液相色谱采用 Thermo Scientific TM Open Accela TM 12 UHPLC 系统和 Thermo Scientific TM Hypersil GOLD TM aq 色谱柱 (1 2.1 mm, 1.9 µm 粒径 ) 进行色谱分离进样量为 3 µl 色谱条件如下: 数

Size: px

Start display at page:

Download "液相色谱采用 Thermo Scientific TM Open Accela TM 12 UHPLC 系统和 Thermo Scientific TM Hypersil GOLD TM aq 色谱柱 (1 2.1 mm, 1.9 µm 粒径 ) 进行色谱分离进样量为 3 µl 色谱条件如下: 数"

尤催葛
5 years ago
Views:

药物发现中的代谢轮廓分析 : 了解代谢组学研究的影响因素与降低生物化学和化学噪音的策略应用文献61 Mark Sanders 1, Serhiy Hnatyshyn 2, Don Robertson 2, Michael Reily 2, Thomas McClure 1, Michael Athanas 3, Jessica Wang 1, Pengxiang Yang 1,

1 药物发现中的代谢轮廓分析 : 了解代谢组学研究的影响因素与降低生物化学和化学噪音的策略应用文献61 Mark Sanders 1, Serhiy Hnatyshyn 2, Don Robertson 2, Michael Reily 2, Thomas McClure 1, Michael Athanas 3, Jessica Wang 1, Pengxiang Yang 1, Yingying Huang 1, David Peake 1 ; 1 Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA; 2 Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ; 3 Vast Scientific, Boston, MA 关键词 Q Exactive Focus;SIEVE 软件 ; 生物标记物 ; 药物发现 ; 代谢组学目的为代谢组学生物标记物的发现开发一套全新的自动化工作流程和仪器分析方法前言在制药行业中, 代谢组学用于研究潜在候选药物的药理学响应所产生的生化变化, 其识别毒性 / 药效标记物的能力可以显著加速药物研发的进程并帮助制定合适的临床计划来自于液相色谱 - 质谱联用技术 (LC-MS) 的代谢轮廓实验数据, 包含大量的化学噪音, 常常干扰生物标记物的发现本文采用全号所需要的精细数据处理此技术可大大减少数据量, 并改进目标代谢物的定量生物因素对代谢轮廓有着深远的影响, 即使细小的代谢变化也会掩盖药物诱导的代谢效应了解大鼠的正常代谢变化能使生物噪音降到最低, 并提供更为可靠的药物相关的代谢变化信息新的质谱技术和数据处理软件来降低动物实验中的化学背景, 进而研究药物诱导的变化与动物年龄和营养的关系常规 LC-MS 代谢组学研究存在很多冗余的 ( 一种组分有多个离子 ) 和不相关的 ( 化学噪音 ) 数据同时影响代谢轮廓的外部因素 ( 年龄营养 ) 增加了生物多变性由于许多化学物质是未知的, 因此, 在进行结构鉴定前过滤掉假阳性结果尤为重要超高分辨率仪器结合超高效液相色谱 (UHPLC) 的分离可以提供足够的分辨率将代谢物与化学背景区分开, 解决了化学噪音和数据冗余的问题准确质量数能确保识别相关信实验部分样品前处理抽取各组雄性大鼠 ( 饱食, 急慢性禁食, 不同年龄 ) 的血液样品并进行 LC-MS 分析取 µl 血清样品, 加入 1 µl 含.1% 甲酸的冷甲醇溶液以除去蛋白质干燥样品, 加入 2 µl1% 甲醇水溶液复溶每份样品中加入 N- 苯甲酰基 -D- 甘氨酸 (tr = 4.27 min,m/z ) 作为内标

2 液相色谱采用 Thermo Scientific TM Open Accela TM 12 UHPLC 系统和 Thermo Scientific TM Hypersil GOLD TM aq 色谱柱 (1 2.1 mm, 1.9 µm 粒径 ) 进行色谱分离进样量为 3 µl 色谱条件如下: 数据处理采用 Thermo Scientific TM SIEVE TM 软件的组分提取 (Component Extraction, CE) 数据处理算法分析数据, 测定大鼠禁食产生的代谢效应流速 : 6 µl/min 柱温 : 溶剂 A:.1% 甲酸水溶液溶剂 B:.1% 甲酸乙腈溶液梯度 : 时间 (min) %A %B 结果与讨论图 2 显示了 N- 苯甲酰基 -D - 甘氨酸内标物的高质量 LC-MS 数据在质量轴校准后的 2 到 3 小时之间采集血清 QC 重复样的正离子模式数据, 展示了 UHPLC 分析时间内优异的峰面积和质量数测定的稳定性基线处的色谱峰宽为 3.6 s, 每个峰获得了 1 次扫描图 3 显示了测定内源代谢物的元素组成时分辨率为 7, 的重要性 A+2 同位素 (m/z 313) 附近的展开图中显示存在一个 34 S, 这在 3, 分辨率下 ( 模拟 ) 是不可能发现的, 因为分辨率较低时, 13 C 2 同位素与 34 S 是不能分辨的质谱采用 Thermo Scientific TM Q Exactive TM Focus Hybrid Quadrupole- Orbitrap 质谱仪 ( 图 1) 分别在正离子和负离子模式下采集得到高分辨率准确质量数 (HRAM) 数据, 分辨率为 7,(FWHM) HCD 碰撞池 C 形阱四极杆质量过滤器 RF 透镜离子源 Orbitrap 质量分析器图 1. Q Exactive Focus 质谱仪示意图

Relative Abundance 1 9,693,41-1.% CV 1 1 1 1 Mean Area 96,686,837 1.41% CV 96,47,711 -.2% CV 9,147,394-1.6% CV 98,394,92 +1.8% CV 97,722,94 +1.1% CV Peak Width - 3.6 sec Mean Scans - 14. 4.1 4.2 4.

3 Relative Abundance 1 9,693,41-1.% CV Mean Area 96,686, % CV 96,47, % CV 9,147, % CV 98,394, % CV 97,722, % CV Peak Width sec Mean Scans Time (min) 7:1 PM (~2 hr post external calibration) 11:14 PM 1:23 AM 3: AM :9 AM (~3 hr post external calibration) x ppm 2.x1 6 2.x1 6 2.x1 6 2.x1 6 Mean ppm ppm ppm ppm -.43 ppm Mean ppm ppm ppm ppm ppm ppm m/z 图 2. N- 苯甲酰基 -D - 甘氨酸的质量数和响应值的稳定性, 外标法, 分辨率为 82, FWHM 7, 分辨率下的 A+2 同位素 3, 分辨率下的 A+2 同位素 S Exp. (blue) Calc. (red) Calc. profile C H O 33 S 13 C m/z m/z m/z m/z m/z 图 3. 同位素精细结构结合准确质量数测定清晰鉴定出了元素组成, 如 7, 分辨率能将 34 S 同位素从 13 C 2 同位素中分离出来, 而 3, 分辨率不能

4 组分提取软件的数据处理工作流程如图 4 所示该软件能像分析人员一样解析数据, 批量处理各个数据文件, 而不是单独处理, 并将每次运行得到的信息用于验证下一次运行获得的信息按照这种方式, 由于每种组分在数据集中的最大浓度点定义, 从而大大减小了数据缺失值现象同样的组分在低浓度样品中时, 可以采用更靶标性的方法实现鉴定和定量实验得到高度简化的数据数据处理去除了系统产生的大量噪音, 得到了更严格的统计学分组和更可靠的差异分析和组分推断结果表 1 中的大鼠研究实验用于监测禁食对大鼠代谢过程的影响图显示了喂养大鼠控制样组混合 QC 样和禁食 4 12 和 16 小时血清样主成分分析 (PCA) 的高质量聚类分析结果结果清晰地显示了喂养和禁食大鼠血清代谢组的区别, 以及不同禁食时间的代谢组差异图 6 显示了随禁食时间变化增加 (Met 甲硫氨酸,2:4 FA 二十碳四烯酸 ) 和减少 (Pro 脯氨酸, 18:2 LPC 溶血磷脂酰胆碱 ) 的代谢物如图 6 所示, 混合血结论 Q Exactive Focus 质谱仪为非靶标代谢组学研究提供了一种精密和耐用的平台此平台拥有与 UHPLC 兼容的超快扫描速度, 能在外标法校准后的相当长时间内, 在正离子和负离子两种模式下均保持优异的质量数准确度和响应值稳定性不需要做技术性重复样高达 7, FWHM 的分辨能力能测定精细同位素轮廓, 有助于清晰地推断元素组成若要消除研究中大量的噪音干扰, 可以采用 SIEVE 软件中的智能化数据简化工具来实现化学噪音的显著降低此外, 系统化的研究有助于生物噪音的表征, 同时代谢组学预筛选功能帮助鉴定出生物离群值, 从而确保整个研究的一致性如本研究所示, 禁食是模型设计中的一个显著变量, 禁食数据有助于分析很多由药物引起的代谢物变化研究发现, 大鼠禁食对代谢轮廓分析有着深远的影响虽然大多数代谢变化在一定程度上是比较细微的, 但是禁食能突显或掩盖掉一些药物引起的代谢影响清 QC 重复样中的每种代谢物均呈现极佳的重现性因此, 没有必要做技术性重复样图 7 说明在实际 LC-MS 分析中, 尽管正离子和负离子模式的运行时间相隔 3 小时, 血清中尿酸的测定结果在两种模式下仍然一致研究证实, 该 LC-MS 平台和方法非常耐用从而推断生物多变性是这些数据中噪音的主要来源

色谱峰对齐 Background Subtraction Based on a series of blank runs 校准保留时间偏差填充数据缺口 Chromatographic Alignment Search 搜索缺失的组分 for missing

internal std 所有有用的信号或内标物建立定量表格 Build Quantitation Table 所有组分和样品 All components and samples statistically significant differences

Ion Extracted ion traces 提取离子谱图自动解析图谱 Automatically Interpret Spectra Charge state, adducts, isotopes 电荷价态加合离子同位素 confirm

5 色谱峰对齐 Background Subtraction Based on a series of blank runs 校准保留时间偏差填充数据缺口 Chromatographic Alignment Search 搜索缺失的组分 for missing components 背景扣除 Background Subtraction Based基于一系列空白进样 on a series of blank runs 峰面积归一化 Peak Area Normalization Total useful signal or internal std 所有有用的信号或内标物建立定量表格 Build Quantitation Table 所有组分和样品 All components and samples statistically significant differences 统计学存在显著性差异 Annotate Components 组分鉴定 Local database or 搜索 ChemSpider ChemSpider或本地数据库 search KEGG 通路匹配 Start从丰度最大的离子开始 with Most Abundant Ion Extracted ion traces 提取离子谱图自动解析图谱 Automatically Interpret Spectra Charge state, adducts, isotopes 电荷价态加合离子同位素 confirm chromatographic co-elution 确证色谱峰的共流出阐明单同位素加合离子 Elucidate Monoisotopic Adduct Ion Add to Component List 添加到组分列表中 Quantitative comparison 定量比较图 4. 具有组分解析算法的 SIEVE 软件数据处理流程表 1. 大鼠禁食研究实验设计 4hr Fast 12hr Fast Controls - Fed Pooled QC 16hr Fast 组别雄性大鼠数量 n 禁食时间 * 1: 暗周期控制无禁食 2: 小时禁食 3: 小时禁食 4: 小时禁食 : 小时禁食 6: 小时禁食 * 大鼠在晚上 6: 到早上 6: 暗周期内禁食以获得摄食高峰时间图. LC-MS 负离子模式下大鼠血清数据的主成分分析 PCA

6 较大的生物差异 4,, 1,2,, 4,, 3,, Methionine 1,,, Proline 3,, 8,, 较小的技术性差异 2,, 2,, 1,, 1,,,, 6,, 4,, 2,, 14,, 2,, 12,, 1,, Arachidonic Acid 2,, Linoleoyl-Lyso-PC (18:2) 8,, 1,, 6,, 1,, 4,, 2,,,, 图 6. 禁食对代谢物变化影响的示例混合血清 QC 重复样中所有代谢物都具有优异的重现性因此不需要技术性重复样 3,, 2,, 负离子模式 2,, 1,, 1,,,, 1,, 9,, 8,, 7,, 6,,,, 4,, 3,, 2,, 1,, QC Blank DC 2h 4h 8h 12h 正离子模式分析时间相差 3 小时 QC Blank DC 2h 4h 8h 12h 图 7. 尽管实际 LC-MS 运行时, 正离子和负离子两种模式运行时间相隔 3 小时, 生物样品在两种模式下测定的尿酸结果完全一致

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.

液相色谱采用 Thermo Scientific TM Open Accela TM 12 UHPLC 系统和 Thermo Scientific TM Hypersil GOLD TM aq 色谱柱 (1 2.1 mm, 1.9 µm 粒径 ) 进行色谱分离 进样量为 3 µl 色谱条件如下: 数

液相色谱采用 Thermo Scientific TM Open Accela TM 12 UHPLC 系统和 Thermo Scientific TM Hypersil GOLD TM aq 色谱柱 (1 2.1 mm, 1.9 µm 粒径 ) 进行色谱分离进样量为 3 µl 色谱条件如下: 数