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1 第 27 卷第 19 期 中国现代医学杂志 Vol. 27 No 年 9 月 China Journal of Modern Medicine Sep DOI: /j.issn 文章编号 : (2017) 基因沉默对肝癌细胞系增殖凋亡及 ERK/RSK2 信号通路的影响 周鸣 1, 余蕾 2, 李琴山 2, 王碧 2, 杨国珍 1 (1. 贵州医科大学医学检验学院, 贵州贵阳 ;2. 贵州医科大学附属医院贵州省产前诊断中心, 贵州贵阳 ) 摘要 : 目的探讨 RNA 干扰介导的巨噬细胞移动抑制因子 (MIF) 基因沉默对肝癌细胞系 与 凋亡的影响及可能的作用机制 方法将 MIF-siRNA 干扰序列转染 与 细胞, 以 Con-siRNA 序列转染的细胞作为对照 采用实时荧光定量聚合酶链反应 (qrt-pcr) 及 Western blot 检测 MIF 沉默效果,CCK-8 法测定细胞增殖情况, 流式细胞术检测细胞凋亡率 采用 Western blot 检测 MIF 沉默后凋亡相关基因 BCL-2 BAX P53 的蛋白水平及细胞外信号调节激酶 (ERK) P90 核糖体 s6 激酶 2(RSK2) 糖原合成激酶 3β(GSK3β) Bad 蛋白水平及其磷酸化水平 结果细胞中 MIF mrna 及蛋白表达水平与比较, 差异有统计学意义 ( <0.05), 低于 ; 两组细胞增殖能力比较, 差异有统计学意义 ( < 0.05),MIF 细胞增殖能力低于 ; 两组凋亡率比较, 差异有统计学意义 ( <0.05),MIF 细胞凋亡率高于 ; 两组细胞 BAX P53 BCL-2 蛋白水平比较, 差异有统计学意义 ( <0.05),MIF 细胞 BAX P53 的蛋白表达水平高于, 而 BCL-2 蛋白水平低于 ; 与细胞中 ERK RSK2 及 Bad 蛋白水平比较, 差异均无统计学意义 ( >0.05), 而与细胞中 GSK3β p-gsk3β p-erk p-rsk2 及 p-bad 蛋白水平比较, 差异均具有统计学意义 ( <0.05) 结论 MIF 基因沉默抑制 与 细胞的增殖能力并促进细胞凋亡可能是通过调节 ERK/RSK2 信号通路实现的 关键词 : 巨噬细胞移动抑制因子 ; 基因沉默 ; 肝癌细胞系 ; 凋亡 ; 细胞外信号调节激酶中图分类号 :R735.7 文献标识码 :A Effect of silencing gene by RNAi on proliferation, apoptosis and ERK/RSK2 signal pathway in hepatic carcinoma cell line MingZhou 1,LeiYu 2,Qin-shan Li 2,BiWang 2,Guo-zhen Yang 1 (1. School of Medical Laboratory Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou , China; 2. Guizhou Provincial Prenatal Diagnosis Center, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou , China) Abstract: Objective To investigate the effect of silencing gene by RNA interference on apoptosis of hepatic carcinoma cell lines and and the potential mechanism. Methods The MIF-siRNA interference sequence was transfected into and cells, Con-siRNA transfected cells were used as the control group. The silencing effect of gene was detected by qrt-pcr and Western blot. The ability of cell proliferation was evaluated by CCK-8 method. The cell apoptosis rate was detected by flow cytometry. The protein levels of Bcl-2, Bax, p53, extracellular signal-regulated kinase (ERK), p-erk, p90 ribosomal s6 kinase 2(RSK2), p-rsk2, glycogen synthase kinase 3 茁 (GSK3 茁 ), p-gsk3 茁,Bad and p-bad were tested by Western blot. Results The expression levels of MIF gene in the cells of the silent groups were significantly lower than that in the control 收稿日期 : [ 通信作者 ] 杨国珍, myyl2004@163.com 22

2 第 19 期周鸣, 等 : 基因沉默对肝癌细胞系增殖凋亡及 ERK/RSK2 信号通路的影响 group ( <0.05). The ability of cell proliferation in the silent groups was obviously lower than that in the control group ( <0.05). The cell apoptosis rates in the silent groups were significantly higher than that in the control group ( <0.05). Bax and p53 protein levels in the cells of the silent groups were higher than those of the control group, while the Bcl-2 protein level was lower than that of the control group ( <0.05). Meanwhile, the protein levels of ERK, RSK2 and Bad were not significantly different between the two silent groups and the control group ( >0.05). However, the protein levels of GSK3 茁,p-GSK3 茁,p-ERK, p-rsk2 and p-bad were significantly different between the two silent groups and the control group ( <0.05). Conclusions Silence of gene inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of both SMMC and cells maybe via regulation of the ERK/RSK2 signaling pathway. Keywords: ;gene silencing; hepatic carcinoma cell line; apoptosis; ERK 原发性肝癌以肝细胞肝癌 (hepatocellular carcinoma,hcc) 为主, 发病率近年来逐渐增高, 在所有恶 性肿瘤中居世界第 6 位, 国内第 3 位 [1] 巨噬细胞移 动抑制因子 (macrophage migration inhibitory factor, MIF) 是一种功能多样的细胞因子, 研究表明 [2-4], 其 在多种肿瘤组织细胞中高表达, 并参与了肿瘤的发 生发展和侵袭转移 近年来研究发现 [5-7],MIF 在多数 肝癌患者血清及肝癌组织中呈高表达并促进肝癌细 胞增殖, 但目前国内外关于 MIF 与肝癌细胞凋亡之 间关系的研究较少 因此, 本课题拟利用 sirna 介 导的 基因沉默来研究其对肝癌细胞系 与 凋亡的影响并探讨可能的分 子信号通路, 为选择 MIF 作为肝细胞癌治疗靶点提 供依据 1 材料与方法 1.1 试剂及仪器 MIF-siRNA 和 Con-siRNA 序列由吉凯基因公 司合成 (MIF-siRNA 序列 : 正向 5'-GGGUCUACAUC AACUUCAACUAUUAdTdT-3', 反向 3'-dTdTCCCAG AUGUAGUUGAUAAU-5';Con-siRNA 序列 : 正向 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3', 反向 3'-dTdT AAGAGGCUUGCACAGUGCA-5'), 配制终浓度为 20μmol Lipofectamine TM 2000 DMEG 高糖培养基 胎牛血清 胰蛋白酶 ( 北京鼎国昌盛生物公司 ),Trizol 试剂 ( 大连宝生物公司 ), 兔抗人 MIF BCL-2 BAX P53 与 GAPDH 一抗 羊抗兔二抗 ( 英国 Abcam 公司 ),ERK p-erk RSK2 p-rsk2 GSK-3β p-gsk-3β Bad 与 p-bad 一抗 ( 美国 Santacruze 公 司 ), 蛋白 Marker PVDF 膜 脱脂奶粉 TBST ECL 发 光试剂盒等 ( 北京康为世纪生物公司 ),CCK-8 试 剂盒 ( 上海谷研生物公司 ), 与 细胞系 ( 中国科学院上海生化与细胞所 ) 传代后用于 本实验 蛋白膜成像扫描仪 ( 美国 BioRad 公司 ) MIF-siRNA 转染细胞 当六孔板中 与 细胞生长至 60% 左右, 每孔用 5μl MIF-siRNA 和 Con-siRNA 稀释液进行转染 (sirna 工作浓度为 50 nmol), 方法 参照 Lipofectamine TM 2000 说明书 1.3 qrt-pcr 及 Westernblot 检测 MIF 沉默效果 转染 48 h 后, 收集 MIF 和 与 细胞,Trizol 法提取总 RNA 并测定浓度 以人 GAPDH 为内参, 按照试剂盒说明 书配制反应体系, 采用 Fast 7500 Real Time System 进行实时荧光定量聚合酶链反应 (quantitative realtime polymerase chain reaction,qrt-pcr) 检测, 每 个样品设 3 个复孔 反应条件为 s,95 3s, s, 共 40 个循环 数据分析采用比较 CT 法 (ΔΔCT), 相对表达量 (RQ)=2 -ΔΔCT, 取 3 次平均 作图 Western blot 方法见 1.6 引物序列如下 : GAPDH- 正向 :5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT C-3',GAPDH- 反向 :5'-GAGGGGCCATCCACAGTC TTCT-3';MIF- 正向 :5'-CTATTACGACATGAACG CG-3',MIF- 反向 :5'-CAACTCCACCTTCGCCTAA-3' 1.4 CCK-8 检测细胞增殖 转染 与 24 h 后, 收集细胞 并接种于 96 孔板中, 每孔 100μl 培养液, 约 2500 个细胞, 每组设 3 个复孔 于接种第 1 天至第 5 天采 用 CKK-8 法检测 MIF 沉默对 及 细胞增殖的影响 每孔加入 100μl 新鲜培养 基和 10μl CCK-8 溶液, 于 37 5% 二氧化碳 CO 2 培养箱中孵育 2h, 测定细胞在 A450 nm 处的吸收, 连测 5d, 实验重复 3 次 绘制细胞生长曲线 1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 MIF-siRNA 转染 与 48 h 后, 胰蛋白酶消化处理并离心收集和 细胞各 5 个于 1.5ml EP 管中, 每管加入 500μl

3 中国现代医学杂志 第 27 卷 结合缓冲液悬浮细胞, 加入 5μl Annexin V-FITC 及 10μl PI 混匀并室温避光放置约 20 min, 然后采用流式细胞术检测细胞凋亡情况 实验重复 3 次 1.6 Western blot 检测蛋白水平转染 48 h 后, 收集和 与 细胞, 提取总蛋白并测定浓度 取 100μg 总蛋白, 加入 5 Loading Buffer, 沸水浴处理 10 min, 再冰浴 5min,-20 保存备用 经 SDS-PAGE 凝胶电泳 转膜与封闭后用 MIF BCL-2 BAX P53 ERK p-erk RSK2 p-rsk2 GSK-3β p-gsk-3β Bad p-bad 与 GAPDH 一抗及二抗杂交, 加上发光混合液后采用蛋白膜成像扫描仪检测结果 蛋白相对表达量 = 目的蛋白灰度 /GAPDH 灰度 1.7 统计学方法采用 SPSS17.0 进行统计学分析, 数据采用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 组间比较采用检验, < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 MIF 沉默效果 MIF sirna 转染细胞 48 h 后提取细胞总 RNA 与蛋白分别进行 qrt-pcr 与 Western blot 检测 结果显示, 与 及 细胞相比, 2 种细胞中 MIF mrna 与比较, 差异有统计学意义 ( =5.011 和 5.274, =0.007 和 0.006), 2 种细胞中蛋白水平与比较, 差异有统计学意义 ( = 和 , =0.000 和 0.000), 表达降低 表明 MIF sirna 的沉默效果较好 见图 细胞增殖结果采用 CCK-8 法检测 MIF 沉默对 2 种细胞增殖能力的影响 结果显示, 与相比,MIF 沉默第 3 天至第 5 天, 及 细胞的增殖能力差异有统计学意义 ( = 和 MIF 12.5 kd GAPDH 36 kd A A:MIF mrna 水平,B:MIF 蛋白水平 图 1 MIF sirna 沉默效果 B 培养天数 /d 培养天数 /d 两组比较, <0.05 图 2 细胞增殖能力 24

4 第 19 期周鸣, 等 : 基因沉默对肝癌细胞系增殖凋亡及 ERK/RSK2 信号通路的影响 4.492, = 和 0.011; = 和 4.042, = 和 0.016) 均下降 表明 MIF 基因沉默抑制了 与 细胞的增殖能力 见图 细胞凋亡情况采用流式细胞术检测 MIF sirna 转染 与 细胞 48 h 后细胞凋亡率 结果显示, 两组 与 细胞的早期凋亡率比较, 差异有统计学意义 ( =3.670 和 2.941, = 和 0.042),MIF 与 细胞的早期凋亡率增加, 而 2 种细胞晚期凋亡率比较, 差异有统计学意义 ( =6.552 和 , =0.003 和 0.000) 表明 MIF 被沉默后, 促进了细胞凋亡, 尤其是促进了晚期细胞凋亡 见图 凋亡相关基因的蛋白水平 Western blot 检测结果显示, 两组细胞 BAX P53 BCL-2 蛋白水平比较, 差异有统计学意义 ( < 0.05),MIF 细胞 BAX P53 的蛋白表达水平 高于, 而 BCL-2 蛋白水平低于 表明 MIF 被沉默后, 促凋亡基因表达增加, 抗凋亡基因表 达减少 见表 1 2, 图 ERK 通路蛋白激酶及磷酸化水平 Western blot 检测结果显示, 与 和 细胞中 ERK RSK2 与 Bad 总 蛋白水平比较, 均差异无统计学意义 ( >0.05) 沉默 组 与 细胞中 GSK-3β 蛋白水 平与相比, 差异有统计学意义 ( <0.05) 沉 默组高于 与 细 胞中 p-erk p-rsk2 p-bad 和 p-gsk-3β 蛋白水 平与相比, 均差异有统计学意义 ( <0.05), 下调 表明 MIF 基因沉默影响了 ERK 信号 通路中相关蛋白的活性 见图 5, 表 早期凋亡 晚期凋亡 A B 早期凋亡 晚期凋亡 表 1 A:MIF 沉默对 凋亡的影响 ;B:MIF 沉默对 凋亡的影响图 3 细胞凋亡情况两组 细胞中相关蛋白表 2 两组 细胞中相关蛋白相对表达量比较 ( =3,x±s) 相对表达量比较 ( =3,x±s) 组别 MIF BCL-2 BAX P ± ± ± ± ± ± ± ± 组别 MIF BCL-2 BAX P ± ± ± ± ± ± ± ±

5 中国现代医学杂志 第 27 卷 MIF 12.5 kd ERK p-erk BCL-2 25 kd RSK2 p-rsk2 BAX 26 kd Bad p-bad P53 44 kd GSK-3β GAPDH 36 kd p-gsk-3β GAPDH 图 4 两组细胞凋亡相关基因的蛋白水平 图 5 两组细胞 ERK 通路蛋白激酶及磷酸化水平 表 3 两组 细胞中相关蛋白相对表达量比较 ( =3,x±s) 组别 ERK p-erk RSK2 p-rsk2 Bad p-bad GSK-3β p-gsk-3β 1.07± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 表 4 两组 细胞中相关蛋白相对表达量比较 ( =3,x±s) 组别 ERK p-erk RSK2 p-rsk2 Bad p-bad GSK-3β p-gsk-3β 0.91± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 讨论 HCC 作为人类最常见的一种恶性肿瘤, 已成为 [8] 仅次于胃癌和肺癌的第 3 大杀手 肿瘤的发展依赖于降低肿瘤细胞凋亡的发生, 因此, 促进肿瘤细胞凋亡是一种抑制肿瘤发展的潜在策略 MIF 广泛存在于各种组织, 最初被认为是一种炎症介质, 具有抑制巨噬细胞移动和黏附 参与机体炎症反应和调控 [9-10] [11-12] 细胞增殖分化等作用 研究发现,MIF 与肿瘤的发生发展关系密切, 且 MIF 在肝癌患者血清 肝 [13-14] 癌组织及肝癌细胞系中呈现高表达, 其可能参与了肝癌的发生和发展 但目前关于 MIF 与肝癌细胞凋亡之间的研究较少 因此, 本课题拟利用 sirna 介导的基因沉默来研究其对肝癌细胞系 与 凋亡的影响并探讨可能的分子作用机制 本研究首先将 MIF-siRNA 转染肝癌细胞系 与,48 h 后采用 qrt-pcr 及 Western blot 技术检测基因沉默效果, 结果显示, 与相比, 与 细胞中 MIF mrna 及蛋白水平降低, 表明基因沉默效果良好 CCK-8 实验结果表明沉默明显抑 [15] 制了 2 种肝癌细胞的增殖, 与 HUANG 等研究结果一致 流式细胞术检测结果显示, 基因沉默增加了肝癌细胞的凋亡率, 且更促进了细胞不可挽回的晚期凋亡, 该结果表明, 基因表达水平与肝癌细胞凋亡之间存在密切关系 然后采用 Western blot 方法检测了几种常见的凋亡相关基因的蛋白水平, 结果显示, 基因沉默可明显下调抗凋亡蛋白 Bcl-2 水平并上调促凋亡蛋白 P53 与 Bax 水平 53 基因与细胞基因组完整性 修复 DNA 损伤 促进癌细胞凋亡等关系密切, 其可以通过激活 BAX 并下调 BCL-2 的表达来共同发挥作用, 但 P53 促进肿瘤细 [16-17] 胞凋亡的作用可被 MIF 抑制, 该结果从分子水平上表明基因沉默对肝癌细胞凋亡的促进作用 26

6 第 19 期周鸣, 等 : 基因沉默对肝癌细胞系增殖凋亡及 ERK/RSK2 信号通路的影响 ERK 通路是丝裂原活化蛋白激酶信号通路重要组成部分, 在调控细胞增殖 存活与凋亡方面发 [18] 挥重要作用 为进一步探讨基因沉默促进肝癌细胞凋亡的分子作用机制, 检测了细胞中 ERK 通路中相关基因的蛋白水平 Western blot 结果显示, 与相比, 细胞中 ERK RSK 和 Bad 的蛋白水平并未发生明显变化, 而 p-erk p-rsk2 p-bad 和 p-gsk-3β 的蛋白水平下调,GSK-3β 蛋白水平上调 蛋白激酶的磷酸化水平直接影响了该激酶自身的活性及其下游新号分子的活化进而调控信号传导过程 RSK2 是 ERK 下游的一级效应蛋白, 活化后可通过调节与增殖凋亡相关蛋白 GSK-3β Bad 等一些下游靶蛋白影响细胞增殖 凋亡等 本研究表明, 基因沉默后, 细胞中 p-erk 水平下降, 减少的 p-erk 直接导致下游 RSK2 磷酸化水平的降低, 同样,p-RSK2 水平下降影响了直接下游蛋白 GSK-3β 的磷酸化,p-GSK-3β 下调可抑制细胞的增殖与存活 Bad 也是 RSK2 的底物蛋白之一,MIF 沉默下调了 p-bad 水平, 进而促进了细胞的凋亡 综上所述,siRNA 介导的基因沉默抑制肝癌细胞系 与 的增殖能力并促进细胞凋亡可能是通过调节 ERK/RSK2 信号通路发挥作用 该研究为选择 MIF 作为肝癌的治疗靶点提供一定的依据, 但癌症的发生过程涉及多种因素的参与, 仍需进一步深入地研究 参考文献 : [1] LI M, QIAO C, QIN L, et al. Application of traditional Chinese medicine injection in treatment of primary liver cancer: areview[j]. J Tradit Chin Med, 2012, 32(3): [2] LO M C, YIP T C, CHENG W, et al. Role of MIF/CXCL8/CX- CR2 signaling in the growth of nasopharyngeal carcinoma tumor spheres[j]. Cancer Letters, 2013, 335(1): [3] CHEN L Z, ZHOU X, FAN L X, et al. Macrophage migration inhibitory factor promotes cyst growthinpolycystickidneydisease[j]. Journal of Clinical Investigation, 2015, 125(6): [4] 马宁, 周云. 胃癌组织中 mir-451 与 MIF 的表达及与临床病理的关系 [J]. 中国老年学杂志,2015, 3: [5] ZHAO Y M, WANG L, DAI Z, et al. Validity of plasma macrophage migration inhibitory factor for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma [J]. Int J Cancer, 2011, 129(10): [6] WANG D, LUO L, CHEN W, et al. Significance of the vascular endothelial growth factor and the macrophage migration inhibitory factor in the progression of hepatocellular carcinoma[j]. Oncology reports, 2014, 31(3): [7] 陶斌胜, 熊茂明, 曹立宇. 肝癌组织中 MIF TNF-α 的表达及临床意义 [J]. 临床与实验病理学杂志,2011, 11: [8] LI Z, JING A R, WANG S B, et al. Clinicopathological predictors of poor survival and recurrence after curative resection in hepatocellular carcinoma without portal vein tumor thrombosis[j]. Pathology & Amp, Oncology Research, 2015, 21(1): [9] WANG K, LIANG Q, WEI L, et al. MicroRNA-608 acts as a prognostic marker and inhibits the cell proliferation in hepatocellular carcinoma by macrophage migration inhibitory factor[j]. Tumour Biol, 2016, 37(3): [10] SAULER M, BUCALA R, LEE P J. Role of macrophage migration inhibitory factor in age-related lung disease [J]. AJP: Lung Cellular and Molecular Physiology, 2015, 309(1): [11] HU C T, GUO L L, FENG N, et al. MIF, secreted by human hepatic sinusoidal endothelial cells, promotes chemotaxis and outgrowth of colorectal cancer in liver prometastasis[j]. Oncotarget, 2015, 6(26): [12] AXEL D, CHRISTIAN P, DANIELA M, et al. Inhibition of MIF leads to cell cycle arrest and apoptosis in pancreatic cancer cells[j]. Journal of Surgical Research, 2010, 160(1): [13] KAMEL M M, SAAD M F, MAHMOUD A A, et al. Evaluation of serum PIVKA-II and MIF as diagnostic markers for HCV/HBV induced hepatocellular carcinoma[j]. Microb Pathog, 2014,77: [14] 于晓辉, 段惠春, 杨晓萍, 等. 肝细胞性肝癌血清中 MIF IL-17 IL-10 的检测及其临床意义 [J]. 中国肿瘤临床,2013,12: [15] HUANG X H, JIAN W H, WU Z F, et al. Small interfering RNA (sirna)-mediated knockdown of macrophage migration inhibitory factor (MIF) suppressed cyclin D1 expression and hepatocellular carcinoma cell proliferation[j]. Oncotarget, 2014, 5 (14): [16] FUKAYA R, OHTA S, YAGUCHI T, et al. MIF maintains the tumorigenic capacity of brain tumor-initiating cells by directly inhibiting p53[j]. Cancer Res, 2016, 76(6): [17] WANG H, YANG Z, LIU C, et al. RBP-J-interacting and tubulin-associated protein induces apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellu lar carcinoma by activating the p53-fbxw7 pathway [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 454(1): [18] CUI YT, LU PR, SONG G, et al. Involvement of PI3K/Akt, ERK and p38 signaling pathways in emodin-mediated extrinsic and intrinsic human hepatoblastoma cell apoptosis[j]. Food and Chemical Toxicology, 2016, 92: ( 张蕾编辑 ) 27

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