上海农业学报 99 黄曲霉毒素主要是由产毒的黄曲霉菌与寄生曲霉菌产生的一组自然发生的真菌代谢产物 [], 是被公认的环境污染物, 普遍存在于玉米 花生 棉籽及其饼粕等饲料原料中 在各种黄曲霉毒素中, 以黄曲霉毒素 b (AFB ) 的量最大 毒性最强, 具有致癌性 致畸性和致突变性 AFB 进入机体

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1 上海农业学报 A A S DOI j 文章编号 黄曲霉毒素 B 对雄性肉仔鸡的毒害作用 及对其肝脏谷胱甘肽硫转移酶活性的影响 熊慧慧 薛惠琴 肖长峰 杭怡琼 蔡 旋 卢永红 上海市农业科学院畜牧兽医研究所 上海 上海海洋大学水产与生命学院 上海 摘 和 饲 要以 日龄雄性鹿苑鸡为材料 分别在基础日粮中添加黄曲霉毒素 B AFB 日龄 每隔 观察肉仔鸡生长情况 并测定肝脏谷胱甘肽硫转移酶 S T 催化底物 CDNB 养到 二硝基 NBC T活性的影 氯苯 DCNB 二氯 硝基苯 硝基氯化苄 的活性 研究 AFB 对雄性肉仔鸡肝脏 S 日龄肉仔鸡体重及平均日增重 AD 显著降低 日龄肉仔鸡平均日采食 响 结果表明两个处理组的 日龄肉仔鸡料重比显著升高 AFB 组的 日龄肉仔鸡肝脏中 S T催化 DCNB活 量显著降低 AFB 组的 日龄肉仔鸡肝脏中 S T催化 CDNB及 DCNB活力显著降低 两个处理组的 力显著降低 日龄肉仔鸡肝脏中 S T催化 CDNB DCNB及 NBC活力极显著降低 本试验表明饲喂含 AFB 或 AFB的日粮 肉仔鸡的生长会受到抑制 肉仔鸡肝脏谷胱甘肽硫转移酶的活性会降低 且饲喂含 AFB 的日粮时间越长 肉仔鸡肝脏谷胱甘肽硫转移酶活性受到的抑制越明显 关键词黄曲霉毒素 B 雄性肉仔鸡 谷胱甘肽硫转移酶 中图分类号S 文献标识码A Tx x B S XI ONH XUEH q XI AOC HANY q CAIX LUY I A H V S S A A S S C C F L S S O U S C A T w w AFB L w w T AFB ST w STw CDNB D DCNB NBC T w w w AD T ST DCNB T ST CDNB DCNB AFB T ST CDNB AFB DCNB NBC w S w w w ST AFB T AFB x ST K w A x B M S 收稿日期 第 号 区域特色农产品产业发展关键技术的研究与集成示范 基金项目上海市农委重点攻关项目 沪农科攻字 女 在读硕士 研究方向动物营养与饲料科学 E qq 作者简介熊慧慧 E 通信作者 T

2 上海农业学报 99 黄曲霉毒素主要是由产毒的黄曲霉菌与寄生曲霉菌产生的一组自然发生的真菌代谢产物 [], 是被公认的环境污染物, 普遍存在于玉米 花生 棉籽及其饼粕等饲料原料中 在各种黄曲霉毒素中, 以黄曲霉毒素 b (AFB ) 的量最大 毒性最强, 具有致癌性 致畸性和致突变性 AFB 进入机体, 细胞色素 P450 氧化酶系可将其代谢活化为 AFB 8,9 环氧化物 (AFBO),AFBO 是一种烷化剂和致变剂, 它是 AFB 存在有害影响的最大原因 机体内的 AFBO 经机体 Ⅱ 相酶催化, 如谷胱甘肽转硫酶 (GST), 可以和环氧化物的功能基团结合形成水溶性的 AFB GSH 共轭化合物, 最终以 AFB 硫醇尿酸 (AFB NAC) 形式经尿排出体外 [2] 谷胱甘肽硫转移酶 (GST) 是生物体内解毒酶系统的重要组成部分, 广泛分布于哺乳动物 植物 鸟类 昆虫 寄生虫及微生物体内 该酶主要催化各种化学物质及其代谢产物的亲电子集团与还原型谷胱甘肽 (GSH) 巯基的偶联, 增加其疏水性, 使其易于穿越细胞膜, 分解后排出体外, 从而达到解毒的目的 鸡的 GST 是由一系列复杂的同工酶组成, 表达序列标签 (EST) 数据库已从家养鸡的 CDNA 序列鉴定出 α [3 5] μ [6 7] τ [8] σ [9] [0] 等类别, 其中 α 类 GST 根据 Mannervik 等提出的亚基命名法重新命名为 cgsta(nm_ ) cgsta2(nm_ ) cgsta3(nm_20488) cgsta CL3(M3829) 本试验以 7 日龄雄性鹿苑鸡为材料, 通过饲料添加给肉仔鸡喂食 AFB, 观察 AFB 对雄性肉仔鸡肝脏谷胱甘肽硫转移酶活性的影响, 探索 AFB 在机体内的代谢机制和 GST 对 AFB 的解毒机制 材料与方法. 试验动物和设计 00 只 日龄鹿苑鸡, 均为雄性, 由上海市农业科学院试验动物中心提供 常规饲养到 7 日龄, 挑选 75 只体重相当的仔鸡 (57.67±0.64)g, 随机分成 3 组 ( 对照组 试验一组和试验二组 ), 每组 25 只, 分笼饲养, 每笼 5 只, 对照组为基础日粮组, 试验一组为基础日粮 +mgkgafb 组, 试验二组为基础日粮 + 2mgkgAFB 组 基础日粮为鸡用配合饲料 53 粉 ( 基础日粮组成及营养水平见表 ), 购自上海延华饲料有限公司 经检测, 基础日粮中黄曲霉毒素含量 <0.2μgkg 所有试验动物均自由采食和饮水, 常规免疫, 均饲养于上海市农业科学院畜牧兽医所试验动物房内, 温度 25 28, 相对湿度 50% 60%, 定期清洁鸡笼, 连续饲养 2d 表 基础日粮组成和营养成分 ( 风干基础 ) Table Compositionandnutrientlevelsofthebasaldiet(air drybasis) 原料 含量 营养水平 含量 玉米 % 58.0 代谢能 Mcal kg 次粉 % 6.0 粗蛋白 % 豆粕 % 26.0 钙 % 0.9 棉籽粕 % 2.0 总磷 % 0.67 菜籽粕 % 2.0 赖氨酸 %.0 鱼粉 % 2.5 碳酸氢钙 %.2 石粉 % 0.3 食盐 % 0.8 预混料 %.2 复合预混料为每千克饲粮添加 :Fe80mg;Zn60mg;Cu8mg;Mn80mg;VA5000IU;VD 3 000IU;VE0IU; 核黄素 3.6mg; 烟酸 35mg;D 泛酸 0mg;VB 2 0.0mg; 生物素 0.5mg; 胆碱 800mg.2 主要仪器和试剂 紫外可见分光光度计购自尤尼科上海仪器有限公司, 多样品组织研磨机购自上海净信科技公司, 生物冷冻离心机购自德国 Eppendof 公司,UV 202C 型紫外 可见分光光度计购自尤尼柯 ( 上海 ) 仪器有限公司,AFB 购自于美国 BBI 公司 ( 纯度 98%), 谷胱甘肽 PMSF( 苯甲基磺酰氟 ) DTT( 二硫苏糖醇 ) EDTA 2Na( 乙二胺四乙酸二钠 ) 牛血清白蛋白 Tris CDNB(2,4 二硝基氯苯 ) DCNB(,2 二氯 4 硝基苯 ) p NBC(4 硝基氯化苄 ) 均购自上海生物工程有限公司, 其他试剂均为国产分析纯.3 样品采集 在饲养第 8 天 第 5 天和第 22 天时称鸡重和计算料重, 并随机从每个笼子选 只鸡, 采用脱颈椎法

3 熊慧慧 等黄曲霉毒素 B 对雄性肉仔鸡的毒害作用及对其肝脏谷胱甘肽硫转移酶活性的影响 处死 解剖 观察不同组雏鸡肝脏组织的变化 迅速取出不同组雏鸡的肝脏组织 生理盐水漂洗后置于 冰箱保存 用于酶活性的测定 测定指标 肉仔鸡的生长性能观察 每天仔细观察肉仔鸡的状态变化 每周对肉仔鸡进行称重并记录 肝脏 ST活性的测定 冰箱取出 每个肝样取 装入 L离心管 然后加入 L L 将肉仔鸡的肝样从 T HC H 组织匀浆 离心 取上清 用 T HC稀释 倍制成 L 的粗酶液 等 方法 以 CDNB为底物进行 ST活性测定 取 μl粗酶液与 μl混合液 按照 H LS H LCDNB 混合后 立即用紫外分光光度计在 处记录 OD值 每隔 计数 共计数 LT HC缓冲液作为空白对照 样品测定时设置 个重复 摩尔吸收 系数 ε NBC为底物测定 S T活性 处读取 OD值 采用同样方法以 在 摩尔吸收系数ε T活性 处读取 OD值 采用同样方法以 DCNB为底物测定 S 在 摩尔吸收系数ε 数据分析 PS S 软件进行单因素方差分析 并进行多重比较 P 所有试验重复 次以上 试验数据采用 S 为差异显著 P 与 P 为差异极显著 结果用平均值 ±标准误表示 结果与分析 肉仔鸡生长性能观察 时 肉仔鸡未出现死亡情况 各组仔鸡在饲养期间摄食和饮水情况良好 活动未见异常 如 试验 日龄与 日龄肉仔鸡体重均先上升后降低 但 表 所示 与对照组相比 随饲料中 AFB 剂量的增加 A F B 日龄 无显著差异 日龄肉仔鸡体重随饲料中 剂量的增加呈显著下降趋势 相较于对照组 与 日龄肉仔平均日增重 AD 无显著差异 说明在本试验条件下 短时间 内 饲喂含 AFB 饲料对肉仔鸡的平均体重 AD影响不明显 个试验组的 日龄肉仔鸡 AD显著降低 说明本试 或 AFB 饲料 会显著降低肉仔鸡的 AD 相较于对照组 日 验条件下饲喂含 日龄肉仔鸡的平均日采食量 ADFI 无显著差异 日龄肉仔鸡的平均日采食量 ADFI 龄和 或 AFB 饲料 会降低肉仔鸡的 ADFI 相较于 显著降低 说明本试验条件下饲喂含 日龄与 日龄肉仔鸡的料重比无显著差异 日龄肉仔鸡的料重比显著增加 说 对照组 明本试验条件下在饲料中添加 AFB 会降低饲料的利用率 表 AFB 对肉仔鸡生长性能的影响 T E AFB w 日龄体重 对照组 ± 试验一组 ± 试验二组 ± 日龄体重 ± ± ± 日龄体重 ± ± ± 日龄体重 ± ± ± 日龄平均日采食量 ADFI ± ± ± 日龄平均日采食量 ADFI ± ± ± 日龄平均日采食量 ADFI ± ± ± 日龄料重比 F ± ± ± 日龄料重比 F ± ± ± 日龄料重比 F ± 日龄平均日增重 AD ± ± ± ± ± 日龄平均日增重 AD ± ± ± 日龄平均日增重 AD ± ± ± 表示差异极显著 P 表示差异极显著 P 下同 表示差异显著 P

4 上 海 农 业 学 报 肝脏 ST活性的测定 AFB 对 日龄肉仔鸡肝脏 S 日龄肉仔鸡肝脏 S 结果表明 图 试验一组的 以 CDNB为底物检测 AFB 对 ST活性显著升高 试验二组的 ST活性相较于对照组有所降低 但并不显著 以 DCNB和 NBC为底 物检测 AFB 对 日龄肉仔鸡肝脏 S 结果表明 图 与对照组相比 试验一组的 ST活 T活性均降低 但两组均无显著差异 性均上升 试验二组的 S AFB 对 日龄肉仔鸡肝脏 S 以 CDNB为底物检测 AFB 对 日龄肉仔鸡肝脏 S 结果表明 图 与对照组相比 T活性极显著降低 以 DCNB为底物检测 AFB 对 试验一组的 ST活性非显著性降低 试验二组的 S 结果表明 图 与对照组相比 试验一组的 ST活性显著降低 试验 日龄肉仔鸡肝脏 S NBC为底物检测 AFB 对 日龄肉仔鸡肝脏 S 结果 二组的 ST活性极显著降低 以 T活性无显著变化 表明 图 试验一组及试验二组的 S!%!& " % & %& '()&!/ !+ '(,&%/ !+ +, - +,- %& '()&&02 345/&+ '(,&%02 345/&+ " () '()!!.! ++, -./ % 5!, - & ' ,./ 6!. /, 图 AFB 对 日龄肉仔鸡肝脏 S F E AFB ST 图 AFB 对 日龄肉仔鸡肝脏 S F E AFB ST AFB 对 日龄肉仔鸡肝脏 S NBC为底物检测 AFB 对 以 CDNB DCNB及 ST活性均极显著降低 %" '() 日龄肉仔鸡肝脏 S 结果表明 图 与 日龄肉仔鸡肝脏 对照组相比 试验一组与试验二组的 %" &" &" 结论与讨论 " 家禽采食含黄曲霉毒素的日粮后 采食量降低 体增 重变缓 饲料转化效率降低 生长发育受阻 严重时甚至 本试验中 长时间 采食含 AFB 造成死亡 或 的日粮 肉仔鸡的体重 体增重和 %& '()&&/ &+ '(,&%/ &+ +,-.,+ -. 5! -.+ 日龄肉仔鸡肝脏 S 图 AFB 对 F E AFB ST 平均日增重明显变缓 平均日采食量降低 料重比明显升高 这进一步证实了 AFB 对肉仔鸡生长的抑制 及毒害作用 ST为不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶 SH PX 在体内具有清除过氧化物及解毒的双重功能 ST 通过介导 AFBO和 SH结合进而达到解毒 AFB 的作用 T基因表达量下调 中毒雄性肉仔鸡肝组织 S 著降低 AFB 会对机体内的 ST产生影响 AFB AFB 中毒雏鸭肾组织的谷胱甘肽过氧化物酶活性显 本试验 后 发现饲喂 AFB 可以引起肉仔鸡肝脏 S T活性极显著降低 表明 AFB 会降 T活性 低肉仔鸡肝脏的 S ST一般是由 D的不同亚基构成的二聚体 每个亚基都含有 N端结构域和 C端结构域 不同的 ST在结构和序列上的主要差异就体现在 C端结构域 其决定底物的特异性 本试验的第 天 天 发现饲喂 AFB 可以引起肉仔鸡肝脏以 CDNB DCNB P NBC为底物的 ST活性表现 第 天和第

5 02 熊慧慧, 等 : 黄曲霉毒素 B 对雄性肉仔鸡的毒害作用及对其肝脏谷胱甘肽硫转移酶活性的影响 出不同的变化, 这可能是鸡肝脏不同 GST 同工酶的综合作用结果 试验的第 7 天后, 发现饲喂 mgkg AFB 可以引起肉仔鸡肝脏以 CDNB DCNB P NBC 为底物的 GST 活性升高, 这可能是鸡日龄增长, 肝脏 GST 活性随之增强 [20], 肝脏 GST 对 mgkgafb 表现出抗性作用, 尤其是以 CDNB 底物的 GST 同工酶表现出的抗性更显著 试验 2d 后, 发现在 mgkgafb 组和 2mgkgAFB 组肉仔鸡肝脏以 CDNB DCNB P NBC 为底物的 GST 活性均极显著降低, 这可能是随着 AFB 饲喂剂量的加大或饲喂时间的增长, GST 同工酶活性会降低甚至失活 目前, 家禽的 GST 在对 AFB 的敏感性和抗性方面还很少引起研究者们的注意 家禽体内是否存在最有效的 GST 解毒同工酶, 以及怎样加强它的解毒活力, 这对于揭示 AFB 在机体内的代谢机制以及研究 GST 对 AFB 的解毒机制有着十分重要的意义, 需要进一步探讨 参考文献 []WANGJS,GROOPMANJD.DNAdamagebymycotoxins[J].MutationResearchFundamentalandMolecularMechanismsofMutagenesis, 999,424():67 8. [2]WOGANGN.Aflatoxinsasriskfactorsforhepatocelularcarcinomainhumans[J].Cancerresearch,992,52(7Supplement):24s 28s. [3]CHANGLH,CHUANGLF,TSAICP,etal.CharacterizationofglutathioneS transferasesfromday oldchicklivers[j].biochemistry,990,29 (3): [4]CHANGLH,FAN JY,LIU LF,etal.CloningandexpresionofachickliverglutathioneS transferasecl3subunitwiththeuseofa baculovirusexpresionsystem[j].biochemicaljournal,992,28(2): [5]LIULF,WUSH,TAM M F.Nucleotidesequenceofclas αglutathiones transferasesfromchickenliver[j].biochimicaetbiophysicaacta (BBA) GeneStructureandExpresion,993,26(2): [6]LIULF,TAM M F.NucleotidesequenceofaclasμglutathioneS transferasefromchickenliver[j].biochimicaetbiophysicaacta(bba) GeneStructureandExpresion,99,090(3): [7]SUNYJ,KUANIC,TAM M F,etal.TheThree DimensionalStructureofanAvianClas muglutathiones transferase,cgstm at.94 Resolution[J].Journalofmolecularbiology,998,278(): [8]HSIAOCD,MARTSENEO,LEEJY,etal.Aminoacidsequencing,molecularcloningandmodelingofthechickliverclas thetaglutathione S transferasecl[j].biochemicaljournal,995,32():9 98. [9]THOMSONAM,MEYERDJ,HAYESJD.Sequence,catalyticpropertiesandexpresionofchickenglutathione dependentprostaglandind2 synthase,anovelclassigmaglutathiones transferase[j].biochemicaljournal,998,333(2): [0]MANNERVIKB,AWASTHIYC,BOARDPG,etal.Nomenclatureforhumanglutathionetransferases[J].BiochemicalJournal,992,282(Pt ):305. []HABIGW,PABSTM J,JAKOBYW B.Thefirstenzymaticstepinmercapturicacidformation.Glutathione S transferase[j].jbiolchem, 974,249: [2]BRADFORDM M.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogram quantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein dye binding[j].analyticalbiochemistry,976,72(2): [3]ZAGHINIA,MARTELLIG,RONCADA P,etal.MannanoligosaccharidesandaflatoxinB infeedforlayinghens:efectsoneggquality, aflatoxinsb andmresiduesineggs,andaflatoxinb levelsinliver[j].poultryscience,2005,84(6): [4] 马志科, 昝林森. 黄曲霉毒素危害 检测方法及生物降解研究进展 [J]. 动物医学进展,2009,30(9):9 94. [5]LARSSONP,TJLVEH.ExtrahepaticbioactivationofaflatoxinB infetal,infantandadultrats[j].chemico biologicalinteractions,995,94 (): 9. [6]VLEETTRV,KLEINPJ,JRRAC.MetabolismandcytotoxicityofaflatoxinB incytochromep 450 expresinghumanlungcels[j].journal oftoxicologyandenvironmentalhealthparta,2002,65(2): [7]YARRULP,SETTIVARIRS,ANTONIOUE,etal.ToxicologicalandgeneexpresionanalysisoftheimpactofaflatoxinB onhepaticfunction ofmalebroilerchicks[j].poultryscience,2009,88(2): [8] 石达友, 廖申权, 刘念, 等. 硒对黄曲霉毒素 B 中毒雏鸭肾组织抗氧化功能的影响 [J]. 中国兽医杂志,20(2):9 2. [9]HAYESJD,PULFORDDJ.TheGlutathioneS TransferaseSupergeneFamily:RegulationofGSTandtheContributionofthelsoenzymesto CancerChemoprotectionandDrugResistancePartI[J].Criticalreviewsinbiochemistryandmolecularbiology,995,30(6): [20]KLEINPJ,VANVLEETTR,HALLJO,etal.Biochemicalfactorsunderlyingtheage relatedsensitivityofturkeystoaflatoxinb [J]. ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartC:Toxicology&Pharmacology,2002,32(2): ( 责任编辑 : 闫其涛 )

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