2. 实 验 部 分 2.1 样 品 采 集 与 制 备 色 谱 柱 : 流 动 相 : 流 速 : 柱 温 : 50 梯 度 : 大 豆 油 菜 籽 油 花 生 油 亚 麻 籽 油 等 十 余 种 不 同 种 类 的 常 见 食 用 植 物 油 样 品 购 自 各 地 超 市, 部 分 由 客 户

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1 Lipidome Profiling Based Foodomics Analysis with Q Exactive Mass Spectrometer For Classification of Different Edible Plant Oils Q Exactive 高 分 辨 质 谱 脂 质 轮 廓 谱 表 征 用 于 食 品 组 学 研 究 中 的 不 同 食 用 植 物 油 分 类 吴 泽 明 1 2, 王 秀 嫔 1. 赛 默 飞 世 尔 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司,201206, 上 海 2. 中 国 农 业 科 学 院 武 汉 油 料 作 物 研 究 所,430062, 武 汉 AN_C_LCMSMS_9_201507Y 1. 前 言 食 品 组 学 (Foodomics) 是 食 品 科 学 中 的 一 门 新 兴 学 科, 它 通 过 运 用 或 整 合 各 种 先 进 组 学 技 术 (-Omics) 来 研 究 食 品 与 营 养 学 中 的 相 关 科 学 问 题, 从 而 改 善 消 费 者 的 福 祉 与 健 康 [1] 按 照 研 究 目 的 与 对 象 体 系 的 不 同, 食 品 组 学 能 从 基 因 组 学 蛋 白 组 学 与 代 谢 组 学 等 不 同 组 学 角 度 实 施, 可 广 泛 应 用 于 食 品 产 地 溯 源 / 真 实 性 判 别 掺 杂 打 假 转 基 因 分 析 食 品 生 产 工 艺 优 化 等 领 域 [2] 代 谢 组 学 是 研 究 目 标 体 系 中 小 分 子 物 质 群 定 性 定 量 存 在 或 变 化 信 息 的 一 门 组 学, 它 与 食 品 组 学 存 在 着 天 然 直 接 的 关 联, 彼 此 融 通 利 用 代 谢 组 学 的 手 段 开 展 食 品 组 学 研 究, 能 描 绘 食 品 中 营 养 物 质 群 的 存 在 分 布 规 律, 揭 示 发 酵 烘 焙 等 生 产 工 艺 中 食 品 组 分 的 动 态 演 变 趋 势, 剖 析 食 品 风 格 风 味 的 微 观 化 学 物 质 基 础, 以 及 认 识 食 品 营 养 与 疾 病 间 的 关 联 关 系 等 等, 这 都 具 有 重 要 的 应 用 价 值 [3] 食 品 组 学 的 开 展 有 赖 于 大 数 据 的 高 效 表 征, 液 相 色 谱 - 高 分 辨 质 谱 技 术 以 其 准 确 灵 敏 等 技 术 优 势 成 为 了 食 品 组 学 研 究 最 为 重 要 的 表 征 技 术 手 段 之 一 本 文 利 用 Thermo Scientific TM Q Exactive TM 四 极 杆 - 静 电 场 轨 道 阱 高 分 辨 质 谱 与 相 关 组 学 信 息 处 理 软 件 产 品, 开 展 了 基 于 脂 质 轮 廓 谱 的 食 用 植 物 油 分 类 研 究, 可 为 名 贵 食 用 植 物 油 的 掺 杂 打 假 油 脂 的 功 能 营 养 学 研 究 提 供 新 的 思 路 图 1. 实 验 整 体 流 程 示 意 图

2 2. 实 验 部 分 2.1 样 品 采 集 与 制 备 色 谱 柱 : 流 动 相 : 流 速 : 柱 温 : 50 梯 度 : 大 豆 油 菜 籽 油 花 生 油 亚 麻 籽 油 等 十 余 种 不 同 种 类 的 常 见 食 用 植 物 油 样 品 购 自 各 地 超 市, 部 分 由 客 户 采 集 并 提 供 取 适 量 植 物 油 原 液, 用 乙 腈 - 异 丙 醇 混 合 溶 液 稀 释, 涡 旋 混 匀 后,15 恒 温 下 5,000 g 离 心 10 min, 取 上 清 液, 供 分 析 用 2.2 脂 质 轮 廓 谱 采 集 使 用 Thermo Scientific TM Dionex TM Ultimate TM 3000 超 高 效 液 相 色 谱 串 联 Thermo Scientific TM Q Exactive TM 高 分 辨 质 谱 采 集 脂 质 轮 廓 谱 色 谱 条 件 : 反 相 分 离, 二 元 洗 脱, 进 样 体 积 5 µl, 其 余 条 件 见 下 表 Thermo ScientificTM HypersilGOLD TM C18 柱 ( mm, 3 µm) 弱 洗 脱 相 A:10% H 2 O + 90% ACN + 10 mm 甲 酸 铵 + 0.1% 甲 酸 强 洗 脱 相 B:90% IPA + 10% ACN + 10 mm 甲 酸 铵 + 0.1% 甲 酸 350 µl/min 时 间 /min A% B% 质 谱 条 件 :Q Exactive 使 用 HESI Ⅱ 加 热 电 喷 雾 离 子 源, 正 离 子 模 式, 离 子 源 主 要 配 置 参 数 : 喷 雾 电 压 (spray voltage)3000 V, 毛 细 管 温 度 (capillary temp.)350, 气 化 温 度 (probe heater temp.)300, 鞘 气 流 速 (sheath gas) 40 arb, 辅 助 气 流 速 (aux gas)12 arb,s-lens level 55% 脂 质 轮 廓 谱 分 析 采 用 全 扫 描 模 式, 质 量 扫 描 范 围 m/z,70,000 FWHM 分 辨 率,AGC target 3e6,Maximum IT 200 ms 脂 质 分 子 结 构 鉴 定 采 用 Full scan-ddms2 模 式, 一 级 MS 分 辨 率 70,000 FWHM,MS2 分 辨 率 17,500 FWHM, AGC target - 1e5,maximum IT - 50 ms,isolation window m/z,nce - 30%,underfill ratio - 1%,Apex trigger - 3~6 s, dynamic exclusion time - 10 s,loop count (TopN) 组 学 数 据 处 理 SIEVE 软 件 分 析 : 全 扫 描 脂 质 轮 廓 谱 数 据 处 理, 包 括 色 谱 匹 配 校 正 质 谱 特 征 提 取 分 析 数 据 质 量 评 估, 使 用 Thermo Scientifc SIEVE TM 2.2 SP2 无 标 记 差 异 表 达 分 析 软 件 完 成 质 谱 信 号 特 征 提 取 使 用 Small molecule-component Exctraction 算 法, 主 要 参 数 设 定 为 :max RT shift min;background SN 50;Base peak minimum intensity - 5e6;RT peak isolation min;peak algorithm - PPD LipidSearch 软 件 分 析 :LipidSearch TM 是 Thermo Fisher Scientific 专 为 解 决 脂 质 组 学 高 通 量 数 据 分 析 中 各 种 科 学 问 题 而 研 发 的 软 件, 它 庞 大 的 谱 图 库 中 包 含 高 达 一 百 七 十 余 万 个 lipid species 的 MS2/MS3 预 测 谱 图, 软 件 搜 索 引 擎 可 通 过 实 测 谱 图 与 理 论 预 测 谱 图 间 的 匹 配, 实 现 自 动 化 的 脂 质 分 子 结 构 注 释 实 验 利 用 ProductSearch_QEX 检 索 模 式 对 Full scanddms2 数 据 进 行 分 析, 主 要 参 数 包 括 :precursor tolerance - 5 ppm;product tolerance - 10 ppm;intensity threshold - 1.0%; m-score threshold - 2.0;ID quality filter - A, B, C, D 主 成 分 分 析 (PCA,Principal Component Analysis) 与 聚 类 分 析 : 使 用 SIEVE 软 件 以 及 SIMCA-P 软 件 完 成 [4] 3. 结 果 与 讨 论 3.1 SIEVE 处 理 与 数 据 质 量 评 价 图 2 为 实 验 采 集 的 各 种 食 用 植 物 油 的 脂 质 轮 廓 图,Q Exactive 定 性 定 量 兼 得 的 Quanfirmation 分 析 力 与 稳 健 性 为 随 后 基 于 SIEVE 软 件 的 组 学 信 息 挖 掘 提 供 了 高 质 量 的 数 据 基 础 图 3A 展 示 了 SIEVE 软 件 的 色 谱 匹 配 效 果 同 时, 由 于 分 析 样 本 数 目 大, 实 验 采 用 Pooled Quality Control 策 略 进 行 分 析 性 能 质 控 结 果 如 图 3B, 在 SIEVE 完 成 的 PCA 分 析 3D 主 成 分 得 分 图 (score plot) 中, 所 有 的 质 控 样 本 均 紧 密 地 聚 集 分 布 在 3D 得 分 图 的 中 心, 显 示 Q Exactive 的 长 期 稳 健 性 表 现 出 色 如 图 4 所 示,SIEVE 软 件 可 利 用 Orbitrap TM 采 集 的 高 分 辨 准 确 质 谱 数 据 与 精 细 同 位 素 模 式 信 息, 通 过 软 件 内 嵌 的 加 合 离 子 数 据 库 与 色 谱 行 为 评 估 等 一 系 列 迭 代, 对 复 杂 的 质 谱 谱 图 进 行 自 动 解 卷 积, 将 源 自 于 同 一 代 谢 物 的 数 十 个 复 杂 质 谱 信 号 特 征 简 化 为 一 个 代 谢 组 分 (metabolic component), 从 而 大 大 改 善 模 式 识 别 数 据 矩 阵 的 信 息 纯 度 与 有 效 性

3 图 2. 实 验 采 集 的 六 种 常 见 食 用 植 物 油 的 脂 质 轮 廓 图 ( 自 上 而 下, 依 次 为 : 葵 花 籽 油 芝 麻 油 菜 籽 油 花 生 油 大 豆 油 与 亚 麻 籽 油 ) 图 3. (A) SIEVE 软 件 的 色 谱 匹 配 效 果 ;(B) SIEVE 软 件 PCA 分 析 用 于 分 析 数 据 质 量 控 制, 黄 色 阴 影 处 为 pooled QC 样 本 3.2 分 类 与 多 元 统 计 结 果 实 验 挑 选 6 种 最 为 常 见 的 食 用 植 物 油 进 行 深 度 的 多 元 统 计 分 析 图 5 为 对 SIEVE 软 件 获 得 的 脂 质 轮 廓 谱 数 据 矩 阵 进 行 聚 类 分 析 的 结 果, 可 见,6 种 食 用 植 物 油 样 品 按 照 各 自 的 植 物 基 源, 分 类 明 确

4 图 4. SIEVE 软件处理组学数据结果的数据浏览基本界面 图 5. 六种最常见食用植物油样本的聚类分析结果与热图

5 图 6. 六 种 常 见 植 物 油 样 本 PCA 分 析 的 得 分 图 (A) 与 载 荷 图 (B) 随 后, 为 进 一 步 明 晰 不 同 脂 质 分 子 在 脂 质 整 体 轮 廓 分 类 中 的 贡 献, 实 验 又 对 这 6 种 植 物 油 样 本 进 行 了 无 师 监 督 (unsupervised) 的 PCA 分 析 结 果 如 图 6A, 得 分 图 中 六 种 植 物 油 样 品 大 致 聚 集 为 4 大 类, 分 类 趋 势 与 聚 类 分 析 结 果 相 一 致 综 合 两 种 多 元 统 计 的 结 果, 可 推 知 花 生 油 菜 籽 油 与 芝 麻 油 三 者 之 间 的 脂 质 成 分 组 成 谱 征 间 具 有 更 高 的 类 似 性, 其 与 大 豆 油 葵 花 籽 油 与 亚 麻 籽 油 间 的 整 体 组 间 差 异 更 为 显 著 图 6B 载 荷 图 中 α β γ 区 域 内 的 变 量 对 得 分 图 中 的 聚 类 趋 势 具 有 较 高 的 贡 献 权 重 利 用 Q Exative sub-ppm 的 高 质 量 精 度 可 准 确 推 定 出 这 些 甘 油 三 酯 分 子 的 唯 一 元 素 组 成, 同 时 结 合 LipidSearch 软 件 的 自 动 谱 库 检 索 ( 图 7), 可 便 利 地 鉴 定 这 些 差 异 脂 质 的 分 子 结 构, 结 果 见 表 1 载 荷 图 中 α 域 内, 脂 肪 酸 酰 链 富 含 亚 油 酸 (Linoleic acid) 的 脂 质 分 子 在 大 豆 油 与 葵 花 籽 油 中 高 表 达 同 理 而 言, β 域 内 富 含 油 酸 (Oleic acid) 的 甘 油 三 酯 在 菜 籽 油 与 花 生 油 中 高 表 达, 而 γ 域 内 的 脂 质 分 子 具 有 高 度 的 不 饱 和 性, 亚 麻 酸 (Linolenic acid) 含 量 十 分 丰 富 位 居 于 PC1 方 向 中 心 位 置 处 的 芝 麻 油 中 油 酸 与 亚 油 酸 的 含 量 比 例 则 相 对 较 为 均 衡 实 验 分 别 选 取 上 述 三 类 中 的 两 个 典 型 脂 质 分 子 进 行 统 计 分 析, 结 果 见 图 8 聚 焦 食 品 与 健 康 间 的 关 联 是 当 今 食 品 科 学 领 域 的 重 要 趋 势, 鉴 于 油 酸 与 多 不 饱 和 脂 肪 酸 (PUFA) 亚 油 酸 亚 麻 酸 广 泛 而 具 有 差 异 的 生 物 功 能, 本 实 验 开 展 的 食 品 组 学 研 究 对 于 深 入 理 解 膳 食 中 不 同 植 物 油 的 功 能 营 养 提 供 了 新 的 工 具

6 图 7. LipidSearch 搜 库 鉴 定 脂 质 分 子 结 构 的 结 果 浏 览 界 面

7 表 1. 载 荷 图 中 显 著 差 异 脂 质 分 子 的 化 学 属 性 与 鉴 定 结 果 Domin Measured m/z Elemental composition ppm Ω Double bonds in acyl chains Lipid ID by LipidSearch α C 55 H 98 O TG(18:2/18:2/16:0) C 57 H 98 O TG(18:2/18:2/18:2) C 57 H 104 O TG(18:1/18:1/18:1) C 57 H 102 O TG(18:1/18:1/18:2) C 55 H 102 O TG(18:1/18:1/16:0) β C 57 H 106 O TG(18:1/18:1/18:0) C 59 H 106 O TG(18:1/18:2/20:1) C 59 H 108 O TG(18:2/18:0/20:1) C 59 H 108 O TG(18:1/18:1/20:1) C 57 H 92 O TG(18:3/18:3/18:3) γ C 57 H 94 O TG(18:3/18:3/18:2) C 57 H 96 O TG(18:3/18:3/18:1) C 55 H 94 O TG(18:3/18:3/16:0) : ions were ammonium adduct species. 图 8. PCA 载 荷 图 中 典 型 差 异 脂 质 分 子 在 各 种 植 物 油 间 的 表 达 量 柱 图 分 布

8 4. 总 结 Thermo Scientific Q Exactive 高 分 辨 准 确 质 谱 是 食 品 组 学 研 究 中 表 征 功 能 蛋 白 与 活 性 小 分 子 物 质 群 的 有 力 技 术 手 段 ; SIEVE 与 LipidSearch 软 件 为 食 品 组 学 中 小 分 子 组 学 研 究 的 信 息 处 理 提 供 了 高 效 的 解 决 方 案 致 谢 : 感 谢 中 国 农 科 院 武 汉 油 料 作 物 研 究 所 王 秀 嫔 博 士 在 样 品 采 集 上 的 大 力 帮 助 参 考 文 献 : [1] Cifuentes A (2009), J. Chromatogr. A, 1216 (43): 7109 [2] García-Cañas V (2012)Anal. Chem., 84 (23), pp [3] Antignac JP (2011), Trends Anal. Chem., 30, [4] Orbitrap 组 学 俱 乐 部 赛 默 飞 小 分 子 质 谱 应 用 技 术 群 赛 默 飞 世 尔 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司 全 国 服 务 热 线 : ( 支 持 手 机 用 户 ) AN_C_LCMSMS_9_201507Y

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