广西医科大学报第10期--排

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1 406 JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY 07 Oct;34(0) * 异基因造血干细胞移植后 MHC 单倍体相合脾脏抗白血病疗效分析 谢 媚, 陈伟红, 杜 新, 蔡云, 张巧霞, 李明, 罗畅如, 蔡力生, 卓家才, 冯春锐, 李玉珠, 汪鹏程, 赵江丽 ( 深圳市第二人民医院深圳大学第一附属医院. 血液内科 ;. 深圳市血液病研究所, 深圳 58035) 摘要 目的 : 观察主要组织相容性复合体 (MHC) 单倍体相合脾脏对非清髓异基因造血干细胞移植 (allo-hsct) 抗白血病疗 效的分析 方法 : 用 8~ 周 C57/BL/6 近交系小鼠 (B6 鼠 ) 作为供鼠, 取其骨髓细胞和脾细胞 ;P85 细胞为肥大细胞瘤细胞 即白血病细胞, 近交系 DBA/ 小鼠与近交系 C57/BL/6 小鼠杂交的第一代小鼠 B6DF(F 鼠 ) 为受鼠, 受鼠骨髓移植 d-5~ d-3, 用环磷酰胺 300 mg/(m d) 腹腔注射预处理, 受鼠移植当天 (d0), 将 F 鼠随机分为 A B C D 4 组, 每组 只, 其中 A 组 经尾静脉注射 P85 细胞 ( 0 4 个 ) 骨髓细胞 (5 0 6 个 ) 和脾细胞 ( 0 7 个 ) 的混合细胞悬液,B 组经尾静脉注射 P85 细 胞 ( 0 4 个 ) 和骨髓细胞 (5 0 6 个 ) 的混合细胞悬液,C 组经尾静脉注射 P85 细胞 ( 0 4 个 ) 的细胞悬液,D 组经尾静脉注 射 RPMI 640 细胞培养基 比较 4 组小鼠血象 急性移植物抗宿主病 (GVHD) 评分以及皮肤 肝 结肠的病理白血病细胞浸 润情况 结果 :() 移植后第 4 天,A 组 GVHD 评分 ~4 分, 第 5 天 3 只小鼠死亡, 第 6 天 只小鼠 GVHD 评分 6 分, 其它 7 只小鼠 GVHD 评分 0~3 分, 第 8 天死亡 只, 存活的 8 只小鼠 GVHD 临床评分 ~6 分 B 组小鼠第 6 天开始出现死亡, 至 第 7 天死亡 只, 第 30 天时仅存活 只 C 组第 8 天时全部死亡 ()4 组小鼠移植后第 7 天时,A B C 组小鼠白细胞数量 明显增高, 组间比较有明显差异 (P<0. 05), 与 D 组比较差异亦有统计学意义 (P<0. 05) 移植后第 4 天时,4 组小鼠白细 胞数均明显下降,A 组分别与 B C D 组比较差异均有统计学意义 (P<0. 05) (3) 移植后第 8 天,A D 组白细胞数均回升, 组间比较无明显差异 (P>0. 05) A 组小鼠的肝脏可见炎性细胞浸润, 汇管区肝细胞萎缩 坏死, 中央静脉区少量白血病细 胞浸润 B 组可见肝细胞数量减少, 肝窦内白血病细胞弥散性浸润 结论 : 非清髓 allo-hsct MHC 单倍体相合脾脏可以提 高抗白血病的疗效 关键词 异基因造血干细胞移植 ; 脾脏 ;P85 细胞 ; 白血病 中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : X(07)0- DOI:0. 690/j. cnki. 45-/r The anti-leukemia effect of major histocompatibility complex haploidentical spleen in hematopoietic stem cell transplantation Xie Mei,Chen Weihong,Du Xin,Cai Yun,Zhang Qiaoxia,Li Ming,Luo Changru,Cai Lisheng,Zhuo Jiacai,Feng Chunrui,Li Yuzhu,Wang Pengcheng,Zhao Jiangli.(. Department of Hematology;. Institute of Hematology,Shenzhen Second People's Hospital,The First Affiliated Hospital of Shenzhen University,Shenzhen 58035,China) Abstract Objective: To evaluate the anti-leukemia effect of major histocompatibility complex(mhc)haploidentical spleen in nonmyeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo-hsct). Methods: Take C57/BL/6 inbred mice(b6 mice)of 8~ weeks as donor rats,and their bone marrow and spleen cells were collected. P85 cells were mast cell tumor cells(leukemia cells). The first generation B6DF mice(f mice)were as recipients who were hybridized by C57/BL/6 mice and DBA/ mice. The recipients were intraperitoneally injected with cyclophosphamide 300 mg/(m d)at day -5 to -3 before transplantation. On day 0,F mice were divided into group A,B,C and D(n= per group). The mice in group A were injected with mixture of P85 cells( 0 4 cells),bone marrow cells(5 0 6 cells)and spleen cells( 0 7 cells)via caudal vein. Mice in group B were injected with mixture of P85 cells * 基金项目 : 深圳市知识创新计划基础研究项目 (No. ( 0 4 cells)and bone marrow cells(5 0 6 cells). JCYJ ); 深圳骨髓移植技术临床应用公共服务 Mice in group C were injected with P85 cells( 平台项目 (No. s ) 0 4 cells),and those in group D were injected with 通信作者, whitney-cindy@hotmail.com RPMI 640 cell culture medium. The status of the 收稿日期 : mice blood,cute graft versus host disease(gvhd)

2 谢媚, 等. 异基因造血干细胞移植后 MHC 单倍体相合脾脏抗白血病疗效分析 407 score and the pathological leukemia infiltration of skin,liver and colon were observed and compared. Results: ()The GVHD score in group A was ~4 on the 4th day after transplantation. Three mice died on day 5. The GVHD score of mice was 6 on day 6,and the rest were scored at 0~3. A mouse died on day 8,and the rest survived mice were scored at -6. In group B,the mice began to die on the 6th day,eleven mice died till day 7 and only one survived on day 30. Mice in group C were all dead on day 8.()Day 7 after transplantation,the white blood cell(wbc)in group A,B and C were significantly increased. There was significant difference among groups(p<0. 05). Day 4 after transplantation,wbc count of all mice were significantly decreased. Compared with group B,C and D,the difference of group A was statistically significant(p<0. 05). On day 8 after transplantation,wbc count of group A and D were increased,but no significant difference was noted between group A and D(P>0. 05).(3)The liver inflammatory cell infiltration,cell atrophy and necrosis in hepatic portal area,a small amount of infiltration of leukemia cells in central vein area could be observed in group A. In group B,the number of hepatocytes was decreased,and the infiltration of leukemia cell in the liver sinus was diffuse. Conclu sion: MHC haploidentical spleen in nonmyeloablative allo-hsct might improve the efficacy of anti-leukemia. Keywords allogeneic hematopoietic stem cell transplantation;the spleen;p85 cell;leukemia 异基因造血干细胞移植 (allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-hsct) 是治疗恶性血液病最有效的手段 [] 移植物抗白血病 (graft-versus-leukemia,gvl) 效应是 allo-hsct 清除白血病细胞和恶性肿瘤细胞的主要手段之一, 但是, 在发挥 GVL 效应同时也会导致移植物抗宿主病 (graft versus host disease,gvhd) 的发生 [-4],GVHD 是异基因造血干细胞移植后非复发恶性血液病死亡的重要原因 [5-6] 如何保留 GVL 效应而减轻 GVHD 是临床一大难题 本课题利用 P85 白血病细胞经尾静脉注射到 F 鼠体内 [5,7], 建立恶性血液病动物模型, 研究主要组织相容性抗原复合体 (major histocompatibility complex,mhc) 单倍体相合脾对 allo-hsct 抗白血病疗效的影响 材料与方法. 实验动物与细胞供鼠为雄性 C57/BL/6 小鼠 (B6 鼠 ); 受鼠为 DBA/ 与 C57/BL/6 杂交获得 F 代 B6DF 小鼠 (F 鼠 ), 雌雄各半 ; 体重 0~30g, 鼠龄 8~ 周, 均为 SPF 级, 免疫功能正常 [8-9], 来源于北京维通利华实验动物技术有限公司, 实验动物质量合格证明编号 : 所有实验动物在广东省动物实验中心 SPF 实验环境中饲养和管理 [ 实验动物使用许可证号 :SYXK( 粤 )03-000] P85 细胞来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞库. 主要试剂及仪器含抗生素饮用水 ( 红霉素 50 mg/l, 庆大霉素 U/L), 环磷酰胺 :Baxter Oncology GmbH 公司, 批号 6A093A, RPMI640 细胞培养基 : 上海立菲生物技术有限公司, 货号 C875500BT 胰酶 : Gen-View 公司, 货号 GP308 红细胞裂解液 :sigma-aldrich 公司, 货号 R7757MSDS 电子分析天平 : BS-3000A, 感量 :0. g, 上海友声衡器有限公司 ; 电子分析天平 :BS4S, 感量 :0. mg, 赛多利斯科学仪器 ( 北京 ) 科技有限公司 血细胞计数仪器 : 全自动血液细胞分析仪, 型号 BC-5000, 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司. 3 动物模型的建立及分组. 3. 受鼠移植前准备 F 鼠移植前 周, 延续至移植后 3 周, 给予含抗生素饮用水饲养, 进行肠道净 [0] 化. 3. 供者鼠骨髓和脾细胞的制取经颈椎脱臼法处死 C57/BL/6 供鼠,75% 乙醇浸泡 5 min, 在无菌条件下, 取供鼠双侧的股骨 胫骨, 剪开其干骺端, 用 RP- MI640 培养基冲出骨髓腔内的骨髓, 制成骨髓单个核细胞 (MNC) 悬液, 再调整密度为 /L 与此同时取其脾脏, 通过 00 目筛网研磨, 得到脾细胞悬液, 再经过淋巴细胞分离液分离得到 MNC, 再调整密度为 0 /L [] 受鼠移植前预处理受鼠移植前第 5 天 移植前第 4 天 移植前第 3 天 (d-5~d-3) 用环磷酰胺 300 mg/(m d) 腹腔注射 实验动物分组及移植移植当天 ( 第 0 天 ) 将 F 鼠随机分成 4 组, 每组 只, 其中 A 组经尾静脉注射 P85 细胞 ( 0 4 个 ) 骨髓细胞 (5 0 6 个 ) 和脾细胞 ( 0 7 个 ) 的混合细胞悬液 ;B 组经尾静脉注射 P85 细胞 ( 0 4 个 ) 和骨髓细胞 (5 0 6 个 ) 的混合细胞悬液 ;C 组经尾静脉注射 P85 细胞 ( 0 4 个 ) 的细胞悬液,D 组经尾静脉注射 RPMI640 细胞培养基 A B C D 组注射等体积液体. 4 主要观察指标移植前第 3 天及移植后第 7 第 4 第 第 8 天 F 鼠行外周血白细胞计数 ; 每天观察各组鼠临床表

3 Oct;34(0) 现 ( 如弓背 耸毛 腹泻等 ) 体重变化 姿势 活动度 皮毛改变 皮肤完整性和生存时间 ( 观察期 30 d) 并进行 GVHD 临床评分 按 GVHD 评分进行临床评估急性移植物抗宿主病 []. 5 移植物抗白血病病理实验 P85 细胞和 B6 鼠的脾细胞在第 0 天经尾静脉注射到 F 鼠, 观察小鼠的临床表现 P85 细胞诱导的白血病的死亡是指突发的肝脏及脾脏巨大白血病结节或后肢麻痹 移植物抗宿主病的死亡是指无白血病, 而有 GVHD 的临床症状及病理, 移植物抗白血病的小鼠肝脏 脾脏 皮肤无白血病细胞的浸润 A B C 组小鼠在濒死前 D 组小鼠在观察期 30 d 结束时取其病变肝脏 结肠 皮肤立即 4% 多聚甲醛固定, 苏木精 - 伊红 (HE) 染色, 观察各组织病理改变的情况. 6 统计学方法用 SAS 9. 统计软件对数据进行分析, 计量资料以均数 ± 标准差 (x ± s) 表示, 多组间均数比较采用方差分析, 两两比较采用 LSD-t 检验 ; 小鼠生存分析采用 Log-rank 检验, 以 P<0. 05 为差异具有统计学意义 结果. 动物的一般情况及 GVHD 观察移植后第 0 天 A 组 F 鼠开始出现精神欠佳 不愿活动 弓背 耸毛 皮肤不光泽 体重下降等情况, 但无逐渐加重趋势, 第 5 天开始出现死亡 3 只, 第 6 天 只 F 鼠出现脱毛 皮损, 第 8 天再次出现死亡 只, 剩余存活 8 只 B 组 F 鼠第 5 天开始出现精神萎靡 耸毛 弓背 不愿活动, 无皮肤结节 脱毛 皮肤溃疡, 呈逐渐加重趋势, 体重无明显下降, 第 6 天开始出现死亡, 至第 7 天死亡 只, 仅生存 只, 直至第 30 天一直存活 C 组 F 鼠开始时活泼好动, 取食正常, 毛发光泽, 无弓背 脱毛 皮肤溃疡 腹泻等表现, 移植后第 0 天出现后肢麻痹, 于第 8 天全部死亡 D 组小鼠直至第 30 天仍活泼好动, 取食正常, 毛发光泽, 无弓背 脱毛 皮肤溃疡 腹泻 各组小鼠的生存状况采用 Log-rank 检验进行生存分析, 生存曲线见图 A B 组 GVHD 临床评分, 见表, 移植后第 7 天及第 4 天, 两组比较差异均有统计学意义 (P<0. 05) 移植后第 天及第 8 天,B 组 F 鼠生存仅剩 只, 未进行统计学分析 因 C D 组未进行 allo-hsct, 不计 GVHD 评分 生存率 (%) A 组 B 组 C 组 D 组 移植后天数 /d 图 生存曲线分析 表 移植后不同时期 A B 组 GVHD 临床评分 ( 分,x ± s) 与 A 组比较, * P< 观察所有 F 鼠移植前 后外周血白细胞的变化情况 4 组 F 鼠在移植前第 3 天时白细胞数比较差异无统计学意义 (P>0. 05), 移植后第 7 天时,A B C 组小鼠白细胞数明显增高, 各组之间有明显差异 (P<0. 05), 与 D 组比较差异亦有统计学意义 (P<0. 05) 移植后第 4 天时, 各组 F 鼠白细胞均明显下降,A 组与 B C D 组比较差异有统计学意义 (P<0. 05),B C D 组白细胞数量比较差异无统计学意义 (P>0. 05) 移植后第 天,A D 组小鼠白细胞数量比较, 差异无统计学意义 (P>0. 05) 移植后第 8 天,A D 组白细胞数量均回升, 但 A D 组比较差异无统计学意义 (P>0. 05) 移植后第 天及第 8 天,B 组 F 鼠仅存活 只,C 组 F 鼠全部死亡, 未进行统计学分析, 见表

4 409 谢 媚 等. 异基因造血干细胞移植后 MHC 单倍体相合脾脏抗白血病疗效分析 表 移植后不同时间各组 F 鼠外周血白细胞数量的比较 09/L x ± s 与 A 组比较 ap 组织病理学观察 A 组 F 鼠的肝脏可见炎性细胞浸润 汇管区肝 细胞萎缩 坏死 肝脏汇管区 中央静脉区炎性细胞局 灶性浸润 中央静脉区少量白血病细胞浸润 B 组 F 鼠的肝脏可见肝细胞数量减少 肝窦内白血病细胞弥 散性浸润 C 组 F 鼠肝脏可见大量的白血病细胞浸 润 D 组小鼠未见明显异常 见图 4 组 F 鼠皮肤 及结肠活检均未见明显异常 a b c d a A 组肝脏病理组织 b B 组肝脏病理组织 c C 组肝脏病理组织 d D 组肝脏病理组织 图 3 讨 4 组小鼠肝脏病理组织 HE 00 论 allo-hsct 是治疗多种良性 恶性血液病的有效 手段 GVHD 是 allo-hsct 后特有的并发症 GVHD 是 allo-hsct 后发病率和死亡率最高的并发症 由供 体 T 细胞攻击受者同种异型抗原所致 移植物中抗原 特异性淋巴细胞识别宿主组织抗原所致的排斥反应 发生后一般均难以逆转 不仅导致移植失败 还可能 威胁受者生命 同时 供者骨髓移植物中成熟 T 细胞 被宿主不同的 MHC 激活 增殖分化为效应 T 细胞 并 随血液循环游走至受者全身 对宿主组织或器官发动 免疫攻击 通过分泌细胞因子的 瀑布效应 加重对受 者的损伤 这种损伤对象为白血病细胞时就表现为 GVL 作用 3-4 脾是成人最大的外周淋巴器官 它是 成熟淋巴细胞定居的场所 是血缘性抗原产生免疫应 答的主要场所 产生抗体的主要器官 在机体防御 免 疫应答中具有重要的地位 本研究结果显示 A 组小鼠临床表现为精神欠 佳 耸毛 皮肤光泽欠佳 白细胞计数 第 天时 白 细胞 09/L 考虑移植后造血得到重建 B 组生存 的 只小鼠也实现了造血重建,考虑移植成功 从生 存率来看 A B C 组相比较 A 组的存活率最高 且 B C 组死亡率高 从病理来看 A 组小鼠的肝脏可见 炎性细胞浸润 汇管区肝细胞萎缩 坏死 为 GVHD 的病理表现 B 组小鼠肝脏病理可见肝细胞数量减 少 肝窦内白血病细胞弥散性浸润 C 组小鼠肝脏病 理可见大量的白血病细胞浸润 A B C 组比较 白 血病细胞的浸润程度依次为 A 组 B 组 C 组 A 组 不仅提示着 MHC 单倍体相合脾脏具有 GVL 效应 同 时表现为 GVHD 效应 陈强等 5 研究发现 MHC 半

5 40 07 Oct;34(0) 相合脾加骨髓细胞移植能产生移植物抗肿瘤效应并降低 GVHD 反应 本实验中,B6 鼠的造血免疫细胞和 F 鼠的造血免疫细胞相互嵌合, 同时识别和监控 P85 细胞 ; 激活和增强 B6 鼠 F 鼠淋巴细胞对 P85 细胞的识别和监控, 使 P85 细胞无增殖, 控制白血病的复发 异基因造血干细胞移植后 MHC 单倍体相合脾脏抗白血病疗效的机制有待进一步的研究 综上所述,allo-HSCT 后 MHC 单倍体相合脾脏具有抗白血病效应 参考文献 : [] DALLE J H,LUCCHININ G,BALDUZZI A,et al. State-of-the-art fertility preservation in children and adolescents undergoing haematopoietic stem cell transplantation:a report on the expert meeting of the Paediatric Diseases Working Party(PDWP)of the European Society for Blood and Marrow Transplantation(EBMT)in Baden,Austria,9-30 September 05[J]. Bone Marrow Transplant,07,5: [] MICHONNEAU D,SAGOO P,BREART B,et al. The PD- axis enforces an anatomical segregation of CTL activity that creates tumor niches after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[j]. Immunity,06, 44(): [3] RINGDEN O,LABOPIN M,CICERI F,et al. Is there a stronger graft-versus-leukemia effect using HLA-haploidentical donors compared with HLA-identical siblings? [J]. Leukemia,06,30(): [4] MINEISHI S. Update on stem cell transplantation for acute leukemias[j]. Rinsho Ketsueki,06,57(0): 8-3. [5] KOESTNER W,HAPKE M,HERBST J,et al. PD-L blokade effectively restores strong graft-versus-leukemia effects without graft-versus-host disease after delayed adoptive trafer of T-cell receptor gene-engineered allogeneinc CD8 + T cells[j]. Blood,0,7(3): [6] HUANG W,CHAO N J. Memory T cells:a helpful guard for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation without causing graft-versus-host disease[j]. Hematology Oncology & Stem Cell Therapy,07. [7] ASAKURA S,HASHIMOTO D,TAKASHIMA S,et al. Alloantigen expression on non - hematopoietic cells reduces graft-versus-leukemia effects in mice[j]. J Clin Invest,00,0(7): [8] XU L H,FANG J P,XU H G,et al. Homing and engraftment of bone marrow ceils derived from difierent donors in a murine model of sensitization[j]. Hematology,0,7:5-9. [9] 张翠平, 曾令宇, 潘彬等. 受鼠年龄对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病发生的影响 [J]. 中国实验血液学杂志,0,0:405-4 [0] 曹江, 李莉, 徐开林等. 基因工程化 Treg 细胞对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病的作用 [J]. 中华血液学杂志,0(): [] CAO J,CHEN C,ZENG L,et al. Engineered regulatory T cells prevent graft-versus-host disease while sparing thegraft-versus-leukemia effect after bone marrow transplantation[j]. Leuk Res. 00;34(0): [] COOKE K R,KOBZIK L,MARTIN T R,et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation:i. The roles of minor H antigens and endotoxin[j]. Blood,996,88: [3] TOUBAI T,GUOQING H,ROSSI C,et al. Ikaros deficiency in host hematopoietic cells separates GVL from GVHD after experimental allogeneic hematopoietic cell transplantation[j]. Oncoimmunology,05,4(7): e [4] LI J M,PETERSEN C T,LI J X,et al. Modulation of immune checkpoints and graft-versus- leukemia in allogeneic transplants by antagonizing vasoactive intestinal peptide signaling[j]. Cancer Res,06,76(3): [5] 陈强, 李晓峰, 叶韵斌, 等. MHC 半相合脾加骨髓细胞诱发 H 荷瘤鼠的抗肿瘤效应 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志,006,3():07-. ( 本文编辑 : 冯雁 )

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