Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. 5 前言胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤, 对人类健康和生存产生严重威胁 [1] 在全球范围内, 胃癌的发病率和死亡率均居于前列 [2] 在中国, 每年新增胃癌病例近 40 万, 死亡人数

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乃穆
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1 Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. ５基础研究 IKL 基因表达对胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响及其机制研究秦洁1 贾皑2 郑雪丽3 肖月梅4 1西安医学院第一附属医院消化内科陕西西安西安交通大学第一附属医院消化内科陕西西安咸阳市第一人民医院消化内科陕西咸阳榆林市第二医院消化内科陕西榆林摘要目的制方法研究肠道富集 Krüppel 样因子 IKL 表达量下调对人胃癌细胞 HGC-27 迁移和侵袭的影响及其作用机采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒和错配体转入人胃癌细胞 HGC-27 中以干扰 IKL 的表达以未转染细胞为空白对照实验分为三组组组和组蛋白质印迹法 Western blot 荧光实时定量 CR qrt-cr 检测细胞转染效率 Transwell 小室法检测细胞迁移和侵袭的能力 Western blot qrtcr 检测胃癌细胞 HGC-27 中 IKL 沉默后蛋白激酶 B Akt1 磷酸化蛋白激酶 B p-akt1 和细胞周期蛋白 D1 Cyclin D1 的表达水平结果转染重组质粒后胃癌细胞 HGC-27 中 IKL 表达量下降且迁移和侵袭能力显著减弱 < 0.05 组和组间细胞的迁移和侵袭能力无显著差异 > 0.05 IKL 基因沉默使胃癌细胞中 p-akt1 蛋白和 Cyclin D1 蛋白的表达量显著降低 < 0.05 Akt1 水平无显著变化 > 0.05 组和组细胞中 p-akt1 蛋白和 Cyclin D1 蛋白的表达量无显著差异 > 0.05 结论沉默 IKL 基因可降低人胃癌细胞 HGC-27 的迁移和侵袭能力其机制可能与 IKL 下调 13K/Akt1 信号通路中 p-akt1 水平和 Cyclin D1 的表达有关关键词 IKL 胃癌 p-akt1 Cyclin D1 迁移侵袭中图分类号 R735.2 文献标识码 A 文章编号 doi /j.issn Effects and Molecular Mechanisms Study of IKL Gene Silencing on Migration and Invasion of Gastric Cancer Cells QIN Jie1, JIA Ai2, ZHENG Xueli3, XIAO Yuemei4 ( Department of Digestive Internal Medicine, the irst Affiliated Hospital of Xi an Medical College, Xi an, Shaanxi, , 1 China; 2 Department of Digestive Internal Medicine, the irst Affiliated Hospital of Xi an Jiaotong University, Xi an, Shaanxi, , China; 3 Department of Digestive Internal Medicine, the irst eople s Hospital of Xianyang, Xianyang, Shaanxi, , China; 4 Department of Digestive Internal Medicine, Yulin Second eople s Hospital, Yulin, Shaanxi, , China) Abstract: Objective To investigate the relationship between IKL gene and migration, invasion of gastric cancer HGC-27 cells. Methods The plasmid and were transfected into HGC-27 cell to silence the expression of IKL gene. The experiment was designed with three groups: group, group and group. The migration and invasion of cells were examed by Transwell assay. The protein and mrna levels of IKL, Akt1, p-akt1 and Cyclin D1 were detected by Western blot and qrt-cr. Results The protein and mrna levels of IKL in the group was significantly lower than in control group ( < 0.05). Knockdown of IKL expression had significant inhibiting effects on cell migration and invasion in the group ( < 0.05), but no significant difference in group and group ( > 0.05). The p-akt1 and Cyclin D1 protein levels in group were obviously lower than in the control group ( < 0.05), but showed no significant difference when compared with those in the group ( > 0.05). No significant difference was found in Akt1 levels ( > 0.05). Conclusion The IKL gene may play a role in inhibiting migration and invasion of gastric cancer cells by suppressing the expression of Cyclin D1 and p-akt1 of 13K/Akt1 signaling pathway. Key words: IKL; Gastric cancer; p-akt1; Cyclin D1; Migration; Invasion 作者简介秦洁女硕士研究生主治医师研究方向胃癌的发病机制 cang @163.com 通讯作者贾皑女博士副主任医师研究方向肝纤维化消化道肿瘤 jiaai0129@163.com

2 Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. 5 前言胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤, 对人类健康和生存产生严重威胁 [1] 在全球范围内, 胃癌的发病率和死亡率均居于前列 [2] 在中国, 每年新增胃癌病例近 40 万, 死亡人数约 17 万, 占全部恶性肿瘤死亡人数的 25% [3] 随着科学技术的进步, 胃癌的治疗方法取得了一定程度的进步, 但 5 年生存率仍低于 30% [4] 胃癌的发病与抑癌基因失活细胞侵袭和迁移有很大关系因此, 研究基因对细胞侵袭迁移的影响, 可为胃癌的治疗提供新的思路转录因子通过特异性序列结合目的蛋白, 从而激活或者抑制基因细胞的表达 [5] 肠道富集 Krüppel 样因子 (intestinal-enriched Krüppel-like factor,ikl, 又称 KL5) 是近年来发现的新型转录因子, 与真核基因转录调控的生理过程密切相关 [6] 研究显示 IKL 在多种肿瘤组织如宫颈癌 [7] [8] 胃癌中高表达, 但 IKL 对胃癌的作用机制尚不明确本研究通过小 RNA 干扰技术 (sirna) 沉默 IKL 的表达, 观察其对细胞侵袭迁移能力的影响及其作用机制, 以期为胃癌的诊治提供新的思路 1 材料与方法 1.1 材料人胃癌细胞 HGC-27 购自中科院上海细胞库, 胎牛血清 RMI-1640 培养基购自美国 Gibco BRL 公司,Traswell 培养板购自美国 Corning 公司,Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自美国 Invitrogen 公司 ( 货号 ), 细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司,Matrigel 基质胶购自上海威奥生物科技有限公司, 磷酸化蛋白激酶 B (hosphorylated protein kinase B,p-Akt1) 抗体细胞周期蛋白 D1(Cyclin D1) 抗体购自美国 roteintech 公司等细胞培养箱购自德国 Heraeus 公司, 倒置相差荧光显微镜购自日本 Olympus 公司, 生物安全柜购自美国 NuAire 公司 1. 2 细胞培养和转染细胞培养 : 人胃癌细胞 HGC-27 置于含 10% 胎牛血清青霉素 (100 U ml -1 ) 链霉素 (100 μg ml -1 ) 的 RMI-1640 培养基中, 置于 37 5% CO 2 95% 湿度的培养箱中培养每天观察细胞的生长情况, 待细胞占整个培养瓶的 75% 时, 用 0.25% 胰酶进行消化传代细胞转染 : 取对数生长期的 HGC-27 细胞, 用 0.25% 胰酶稀释成单细胞悬液, 以每孔个细胞接种于 6 孔板中, 摇匀, 置于培养箱中培养 ; 当细胞融合度达到 80%~90% 时, 吸去完全培养基, 缓冲液洗涤 2 次, 加入 1 ml 含 10% 胎牛血清的 RMI 1640 培养基实验分三组, 组加入 Lipofectamine 2000 IKL sirna 复合体 ;sirna- NC 组加入 Lipofectamine 2000 错配 sirna 复合体 ; 组加入 Lipofectamine 2000 转染后 48 h 收集细胞中的 IKL 蛋白以检测转染效率 1.3 细胞迁移侵袭实验用 Transwell 小室法检测转染细胞的迁移侵袭能力接种细胞前 1 天将小室放入 24 孔板中, 在小室上室面的底部铺 Matrigel 基质胶 (50 μl/ 孔 ); 将细胞悬浮液以个 / 孔接种于小室上室, 下室加入 500 μl 含 10% 胎牛血清的 RMI1640 培养基作为趋化剂将 24 孔板置于 37 5% CO 2 细胞培养箱中培养 48 h; 取出小室, 弃去培养液, 用棉签轻轻擦去 Matrigel 基质胶和微孔膜上的细胞, 用 4% 多聚甲醛进行固定, 苏木素和伊红染色, 倒置显微镜下随机选取 5 个视野计算穿过小室的细胞数, 取平均值细胞迁移实验上室中不加 Matrigel 基质胶, 其余步骤与侵袭实验相同 1.4 Western blot 检测 Akt1 p-akt1 Cyclin D1 蛋白表达水平收集细胞,BS(4 预冷 ) 洗涤, 加入 200 μl 细胞裂解液, 置于冰上 30 min, rpm 离心 5 min, 将上清移入 E 管,BCA 法测定蛋白浓度取 30 μg 蛋白在十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-AGE) 变性后转至硝酸纤维素膜, 5% 脱脂牛奶封闭 1 h 一抗 4 孵育过夜,TBST 洗涤 4 次, 二抗室温孵育 1.5 h,tris-hcl 缓冲盐溶液 +Tween(TBST) 洗涤后用增强化学发光 (ECL) 显色检测蛋白含量 1.5 qrt-cr 检测转染后细胞中 IKL p-akt1 Cyclin D1 mrna 的表达量收集个细胞, 预冷的 BS 冲洗 3 次, 加入 1 ml Trizol 冰上裂解 5 min, 提取细胞总 RNA,DEC 水溶解 RNA 沉淀, 保存于 -80 加入 0.6 μl 逆转录酶,42 孵育 15 min,95 孵育 5 min,5 孵育 5 min, 保存于 -20

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3 Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. ５上海生工生物合成基因引物 IKL 引物上游序列为 5 -AGCAGCAATGGACACTCTT-3 下游序列为 5 -TGTAGCAGCATA GGATGGA-3 Akt1 引物上游序列为 5 -ACTTCCCCCAGTT CTCCTACTCG-3 下游序列为 5 -CCCACAGCACAAAAACGTCTTTC-3 Cyclin D1 引物上游序列为 5 -AGGAACAGAA GTGCGAGGAG-3 下游序列为 5 -AGGCGGT AGTAGGACAGGAAG-3 β-actin 上游序列为 5 -G G G A A A T C G T G C G T G A C A - 3 下游序列为 5 -TCAGGAGGAGCAATGATC-3 反应条件为 95 5 min s s 95 8 min 45 cycles 实验重复 3 次采用 2-ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达量 1.6 统计学分析图1 sirna下调ikl表达效果的检测 ig. 1 Detection of the downregulation of sirna on IKL expressions 表1 sirna下调ikl表达效果的检测 Tab. 1 Detection of the downregulation of sirna on IKL expressions IKL 蛋白 IKL mrna 0.611± ± ± ±0.008 实验数据采用 SSS 22.0 进行分比较采用单因素方差分析组间比较采用 LSD-t 检验 < 0.05 为差异有统计学意义 sirna 下调 IKL 表达的检测组细胞中 IKL 的 mrna 水平 t 1= =0.002 蛋白表达量 t 1= =0.005 t 2=5.07 2=0.002 t 2= =0.006 显著低于组和 sirnanc 组组细胞中 IKL 的 mrna 蛋白表沉默 IKL 对人胃癌细胞 HGC-27 中 p-akt1 Cyclin D1 表达水平 Note compared with the group < 0.05 compared with group < 结果 0.118± 析计量资料用均数 ± 标准差 x±s 表示多组间 0.589±0.107 组 Akt1 mrna 蛋白水平较对照组无显著差异 t 1= > 0.05 t 2 = > 0.05 组 p-akt1 蛋白表达量显著低于组和 sirnanc 组 t 1= = t 2= = 组与组蛋白表达量无显著差异达量与组无显著差异 t 1= =0.692 t 1= = 组 Cyclin D1 低 IKL 的表达量图 1 表 1 mrna 表达量 t 1 = = t 2 = 表明 RNA 干扰体系可以有效降 t 2= = 沉默 IKL 对细胞迁移能力的影响 sirna- IKL 组与组组细胞迁移数目比较差异有统计意义 t1= =0.010 t2= =0.010 组与组比较差异无统计学意义 t = = 表明 IKL 表达量下降可抑制人胃癌细胞 HGC-27 迁移表沉默 IKL 对细胞侵袭能力的影响 Transwell 侵袭结果如表 3 所示组与组及组侵袭能力相比差异有统计意义 t 1= =0.002 t 2= =0.003 组与组间差异无统计学意义 t = = 表明 IKL 表达下调可抑制人胃癌细胞 HGC-27 的侵袭能力蛋白 t 1= = t 2= = = 显著低于组和组组与组无显著差异 t 1= 图 4 表 4 1= t 2= = 表2 沉默IKL对细胞迁移能力的影响 Tab. 2 Effects of knockdown of IKL expression on cell migration 迁移细胞数 ± ± ± Note compared with the group < 0.05 compared with the group < 0.05.

- 698 - Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. 5 图2 沉默IKL对细胞迁移能力的影响 ig. 2 Knockdown of IKL expression had significant inhibiting effects on cell migration 图3 沉默IKL对细胞侵袭能力的影响 ig.

598 126.420±10.562 17.362 0.003 Note compared with the group < 0.05 compared with the group < 0.05. 3 讨论图4 沉默IKL对人胃癌细胞HGC-27中Akt1 p-akt1 Cyclin D1蛋白表达水平 ig.

receptor AR Myc Cyclin D1 p15 等目的基因的制靶基因的表达与血管生成细胞增殖分化侵表达进而调控细胞增殖凋亡侵袭迁移等生理袭迁移有密切关系研究表明 IKL 可通过调活动 11 据报道 IKL 在乳腺癌中被乙酰化后可控 TNRS11A 表达促进宫颈癌细胞增殖迁移抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡 12 但 IKL 在侵袭 6

4 Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. 5 图2 沉默IKL对细胞迁移能力的影响 ig. 2 Knockdown of IKL expression had significant inhibiting effects on cell migration 图3 沉默IKL对细胞侵袭能力的影响 ig. 3 Knockdown of IKL expression had significant inhibiting effects on cell invasion 表3 沉默IKL对细胞侵袭能力的影响 Tab. 3 Effects of knockdown of IKL expression on cell invasion 侵袭细胞数 ± ± ± Note compared with the group < 0.05 compared with the group < 讨论图4 沉默IKL对人胃癌细胞HGC-27中Akt1 p-akt1 Cyclin D1蛋白表达水平 ig. 4 Knockdown of IKL expression had effects on the protein levels of Akt1 p-akt1 and Cyclin D1 in cell HGC-27 通路等 10 IKL 还可抑制或激活过氧化物酶体增殖物激活受体 peroxisome proliferator-activated 作为新发现的转录因子 IKL 可激活或者抑 receptor AR Myc Cyclin D1 p15 等目的基因的制靶基因的表达与血管生成细胞增殖分化侵表达进而调控细胞增殖凋亡侵袭迁移等生理袭迁移有密切关系研究表明 IKL 可通过调活动 11 据报道 IKL 在乳腺癌中被乙酰化后可控 TNRS11A 表达促进宫颈癌细胞增殖迁移抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡 12 但 IKL 在侵袭 6 还可通过直接调节血管内皮生长因子 A 多种肿瘤中的表达水平一直存在争议在胃癌乳 vascular endothelial growth factor A VEGA 的转录腺癌组织中表达上调在前列腺癌食管癌中表达水平促进膀胱癌血管生成 9 其表达量可影响多个下调提示 IKL 参与了肿瘤发展的多个环节 13 信号通路包括肿瘤坏死因子蛋白激酶 C 和转化 IKL 在胃癌组织中高表达 8 本实验通过 RNA 干生长因子 -β transforming growth factor-β TG-β 扰技术沉默 IKL 发现 IKL 的 mrna 蛋白表达

5 Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. ５表4 沉默IKL对人胃癌细胞HGC-27中Akt1 p-akt1 Cyclin D1表达水平 Tab. 4 Effects of knockdown of IKL expression on the Akt1 p-akt1 and Cyclin D1 protein levels in cell HGC-27 Akt1 蛋白 p-akt1 蛋白 Cyclin D1 蛋白 Akt1 mrna Cyclin D1 mrna 1.236± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 注与组相比 < 0.05 与组相比 < ± ± ± Note compared with the group < 0.05 compared with the group < 量下降表明转染胃癌细胞 HGC-27 Cyclin D1 表达从而抑制细胞的侵袭迁移这些可降低 IKL 的表达量组细胞的迁发现将为胃癌的临床诊断和治疗提供实验依据移侵袭能力均下降表明 IKL 表达下降可抑制胃癌细胞 HGC-27 的侵袭迁移能力胃癌是一个复杂的过程其发生发展的分子机制仍不明确近年来肿瘤信号通路成为研究热点之一 13K/AKT 通路异常可诱发肿瘤的产生对细胞周期转移血管生成等过程起重要作用 14 AkT 蛋白是 13K/AKT 通路中的重要蛋白在多种肿瘤中均表达 p-akt 是其磷酸化形式具有活性已被证明在多种恶性肿瘤中均表达并与细胞转移有关 15 高瑞林等发现 p-akt 表达下降可抑制基质金属蛋白酶 matrix melaiiopmleinases MMs 家族中 MM2 MM9 蛋白的表达从而有效抑制膀胱癌细胞的侵袭能力 16 Cyclin D1 在调控细胞周期方面起重要作用可正向调控多种肿瘤的发生和发展在正常胃黏膜组织中高表达达到一定水平后可刺激黏膜上皮恶性增殖说明 Cyclin D1 在胃癌发生早期具有重要作用 19 Cyclin D1 可调控细胞有丝分裂与细胞周期依赖性激酶共同作用促进细胞从 G 1 期向 S 期转化 20 本研究中人胃癌细胞 HGC-27 转染后 Akt1 mrna 和蛋白水平无明显变化 p-akt1 Cyclin D1 mrna 和蛋白表达量均下降表明 IKL 基因可能通过下调 13K/Akt1 信号通路中 p-akt1 水平抑制 Cyclin D1 表达阻滞细胞 G1/S 期转化降低细胞迁移侵袭能力综上所述沉默 IKL 基因可有效抑制胃癌细胞 HGC-27 的迁移侵袭能力其机制可能是通过下调 13K/Akt1 信号通路中 p-akt1 水平抑制参考文献 References 1 Loft A, orss I, Mandrup S. Genome-Wide Insights into the Development and unction of Thermogenic Adipocytes J. Trends Endocrinol Metab, 2017, 28(2): doi: /j. tem Xie R, Liu J, Wu RN, et al. The effect of lentivirus - mediated Annexin A2 silence on gene expression profiles of AGS gastric cancer cells J. J Mod Oncol, 2017, 25(3): 谢蕊, 刘娇, 吴日娜, 等. 慢病毒介导的 Annexin A2 基因沉默对胃癌 AGS 细胞基因表达谱的影响 J. 现代肿瘤医学, 2017, 25(3): doi: /j. issn He N, Jin QN, Huang YM, et al. Expression of ADAM8 in Gastric Carcinoma and Its Association with Clinicopathologic eatures J. Acta Med Univ Sci Technol Huazhong, 2017, 46(1): 1-4. 何楠, 金倩娜, 黄永明, 等. ADAM8 基因在胃癌组织中的表达及与临床病理特征的关系 J. 华中科技大学学报 (医学版), 2017, 46(1): 1-4. doi: /j. issn Horasawa S, Matsui R, Kawasumi K, et al. The Usefulness of Outpatient harmacy Services in Adjuvant Chemotherapy for Gastric Cancer J. Gan To Kagaku Ryoho, 2016, 43(9): Limame R, Op de Beeck K, Lardon, et al. Krüppel-like factors in cancer progression: three fingers on the steering wheel J. Oncotarget, 2014, 5(1): Zhu JJ, Lin YQ, Zuo LL, et al. Molecular Cloning, Tissue Expression of KL5, KL6, KL7 Genes, and Their Correlations with Intramuscular at Content in Yak J. Acta Veter et Zootech Sinica, 2017, 48(3): 朱江江, 林亚秋, 左璐璐, 等. 牦牛KL5 KL6 KL7基因的克隆表达及其与肌内脂肪含量的相关性分析 J. 畜牧兽医学报, 2017, 48(3): doi: /j. issn Chang LY, Ma D, Li O, et al. Expressions and unctions of

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12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. 5 前言 胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤, 对人类健康 和生存产生严重威胁 [1] 在全球范围内, 胃癌的发 病率和死亡率均居于前列 [2] 在中国, 每年新增胃 癌病例近 40 万, 死亡人数

Anti-tumor harmacy, October 2018, Vol. 8, No. 5 前言胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤, 对人类健康和生存产生严重威胁 [1] 在全球范围内, 胃癌的发病率和死亡率均居于前列 [2] 在中国, 每年新增胃癌病例近 40 万, 死亡人数