇 脱 氢 酶 催 化 的 反 应 只 在 )MGb 尼克酰胺环 10 位的一侧加氢或者脱氢%另 一侧不 被 作 用&图 " -'( 酵 母 乙 醇 脱 氢 酶 的这种专一性被定义为 M 型 专 一 性%凡 是 与 酵 母 乙 醇 脱 氢 酶 一 样%对 )MGb 尼 克 酰 胺 环 10 位上的氢具有同侧专一性的脱氢酶%统称为 M 型 专一 性 酶%如 苹 果 酸 脱 氢 酶 和 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶等,凡是与酵母乙醇脱氢酶对辅酶中氢的选择性不同的脱氢酶%即在尼克酰胺环 10 位 的另 一侧加氢或者脱氢的酶%统称为 ( 型专一性酶%如谷氨酸脱氢酶和! 甘油磷酸脱氢酶等( 图 %,! 以 -(). 为辅酶的脱氢酶的立体异构专一性!! 酶的立体专一性在实际应用中具有指导意义%例如有些药 物只 有某一 种构型才 有生理 效 用%化学合成不能区分立体异构体%得到的只能是消旋产物%而 用酶 催化反 应则可以 进行不 对 称合成或者不对称拆分( 酶的专一性由脱辅酶部分决定%辅因子则负责传递电子)原 子或化学 基团%因此 同一 种辅 因子可以被多种脱辅酶使用%如 )MGb 就是很多脱氢酶的辅酶( 为了 解 释 酶 的 专 一 性%曾 经 提 出 过 几 种 不 同 的 假 说%最 主 要 的 假 说 有 两 种%即 锁 钥 假 说 & U?7]E;:N5D \D3? 9 I5 6 = 6'和诱导契合 假说& & ;:87 5: Y = 9\D3? 9 I5 6 = 6'($%*0 年 B@= FY = 6 Q 提出的锁钥假说把酶比作锁% 底物比作钥匙% 认为整个酶分子的天 然构象 具有 刚性结 构% 7I5 4 酶的活性中心具有特定的结构%底 物 的 结 构 与 酶 活 性 中 心 的 结 构 相 互 吻 合%就 像 钥 匙 与 锁 的 关系一样-图 " +& E'.%以此说明酶与 底 物 结 构 上 的 互 补 性( 锁 钥 假 说 可 以 很 好 地 解 释 酶 的 绝对专一性%但是不能解释相对专一性%尤其是该假说不能解 释酶的 结构既能 与底 物 结合)催 化正反应%又能与产物结合)催化逆反应%因而存在明显的缺陷( $*,% 年 GE;N? 6I F E;: 提出了诱导契合假说%认为酶的结构不是一成不变的%当底物分子 与酶分子相互接近时%酶分子受到底物分子的诱导%其构象发 生有利 于与底物 结合 的 改变%使 酶活性中心的结构与底物结构相互契合-图 " +& >'.( 图 % /! 锁钥假说与诱导契合假说示意图

35 %! 酶 的 分 类 与 命 名 ($!! 近年来通过 L 射线晶体衍射技术对酶与底物结合前后的结构分析数据也证明%酶与 底物 结合时确实发生了显著的构象变化%如己糖 激 酶 与 底 物 G 葡 萄 糖 结 合 前 后 的 构 象 就 发 生 了 明显的变化&图 " %'( 图 % 0! 己糖激酶与底物 ) 葡萄糖结合前后的构象变化!! 诱导契合假说认为酶的活性中心并没有与底物结构互补 的固定 结构%只 是由于 底物 的诱 导才产生了互相契合的结构(该假说既可以解释正反应&酶与 底物 结合'%又 可以解 释逆 反应 &酶与产物结合'%因此被认为较好地解释了酶的专一性( 对于 酶 的 立 体 异 构 专 一 性% $*0% 年 牛 津 大 学 的 M! S! KW6 9?; 曾 经 提 出*三 点 附 着+假 说%来 解 释 酶 为 什么能够区 分 对 映 异 构 体 以 及 从 有 机 化 学 角 度 看 属 于对称分子中 的 两 个 等 同 的 基 团(KW6 9?; 指 出 酶 与 底物结合时%酶分子上的 三 个 位 点& ( )) * )) + )表 示'必 须与底物分 子 四 面 体 碳 原 子 上 的 四 个 基 团 中 的 三 个 特异性& () *) + 表示'结合%因此酶只能与一种 对 映异 构体&! '结 合%而 不 能 与 另 一 种 对 映 异 构 体 &# '结 合(对于有两个相同基团&两 个 ('的 底 物 分 子 &$ '% 图 % 1! 三点附着模型 则只有当其中的 () *) + 能够与酶分子的 Me) ( e) 1e相 匹配时%才能与酶结合%因此只有其中的一个 ( 基团能被酶识别和作用%模型见图 " *( 三点附着假说认为酶与底物的结合依赖于酶与底物中的三 个结合位 点%只有当 这三 个结 合位点都相互匹配时%酶 与 底 物 才 能 结 合 并 催 化 反 应( 一 对 对 映 异 构 体 虽 然 所 有 的 基 团 相 同%但是空间排列方式不同%因此其中必有一种与酶结合时不 能保证 三点都相 互匹 配%而 不能 成为酶的特异性底物(对于存在从 有 机 化 学 角 度 看 属 于 对 称 分 子 中 的 两 个 等 同 基 团 的 底 物 而言%该底物只能以一种方式与酶结合%以保证酶与底物中三 个结合 位点的相 互匹 配%酶 只能 识别这样结合的底物%因此只能产生一种产物( 三点附着模型不仅被用来解释酶的立体专一性%还被用于 解释 配体与 受体结合 的立体 专 一性%在很 长 时 间 内 一 直 被 大 家 所 接 受( 但 是 美 国 加 州 大 学 伯 克 利 分 校 的 N?6I F E;: 和 J E 4在研究异柠檬酸酶的催化活性 时 发 现%只 能 识 别 G 异 柠 檬 酸 的 异 柠 檬 酸 酶 在 特 定 条件下&没有 JW"b 存在时'%也甚至能更易与 U 异柠 檬 酸 结 合%说 明 金 属 离 子 在 酶 与 底 物 的 结合中起着十分重要的作用(进一步的研究发现%还有一些酶 与两 种对映 异构体的 亲和力 相

36 酶与酶工程 第二版 同 但只有一种对映体是真正的底物 另一种则是抑制剂 因此他们认为在酶活性中心还存在着第四个位点 比如说一个金属离子 决定酶分子与 哪一种异构体结合 年 $1.- 和 #$#3 %-" 在 -'&"# 上发表论文 提出了解释酶的立体专一性的新模型 四点定位模型 图 他们认为在 9$' 的三点附着模型中隐含了两个假设 底物只能从一个方向接近酶分子的表面 酶分子的表面是比较平的 四点定位模型则认为底物可以从两个方向接近酶活性中心的结合位点 因此必须有第四个位点来区分两种对映体 图 四点定位模型 酶容易失活绝大多数酶的化学本质是蛋白质 其催化活性依赖于酶蛋白的空间结构 凡是可以导致蛋白质变性的各种理化因素 如高温 极端的! 条件 有机溶剂等 也都能使酶蛋白发生变性 而降低或完全丧失催化活性 因此与一般化学催化剂相比 酶对反应条件极为敏感 反应条件的改变会影响到酶的催化效率 能够使酶保持最高催化效率的反应条件就是酶的最适条件 如最适! 最适温度等 大多数酶的最适条件是比较温和的条件 如常温 常压 接近中性的! 条件等 酶的活性调节酶是在机体内催化各种代谢反应的生物催化剂 生物体的新陈代谢和各种生命活动均离不开酶的作用 生物体内各种酶的作用必须在严格的调控下有序地进行 才能维持代谢平衡和机体的健康 否则就会造成代谢紊乱 产生疾病 甚至死亡 因此机体内各种酶的活性都受到严格的调控 调控的方式主要有酶浓度的调节和酶活性的调节 酶浓度的调节是指依靠对细胞内酶量的调节来调节酶的活性 一是诱导或者抑制酶的合成 比如一些与分解代谢有关的酶类 通常在没有底物存在时 酶并不表达或者只维持低水平的合成 但是在有底物存在时 酶可以被诱导而大量表达 如乳糖的存在可以诱导乳糖分解代谢所需的 半乳糖苷酶 半乳糖苷透过酶等的表达 一些与合成代谢有关的酶类 在缺少相关的合成产物时 酶可以大量表达 但是当产物浓度达到一定水平 就可以抑制酶的合成 如细胞内色氨酸浓度达到一定水平时 可以抑制色氨酸合成酶的表达 另一种情况是调节酶的降解 当不需要某种酶时 可以通过细胞内的蛋白质降解体系降解酶蛋白 有些激素特别是脂溶性激素可以通过与胞内或核内的受体结合 形成激素 受体复合物 充当转录因子诱导某些酶的表达来调节酶活性 如催化哺乳动物乳腺组织中乳糖合成的乳糖合成酶由催化亚基和调节亚基组成 而调节亚基的合成就受到激素水平的调控 在分娩后 激素水平急剧增加 诱导调节亚基大量合成 与催化亚基结合成乳糖合成酶 大量合成乳糖以满足生理需要 酶浓度的调节是一种慢反应 因为酶蛋白的表达涉及基因的转录 转录后加工 翻译和翻译后加工等多个步骤 需要一定的时间 对酶活性的调节是指直接对已经存在于细胞内的酶的活性进行调节 包括共价修饰 别

37 酶的分类与命名 构调节 水解激活等多种方式 相对于酶浓度的调节 酶活性的调节是一种快反应 是对已经存在的酶蛋白进行化学修饰而快速激活或抑制酶的活性 详见第 章 新型酶 年美国化学家 <-(#$-'%1#.#"&( #" 从刀豆中提取得到脲酶 ="#-$# 获得脲酶结晶 并通过进一步的化学检测证明纯化的脲酶是一种蛋白质 这是首次通过实验证明酶的化学本质是蛋白质 年 &( #" 又获得了弹性蛋白酶 -'-.-$# 的结晶 与此同时 < 1 -" "'1"! 用类似的方法于 年获得胃蛋白酶的结晶 以后又相继获得胰蛋白酶 2",!$ 胰凝乳蛋白酶 1,( '",!$ 和羧肽酶 -" :,!#!' -$# 等多种酶的结晶 并证明这些酶都是蛋白质 他们的努力最终使 酶的化学本质是蛋白质 这一观点得到人们的普遍认可 也结束了关于酶的化学本质的争论 &( #" 和 "'1"! 因此而分享了 年的诺贝尔化学奖 但是进入 世纪 年代以后 关于酶的化学本质的问题再次成为热点 年美国科罗拉多大学的 21 (-$#%1 等发现单细胞原生动物四膜虫的 " 前体具有自我剪接功能 并于 年证明其内含子 7 B 具有多种催化功能 与此同时 耶鲁大学的, #,.'(- 等发现大肠杆菌的核糖核酸酶 -$# 的核酸组分 具有催化活性 而其蛋白质部分并没有酶活性 #%1 和.'(- 的发现震惊了世界 挑战了 酶的化学本质是蛋白质 这一传统观念 他们分享了 年的诺贝尔化学奖 以后更多的具有催化活性的 被发现 具有催化活性的 被称为核酶 +,(# 核酶的发现开辟了酶学研究的新领域 对酶的化学本质的认识也被修正为 绝大多数酶的化学本质是蛋白质 少数 也具有催化活性 随着酶学理论和应用研究的不断深入和发展 以及各种相关理论和技术如分子生物学理论 / 重组技术 单克隆抗体技术 化学合成技术等的出现和发展 各种新的酶学概念不断出现 例如 对酶蛋白进行各种化学修饰获得的化学修饰酶 1#( %-. %-' * 3 +,(# 通过基因工程手段对酶蛋白进行定点突变和修饰以改进酶的特性 或者设计新的蛋白质类酶 称为基因工程酶或蛋白质工程酶 " '# * 9 ##" 9* +,(# 以酶反应的过渡态类似物诱导产生的各种具有催化活性的抗体 即抗体酶 +,(# 通过各种化学方法设计和合成的模拟天然酶活性的非蛋白类酶分子 即人工合成酶, +,(#$ 等 因此从酶的来源区分 可以将酶分为天然酶 或者叫生物酶 和化学合成酶两大类 从酶的化学本质出发 可以将酶分为蛋白质类酶和非蛋白质类酶两大类 参考文献,#" /21## +,(#$ " # # 0 " %- #( % "#$$ % / : # ** +,(#$ " # 7 7 9(- $5" &!7' 袁勤生 赵健 酶与酶工程 上海 华东理工大学出版社 袁勤生 现代酶学 版 上海 华东理工大学出版社 吴梧桐 袁勤生 酶类药物学 北京 中国医药科技出版社

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