2 叮川唱叫峰,37 卷第 6 期 张胜娟, 夏文彤, 杨晓辉, 等 : 六种食用油对铜绿微蠢的抑制效应 565 均购于沃尔玛超市, 所有食用油均为一级油. 实验藻种铜绿微囊藻 FACHB-942 (Microcystis aeruginosa. F ACHB-942) 由中国科学院武汉水生所淡水

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1 电 第 37 卷 6 期 14 年 11 月 Joumal of A 且 hui Nonnal University (Natural Science) Vol. 37 No. 6 Nov. 14 六种食用油对铜绿微囊藻的抑制效应 张胜娟 1 夏文彤 2 杨晓辉 3 张庭廷 4 ( 安徽师范大学生命科学院, 生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室, 安徽芜湖 ) 摘要 : 远过对藻密度 抑制率等相关参数的测定, 分别研究了全龙鱼食用油 大豆油 花生油等 6 种常见食用油对铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa Kutz. ) 生长的影响. 实验结果表明, 全龙鱼食用 油能有效抑制铜绿微囊藻的生长, 并具有明显的剂量一效应关系, 一定时间范围内的时间一效应关 系. 而 3.0 X 10 5 cel1s/ml 的铜绿微囊藻, 其半抑制浓度 (EC50) 最高可达 4. 18mllL. 关键词 : 铜绿微囊藻 ; 全龙鱼食用油 ; 脂肪酸 ; 抑藻效应 中图分类号 :X524 文献标志码 :A 文章编号 : (14 ) 近年来, 随着城市化和工业化的快速发展, 大量生活和工业废水被排人江河湖泊, 导致了淡水水体的富 营养化, 每至春夏之际, 藻类水华频繁爆发, 而水华藻类极易腐败, 不仅能降低水体的含氧量, 还能释放大量 毒素, 对人类淡水资源和水生生物的生存环境造成严重破坏 [1] 因此, 如何有效控制水华藻类是维护人类生 存环境的重大课题之一. 淡水水华主要是蓝藻, 而蓝藻中最常见的铜绿微囊藻 ( Microcystis αeruginosa) 是蓝 藻水华的主要元凶 [2] 严重威胁野生动植物及人类健康 [3] 铜绿微囊藻是一种单细胞藻类, 属蓝藻门 微囊藻属, 它所产生的藻毒素能够致癌, 可 目前, 利用化感物质治理水华是水华治理的主要研究方向. 化感物质是水生植物生长过程中产生的次生 代谢产物, 一般能在自然环境中降解, 不会在生态系统中长期积累 [4] 故其生态安全性良好. 迄今为止, 发现 的化感物质按照其化学结构可以分成 5 大类 : 脂肪族 芳香族 含氧杂环化合物 类晴和含氮化合物 [5J 其中 脂肪酸作为一种重要化感物质, 存在于许多植物的根茎叶中, 在控制蓝藻水华过程中发挥着重要作用. Yasushi[6] 等 (03) 证明长链脂肪酸能够强烈抑制羊甲绿芽藻 (Selenastrum capricornutum) 正常生长. Ikawa 等的 (1984) 发现 C14-C18 脂肪酸对绿藻 (Chtorella pyrenoidosa) 的生长也具有强烈的抑制作用 ; Zhang 等问 J (08) 从普生轮藻中分离出亚油酸 软脂酸和豆寇酸, 并发现它们均有不同程度的抑藻效应 ; 同 时还研究了 17 种不同碳链长度 不同饱和程度脂肪酸类物质的抑藻作用 ; 发现各种脂肪酸均有一定的抑藻 效应, 抑藻活性与脂肪酸的结构有关 ; 不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸的抑藻效应好, 不饱和程度越高, 抑藻效应 越明显 ; 饱和脂肪酸中碳链越短, 化感抑藻效应越强. 为此, 本实验所选用的材料是以脂肪酸为主要成分的食用油类, 即金龙鱼食用油 大豆油 山茶油 花生 油 芝麻油 菜籽油, 这些油从天然植物中提取, 对环境相对安全无毒, 不会造成诸如化学试剂抑藻所带来的 二次污染及生态毒性. 实验研究对象为水华常见藻类一一产毒铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa ), 拟通过 研究分析上述 6 种常见食用油对产毒铜绿微囊藻生长的影响, 寻找出抑藻效应强的食用油. 为进一步开发生 物除藻剂提供理论与实验依据. 1 材料与方法 1. 1 实验材料 实验中使用的 6 种食用油分别选定为 : 金龙鱼食用调和油 ( 金龙鱼集团有限公司产品 ) 大豆油 ( 中粮艾 地盟粮油工业有限公司产品 ) 山茶油 ( 金华市金山油脂有限公司产品 ) 压榨花生油 ( 山东鲁花集团有限公司 产品以芝麻油 ( 北京金亭建鑫食用油有限公司产品 ) 菜籽油 ( 江苏虹蜻蜓油脂有限责任公司产品 ), 以上材料 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ). 作者简介 : 张胜娟 ( ), 女, 河南民权人, 硕士研究生通讯作者 : 张庭廷 (1955-), 女, 安徽东至人, 教授, 博士. 引用格式 : 张胜娟, 夏文彤, 杨晓辉, 等六种食用油对铜绿微囊藻的抑制效应 []] 安徽师范大学学报 : 自然科学版, 14,37( 6) :

2 2 叮川唱叫峰,37 卷第 6 期 张胜娟, 夏文彤, 杨晓辉, 等 : 六种食用油对铜绿微蠢的抑制效应 565 均购于沃尔玛超市, 所有食用油均为一级油. 实验藻种铜绿微囊藻 FACHB-942 (Microcystis aeruginosa. F ACHB-942) 由中国科学院武汉水生所淡水 藻种库提供 实验仪器 Motic 数码显微镜 ( 德国 Motic 有限公司 ) ; 血球计数板 ( 上海精密仪器仪表有限公司 ) ; 微孔过滤器, 0.22 μm 微孔滤膜 ( 上海兴亚净化材料厂 ) ; 注射器 ( 上海中鸽注射器有限公司 ) ; 光照培养箱 PGX-250B( 宁波海曙 赛福实验仪器厂 ) ; 架物托盘天平 ( 上海斗门五金工具有限公司 ) ; 电子天平 FAll04( 上海精密科学仪器有限 公司 ) ; 无菌操作台 ( 新加坡 ESC 有限公司 ) ; 立式压力蒸汽灭菌锅 ( 上海申安医疗器械厂 ) 藻种培养 在无菌条件下, 向已经高温湿热灭菌的 250ml 锥形. 瓶内加入 100ml 的 BG-ll 培养基 [9] 加入铜绿微囊 藻藻种, 摇匀后放入光照培养箱内培养. 培养条件为 : 温度 24 士 2 'C, 光周期 12L/12D, 光照强度 40001x. 每天 振荡摇匀 4-5 次, 实验前 7 天, 对铜绿微囊藻进行扩大培养, 每天加入新鲜培养基, 使之处于对数生长期 抑藻实验 使用 0.22μm 微孔过滤器, 分别对实验材料 : 金龙鱼食用油 大豆油 山茶油 花生油 芝麻油 菜籽油进 行过滤以除去微生物, 置于无菌环境中备用. 在元菌条件下, 取处于对数生长期的铜绿微囊藻, 用已灭菌 BG -11 培养基稀释藻液, 使得铜绿微囊藻液的藻密度为 3. 0 X 10 5 cells/ml. 分别取出已稀释的藻液 40ml 加人 100ml 锥形瓶中, 再加入各种待测试的食用油, 使得各种油的最终浓 度分别为 ~2. 0~4. 0~8. mlll. 另外设置一个空白对照组, 即只含相同藻密度的藻液 ; 每组三个平行, 置于 1. 3 相同条件下进行培养, 实验期为 8 天, 每隔 48h 用血球计数板统计藻细胞数 对铜绿微囊藻生长影晌的参数测定 藻密度通过对藻细胞的计数来反映食用油对铜绿微囊藻生长的影响, 每隔 48h 统计藻细胞 1 次, 算出当天的藻细胞密度, 连续计数 8 天 抑制率与半抑制浓度 6 种食用油对铜绿微囊藻的抑制百分率 (I nhibition Ratio) 公式为 :IR( %) = (1- NIN) X 100%, 其中 :IR 一一抑制率 ;N 一一处理组的铜绿微囊藻的藻密度 ( cells/ml) ; N 一一对照组的 铜绿微囊藻的藻密度 (cells/ml) ; 将各浸提液的浓度及杀藻剂的用量与相应处理组生长抑制率做一元线性回 归, 求出半抑制浓度 EC5o (ml ll) 比增长率铜绿微囊藻的比增长率的计算公式 :μ= Ln(XnlX = (';_1)/( tn 一!n -l)' 其中 μ 为比增长 率 ;Xn Xn - 1 分别为当天和 2 天前的铜绿微囊藻的藻密度山 tn -l 分别对应于 Xn Xn - 1 的培养时间 统计方法 数据采用 Exce103 软件和 SPSS13, 软件处理, 相关统计分析采用单因素方差分析, P < 0.05 表示有 显著性差异 ;P < 0.01 表示有极显著性差异 种食用油对铜绿微囊藻生长的影晌图 1 显示的是 6 种食用油对铜绿微囊藻藻密度的影响. 各处理组在 2d 内变化不大, 从 4d 后开始表现出不同的变化趋势. 金龙鱼食用油处理组从 0.2ml ll-8. mlll, 每个处理组的藻细胞生长曲线均低于同期对照组生长曲线, 随处理时间增加, 藻密度和同期对照组差距越大 ; 观察各浓度的处理组藻密度变化情况, 可发现浓度越高, 藻细胞密度越低 ; 而其他 5 种食用油处理组各组生长曲线与同期对照组相比较, 差距并不明显, 甚至有些浓度处理组的藻密度还高于对照组 ; 这可能是因为这 5 种食用油对铜绿微囊藻并没有明显的抑制作用 ; 综合比较 6 种食用油对铜绿微囊藻生长的影响, 可以发现金龙鱼食用油对铜绿微囊藻有较明显的抑制作用, 且浓度与抑制效果正相关. 2.2 金龙鱼食用油对铜绿微囊藻比增长率的影晌表 1 显示的是金龙鱼食用油对铜绿微囊藻比增长率的影响, 与同期对照组比较, 金龙鱼食用油的各处理组比增长率均低于同期对照组, 随着处理时间延长, 比增长率较对照组越低, 在第 8 天 8.0mllL 处理组出现了负增长. 说明金龙鱼食用油能明显抑制铜绿微囊藻藻细胞的分裂和生长, 浓度越高抑制效果越明显. 结果与分析

3 4 4 ' 年 + B E0EFU Et mfcω u 虽革 ) 安 A +> HgGJ 可 ωm 的 F 叫 l, t 同国 三 J 60 气 F U 4 要建 ) 时间 time (d) 日寸 司 t i riie (d) 8 φ;:;. - HEo <t 飞严 ω4 60 M3D CFD 主 8E 3 且 60 1) lt1ï'ï'l]time(d) 日寸 吕 ]time(d) 占 / 于 6 8 +> J 飞 -823d 60 虽盖 3 1 H 哺 8.1 E +>J 'rl 巳气 ω H Fa-4 黯.F 巳只 nmez k ~ 60,. 飞的飞 吨 FmE4A4 n u3b w 时间 Jt ime (d) 时才问 time(d) 6 s :ck, 口 :0. 5mllL,Lò.: 1. mill, X :2. mlll, :4. mlll, 十 :8.0ml ll, 图 1 金龙鱼食用油 (A) 大豆油 (B) 山茶泊 (C) 花生泊 (D) 芝麻油 (E) 菜籽油 (F) 对铜绿微量 E 藻藻细胞密度的影响 Fig 1 The effect of the edible oil of Golden dragon fish(a) soybean oil(b) 臼 mellia oil(c) 口创且.ut oil(d) sesame oil(e) rapeseed oil(f)on algae cell density of M. aeruginosa. Table 1 表 1 金龙鱼食用油对铜绿微襄藻比增长率的影晌 The effect of the edible oil of Golden dragon fish on specific growth rate of M. aerugino 切 金龙鱼食用 泊浓度 (mlll) 2 4 o 土 :1:. 003 特 :1: 土 土 土 :1: 土 土 :1: 土 :1: 赘 怜 怜 铃 处理天数 (d) 土 土 :1: 土 :1: 土.021 件 畴 特 普 土 :1: :1: :1: :1: 士 曾传著特警特传普 骨特 公与同期对照组比较, P<0.05 卢关与同期对 j 照组比较, P < 金龙鱼食用油对铜绿微囊藻生长的抑制军 表 2 显示, 金龙鱼食用油各处理组随处理时间的增加, 抑制率明显升高, 比较同期各处理组的抑制率, 还

4 37 卷第 6 期张胜娟, 夏文彤, 杨晓辉, 等 : 六种食用泊对铜绿微袭的抑制效应 567 可发现浓度越高, 抑制率越高, 8.0mllL 处理组在第 8 天抑制率达 70% 左右, 说明金龙鱼食用油对铜绿微囊藻有明显的抑制作用, 且浓度与抑制率正相关, 说明金龙鱼食用油能明显抑制铜绿微囊藻的正常生长. 表 2 金龙鱼食用油对铜绿微囊藻的抑制率 (%) Table 2 The inhibition ratio of the edible oil of Golden dragon fish on M. aerz 昭 nosa(%) 金龙鱼食用油浓度 (nù ll) 土 :t :t :t :t 土 土 土 :t 土 处理天数 (d) 土 土 士 士 :t :t 士 :t :t :t 金龙鱼食用油抑制铜绿微囊藻生长的半抑制浓度 EC50 按照第 8 天计算, 由于只有金龙鱼食用油对铜绿微囊藻的抑制率达到了 50% 以上, 而其他 5 种食用油的押制率并没有达到 50%, 所以只计算金龙鱼食用油的半抑制浓度, 计算结果为 4. 18mllL. 3 讨论脂肪酸是一类重要的化感物质, 有很强的抑藻作用 [11-12] 但本研究所用的原料是 6 种食用油, 由于食 用油均为饱和或不饱和脂肪酸所形成的甘油三醋, 相对来说, 游离的脂肪酸含量较低, 其抑藻效果远不如游离脂肪酸的解释可能是脂肪酸中的主要官能团一一援基形成了醋键, 使其化学性质发生了改变, 因此, 本研究所得结果可为是利用脂肪酸还是利用其形成的醋类化合物进行抑藻提供理论参考. 而在 6 种食用油中, 其它 5 种食用油均为单一油类, 只有金龙鱼食用调和油是多种油的复合制剂, 相对来说, 其成分更多样化, 而且其脂质中各种饱和程度不同的脂肪酸比例为饱和脂肪酸 : 单不饱和脂肪酸 : 多不饱和脂肪酸是 1 : 1 : 1, 因此在对铜绿微囊藻的抑制作用中, 可能起到协同抑藻的效果, 这一推测与张庭廷等 [12J 的研究结果相似. 此外, 6 种食用油均是从相应植物体提取出来的含脂肪酸的脂类物质, 将它们加人培养基之后, 这种培养基物理性质的改变, 特别是其粘滞性对微囊藻的生长基本不会产生多大影响 ( 加人食用油的量较小 ), 而真正的影响可能来源于食用油中的脂肪酸对藻细胞产生的一系列连锁反应. 关于脂肪酸的抑藻机理也有一些报道. 张庭廷等 [11] 认为脂肪酸通过自由基的链锁反应, 引起藻细胞膜脂质过氧化, 导致 :tvida 的积累, 大分子核酸或蛋白质受到损伤, 细胞膜通透性增加, 叶绿素 a 合成减少, 从而抑制藻细胞的生长, 最终导致藻细胞破裂死亡.Wu 等 [13] 认为脂肪酸改变藻细胞膜结构, 造成 K+ 外泄, 诱发了对藻类的抑制效应. Sokolov 等 [14J 认为脂肪酸改变了细胞膜超微结构或膜内的离子通道, 从而引起细胞死亡. Agafonov 等 [15] 报道长链 ~6 - Cz 2 之间的饱和脂肪酸与 Ca 2 + 的亲和作用引发了抑藻效应. fgarashi 等 [16] 认为脂肪酸通过 Ca 2 + 通道影响钙调蛋白依赖的蛋白激酶 (CaM 激酶 ) 活性, 进而影响磷酸酶活性, 最终抑制藻类生长. 另外, 食用油虽然能够有效抑制铜绿微囊藻的生长, 但其效果却不是最理想的. 油脂类在水体中的溶解性很低, 即使加入量极少也会在水面出现漂浮现象, 虽然是安全无毒害却也影响水体环境的美观. 因此, 以食用油抑制藻类生长在实际应用中将存在局限性. 若想利用天然的油类抑藻可能要对其进行适当处理, 在保持其天然特性的同时使其游离脂肪酸增加, 从而增加其抑藻效能, 这也是今后需要进一步探讨的内容. 然而, 直接用食用油进行抑藻的研究还是首次, 本研究为利用脂肪酸及其脂类抑藻提供了一些新的认识和实验依据. 以食用油抑藻其优点是成本相对较低, 纯天然, 较人工合成的脂肪酸类可能会对环境更友好. 脂肪酸类物质是植物体内重要的次生代谢产物, 有着很好的生态安全性. 因此利用脂肪酸类化感物质的特性进行抑藻, 将对未来水华的治理有着重要意义. 不足之处是耗损了粮食资源. 同时, 用脂肪酸抑藻时水体表面常有油状物漂浮, 影响景观. 如何才能减少食用油的使用, 增加其溶解性, 减少或消除其在水面的漂潭, 提高其抑藻效果, 这将是有待进一步解决的问题. 参考文献 : [lj 俞家禄, 陈明惠, 林坤. 武汉东湖蓝藻水华毒性研究 (I) : 淡水蓝草草水华毒性检测 [J]. 水生生物学报, 1987, 11(3) : 一 - 酬 a 脚时 ~

5 ' 吨喃喃电吨 "'" " 喃喃... 一一 酬跚跚 年 [2J JIN Z 日, ZHUANG Y Y, DAI S G, et al. 1 回 lation and identification of extracts of Eich homia crassipes and their alleopathic effects on algae [JJ. Bull Environ Contam. Toxical, 03,71: [3J NEILAN B A, PEARSN L A, MUENCHHFF J, et al. Environmental conditions that influence toxin biosynthesis in cyanobacteria[jj. Environmental Microbiology, 13, 15(5) : [4 J NAKAI S, INUE Y, HSMI M. Myriophyllum spicatum released allelopathic polyphe-nols inhibiting growth of blue-green algae Microcystis aeruginosa[j]. Water Res, 00,34: [5J RICE. Allelopathy[MJ. The second edition. London:Academic P 自由, 1984:1 一 2. [6 J YASUSHI K, YASUNRI K, KYJI S. Acute toxicity of fatty acids to the freshwater green-algal selenastrum capricomutum [J J. Environmental Toxicology, 03,18: [7J lkawa M, HARSTSHRNE T, CARN LA, et al. Inhibition of growth of the green-alga Chl rella pyrenoidosa by unsaturated fatty acid [JJ. Joumal of the American il Che -mists' 如 ciety, 1984,61 : [8J ZHANG T T, HE M, WU A P, et a1. Allelopathic effect of surbmerbed macrophyte Chara v 吐 g 缸 is on toxic Microcystis aerugir 回国 [J J. Allelopathy Joumal, 09,23(2) : [9J 周扬. 可水培陆生植物大葱化感抑藻效应及其机理研究 [DJ. 芜湖 : 安徽师范大学, 13:4 一 8. [10J GNIAZDWSKA A, BGATEK R. Allelopathic interactions between plants, Multisite action of allel hemi 臼 1s [ J J. Acta Physiologiae P1ant 町山 n, 05, 27(3): [l1j 张庭廷, 郑春艳, 聂刘旺, 等. 亚泊酸对铜绿微囊藻的抑制机理 [JJ. 中国环境科学, 09, 29(4) : [12J 张庭廷, 郑春艳, 何梅, 等. 脂肪酸类物质的抑藻效应及其构效关系 [JJ. 中国环境科学, 09, 28(3) : [13J WU J T, CHIANG Y R, HUANG W Y, et al. Cytotoxic effects of free fatty acids on phytop1ankton algae and cy 皿.oact -eria[jj. Aquatic Toxicology, 06,: [14 J SKLV Y, MARTIN D, LEHRER 1, et al. Membrane channel formation by an 世 rnicrobial protegrins[jj. Biochimica et Biophysica ac 钮, 1999, 14: [15J AGAFNV A, GRITSENK E, BELSLUDTSEV K, et al. A permeability transition in lipo 四 m-es induced by the formation of ea 2 + I palmitic acid complexes[jj. Biophysica Ac. 钮, 03, 1609(2) : [16J IGARASHI T, ARITAKE S, YASUMT T. Mechanisms underlying the hem01ytic 四 d ichthy -otoxic activities of maitotoxin[jj. Natural Toxins, 1999,7: The Inhibition Effects of Six Kinds of Edible il to Microcystis Aeruginosa ZHANG Shen 鸣 1 噶啥 g 念 - 讪 an 1, XIA Wen-tong 2, Y 且也 Xiao-hui 3, ZH 却叫 G Ting-ting 4 (The Key Laboratory of Biotic Environment and Ec010gical Safety in Anhui Province, College of Life Sciences, Anhui No 口 nal University, W 吐血 , China) Abstract: Through the determination of related parameters, such as algal density, inhibition rate and so on, this article respectively studied 6 kinds of common edible oi1, for example, the golden dragon fish cooking oil, soybean oi1, peanut oil, etc., in order to research their inf1uence to the growth of microcystis aeruginosa Kutz. The experimental results show that the golden dragon fish oil 臼丑 effectiv e1y inhibit the growth of Microcystis aeruginosa. Simultaneously, it also has obvious dose-effect relationship, time-effect relationship within a certain period of time. And the half inhibitory concentration (EC50) of 3. 0 X 10 5 cells/ml microcystin algae is up to 4. 18mllL. Key words: microcystis aeruginosa; golden dragon fish oil; fattyacid; inhibitory effect on a1ga;

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