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1 420 中华骨科杂志 2015 年 4 月第 5 卷第 4 期 Chin J Orthop, April 2015, Vol. 5, No. 4 基础与骨病 坐骨神经预损伤后 mir 124 p 调节 GAP 4 表达并促进轴突生长的实验研究 王天仪原文琦刘勇张衍军王志杰陈学明张亚奎 冯世庆赵向阳修玉才杨明星李晓华 摘要 目的 索损伤修复机制 方法 通过研究坐骨神经预损伤后背根神经节中 microrna 表达谱变化, 探讨坐骨神经预损伤促进脊髓后 利用微阵列芯片技术和生物信息学方法, 研究与坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复有关的 microrna, 并用 RT qpcr 技术 Western blot 技术 免疫荧光染色 反义 mirna 寡核苷酸抑制剂等技术验证 结果 脊髓后索损伤组 mir 124 p 在大鼠脊髓后索损伤后 7 d 14 d 明显上调 ; 坐骨神经预损伤组, 脊髓后索损伤后 7 d 14 d 背根 神经节中 mir 124 p 明显下调 与正常背根神经节神经元相比, 抑制 mir 124 p 后 GAP 4 表达增加, 神经元轴突延长 与相比, 各组各时间窗 STAT mrna 表达差异无统计学意义, 坐骨神经预损伤组 STAT 蛋白在脊髓后索损伤后 7 d 和 14 d 表达上调而单纯脊髓后索损伤组脊髓后索损伤后 7 d 和 14 d STAT 蛋白表达下调 与正常背根神经节神经元相比 抑制 mir 124 p 的神经元 STAT 免疫荧光增强 轴突延长,p STAT GAP 4 蛋白表达明显上调 与正常背根神经节神经 元相比 AG490+AMO 124 共同处理的神经元轴突长度无明显差异,STAT 表达明显上调, 而 p STAT 和 GAP 4 表达无明 显差异 结论 背根神经节神经元中 mir 124 p 下调通过 STAT 蛋白的上调促使 GAP 4 蛋白表达增加是坐骨神经预损 伤促进脊髓后索损伤修复的机制之一 关键词 坐骨神经 ; 创伤和损伤 ; 微 RNAs; 轴突 单纯 After sciatic nerve conditioning injury mir 124 p regulates GAP 4 expression in dorsal root ganglion neurons and fur ther promoting neurite growth via STAT Wang Tianyi, Yuan Wenqi, Liu Yong, Zhang Yanjun, Wang Zhijie, Chen Xuem ing, Zhang Yakui, Feng Shiqing, Zhao Xiangyang, Xiu Yucai, Yang Mingxing, Li Xiaohua. Department of Orthopaedics, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 00052, China Abstract Objective To study the effect of sciatic nerve conditioning injury on repairment of dorsal column lesion via investigating the alteration of mirnomes. Methods To study the micrornas which are associated with dorsal column lesion whose repairment is promoted by sciatic nerve conditioning injury, the microrna profiles of dorsal root ganglion in sciatic nerve conditioning injury group and simple dorsal column lesion group were investigated by Microarray and bioinformatics. And then RT qpcr, western blot, immunofluorescence staining and antisense oligonucleotide (AMO 124) were applied to validate the result of microarray. Results mir 124 p was significantly upregulated on 7 d and 14 d post dorsal column lesion in simple dorsal col umn lesion group, whereas it was downregulated on 7 d and 14 d post dorsal column lesion in sciatic nerve conditioning injury. Compared with normal dorsal root ganglion (DRG) neurons, expression was increased and neurite was prolonged in mir 124 p in hibited neurons. Compared with control group, there was no statistical difference about the expression of signal transducer and acti vator of transcription (STAT) mrna among each check point of every group. On 7 d and 14 d post dorsal column lesion, STAT protein expression was significantly upregulated in sciatic nerve conditioning injury group, whereas it was significantly downregu lated in simple dorsal column lesion group. Compared with normal DRG neurons, immunofluorescence of STAT was enhanced, neurite was prolonged and the expression of p STAT protein and protein was upregulated in mir 124 p inhibited neurons. Com pared with normal DRG neurons, in AG490+AMO 124 co inhibited neurons, the length of neurite and the expression of p STAT protein and protein have no statistical difference whereas the expression of STAT was significantly upregulated. Conclusion It is one of the mechanisms of sciatic nerve conditioning injury promoting dorsal column lesion that the downregulation of mir 124 p in DRG neurons increases the expression of GAP 4 protein via upregulating STAT protein. Key words Sciatic nerve; Wounds and injuries; MicroRNAs; Axons 脊髓损伤 (spinal cord injury,sci) 致残率高, 给 患者 家庭乃至社会带来严重的负担 脊髓损伤后 DOI:10.760/cma.j.issn 基金项目 : 全军医学科技青年培育项目 (1QNP017); 国家自然科学基金重点项目 (810042); 国家自然科学基金面上项目 ( , ) 作者单位 :00052 天津医科大学总医院骨科 ( 王天仪 原文琦 刘勇 张衍军 陈学明 冯世庆 ); 解放军 266 医院骨一科 ( 王天仪 修玉才 ); 首都医科大学附属潞河医院骨科 ( 张衍军 陈学明 张亚奎 ); 承德医学院附属医院儿内科 ( 王志杰 ); 解放军 266 医院普外科 ( 赵向阳 ); 解放军 266 医院急诊科 ( 杨明星 ); 解放军 266 医院医务处 ( 李晓华 ) 通信作者 : 冯世庆,E mail:professorfengsq@16.com

2 中华骨科杂志 2015 年 4 月第 5 卷第 4 期 Chin J Orthop, April 2015, Vol. 5, No 患者出现的感觉错乱 迟钝和慢性神经痛等上行感 [1] [2] 觉传导束损伤症状, 持续困扰其生理 心理 已有研究表明脊髓损伤后感觉异常会影响唤醒大脑 [] 皮质, 进而导致认知和心理障碍 1984 年,Richardson 和 Issa [4] 提出在脊髓后索损伤前 7 d 切断坐骨神经能促进脊髓后索损伤的修复 此后, 也有研究表明单独或联合应用前置性坐骨神经切断对于脊髓上行感觉传导通路损伤的修 [5] 复有积极作用 然而, 由于脊髓损伤后果的不可预测性以及坐骨神经预损伤违背临床医学的伦理要求, 这一措施无法应用于临床治疗 microrna 是一类内源性长约 22 nt 的非编码 RNA, 能够绑定靶基因 mrna 的 端非翻译区, 通 [6-8] 过降解或转录后抑制调节靶基因表达 mirna 通过翻译抑制调控细胞功能和状态, 在 SCI 的病理 [9] 生理过程中发挥着重要作用 基于微阵列技术的 microrna 组学研究能够在基因组调控水平上全面分析疾病的发生发展, 使从基因组的角度分析坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的机理以及寻找替代坐骨神经预损伤的治疗靶点成为可能 信号转导和转录活化蛋白 (signal transducer and acti vator of transcription, STAT) 是 STAT 家族中的一 [10-11] 员, 在调控基因表达上发挥着重要作用 有研究证明磷酸化的 STAT 能够促进 GAP 4 基因的表 [12] 达进而促进轴突的再生 本研究采取分组对照的方法, 通过微阵列技术和生物信息学的方法分析坐骨神经预损伤后脊髓后索损伤大鼠 单纯脊髓后索损伤大鼠与大鼠的背根神经节组织的 mirna 表达谱改变, 并应用 RT qpcr 技术 Western blot 技术 免疫荧光染色和反义 mirna 寡核苷酸抑制剂等技术进行验证 目的在于 :(1) 探讨坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的分子生物学机制 ;(2) 寻找替代这一方法的治疗靶点, 以期为临床应用提供理论基础 材料与方法一 动物实验分组健康雌性 Wistar 大鼠 9 只, 体重 (250±10)g( 天津市放射研究所动物中心提供 ), 随机分组 坐骨神经预损伤组 :12 只, 大鼠在脊髓后索损伤前 7 d, 切断大鼠双侧坐骨神经, 然后在脊髓后索损伤后 4 h, d,7 d,14 d 共 4 个时间窗取材并记录, 每个时间点 只大鼠 单纯坐骨神经损伤组 :12 只, 与坐骨神经预损 伤组同时切断双侧坐骨神经, 并按该组取材时间窗, 在同一时间取材并记录, 每个时间点 只大鼠 单纯脊髓后索损伤组 :12 只, 不进行坐骨神经预损伤造模, 在脊髓后索损伤后 4 h, d,7 d,14 d 取材, 每个时间点 只大鼠 : 只, 健康大鼠未行脊髓损伤及坐骨神经预损伤造模 二 动物模型制作 ( 一 ) 坐骨神经预损伤造模质量浓度 10% 水合氯醛腹腔麻醉大鼠, 备皮 消毒 ; 确定股骨位置后于股骨后方约 0.5 cm 处作与股骨长轴平行的长约 2 cm 皮肤切口, 钝性分离皮下筋膜后可见一较明显的白线, 为肌肉间隙, 沿此白线钝性分离肌肉 ; 分离满意可见附着于深层肌肉表面的坐骨神经干, 小心分离后离断坐骨神经 ; 逐层缝合伤口, 头孢哌酮 0. ml 腹腔注射预防伤口感染 ( 二 ) 脊髓后索损伤造模质量浓度 10% 水合氯醛腹腔麻醉后常规备皮 消毒 ; 以 T 10 棘突为中心作长约 2 cm 的切口, 钝性分离皮下筋膜 椎旁肌, 暴露椎板, 以微型咬骨钳咬除 T 10 椎板, 暴露脊髓背侧, 剪开脊髓硬膜, 找到脊神经后根 ; 确定同一节段两侧后根, 以剪切两脊神经根之间的后索纤维束, 明胶海绵压迫止血, 逐层关闭伤口, 头孢哌酮 0. ml 腹腔注射预防伤口感染 ( 三 ) 取材质量浓度 10% 水合氯醛腹腔麻醉大鼠后, 用磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline,pbs) 灌注 取与双侧坐骨神经对应的背根神经节, 用液氮冻存 坐骨神经预损伤组和单纯脊髓后索损伤组取以 T 10 为中心的 2 cm 脊髓组织, 置于 4% 多聚甲醛溶液中固定 三 总 RNA 抽提使用 mirvana TM RNA 提取工具盒提取总 RNA 在试管中放入相当于背根神经节组织块 10 倍体积的 Lysis/Binding Buffer, 利用预冷的金属铲将碎组织放入 Lysis/Binding Buffer, 迅速混匀并转移到另一个容器, 操作均在冰上进行 加入 1/10 体积的 mirna 匀浆添加剂, 涡旋匀浆后在冰上孵育 10 min 加入与 Lysis/Binding Buffer 等体积氯仿后涡旋 0~60 s, r/min 离心 5 min 后取上清液转移至另一管中, 记录体积 加入 1.25 倍体积质量浓度 100% 乙醇后涡旋混匀, 反复过纯化柱后 r/min 离心 15 s 然后用 700 μl wash 1 清洗纯化柱, 以 500 μl wash 2/ 清洗纯化柱 2 次 后将离心柱置于新收集

3 422 中华骨科杂志 2015 年 4 月第 5 卷第 4 期 Chin J Orthop, April 2015, Vol. 5, No. 4 管中, 加入 100 μl 95 预热的 Elution Solution, 室温下以最高转速离心 20~0 s, 收集管中液体即总 RNA,-70 保存 四 Affymetrix mirna.0 芯片操作本实验应用 Affymetrix mirna.0 芯片 利用 NanoDrop ND 2100(Thermo Scientific) 定量总 RNA 并用 Agilent 2100(Agilent Technologies) 检测 RNA 完整性 确保质检合格, 参照芯片标准流程进行样本标记 芯片杂交以及洗脱 利用 Affymetrix Scanner 000(Affymetrix, 美国 ) 扫描得到原始图像 应用 Expression Console(version1..1, Affymetrix) 数据分析软件分析图像, 将所得原始数据转化为 RMA 标准化算法信号值, 并应用分层聚类分析的方法对样本间 mirna 表达模式进行分析 五 细胞培养及转染新生 Wistar 大鼠无菌条件下取出背根神经节, 放入 D/F12+10% 胎牛血清培养基中, 加入 24 孔板, 待其贴壁后, 换为 Neurobasal+B27 培养基, 培养 d 用于实验 将 mir 124 p 反义 mirna 寡核苷酸抑制剂 (AMO 124)(Invitrogen, 加拿大 ) 进行转染 这样, 我们得到,rno mir 124(5 UAAGGCACGCG GUGAAUGCC ),AMO 124(5 GCATTCACCGC GUGCCUUAUU ),scrambled RNA(5 UUCUCC GAACGUGUCACGUTT )(YIJUN, 中国 ) 而在使用 AG490 抑制 STAT 的磷酸化时发现 50 μmol/l 的 AG490 明显抑制 AMO 124 六 免疫荧光室温下用 4% 多聚甲醛固定背根神经节神经元, 然后用 PBS 冲洗 次, 每次 5 min 应用 0.1% Triton X 100(Sigma, 美国 ) 使细胞透化,PBS 冲洗 2 次, 每次 5 min 用含 5% 牛血清白蛋白的 PBS 封闭 1 h, 一抗 [ 包括抗 STAT 抗体 (1 400,Abcam, 英国 ), 抗 NF 200 抗体 (1 200,Sigma, 美国 ), 抗 GAP 4 抗体 (1 500,Abcam, 英国 )]4 过夜 后二抗孵育 1 h,dapi(beyotime, 中国 ) 染色 5 min 用 Image pro plus 6.0 软件处理所得图像, 测量轴突长度 七 RT qpcr 用 miscript II Reverse Transcription Kit(Qiagen, 德国 ) 和 PrimerScript RT reagent Kit(TaKaRa, 日本 ) 分别进行 mirna 和 mrna 的检测 分别用 U6 和 GADPH 对所得的 mirna 和 mrna 表达量标准化 八 Western blot 样本被分别放入 RIPA 裂解液中, 加入蛋白酶抑制剂并离心以分离蛋白 蛋白样品通过 SDS 聚 丙烯酰胺凝胶电泳分离, 并被转膜到硝酸纤维素膜上 封膜以降低非特异性抗体的结合, 随后加入一抗 二抗,ECL 化学发光试剂检测 九 统计学处理应用 SPSS 18.0(SPSS 公司, 美国 ) 软件包对实验数据进行分析 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 坐骨神经预损伤组 单纯坐骨神经损伤组 单纯脊髓后索损伤组及组间比较采用方差分析 (ANOVA) 和 SNK 检验, 两样本间比较采用 t 检验 检验水准 α 值取双侧 0.05 结果一 坐骨神经预损伤后脊髓后索损伤大鼠的 MicroRNA 表达谱分析 Affymetrix mirna.0 芯片结果显示, 与相比坐骨神经预损伤组及单纯脊髓后索损伤组在脊髓后索损伤后各时间点的大鼠背根神经节中, 共 681 个 mirna 表达发生变化 ( 图 1A) mir 124 p 在单纯脊髓后索损伤组损伤后 7 d 14 d 明显上调, 与相比分别上调 5.12 倍和 4.17 倍, 这两个倍数在其各所属时间点所有 mirna 上调倍数排序中均位于第 5 位 坐骨神经预损伤组, 损伤后 7 d 14 d 背根神经节中 mir 124 p 明显下调, 下调倍数分别为.55 倍和 6.18 倍 ( 表 1) 对 mir 124 p 在各样本中的表达量聚类分析, 发现坐骨神经预损伤组表达量在 7 d 14 d 被聚为一类, 而单纯脊髓后索损伤组表达量在 7 d 14 d 被聚为一类, 其余样本聚为一类 ( 图 1B) 用 RT qpcr 验证芯片 mir 124 p 相关数据, 结果具有良好的一致性 ( 图 1C) 进而 RT qpcr 检测单纯坐骨神经损伤组 mir 124 p 表达与相比无明显变化 ( 图 1C) 二 抑制 mir 124 p 增强背根神经节 GAP 4 基因表达并促进轴突生长因脊髓后索损伤前 ( ) 后及坐骨神经预损伤干预前 后均有明显的表达量变化,miR 124 p 可能在脊髓后索损伤及坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复过程中具有重要的生物学意义 故本实验尝试用 mir 124 p 的反义 mirna 寡核苷酸抑制剂 (AMO 124) 抑制 mir 124 p 在背根神经节神经元的表达, 观察其生物学效用, 与正常背根神经节神经元相比 GAP 4 表达增加, 神经元轴突延长 ( 图 2)[ 正常背根神经节神经元最长轴突长度为 ( ± 17.26)μm, 而在抑制 mir 124 p 后为 (27.6±1.87)μm], 差异有统计学意义 (P<0.05)

4 中华骨科杂志 2015 年 4 月第 5 卷第 4 期 Chin J Orthop, April 2015, Vol. 5, No 单纯脊髓后索损伤组坐骨神经预损伤组 h d 7 d 14 d 4 h d 7 d 14 d 单纯脊髓后索损伤组 坐骨神经预损伤组 d 7 d 4 h d 4 h d 7 d 14 d rno-mir-124-p B A mir124-p 相对表达量 坐骨神经预损伤组单纯脊髓损伤组单纯坐骨神经损伤组 4 h d 7 d 14 d C 图 1 坐骨神经预损伤组及单纯脊髓后索损伤组背根神经节的 microrna 表达谱 A 横列表示差异表达的 microrna, 纵列表示不同 组别及时间点 绿色表示表达下调, 红色表示表达上调, 其余颜色所代表的表达变化如上方颜色标尺所示 B 对 mir 124 p 在各个 样本中的表达量进行聚类分析黑色表示表达下调, 红色表示表达上调, 其余颜色所代表的表达变化如上方颜色标尺所示 C 用 RT qpcr 检测坐骨神经预损伤组 单纯脊髓后索损伤组和单纯坐骨神经损伤组 mir 124 p 的相对表达量 分组 表 1 坐骨神经预损伤组 4 h d 7 d 14 d 微阵列芯片技术检测 2 组大鼠脊髓后索损伤后不同时间背根神经节 mir 124 p 的表达 单纯脊髓后索损伤组 4 h d 7 d 14 d 例数 12 三 mir 124 p 靶基因预测及背根神经节组织 中 STAT 蛋白变化趋势验证 12 变化倍数 标准化信号值 为进一步研究抑制 mir 124 p 后 GAP 4 表达 增加 神经元轴突延长的机制, 我们应用 TargetScan 数据库预测 mir 124 p 的靶基因 运用 RT qpcr 检测坐骨神经预损伤组背根神经节组织 STAT mrna 的表达水平, 发现各组各时间窗间表达无统计学差异 (P >0.05, 图 A) 用 Western blot 检测背根神经节组织 STAT 及 p STAT 蛋白的表达变化, 发现其在坐骨神经预损伤组脊髓后索损伤后 7 d 和 14 d 与相比表达上调 ( 图 B), 而单纯脊髓后索损伤组下调 ( 图 C), 这与 mir 124 p 的表达趋势相反 ( 图 D) 四 mir 124 p 与 STAT 蛋白 GAP 4 蛋白及轴突生长的关系我们为了在细胞及功能层次上验证 STAT 是 mir 124 p 的靶基因, 运用 AMO 124 抑制背根神经节神经元 mir 124 p 后, 与正常背根神经节神经元相比,miR 124 p 抑制组轴突延长 ( 图 4A): 正常背根神经节神经元最长轴突长度 (18.86±15.5)μm; 抑制 mir 124 p 后 (244.5±12.56)μm, 两者比较差异有统计学意义 Western blot 结果示与正常背根神经节神经元相比 mir 124 p 抑制组 p STAT STAT GAP 4 表达明显上调 ( 图 4B) 有研究证明磷酸化的 STAT [12] 能促进 GAP 4 基因表达进而促进轴突再生

5 424 中华骨科杂志 2015 年 4 月第 5 卷第 4 期 Chin J Orthop, April 2015, Vol. 5, No. 4 DAPI Merge Scrambled组 AMO-124组 GAP-4 图 2 倒置相差显微镜观察与正常背根神经节神经元相比抑制 MiR 124 p 增强背根神经节中 GAP 4 表达并促进轴突生长 Scramble 组 背根神经节神经元中 GAP 4 表达及神经元轴突长度与正常背根神经节神经元相比无差异 GAP 4 及 DAPI 免疫荧光染色 200 五 STAT 是 mir 124 p--gap 4 通路的关键 组成部分 由于一个 mirna 可能具有多个靶基因 为验证 mir 124 p 只能够通过 STAT 蛋白来调节 GAP 4 蛋白的表达量 进而促进轴突生长 本研究在用 AMO 124 抑 制 mir 124 p 的 同 时 用 AG490 抑 制 STAT 的磷酸化 正常背根神经节神经元最长轴突 长度 ±12.52 μm 相比 AG490+AMO 124 处理 后 19.72±14.82 μm 两者比较差异无统计学意义 P 0.05 图 5 Western blot 结 果 显 示 AG490 + AMO 124 共同处理的神经元 STAT 表达与 相比明显上调 而 p STAT 和 GAP 4 表达量与对照 组相比无明显差异 图 4B 讨 论 在脊髓后索损伤前 7 d 切断坐骨神经能促进脊 髓后索损伤的修复这一观点最早见于 Richardson 和 Issa 的报告 4 然而 由于脊髓损伤后果的不可预测 性以及坐骨神经预损伤本身违背临床医学的伦理 要求的原因 这一措施无法应用于临床治疗 此 后 许多学者致力于研究其作用机制和替代疗法 有学者从 A 型酪氨酸激酶受体 TrkA 和脑源性神 经营养因子 BDNF 等角度寻求其替代疗法 但对 于机制的探讨并不深入 且存在分歧 5, 1 近年来 一些学者开始关注 mirna 作为诊断和治疗靶点在 临床医学中的应用 年 Janssen 等 14 报告 Miravirsen 靶定 mir 122 的锁链核苷酸修饰的 DNA 磷硫酰化反义寡核苷酸序列 治疗丙型病毒性肝 炎 已经进入了二期临床试验 这为深入研究坐骨 神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的机制和寻找 替代疗法带来了新的希望 一 mir 124 p 在坐骨神经预损伤修复脊髓后 索损伤过程中具有重要生物学意义 本实验应用 microarray.0 芯片检测脊髓后索

6 中华骨科杂志 2015 年 4 月第 5 卷第 4 期 Chin J Orthop, April 2015, Vol. 5, No p-stat STATmRNA 相对表达量 h d 7 d 14 d A 蛋白相对表达量 STAT β- actin p-stat 蛋白 STAT 蛋白 4 h d 7 d 14 d B p-stat 蛋白相对表达量 STAT β-actin p-stat 蛋白 STAT 蛋白 4 h d 7 d 14 d C 蛋白相对表达量 h d p-stat 蛋白 STAT 蛋白 mir-124-p 7 d 14 d mir-124-p 相对表达量 D 图 mir 124 p 靶基因预测及背根神经节组织中 STAT 蛋白变化趋势验证 A 运用 RT qpcr 检测坐骨神经预损伤组背根神经节组 织 STAT mrna 的表达水平, 发现各组各时间窗间表达无统计学差异 B Western blot 检测背根神经节组织 STAT 及 p STAT 蛋白的 表达变化, 发现坐骨神经预损伤组 STAT 及 p STAT 蛋白在脊髓后索损伤后 7 d 和 14 d 与相比表达上调 C 单纯脊髓后索损 伤组脊髓后索损伤后 7 d 和 14 d STAT 及 p STAT 蛋白表达与相比下调 D 坐骨神经预损伤后 mir 124 p 与 STAT 及 p STAT 蛋白的表达趋势相反 损伤及用坐骨神经预损伤干预后索损伤过程中关键调控 microrna, 发现 mir 124 p 在脊髓后索损伤后 7d 和 14 d 明显上调, 其上调倍数在各自时间点改变的 microrna 中分别排名于第 5 位, 说明其在脊髓后索损伤过程中有重要的意义 而坐骨神经预损伤组 mir 124 p 表现出了明显相反的表达趋势, 下调倍数分别为.55 倍和 6.18 倍, 这说明其下调在坐骨神经预损伤修复脊髓后索损伤过程中可能具有重要意义, 于是我们进一步研究验证 mir 124 p 的靶基因, 以探索它在坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复过程中所起的作用 二 mir 124 p 可能与轴突生长及 GAP 4 的表达有关本实验抑制了 mir 124 p 的表达, 试图观察这一改变对背根神经节神经元所带来的影响 首先抑制 mir 124 p 后神经元轴突延长 ; 其次, 原本用 来标志神经元的 GAP 4 蛋白在抑制 mir 124 p 后表达量增加 我们推测,miR 124 p 可能和轴突生长以及 GAP 4 的表达有关 三 坐骨神经预损伤导致 STAT 蛋白表达改变为了验证上述假设, 应用 Targetscan 数据库查询了 mir 124 p 的靶基因, 发现 STAT 与其有良好的互补性, 且 STAT 能够导致 GAP 4 表达上调 为进一步验证上述观点, 我们检测坐骨神经预损伤组在各个时间点中 STAT mrna 的表达, 发现与相比均无统计学差异 我们猜测 mir 124 p 可能是通过翻译抑制而不是降解来调控 STAT 表达的 检测坐骨神经预损伤组及单纯脊髓后索损伤组 STAT 及 p STAT 蛋白的表达量, 发现坐骨神经预损伤组表达趋势与 mir 124 p 相反 这一现象在一定程度上说明了坐骨神经预损伤可以通过 mir 124 p 造成 STAT 蛋白表达的改变, 但仍然缺

7 426 中华骨科杂志 2015 年 4 月第 5 卷第 4 期 Chin J Orthop, April 2015, Vol. 5, No. 4 STAT DAPI Merge AMO-124组 NF-200 A 2.50 GAP-4 蛋白相对表达量 2.00 p-stat STAT β-actin AMO-124 AG490+ AMO-124 GAP-4蛋白 p-stat蛋白 STAT蛋白 AMO-124 组别 AG490+AMO-124 B 图 4 背根神经节神经元中 mir 124 p 与 STAT 蛋白 GAP 4 蛋白及轴突生长的关系 A 倒置相差显微镜观察 mir 124 p 抑制组 比正常背根神经节神经元轴突延长 NF-200 STAT 及 DAPI 免疫荧光染色 200 B Western blot 结果示与相比 mir 124 p 抑制组 p STAT STAT GAP 4 表达明显上调 AG490+AMO 124 组 STAT 表达与相比明显上调 而 p STAT 和 GAP 4 表达量 与相比无明显差异 DAPI Merge AG490+AMO-124组 NF-200 图 5 倒置相差显微镜观察与正常背根神经节神经元相比 AG490+AMO 124 共同处理的神经元轴突长度无差异 STAT 是 mir 124 p GAP 4 通路的关键组成部分 NF 200 及 DAPI 免疫荧光染色 200

8 中华骨科杂志 2015 年 4 月第 5 卷第 4 期 Chin J Orthop, April 2015, Vol. 5, No 乏细胞层次的靶基因验证 本实验在背根神经节神经元中抑制 mir 124 p 的表达发现与正常背根神经节神经元相比 STAT 表达上调, 这在细胞水平进一步验证了 mir 124 p 的靶基因是 STAT 同时 western blot 检测磷酸化的 STAT 以及 GAP 4 的变化, 发现其变化趋势与 STAT 相符 四 mir 124 p 通过调控 STAT 蛋白表达影响 p STAT 和 GAP 4 蛋白表达进而促进轴突生长由于一个 mirna 可以调控多个基因的表达, 看到抑制 mir 124 p 后 STAT 表达上升且轴突延长, 只能说明其靶基因是 STAT, 轴突延长是否是由 mir 124 p 的其他靶基因改变造成仍有待证明, 因此我们在抑制 mir 124 p 表达的同时用 AG490 抑制了 STAT 的活化, 用于判断是否存在 mir 124 p 的其他靶基因能促进轴突生长, 但实验结果显示与正常背根神经节神经元相比轴突长度无明显差异 上述结果证明,miR 124 p 的靶基因是 STAT, 能通过调控 STAT 蛋白的表达来影响 p STAT 蛋白和 GAP 4 蛋白进而促进轴突生长 五 本研究的局限性本研究在前人基础上, 从 microrna 角度探讨和分析坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的机制 脊髓后索损伤后至少在任一时间窗改变的 mirna 有 681 个, 我们关注的 mir 124 p--gap 4 通路可能只是其发挥作用的重要通路之一, 期待后续的体内实验能够通过调节 mir 124 p 的表达来模仿坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的机制, 进而克服其伦理限制以及作用时间短而致效果有限的弊端 综上所述, 坐骨神经预损伤后,miR 124 p 下调能通过调控 STAT 蛋白表达来影响 p STAT 蛋白和 GAP 4 蛋白表达进而促进脊髓后索损伤的修复 在今后的研究中, 我们将继续研究其他发生改变的 mirna 以期更全面的了解坐骨神经预损伤促进脊髓后索损伤修复的机制, 为临床治疗找到更多更有效的治疗靶点 参考文献 [1]Lu P, Yang H, Jones LL, et al. Combinatorial therapy with neuro trophins and camp promotes axonal regeneration beyond sites of spinal cord injury[j]. J Neurosci, 2004, 24(28): [2]Hoschouer EL, Finseth T, Flinn S, et al. Sensory stimulation prior to spinal cord injury induces post injury dysesthesia in mice[j]. J Neurotrauma, 2010, 27(5): []Chen ZL, Yu WM, Strickland S. Peripheral regeneration[j]. An nual Rev Neurosci, 2007, 0: [4]Richardson PM, Issa VM. Peripheral injury enhances central re generation of primary sensory neurones[j]. Nature, 1984, 09 (5971): [5]Neumann S, Woolf CJ. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury[j]. Neuron, 1999, 2(1): [6]Bhalala OG, Pan L, Sahni V, et al. microrna 21 regulates astro cytic response following spinal cord injury[j]. J Neurosci, 2012, 2(50): [7]Liu NK, Xu XM. MicroRNA in central nervous system trauma and degenerative disorders. Physiol Genomics, 2011, 4(10): [8]Williams AE. Functional aspects of animal micrornas[j]. Cell Mol Life Sci, 2008, 65(4): [9]Nieto Diaz M, Esteban FJ, Reigada D, et al. MicroRNA dysregula tion in spinal cord injury: causes, consequences and therapeutics [J]. Front Cell Neurosci, 2014, 8: 5. [10]Aittomäki S, Pesu M. Therapeutic targeting of the Jak/STAT path way[j]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2014, 114(1): [11]Nicolas CS, Amici M, Bortolotto ZA, et al. The role of JAK STAT signaling within the CNS[J]. JAKSTAT, 201, 2(1): e [12]Cafferty WB, Gardiner NJ, Das P, et al. Conditioning injury in duced spinal axon regeneration fails in interleukin 6 knock out mice[j]. J Neurosci, 2004, 24(18): [1]Qiu J, Cafferty WB, McMahon SB, et al. Conditioning injury in duced spinal axon regeneration requires signal transducer and ac tivator of transcription activation[j]. J Neurosci, 2005, 25(7): [14]Janssen HL, Reesink HW, Lawitz EJ, et al. Treatment of HCV in fection by targeting microrna[j]. N Engl J Med, 201, 68(18): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 马宝意 )

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