1890 中华临床医师杂志 ( 电子版 )2014 年 5 月第 8 卷第 10 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),May 15,2014,Vol.8,No.10 神经细胞内出现神经元纤维缠结 (neurofibrillary tangle,nft) 和

Size: px

Start display at page:

Download "1890 中华临床医师杂志 ( 电子版 )2014 年 5 月第 8 卷第 10 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),May 15,2014,Vol.8,No.10 神经细胞内出现神经元纤维缠结 (neurofibrillary tangle,nft) 和"

干唐
5 years ago
Views:

1 中华临床医师杂志 ( 电子版 )2014 年 5 月第 8 卷第 10 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),May 15,2014,Vol.8,No Aβ42 基因在大肠杆菌中的表达及诱导 BALB/c 小鼠的抗体产生基础论著牟玲燕沈蒋君孙爱群舒建洪李司摘要目的研究纯化大肠杆菌中 Aβ42 蛋白的表达情况, 并探索该蛋白接种小鼠后抗体的产生情况方法构建表达载体 pgex-4t-1-aβ42, 设置不同的诱导温度来进行 Aβ42 在大肠杆菌中表达用 SDS-PAGE GST 柱及 Western blot 来鉴定纯化目的蛋白动物实验中, 用福氏佐剂采用背部多点注射的方式免疫 BALB/c 小鼠 3 次间接 ELISA 法检测免疫小鼠血清和脑组织匀浆上清液中特异性抗体的滴度结果在 25 下, 经 1.0 mmol/l 的 IPTG 诱导后该蛋白表达量最多, 实现可溶性表达小鼠实验中, 第 2 次免疫后,Aβ42 蛋白组小鼠的免疫血清有抗 Aβ42 抗体产生, 且第三次免疫后, 抗体数量增高同时, 在脑组织匀浆上清液中也可检测出低滴度的抗 Aβ42 抗体结论在大肠杆菌中可获得了高纯度的可溶性 Aβ42 蛋白该蛋白结合福氏佐剂免疫 BALB/c 小鼠后, 可诱导小鼠产生特异性的抗 Aβ42 抗体关键词大肠杆菌 ; Aβ42; 可溶性蛋白 The expression of Aβ42 gene in Escherichia coli and antibody production in BALB/c mice induced by the protein Mou Lingyan, Shen Jiangjun, Sun Aiqun, Shu Jianhong, Li Si. Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine, College of Life Sciences, Zhejiang Sci-tech University, Hangzhou , China Corresponding author: Li Si, lisi214@126.com Abstract Objective In order to purify the Aβ42 protein expressed in E. coli and explore the production of anti-aβ42 antibody after immunization. Methods Expression vector of pgex-4t-1-aβ42 was constructed and different experimental temperature was set to Induce expression of Aβ42 protein in Escherichia coli. The expression product was determined by SDS-PAGE and Western blot analysis. Fusion protein was purified by GST affinity chromatography. BALB/c mice were immunized by subcutaneous injection with the purified fusion protein and the titers of anti-aβ42 antibodies in sera and supernatants of brain tissue homogenates from the immunized BALB/c mice were detected by indirect ELISA. Results Aβ42 protein reaches the highest level which was induced at 25 by 1.0 mmol/l IPTG. Western blot analysis indicated that anti-aβ42 antibody could react specifically against the purified protein. Mice experiment showed that after the third time, the titers of anti-aβ42 antibodies in the immunized mice by purified protein was significantly higher than the control group. At the same time, in the brain homogenate supernatant can also detect low titers of anti A β 42 antibody. Conclusion Anti-Aβ42 antibody is induced in BALB/c mice by the Aβ42 protein expressed in E.coli. Key words Escherichia coli; Aβ42; Soluble protein 阿尔茨海默病俗称老年痴呆症, 是一种老年人中最为常见的中枢神经系统退化性疾病 [1] 近年来, DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 大学生科技创新项目 (2013R406018); 浙江省自然科学基金面上项目 (Y ) 作者单位 : 杭州, 浙江理工大学生命科学学院浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室通讯作者 : 李司, lisi214@126.com 随着世界人口的老龄化, 其患病人数逐年递增 [2], 已成为继心血管疾病和肿瘤后威胁人类健康的第三大杀手阿尔茨海默病的主要临床表现为记忆认知以及行为障碍, 包括记忆力减弱 [3] 抑郁判断力降低思维混乱等疾病症状通常进程缓慢, 但随着时间的推移逐步恶化, 严重影响患者及其家庭的正常生活阿尔茨海默病的特异性病理特征是

2 1890 中华临床医师杂志 ( 电子版 )2014 年 5 月第 8 卷第 10 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),May 15,2014,Vol.8,No.10 神经细胞内出现神经元纤维缠结 (neurofibrillary tangle,nft) 和脑内淀粉样蛋白的沉积 [4], 俗称老年斑 (senile plaques,sp) 现在科学界普遍认为, 阿尔茨海默病是由淀粉样蛋白 (amyloid) 引起的病变患者脑内的 β 淀粉样蛋白大量表达, 并聚集成块, 形成斑块而致病因为这种斑块会释放出有毒的 β 淀粉样蛋白碎片, 以一种我们尚未知晓的机制使人体致病, 即 Aβ 假说 [5-7], 认为 Aβ 沉着是阿尔茨海默病的启动因素 [8], 特别是 Aβ42 的聚集尤为显著, 在过去的 10 年中, 越来越多的证据支持 Aβ 假说因此减少和清除脑中的 Aβ42 沉着成为治疗和预防阿尔茨海默病的关键本研究将 Aβ42 融合蛋白在大肠杆菌 pgex-4t-1 表达系统中表达, 探索到可溶性表达的最适温度条件, 纯化得到融合蛋白, 可诱导 BALB/c 小鼠产生特异性的抗 Aβ42 抗体材料与方法一质粒和菌种原核表达载体 pgex-4t-1: 浙江理工大学生化所保存 ;Aβ42 基因由医院提供患者脑组织 PCR 获得 ; 表达菌株 BL21: 浙江理工大学生化所保存二主要试剂和酶 5 周龄 BALB/c 小鼠弗氏完全佐剂 (FCA) 弗氏不完全佐剂 (FIA) 由杭州师范学院提供 ;Aβ x-42 小鼠抗人一抗血清购自 Millipore 生物技术公司 ; 聚偏氟乙烯膜 (PVDF) 购于 Millipore 公司 ; 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG 抗体购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 ; 异丙基 -β-d- 硫代半乳糖苷 (IPTG) 还原型谷胱甘肽(GSH) Glutathione Sepharose 4B 亲和色谱柱购自 Amersham 公司 ;Taq DNA 聚合酶及相关 PCR 反应有关试剂购自上海博亚 ( Biosia) 生物技术有限公司 ; 限制性内切酶 Xhol Ⅰ 和 BamHⅠ 购自 Promega 公司 ; 其他实验用酶类 DNA 分子质量蛋白分子质量 Marker 均购自 Fermentas 公司 ; 其他试剂均为国产分析纯三实验仪器 Tanon 公司购买的 1600 凝胶成像系统 ; EPS601 二维电泳仪购自 Amersham 公司 ; Neofuge13R 台式高速冷冻离心机购于 Heal Force 公司 ; 宁波新芝生物科技股份有限公司购买的 SCIENTZ-ⅡD 超声波细胞粉碎机 ;HITACHI 公司购买的 himac CR 21G 大型高速冷冻离心机四构建表达菌株 Aβ42 基因序列全长 145 bp, 编码由 24 个氨基酸组成的蛋白质分子根据获得的基因序列, 设计出 5' 端引物 F1:GGGGATCCGATGCAGAATTCCG ACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCA(BamHⅠ) 和 3' 端引物 R1:GGCTCGAGCTACGCTATGACAA CACCGCCCACCATGAGTCCAATGATTG(XholⅠ) 其中下划线部分为在引物中引入的限制性内切酶的酶切位点 Aβ42 基因经 PCR 扩增产物纯化后, 由限制性内切酶 BamHⅠ 和 XholⅠ 进行双酶切, 然后插入同样酶切过的载体质粒 pgex-4t-1 中, 并转化到大肠杆菌 BL21 感受态细胞进行阳性菌落筛选, 通过 PCR 技术鉴定重组质粒最后将保存的菌种送往上海生物工程技术服务有限公司进行测序五诱导蛋白表达将构建好的表达菌株按接种于 LB 液体培养基中在 37 下培养 4 h 在不同温度 ( 25,30, 37 ) 下分别加入浓度为 1.0 mmol/l 的 IPTG 诱导 4 h, 然后 r/min 离心 15 min 后收集菌体, 每 20 ml 原始菌液用 1 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) 重悬, 然后置于冰上进行超声裂解 ( 条件为超声 5 s, 停 5 s) 超声裂解后再 r/min 离心 20 min, 并分别收集上清与沉淀再进行蛋白电泳, 用以检测目的基因的表达情况电泳结束后用考马斯亮蓝 R-250 染色,1600 凝胶成像系统进行扫描成像分析六 Western blot 鉴定表达产物经过 SDS-PAGE 电泳后的蛋白通过电转移至 PVDF 膜上, 放入 TBS(20 mmol/l Tris/Hcl, 500 mmol/l NaCl,pH=7.5) 中, 使 TBS 浸过 PVDF 膜, 洗膜 10 min, 然后去除 TBS, 再加入封闭液进行封闭接着将 PVDF 膜在 37 下摇床摇 2 h, 然后用小鼠抗人一抗血清在 37 下放置于摇床上摇 1.5 h 摇床结束后用 TBST( 含 0.05% Tween20 的 TBS 缓冲液,pH=7.5) 洗膜洗 3 次, 每次 5 min; 接着加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG 抗体, 在室温下缓慢摇动 1 h 后再次进行洗膜, 先用 TBST 洗膜 3 次, 每次 10 min, 再用 TBS 每次 5 min, 洗 2 次 ; 洗完膜后将膜转入 DAB 显色液中显色, 要求在室温暗室的环境下显色 5 min, 等到膜上有明显条带出现后再用 ddh 2 O 漂洗七小鼠免疫初步实验选用 5 周龄的 BALB/c 小鼠作为实验动物, 佐剂为弗氏完全佐剂 (FCA) 和弗氏不完全佐剂 (FIA)

3 中华临床医师杂志 ( 电子版 )2014 年 5 月第 8 卷第 10 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),May 15,2014,Vol.8,No 将 BALB/c 小鼠分为两组, 每组 10 只, 一组为生理盐水 + 佐剂组, 另外一组为 Aβ42+ 佐剂组 1. 抗原制备 : 将已构建好的目的蛋白表达菌株在 37 下培养 4 h, 将新鲜菌按照进行接种, 在 37 震荡培养到 OD 600 nm 值为 0.5 为止, 然后加入 IPTG 至最终浓度为 1 mmol/l, 接着 37 培养大约 4 h, 再 r/min, 离心 10 min, 收集菌体, 按照体积比 1 20 加入 PBS 进行悬浮, 然后冰上超声破碎, 超声条件是 : 超声 1 s, 停 2 s, 整个过程 15 min 再 r/min 离心分离上清液和沉淀最后通过 SDS-PAGE 检测表达情况将收集到的上清上样经过 ph 7.3 PBS 预平衡的 Glutathione Sepharose 4B 亲和色谱柱, 流速为 1 ml/min, 然后收集洗脱液 500 μl, 重复上述步骤 3 次再用 5 倍柱体积的 ph 为 7.3 的 PBS 充分洗涤, 接着用 50 mmol/ml 的 Tris-HCl 缓冲液 (ph 8.0, 含 10 mmol/l GSH) 20 ml 洗脱柱上结合的谷胱甘肽 - 硫 - 转移酶 (GST) -Aβ42 融合蛋白, 并且收集洗脱液 500 μl, 然后重复 2 次, 再用 SDS-PAGE 凝胶电泳进行检测将超滤除盐后收集到的重组蛋白在 -80 冷冻 2 h 后放到预冷 1 h 的冷冻干燥机中冷冻干燥过夜, 至管内蛋白呈粉末状后停止冻干根据上面 ELISA 结果用 PBS 定量溶解蛋白至终浓度为 50 µg/ml 抗原与佐剂 1 1 混合均匀, 此时 Aβ42 抗原浓度为 25 µg/ml 2. 小鼠免疫 : 对实验小鼠分别进行初次免疫再次免疫和加强免疫初次免疫时, 按每只小鼠 0.2 ml 抗原 ( 抗原弗氏完全佐剂 =1 1) 的注射量, 在其背部中线两侧 5 个点进行皮下注射再次免疫在初次免疫的 2 周后进行按相同的注射量抗原弗氏不完全佐剂 =1 1), 采用腹腔注射在此之后, 每隔 21 d 左右进行一次免疫, 相同的抗原注射量 ( 抗原弗氏不完全佐剂 =1 1), 采用腹腔注射 3. 间接 ELISA 抗体检测 : 再次免疫和加强免疫以后第三周进行眼球取血, 剂量为 0.1 ml, 最后一次免疫后第三周取脑脊髓液 0.2 ml; 将采取的血液置室温下 2 h, 凝血后于 4 冰箱过夜, 然后 r/min 离心 10 min, 吸取血清, 按 1 50 至倍比稀释,4 保存备用 ;96 孔酶标板用 500 µg/ml 标准品 Aβ42 购自 GenScript( 美国 ) 100 µl 在 37 烘箱中包被 2 h 或 4 过夜 ; 用 PBST 洗涤两次后, 加入 100 µl 含 1% BSA 的 PBS, 37 烘箱中封闭 2 h; 再用 PBST 洗涤两次 ; 取倍比稀释的小鼠血清 100 µl 包被酶标板,37 温育 2 h 后用 PBST 洗涤三次 ; 二抗 ( 山羊抗小鼠 ) 用 PBS 稀释后取 100 µl 包被,37 1 h; PBST 洗涤三次 ; 加底物缓冲液 100 µl 显色 10~ 15 min; 加终止液 50 µl 终止反应 ; 酶标仪上测光吸收值 A 492 nm, 阳性反应的最大稀释度为待测样品效价, 比例法以阳性血清与阴性血清的吸光值之比 (P/N) 表示 : 当 P/N 2.1 时为阳性 ;1.5 P/N< 2.1 时为可疑 ;P/N<1.5 时呈阴性八统计学分析采用 SPSS 16.0 统计学软件进行方差分析, 组间采用多重比较 P<0.05 为差异具有统计学意义结果一重组质粒 pgex-4t-1-aβ42 的筛选与鉴定结果 1. PCR 鉴定 : 对重组质粒进行 PCR 鉴定, 结果显示, 在 100~250 bp 之间有明显条带 ( 图 1), 其大小在 150 bp 左右, 与预期大小相符合初步推断 Aβ42 基因已成功转入 pgex-4t-1 中 2. 核酸测序鉴定 : 将保存的重组甘油菌交予测序公司测序, 测序结果经过比对, 说明目的基因 Aβ42 已经连接到载体 pgex-4t-1, 获得重组质粒 pgex-4t-1-aβ42 测序结果如图 2, 与该基因序列一致, 说明 Aβ42 基因已成功转入 pgex-4t-1 载体中二蛋白表达最佳温度分析已经构建好的目的蛋白表达菌株分别在的温度下诱导表达, 所得的总蛋白通过 SDS-PAGE 检测表达情况 SDS-PAGE 检测目的蛋白表达结果如图 3, 空载菌 pgex-4t-1 在 37 条件下诱导重组菌 pgex-4t-1-aβ42 未诱导条件下未出现目的蛋白条带, 而重组菌在用的温度下,1.0 mmol/l IPTG 诱导有出现目的条带, 泳道显示目的蛋白条带大约在 32 kd 处, 与目的蛋白大小一致温度梯度实验显示在泳道 3, 也就是 25 下重组菌表达目的蛋白量最多将重组菌超声破碎, 破碎之后离心所得的上清液和沉淀做成的蛋白样品,SDS-PAGE 检测结果如图 4, 蛋白条带对比可知, 超声破碎之后上清和沉淀都有目的蛋白, 且在此超声上清里的目的蛋白纯度相当高进一步纯化后用 BandScan 软件检测纯度可达 90% 以上 Western blot 检测说明纯化蛋白具有抗原性

4 1892 中华临床医师杂志 ( 电子版 )2014 年 5 月第 8 卷第 10 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),May 15,2014,Vol.8,No.10 三小鼠免疫的初步实验结果如表 1 所示, 第二次接种后, 实验组与对照组中均开始出现抗 Aβ42 的抗体,Aβ42 蛋白组中抗 Aβ42 的抗体的滴度显著高于对照组的抗 Aβ42 的抗体第三次免疫后 Aβ42 蛋白组抗体滴度明显升高, 达到 , 脑匀浆上清液中也可检出较低滴度

5 中华临床医师杂志 ( 电子版 )2014 年 5 月第 8 卷第 10 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),May 15,2014,Vol.8,No 的抗 Aβ42 的抗体说明大肠杆菌表达的 Aβ42 蛋白结合福氏佐剂免疫 BALB/c 小鼠后, 可诱导小鼠产生特异性的抗 Aβ42 抗体表 1 免疫小鼠血清和脑匀浆上清液中抗 Aβ42 抗体的组别平均滴度免疫后血清中抗体滴度第二次第三次免疫后脑匀浆液中抗体滴度对照组 Aβ42 组 a a a 注 : 与对照组比较, a P<0.01, 有统计学差异讨论大肠杆菌中外源性蛋白的表达受多种因素的影响比如诱导温度诱导剂浓度载体及宿主细胞等 [9-10] 本实验采用 pgex-4t-1 质粒作为载体该质粒整合了 LacⅠ 阻遏蛋白基因, 在其 SD 序列下游是 GST 基因,GST 有助于目的蛋白的正确折叠, 提高可溶性 [11] 而大肠杆菌缺乏真核生物转录翻译后修饰蛋白所需的酶类和分子伴侣, 导致表达的蛋白容 [12] 易形成包涵体及不溶性的聚集物为了获得可溶性的蛋白, 有多种解决方法方法之一是降低表达水平, 可增加可溶性蛋白的比例而实验室中常用的方法则是改变其诱导温度由于尚未明了的原因, 高温 (37~42 ) 会促进包涵体的形成, 而低温 ( 小于 30 ) 抑制其形成 [13] 本实验中 25 时其蛋白表达水平最高, 优于 30 和 37, 且 30 的可溶性表达明显优于 37 在本次模型小鼠免疫实验中, 与对照组相比, 小鼠血清中明显产生了高低度的抗 Aβ42 的抗体, 说明了本实验纯化的 Aβ42 蛋白具有免疫原性但是否可以将 Aβ42 蛋白作为疫苗运用于临床了呢? 在 2000 年,élan 公司生产的以聚山梨酯 80(QS21) 为佐剂的 Aβ42 疫苗 AN1792 正式进入临床 Ⅰ 期试验, 结果 53% 的患者产生了抗 Aβ42 抗体, 认知功能显著改善, 但 Ⅱ 期试验因 6% 的患者并发急性脑膜脑炎而中止 [14-15] 说明 Aβ42 蛋白作为疫苗, 仍存在其局限性如何在不改变其免疫原性的前体下减低其临床上的不良反应, 是未来 Aβ42 蛋白作为疫苗所要攻克的难题参考文献 [1] 崔雯, 邓小细, 钟振国. 老年痴呆症的药理实验方法研究进展 [J]. 检验医学与临床, 2013, 10(7): [2] 郑亚楠, 甘小荣. 我国阿尔兹海默病相关心理学研究综述 [J]. 中国实用医药, 2013, 8: [3] 龙元先, 唐雨萌, 唐利军. 中国阿尔兹海默病主要影响因素的 Meta 分析 [J]. 中国预防医学杂志, 2013, 14(1): [4] 赵婷婷. 阿尔兹海默病的免疫学机制及其治疗进展 [J]. 免疫学杂志, 2003, S1: [5] Geodert M, Spillantini MG. A century of Alzheimer's disease[j]. Science, 2006, 314(5800): [6] Kins S, Lauther N, Szodorai A, et al. Subcellular trafficking of the amyloid precursor protein gene family and its pathogenic role in Alzheimer's disease[j]. Neurodegener Dis, 2006, 3(4/5): [7] Tanzi RE, Bertram L. Twenty years of the Alzheimer's disease amyloid hypothesis: a genetic perspective[j]. Cell, 2005, 120(4): [8] Walsh DM, Selkoe DJ. Abeta Oligomers--a decade of discovery[j]. J Neurochem, 2007, 101(5): [9] 朱红裕, 李强. 外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略 [J]. 过程工程学报, 2006, 6(1) : [10] 程晶晶, 潘斯科, 钟云平, 等. CTB-Aβ42 融合蛋白的原核表达条件优化及鉴定 [J]. 中国生化药物杂志, 2012, 33(4): [11] 华子春. 蛋白高效表达技术 [M]. 北京 : 化学工业出版社, 2011: 5-6. [12] 龙英娜, 刘焕奇, 王明志. 重组包涵体的纯化与复性 [J]. 兽医临床, 2008(4) : [13] 严小芳, 张佩, 董硕. 霍乱毒素无毒 B 亚单位 (CTB) 黏膜免疫佐剂的研究进展 [J]. 生命科学, 2009, 21(1): [14] Boche D, Nicoll JA. The role of the immune system in clearance of Abeta from the brain[j]. Brain Pathol, 2008, 18(2): [15] Nicoll JA, Barton E, Boche D, et al. Abeta species removal after abeta42 immunization[j]. J Neuropathol Exp Neurol, 2006, 65(11): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 戚红丹 ) 牟玲燕, 沈蒋君, 孙爱群, 等. Aβ42 基因在大肠杆菌中的表达及诱导 BALB/c 小鼠的抗体产生 [J/CD]. 中华临床医师杂志 : 电子版,2014,8 (10):

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌