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醒渊泉仲
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1 164 江苏农业学报 (Jiangsu J. of Agr. Sci. ),2011,27(1):164 ~ 168 赵海鹏, 谢摇晶, 严文蓉. 南美白对虾冷藏过程中的细菌分离初步鉴定及菌相分析 [J]. 江苏农业学报,2011,27(1):164 鄄 168. 南美白对虾冷藏过程中的细菌分离初步鉴定及菌相分析赵海鹏, 摇谢摇晶, 摇严文蓉 ( 上海海洋大学食品学院, 上海 ) 摇摇摘要 : 摇为了明确南美白对虾在冷藏过程中细菌的组成, 为开发新的保鲜剂提供指导, 利用生理生化检验和 16S rdna 序列分析对分离纯化的菌株进行了鉴定, 并结合生理生化检验结果和系统进化树进行了分析结果表明 : 南美白对虾冷藏期间有 8 种典型菌株, 它们在货架期结束时所占的比例分别为腐败希瓦氏菌 36% 嗜水气单胞菌 26% 恶臭假单胞菌 15% 蜡样芽孢杆菌 7% 嗜冷杆菌 10% 不动杆菌 2% 金黄色葡萄球菌 2% 微小杆菌 1%, 其中腐败希瓦氏菌为南美白对虾冷藏后期的主要优势腐败菌关键词 : 摇南美白对虾 ; 腐败菌 ; 16SrDNA; 保鲜中图分类号 : 摇 TS 摇摇摇文献标识码 : 摇 A 摇摇摇文章编号 : 摇 1000 鄄 4440(2011)01 鄄 0164 鄄 05 Isolation and identification of bacteria in Penaeus vannammei during cold storage and analysis of composition of microorganism ZHAO Hai 鄄 peng, 摇 XIE Jing, 摇 YAN Wen 鄄 rong ( College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai ) 摇摇 Abstract: 摇 To identify the bacterial composition during cold storage of Penaeus vannammei and providing guidance for the new natural preservative, identification of microorganism strain was performed by using the physiological and biologi 鄄 cal test, and 16S rdna sequence analysis. Combined with physiological and biochemical test results and phylogenetic tree analysis, the result demonstrated that there were eight typical microorganism strains in Penaeus vannammei under cold stor 鄄 age. The eight microorganism strains ( and the proportion in the end of shelf life, respectively) were as follows: Shewanella putrefaciens (36% ), Aeromonas hydrophila(26% ), Pseudomonas putida (15% ), Bacillus cereus(7% ), Psychrobacter sp. (10% ), Acinetobacter (2% ), Staphyloccocus aureus(2% ), Microbacterium(1% ). Shewanella putrefaciens could be considered as dominated strains during cold storage of Penaeus vannammei. Key words: 摇 Penaeus vannammei; spoilage bacterium; 16S rdna; preservation 摇摇南美白对虾 (Penaeus vannamei) 学名凡纳对虾, 原产于南美地区, 自 1988 年引入中国以来, 经过淡收稿日期 :2010 鄄 04 鄄 10 基金项目 :2010 年国家农业成果转化基金项目 (2010GB2C000148); 2009 年上海市优秀学科带头人计划项目 (09XD ); 上海市教育委员会重点学科建设项目 (J50704) 作者简介 : 赵海鹏 (1984 鄄 ), 男, 山东曲阜人, 硕士研究生, 主要从事水产品加工及贮藏工程方向研究通讯作者 : 谢摇晶,(E 鄄 mail)jxie@ shou. edu. cn 化养殖, 目前其产量已经跃居中国三大主产经济虾之首南美白对虾营养丰富味道鲜美, 但较难保藏, 主要是由于腐败菌的作用南美白对虾体内的细菌组成较为复杂, 因生长环境季节贮藏方式的不同而不同, 复杂的细菌组成使得在低温贮藏过程中的货架期较短因此, 研究冷藏条件下当地南美白对虾的细菌种类和数量的变化, 可以为保鲜过程中采取针对性的措施抑制微生物和延长货架期提供参考 [1] 关于水产品在贮藏过程中的菌相变化国内外已

2 赵海鹏等 : 南美白对虾冷藏过程中的细菌分离初步鉴定及菌相分析 165 [2] 有少量报道郭全友等利用表型生理生化和细菌快速鉴定系统分离鉴定了冷藏罗非鱼优势腐败菌 [3] 的种类曹荣等利用表型和传统生理生化反应分析了太平洋牡蛎的菌相变化南美白对虾在冷藏过程中的菌相变化和以保鲜剂开发为目的的菌相研究鲜见报道 [4 鄄 5] 本试验利用传统的生理生化检验与 16S rdna 序列分析的方法对南美白对虾冷藏过程中的腐败菌进行鉴定, 为进一步研究南美白对虾的保鲜技术提供参考 1 摇材料与方法 1. 1 摇材料与仪器 2009 年 9 月从上海市南汇区东海农场, 将南美白对虾当日保活运回实验室, 加冰猝死后置于 4 益冷藏, 以备后续菌相分析试验所用试剂有胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (TSA)( 上海市疾病预防控制中心 ) 胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB)( 上海市疾病预防控制中心 ) 细菌基因组 DNA 提取试剂盒 ( 北京天根生化有限公司 ) 相关生理生化试验所用试剂均购自于国药集团试验所用仪器有超净工作台 VS 鄄 1300L 鄄 U 全自动立式电热压力蒸汽灭菌器 YXQ 鄄 LS 鄄 S 域 DHP 鄄 9162 型恒温培养箱 Eppendorf AG Hamburg PCR 仪 DYY 鄄 6C 电泳仪 minispan 微型高速离心机 THZ 鄄 82A 气浴恒温振荡器 QL 鄄 901 漩涡振荡器 1. 2 摇试验方法摇细菌的培养及分离纯化摇对冷藏第 1 d 3 d 5 d 的南美白对虾样品分别进行菌相分析, 采用有氧平板菌落计数法对菌液采用 10 倍稀释法进行稀释, 取当前状态下菌落总数合适的 3 个梯度的菌液 0 郾 1 ml 涂布于 TSA 培养基上为了获得尽量多种类的菌落, 同一梯度做 10 个平行平板 37 益培养 48 h 后计数计数时根据菌落颜色形态表面特征革兰氏染色镜检形态等对细菌进行初步归类, 计算同一类菌落的个数选择菌落数在 30 和 300 之间的所有平板, 随机挑取包含上述不同类型的 50 个菌落进行 2 ~ 3 次分离纯化, 得到的纯化菌株保存于试管斜面培养基上, 以备鉴定摇优势菌株的生理生化反应摇参照文献 [6] 和 [7] 对优势菌株进行生理生化鉴定, 主要包括革兰氏染色试验氧化酶试验淀粉酶试验氧化是否产酸 (O / F) 试验明胶液化试验硝酸盐还原试验柠檬酸盐还原试验 2,4 鄄二氨基鄄 6,7 鄄二异丙基喋啶 (O / 129) 敏感性试验糖发酵试验等摇 DNA 提取及纯化摇挑取已纯化的菌株单菌落,37 益摇床扩增培养 17 h 获得菌体采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取纯化菌株的 DNA, 方法和步骤按试剂盒说明书进行, 不同的是增加了溶菌酶破壁提取的 DNA 编号后置于 20 益冰箱中保存备用摇 16S rdna 片段的 PCR 扩增摇以提取的 DNA 为模板, 选择细菌通用引物进行 PCR, 正向引物 27f 为 5 忆鄄 GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 鄄 3 忆, 反向引物 1492r 为 5 忆鄄 CTACGGCTACCTTGTTACGA 鄄 3 忆 PCR 采用 25 滋 l 体系, 含 2 郾 5 滋 l 10 伊 PCR buffer 2 郾 0 滋 l MgCl 2 2 郾 0 滋 l dp 1 郾 0 滋 l 上游引物 1 郾 0 滋 l 下游引物 0 郾 3 滋 l TaqDNA 酶 1 郾 5 滋 l DNA 模板 14 郾 7 滋 l ddh 2 O PCR 反应的步骤为 :95 益热启动 5 min;94 益预变性 5 min;94 益变性 1 min,57 益退火 1 min,72 益复性 2 min, 重复 25 次 ;72 益延伸 10 min 使用 1% 的琼脂糖凝胶电泳, 检验 PCR 扩增产物采用北京天根生物工程有限公司的 DNA 纯化试剂盒对 PCR 产物进行纯化获得的纯化产物送上海 Sunny 生物科技有限公司测序摇 16S rdna 序列的比对和系统发育树分析摇测序得到菌株部分长度的 16S rdna 序列 ( 约 bp), 将测序结果登陆 NCBI 网站 ( 美国国立生物技术信息中心 ) 通过 Blast 程序与 GenBank 中的核酸序列进行比对, 从中选出相似性较高的序列, 应用 Bioedit 和 DNAMAN version6. 0 软件进行多重比较后构建系统发育树 2 摇结果 2. 1 摇细菌菌株的基本特征采用稀释平板分离法和划线分离法, 从南美白对虾上共分离出 8 种典型菌, 其特征见表摇南美白对虾在冷藏过程中菌相变化分别在冷藏第 1 d 3 d 5 d 随机取 10 袋虾进行分析, 每次对细菌总数和典型菌株进行计数南美白对虾冷藏过程中细菌组成及变化见表摇优势菌株的生理生化特征南美白对虾冷藏货架期结束时菌相趋于简单, 主要的优势菌为 X 1 和 X 3 2 种,2 种菌的各项生理生化指标见表 3

3 江苏农业学报摇 2011 年第 27 卷第 1 期 166 表 1摇南美白对虾中细菌的特征 Table 1摇 The properties of bacteria in Penaeus Vannamei 摇摇特征形状 X2 G 有乳白色白色菌落隆起度菌落边缘形状菌落表面状态光滑湿润芽孢菌落颜色菌落透明度 X2 X4 X5 Y6 Y7 Y8 为菌株编号 X4 G G 淡黄色棕黄色金黄色黄红色浅黄金黄色呈扩展状粗糙蜡状光滑湿润光滑半透明半透明 X5 Y6 Y7 Y8 Table 3摇 The physiological and biological properties of and 生理生化反应淀粉酶试验冷藏第 1 d 冷藏第 3 d 冷藏第 5 d 摇摇依据和的主要生理生化反应和菌落特征, 可判断为希瓦氏菌属中的一种, 为气单胞菌属中的一种希瓦氏菌在南美白对虾冷藏的中后期成为优势腐败菌,其次是气单胞菌表 3摇和的生理生化特征氧化酶( OX) 试验 Y8 球状典型菌株占细菌总数的比例 ( % ) Y7 球状 changes during cold storage X2 Y6 G Table 2摇 The composition of bacturia in Penaeus vannammei and its X5 球形表 2摇南美白对虾冷藏过程中细菌的组成及其变化菌株 X4 革兰氏染色过氧化氢酶试验柠檬酸盐试验硝酸盐还原试验明胶液化试验 O / F 试验 O / 129 敏感性试验乳糖利用试验葡萄糖利用试验生理生化反应麦芽糖利用试验山梨糖利用试验山梨醇利用试验水杨素利用试验蔗糖利用试验海藻糖利用试验阿拉伯糖利用试验半乳糖利用试验果糖利用试验纤维二糖利用试验甘露醇利用试验革兰氏染色试验 GG:大多数 ( 逸90% ) 菌株为阳性; : 大多数 ( 逸90% ) 菌株为阴性; :未试验 2. 4摇 8 种菌株的 16S rdna 片段的 PCR 扩增结果用引物 27f 和 1492r 对样品基因组进行 PCR,得到重复性好且稳定的特异性条带, 片段大小为 bp 左右( 图 1) 图 1摇 8 种菌株的 16S rdna PCR 扩增电泳图谱 Fig. 1摇 PCR amplification of 16S rdna of eight strains

4 赵海鹏等 : 南美白对虾冷藏过程中的细菌分离初步鉴定及菌相分析摇 16S rdna 序列的同源性对 8 种细菌的碱基序列在 NCBI 数据库中使用 BLAST 程序进行同源性搜索, 取每种细菌 16S rdna 相似性在 99% 以上的 7 ~ 8 个菌株进行比较, 并构建系统发育树, 根据亲缘关系远近判断细菌种类对优势菌 X 1 和 X 3 同源性搜索结果见表 4, 系统发育树见图 2 图 3 表 4 摇与优势菌 X 1 和 X 3 同源性较高的菌株 Table 4 摇 Strains having higher homologous relationships with dominant strains X 1 and X 3 菌种名摇 X 1 登录号分值相似性 (% ) 菌种名摇 X 3 登录号分值相似性 (% ) Shewanella sp. AF Aeromonas hydrophila GU Shewanella sp. EU Aeromonas hydrophila GQ Shewanella sp. AF Aeromonas GU Shewanella taiwanensis AB Aeromonas hydrophila AB Shewanella putrefaciens GQ Aeromonas hydrophila FJ Shewanella putrefaciens AB Aeromonas sp. FJ Shewanella sp. FJ Aeromonas sp. FN Pseudomonas sp. FN 图 2 摇基于 16S rdna 序列同源性的 X 1 菌株系统发育树 Fig. 2 摇 Phylogenetic tree of strains X 1 based on 16S rdna sequences 图 3 摇基于 16S rdna 序列同源性的 X 3 菌株系统发育树 Fig. 3 摇 Phylogenetic tree of strains X 3 based on 16S rdna sequences

5 168 江苏农业学报摇 2011 年第 27 卷第 1 期摇摇由图 2 可见,X 1 与腐贩希瓦氏菌 ( Shewanella sp. ) 的亲缘关系较近, 且 X 1 与腐败希瓦氏菌 ( 登录号 :AB ) 在同一分支中, 结合生理生化反应特征可将 X 1 鉴定为腐败希瓦氏菌 X 3 与气单胞菌属 (Aeromonas sp. ) 亲缘关系较近, 且与嗜水气单胞菌 ( 登录号 :AB ) 在同一分支中 ( 图 3), 结合生理生化反应特征,X 3 鉴定为气单胞菌属中的嗜水气单胞菌对其余 6 种菌株构建系统进化树并结合生理生化反应, 将 X 2 鉴定为芽孢杆菌属中的蜡样芽孢杆菌,X 4 为假单胞菌属中的恶臭假单胞菌,X 5 为金黄色葡萄球菌,Y 6 为不动杆菌,Y 7 为嗜冷杆菌, Y 8 为微小杆菌 3 摇讨论在南美白对虾冷藏过程中, 随冷藏时间的延长, 细菌种类趋于稳定基于 16S rdna 的分子生物学方法对细菌种类的鉴定结果与传统的生理生化反应鉴定结果有较好的一致性 [8] Shewan 认为以食品保藏为目的的菌相分析将细菌种类分类到属已经足够 [9] 在菌相清楚的情况下, 就可以选择具有相应抑菌作用的生物保鲜剂进行靶向抑菌, 从而为后续的保鲜技术提供理论指导在冷藏货架期结束时, 南美白对虾的主要优势腐败菌为腐败希瓦氏菌, 占细菌总数的 36 郾 0% 腐败希瓦氏菌大量存在于水 [10] 和土壤中, 水产品携带较多 Gill 等研究认为假单胞菌属 (Pseudomonas) 和希瓦氏菌属 (Shewanella) 是冷链流通中高水分蛋白食品的特定腐败菌 (Spe 鄄 cific spoilage organisms,sso) 贮藏过程中腐败希瓦氏菌会产生 H 2 S 和不良气味, 同时导致肉变色发粘, 这可能是南美白对虾腐败的一个主要原因南美白对虾的另一个优势腐败菌是气单胞菌, 货架期结束时占细菌总数的 26 郾 0% 气单胞菌属又分致病菌和非致病菌, 本试验通过构建系统进化树发现 X 3 与嗜水气单胞菌的亲缘关系最近, 极可能是嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌是水产动物常见的致病菌, 甚至会引发人的腹泻和食物中毒 [11], 本试验中嗜水气单胞菌在冷藏过程中的比例呈先增大后减小的趋势, 在整个货架期内所占的比例在 24 郾 0% 至 33 郾 9% 之间, 在食用过程中应注意防范, 在保鲜过程中也需要采取抑制此种菌的措施假单胞菌也是水产动物常见的腐败菌, 在南美白对虾冷藏过程中其数量变化不大, 但仍占一定比例蜡样芽孢杆菌和不动杆菌呈减小趋势, 分别由冷藏第 1 d 的 23 郾 4% 和 3 郾 5% 下降为货架期结束时的 7 郾 0% 和 2 郾 0%, 而嗜冷杆菌在冷藏过程中不断增加由最初的 4 郾 0% 增加到 10 郾 0% 有研究认为腐败希瓦氏菌假单胞菌气单胞菌和乳酸菌等是温带水域鱼类的腐败菌 [12] 郭全友等研究发现假单胞菌是 0 ~ 10 益贮藏罗非鱼的优势腐败菌 [2] 本研究发现南美白对虾冷藏过程中腐败菌种类为腐败希瓦氏菌气单胞菌和假单胞菌, 其中腐败希瓦氏菌为主要优势腐败菌, 与其他学者的研究结果有相似之处参考文献 : [1] 摇曹摇荣, 薛长湖, 薛摇勇, 等. 臭氧水对牡蛎细菌菌相及货架期的影响 [J]. 食品工业科技,2006,27(5):63 鄄 65. [2] 摇郭全友, 杨宪时, 许摇钟. 冷藏罗非鱼优势腐败菌的鉴定及其特征 [J]. 食品与机械,2009,25(3):87 鄄 90. [3] 摇曹摇荣, 薛长湖, 许加超, 等. 太平洋牡蛎细菌菌相分析及鄄 20 益冻藏过程中的菌相变化 [J]. 食品与发酵工业,2006,32(3): 1 鄄 3. [4] 摇赵海鹏, 李清纯, 谢摇晶, 等. 复合生物保鲜剂对南美白对虾的保鲜效果 [J]. 江苏农业学报,2010,26(4):812 鄄 817. [5] 摇凌萍华, 谢摇晶, 赵海鹏, 等. 冰温贮藏对南美白对虾保鲜效果的影响 [J]. 江苏农业学报,2010,26(4):828 鄄 832. [6] 摇布坎南 R E, 吉本斯 N E. 伯杰细菌鉴定手册 [M]. 8 版. 中国科学院微生物研究所伯杰细菌鉴定手册翻译组. 北京 : 科学出版社,1984:276 鄄 604. [7] 摇东秀珠, 蔡妙英, 王宝玲, 等. 常见的细菌鉴定手册 [ M]. 1 版. 北京 : 科学出版社,2001:216 鄄 334. [8 ] 摇 SPANGGAARD B, HUBER I, NIELSEN J. The microflora of rainbow trout intestine:a comparison of traditional and molecular i 鄄 dentification[j]. Aquaculture,2000,182:1 鄄 15. [9] 摇 SHEWAN J M. The microbiology of fish and fishery products [J]. Appl Bacteriol, 1971,34: 299 鄄 315. [10] GILL C O, BADONI M, JONES T. Hygienic effects of trimming and washing operations in a beef carcass dressing process [ J]. Journal of Food Protection, 1996, 59: 666 鄄 669. [11] 王摇建, 沈莉萍, 徐摇锋, 等. 企鹅源嗜水气单胞菌的分离鉴定 [J]. 动物医学进展,2009,30(5):114 鄄 116. [12] GRAM L, HUSS H H. Microbiological spoilage of fish and fish products[j]. Int J Food Microbiol, 1996,33:121 鄄 137.

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Microsoft Word 熊振海.doc 5 7 Vol. 5 No. 7 2014 7 Journal of Food Safety and Quality Jul., 2014 熊振海, 马晨晨 * (, 201306) 摘要 : 目的,, 方法 16S rdna 结果 2.6 10 4 CFU/g, 8, : S01 S02, S03, S04 S06, S05, S07, S08 结论, 4, 5 关键词 : ; ; ; 16S rdna