1346 水产学报 41 卷克蛋白 Y-box 编码基因在低温和低氧条件下的响应机制具有重要意义本实验采用 RACE (rapid amplification of cdna ends) 方法克隆了青虾肝胰腺中 Y-box 编码基因的全长 cdna, 并通过研究序列特征低温和低氧以及恢复

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卉筹苏
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1 第 41 卷第 9 期水产学报 Vol. 41, No 年 9 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Sept., 2017 文章编号 : (2017) DOI: /jfc 青虾冷休克蛋白 Y-box 编码基因的 cdna 全长克隆与表达分析孙盛明 1, 傅洪拓 1,2, 戈贤平 1,2, 朱健 1, 乔慧 1, 金舒博 1 1, 张文宜 (1. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 农业部淡水渔业与种质资源利用重点实验室, 江苏无锡 ; 2. 南京农业大学无锡渔业学院, 江苏无锡 ) 摘要 : 为研究冷休克蛋白 Y-box 基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用, 实验应用 RACE PCR 技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白 Y-box 基因全长 cdna 序列, 并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析 ; 采用实时荧光定量 PCR 技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析青虾冷休克蛋白 Y-box 基因 cdna 全长 1501 bp, 包括 84 bp 的 5 末端非翻译区 (UTR),876 bp 的开放阅读框 (ORF),541 bp 的 3 UTR, 开放阅读框编码 291 个氨基酸氨基酸相似度比对显示, 青虾冷休克蛋白 Y-box 基因富含高度保守的冷休克结构域系统进化树分析显示, 青虾冷休克蛋白 Y-box 基因与水蚤等节肢动物冷休克 Y-box 聚类一支, 具有最近的亲缘关系荧光定量 PCR 检测显示, 冷休克蛋白 Y-box 基因在青虾不同组织中均有表达, 其表达量在肝胰腺组织中最高, 使用荧光定量 PCR 检测青虾冷休克蛋白 Y-box 基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的 mrna 时空表达情况, 结果显示, 与对照组相比冷休克蛋白 Y-box 在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫 3,6 和 12 h 出现了显著上调, 而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著此外, 本实验对 Y-box 进行了原核表达, 为进一步研究 Y-box 基因的功能奠定了基础关键词 : 青虾 ; 冷休克蛋白 ; 低温 ; 低氧 ; 原核表达中图分类号 : Q 785;S 文献标志码 : A 冷休克蛋白是进化上保守的核苷酸结合蛋白, 其同源染色体作为冷休克蛋白结构域存在 Y-box 结合蛋白中无论是从细菌还是到人类, Y-box 结合蛋白都是一类在进化上高度保守的多功能蛋白, 主要包括 3 个区域的典型结构 : 高度保守的冷休克结构域能够识别特殊 RNA 发卡结构完成基因表达调控 C- 端尾域以及富含丙氨酸和脯氨酸的 N 末端结构域 [1] 它主要负责转录调节选择性剪接 DNA 修复翻译调控细胞增殖和再生等方面 [2-6] Y-box 结合蛋白在真核生物体内还能起到增加 mrna 稳定性的作用 [7], 并参与到适应低温的细胞过程 [8] 利用分子生物学技术已相继克隆了多个水生动物 Y-box 基因家族的成员, 如加州海兔 (Aplysia californica) [9] 红鳍东方鲀(Fugu rubripes) [10] 日本青鳉 (Oryzias latipes) [10] 日本七鳃鳗(Lampetra japonica) [11] 虹鳟(Oncorhynchus mykiss) [12] 红螯螯虾 (Cherax quadricarinatus) [13] 然而, 关于淡水虾类 Y-box 基因的克隆与表达分析尚未见相关报道青虾 (Macrobrachium nipponense) 是我国淡水养殖虾蟹品种之一, 具有重要的经济价值 [14-15], 青虾对环境应激的耐受程度较弱, 导致其无法实现高密度养殖, 而温度和溶解氧是直接影响水生动物生长的重要生态因子, 故研究青虾休收稿日期 : 修回日期 : 资助项目 : 国家自然科学基金 ( , ); 国家十二五科技支撑计划 (2012BAD25B07) 通信作者 : 傅洪拓, fuht@ffrc.cn

2 1346 水产学报 41 卷克蛋白 Y-box 编码基因在低温和低氧条件下的响应机制具有重要意义本实验采用 RACE (rapid amplification of cdna ends) 方法克隆了青虾肝胰腺中 Y-box 编码基因的全长 cdna, 并通过研究序列特征低温和低氧以及恢复刺激后时空表达模式, 不仅有利于更深入地探讨甲壳动物的环境应激响应机制, 而且为青虾抗逆育种提供理论依据 1 材料与方法 1.1 实验材料实验青虾来自太湖无锡湖区, 为野生青虾, 在实验室暂养 2 周后, 实验组和对照组各设 3 个平行重复, 养殖水槽规格为 80 cm 50 cm 50 cm, 每个水槽养殖 20 尾健康青虾平均体质量 [16] 为 (1.28±0.22) g, 参照陈超等文献方法, 实验组与对照组温度分别设置为 10 和 25 ; 参照 [17] 孙盛明等文献方法, 实验组与对照组溶解氧分别设置为 2.0 和 6.5 mg/l 两个胁迫实验取样时间均为 0,3,6,12 和 12h, 前 4 个取样时刻为胁迫阶段, 后 1 个时刻为恢复阶段挑选健康活泼的青虾个体且性腺发育良好, 用于血细胞脑肝胰腺鳃肠道肌肉精巢及卵巢的 RNA 提取 1.2 方法总 RNA 的提取及 cdna 第一链的合成取 100 mg 青虾血细胞脑肝胰腺鳃肠道肌肉精巢和卵巢组织用于提取总 RNA, 通过液氮研磨后用酚仿抽提法提取总 RNA, 然后使用 RNA-free DNaseI 纯化试剂盒进行纯化,RNA 浓度及纯度通过紫外分光光度计测定, 并使用琼脂糖凝胶电泳进行总 RNA 的完整性鉴定参照 TaKaRa cdna 第一链合成试剂盒说明书进行肝胰腺总 RNA 反转录, 保存在 80 C 冰箱, 以备克隆 Y-box 基因 cdna 全长序列参照 BIO-RAD 的 iscript cdna Synthesis Kit 第一链合成试剂盒说明书进行荧光定量 PCR 反应的 cdna 反转录, 以备检测 Y-box 基因在各组织的表达分布青虾 Y-box 的基因克隆各根据本实验室已构建的青虾肝胰腺 cdna 文库, 通过组装拼接和比对分析, 获得一个冷休克蛋白 Y-box 编码基因序列片段参照现有 cdna 序列片段, 应用 Primer 5.0 软件分别设计 5 RACE 和 3 RACE 的特异性扩增引物 ( 表 1), 以青虾肝胰腺 cdna 为模板, 结合套式 PCR 技术对冷休克蛋白 Y-box 编码基因 5 端和 3 端序列片段扩增 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后采取克隆测序分析序列分析应用 Contig Express 软件将中间序列 3 端序列 5 端序列拼接成全长 cdna 序列分别采用 BLAST ( gov/blast) 和蛋白质性质分析软件 ( expasy.org/) 分析 Y-box 编码基因序列及其推断的氨基酸序列 ; 在 NCBI 中用 BLASTP 程序检索氨基酸同源序列 ; 应用 Clustal X1.83 软件进行多序列比对, 然后应用 MAGE4.0 软件以邻接法 (Neighbour-Joining) 通过不同物种的 Y-box 编码基因氨基酸序列构建系统进化树青虾不同组织 Y-box 编码基因 mrna 的表达分析应用 BIO-RAD 的 iscript cdna Synthesis Kit 利用青虾不同组织的总 RNA 合成 cdna, 在 qrt-pcr 反应中作为模板根据获得的 Y-box 和 β-actin 基因全长 cdna 序列分别设计 2 对荧光定量特异引物 ( 表 1) 参照 BIO-RAD SsoFast EvaGreen Supermix 推荐反应条件, 进行两步 PCR 扩增, 即先进行 1 min 95 C 预变性, 接着连续进行 40 个循环, 其中包括 95 C 下 10 s 变性,60 C 下 30 s 延伸, 最后温度从 55 C 慢慢提升到 95 C, 并绘制熔解曲线样品每份进行 3 次重复, 熔解曲线使用 BIO-RAD iq5 自带实时分析软件分析, 实验数据采用 2 - Ct 法进行相对定量分析, 计量数据资料均用平均值 ± 标准误表示 [18], 并使用 SPSS 13.0 软件进行显著性分析, 用 Turkey 法进行多重比较分析 (P<0.05 为显著水平 ) 青虾肝胰腺组织应答低温和低氧胁迫以及分别恢复刺激后 Y-box 编码基因的表达分析在低温和低氧和 12 h 以及恢复刺激后 12 h, 处理组和对照组在各个取样时刻分别随机取 3 只青虾, 取肝胰腺保存于 80 C 用于提取 RNA, 再通过反转录获得 cdna 模板, 进行 RT-PCR 分析在 BIO-RAD iq5 中进行反应, 获得的肝胰腺组织 cdna 样品在每个取样时刻做 3 个荧光定量特异引物和内参基因 β-actin 基因重复实验数据进行 t 检验显著性分析, 若 P<0.05 则具有显著性差异 1.3 原核表达体系构建以成熟肽序列为模板设计 Y-box 的原核表达扩增引物, 在上游引物添加 EcoRⅠ 酶切位点, 下游引物添加 XhoⅠ 酶切位点普通 PCR 扩增

3 9 期孙盛明, 等 : 青虾冷休克蛋白 Y-box 编码基因的 cdna 全长克隆与表达分析 1347 引物 primer 表 1 基因克隆所用的引物及其序列 Tab. 1 Primers and their sequences used in this study 引物序列 primer sequence 长度 /bp length 引物用途 usage Y-box-GSP1 forward 5 -ACGTATTCGTCCACCAGAGC-3 20 Y-box 3 RACE Y-box-GSP2 forward 5 -GGCCGTGGTCCAAGAAGATT-3 20 Y-box-GSP1 reverse 5 -GAAGGTCCTCCCATCATGCC-3 20 Y-box 5 RACE Y-box-GSP2 reverse 5 -CAAAGAAGCGGCCACGATAG-3 20 QY-box forward 5 -TCGGTATTATCGCCGTGCTG-3 20 Y-box qpcr QY-box reverse 5 -CAAAGAAGCGGCCACGATAG-3 20 β-actin forward 5 -TATGCACTTCCTCATGCCAT-3 20 β-actin qpcr β-actin reverse 5 -AGGAGGCGGCAGTGGTCAT-3 19 后, 液体回收 DNA 片段, 将产物和 pgex-4t-1 载体同时用 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 双酶切 12 h, 琼脂糖凝胶电泳检测双酶切成功后, 将其纯化回收, 按照基因与载体体积比为 5 1 的比例, 在 T4 连接酶作用下,23 C 快速连接 30 min 后转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 中, 挑选阳性克隆测序验证载体构建成功后, 进行原核表达诱导, 以菌液与 LB 培养基体积比为 1 50 的比例, 在 180 r/min 摇床中培养, 当 OD 600 值为 0.6 时, 加入 IPTG 诱导剂诱导 4 h 后取出菌液, 超声波破碎,4 C r/min 离心 10 min, 分离上清液和沉淀,SDS-PAGE 检测其融合蛋白表达情况 2 结果与分析 2.1 青虾冷休克 Y-box 基因全长 cdna 克隆根据 Contig Express 软件拼接结果可得,Ybox 基因 cdna 全长序列为 1501 bp, 其中 5 末端非翻译区为 84 bp, 开放阅读框为 876 bp,3 UTR 为 541 bp,3 UTR 中带有加尾信号 AATAAA 和 Poly (A) 尾 ( 图 1), 共编码 291 个氨基酸 ( 图 1) 理论蛋白相对分子量为 ku, 等电点 (pi) 约为通过 Signal P 软件对青虾的 Y-box 氨基酸序列进行预测, 发现其信号肽不存在, 因此推测 Y-box 不是分泌性蛋白类 Y-box 结合蛋白含有氨基酸 C 末端结构域 N 末端结构域和冷休克结构域 (cold shock domain, CSD), 其中 CSD 是高度保守结合域并含有 68 个氨基酸, 具体功能是与损伤 DNA 和非特异性 DNA 结合冷休克 Y-box 基因 cdna 序列已经提交到 GenBank, 登录号为 KF 冷休克 Y-box 基因的同源性分析分析结果显示, 青虾 Y-box 基因的氨基酸序列与红鳌鳌虾 (AFI74356) 同源性最高应用在线分析软件 ClustalW 1.83 比对青虾 Y-box 基因编码的氨基酸序列与水蚤 (EFX88831) 虹鳟(ACL31579) 和果蝇 (AAC06034) 的氨基酸序列, 结果显示 Y-box 基因氨基酸序列中含有保守的冷休克区, 该区域中有 RNP-1(GYGFINR) 和 RNP-2(EDVFVHQS) 两个 RNA 结合基序, 这两个基序与其转录调控功能联系密切 ( 图 2) 2.3 冷休克 Y-box 基因的系统进化树分析根据青虾冷休克 Y-box 基因和其他甲壳动物 Y-box 基因的氨基酸序列进行系统进化树构建 ( 图 3), 发现青虾 Y-box 基因与水蚤的该基因蛋白亲缘关系最近, 同时与其他无脊椎类聚为一支, 说明冷休克 Y-box 基因在进化过程中相对保守 2.4 青虾冷休克 Y-box 基因在不同组织内的表达分析应用荧光定量 PCR 技术分析青虾体内不同组织中 Y-box 基因的表达情况结果发现, 青虾 Y-box 基因在所有被检测组织中均有表达, 其中在肝胰腺中表达量最高, 其次为脑血细胞鳃肠道卵巢精巢肌肉 ( 图 4) 2.5 青虾冷休克 Y-box 基因应答环境胁迫和分别恢复刺激后不同时刻的表达规律应用实时荧光定量 PCR 方法分析环境胁迫和恢复刺激后各个时刻青虾肝胰腺中 Y-box 基因的表达规律在低温胁迫后 3 h,y-box 基因表达量

4 1348 水产学报 41 卷图 1 青虾 Y-box 基因 cdna 全长序列及推导的氨基酸序列黑色方框内为起始密码子 ATG, 终止密码子 TAA, 灰色阴影区域为冷休克区 (CSD 区 ), 下划线标出的为 polya 加尾信号 AATAA Fig. 1 Full-length cdna of M. nipponense Y-box and the deduced amino acid sequence Black panes indicate the start codon (ATG) and the stop codon (TAA), CSD is shaded by gray. The polya special sequences AATAA is underlined 显著升高 (P<0.05); 随后在 6 和 12 h 时 Y-box 基因表达迅速达到峰值在低温胁迫恢复后 12 h,ybox 基因表达量与对照组基本一致 (P<0.05)( 图 5) 在低氧胁迫后 12 h,y-box 基因表达量与对照组相比显著升高 (P<0.05), 在低氧胁迫恢复后 12 h, Y-box 基因表达量与对照组基本一致 (P<0.05)( 图 6)

9期孙盛明等青虾冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA全长克隆与表达分析 1349 图2 青虾Y-box基因与其他物种Y-box基因的多序列比对结果红色框内为包含68个氨基酸残基的保守的CSD 基序RNP-1(GYGFINR)和RNP-2(EDVFVHQT)用阴影标出 Fig. 2 Multi-sequence alignment of M.

5 9期孙盛明等青虾冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA全长克隆与表达分析 1349 图2 青虾Y-box基因与其他物种Y-box基因的多序列比对结果红色框内为包含68个氨基酸残基的保守的CSD 基序RNP-1(GYGFINR)和RNP-2(EDVFVHQT)用阴影标出 Fig. 2 Multi-sequence alignment of M. nipponense Y-box with Y-box from other species The 68 amino acid residues of the cold-shock domain are red boxed, the motifs of RNP-1 and RNP-2 are marked by shadow 2.6 青虾冷休克Y-box的纯化 13 ku 因此Y-box融合蛋白大小约为44 ku 与图冷休克 Y-box基因的原核表达用 EcoRⅠ 和中条带位置基本一致不同温度对融合蛋白的 XhoⅠ同时双酶切pET28 b载体质粒和目的片段表达影响较大融合蛋白以包涵体的形式存在琼脂糖凝胶可检测是否酶切完全在T4连接酶于沉淀中(图7) 作用下将目的片段连接并转化到大肠杆菌 BL21(DE3)表达载体中测序结果显示正确构建 3 讨论了重组质粒Y-box-pET28 b 在20 C和37 C 180 甲壳动物 Y-box基因的相关研究还十分缺 r/min的条件下当菌液OD600值达到0.6时加入乏也很少从Y-box基因在应答环境胁迫过程中 0.5 mmol /L IPTG诱导剂诱导 4 h 离心收集菌发挥的功能方面进行探讨本实验获得青虾 Y- 体并用超声波破碎分离上清液和沉淀用 box基因cdna全长1, 501 bp 其中5 非编码区为 12% SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况冷休克 84 bp 3 非编码区为76 bp 开放阅读框为541 bp Y-box成熟肽大小为31 ku GST标签蛋白大小约可编码291个氨基酸氨基酸序列比对发现本

6 1350 水产学报 41 卷 Gallus gallus 图 3 青虾 Y-box 基因与其他物种 Y-box 基因的系统进化树 Fig. 3 Phylogenetic tree based on Y-box amino acid sequences from other species relative mrna expression tissue relative mrna expression normal temperature low temperature time 图 4 qrt-pcr 方法检测冷休克 Y-box 基因在青虾不同组织内的表达 1. 肌肉 ;2. 精巢 ;3. 卵巢 ;4. 肠道 ;5. 鳃 ;6. 血细胞 ;7. 脑 ; 8. 肝胰腺 Fig. 4 Expression of Y-box mrna in M. nipponense among different tissues by qrt-pcr 1. muscle;2. testis;3. ovary;4. intestine;5. gill;6. haemocytes; 7. brain;8. hepatopancreas 实验中获得的青虾 Y-box 基因含有 CSD 区域, 此区域与其他动物的氨基酸序列相似性都在 90% 以上, 说明青虾冷休克结构域在进化上相对保守冷休克 Y-box 系统发育树分析表明青虾与甲壳动物水蚤聚为一支, 且与昆虫等节肢动物聚为一支, 这也基本上与传统的动物系统发生分图 5 低温和恢复刺激后青虾肝胰腺中 Y-box 基因 mrna 的表达量变化 1. 低温 0 h;2. 低温 3 h;3. 低温 6 h;4. 低温 12 h;5. 低温恢复 12 h Fig. 5 Temporal expression of Y-box mrna in M. nipponense hepatopancreas in response to environmental low temperature and recovery 1. low temperature 0 h;2. low temperature 3 h;3. low temperature 6 h;4. low temperature 12 h;5. low temperature recoveay12 h 类次序相吻合本实验结果表明, 青虾 Y-box 基因的表达具有组织特异性, 肝胰腺和脑表达量较高, 与红鳌鳌虾的研究结果类似 [13] 此外, 与内分泌相关的组织如青虾脑卵巢和精巢中 Y- box 蛋白均有较高表达, 结果表明在冷休克蛋白

9 期孙盛明, 等 : 青虾冷休克蛋白 Y-box 编码基因的 cdna 全长克隆与表达分析 1351 relative mrna expression 6 5 4 3 2 1 0 control hypoxia 1 2 的功能表达和信息传递过程中内分泌系统可能扮演着重要角色考虑到甲壳动物具有开放性 3 4 5 time 图 6 低氧和恢复刺激后青虾肝胰腺中 Y-box 基因 mrna

hypoxia 0 h;2. hypoxia 3 h;3. hypoxia 6 h;4. hypoxia 12 h; 5. recovery 12 h ku 116 66 45 35 25 18 14 图 7 M 1 2 3 4 5 SDS-PAGE 检测不同温度对 Y-box 重组蛋白表达的影响 M. 分子量,1. 诱导前菌液,2. 20 C 诱导表达菌液,3. 37 C 诱导表达菌液,4.

1 represent without induction, 2 represent induced expression for supernatant at 20 C, 3 represent induced expression supernatant at 37 C, 4 represent induced expression for precipitate at 20 C, 5

7 9 期孙盛明, 等 : 青虾冷休克蛋白 Y-box 编码基因的 cdna 全长克隆与表达分析 1351 relative mrna expression control hypoxia 1 2 的功能表达和信息传递过程中内分泌系统可能扮演着重要角色考虑到甲壳动物具有开放性 time 图 6 低氧和恢复刺激后青虾肝胰腺中 Y-box 基因 mrna 的表达量变化 1. 低氧 0 h;2. 低氧 3 h;3. 低氧 6 h;4. 低氧 12 h;5. 低氧恢复 12 h Fig. 6 Temporal expression of Y-box mrna in M. nipponense hepatopancreas in response to environmental hypoxia and recovery 1. hypoxia 0 h;2. hypoxia 3 h;3. hypoxia 6 h;4. hypoxia 12 h; 5. recovery 12 h ku 图 7 M SDS-PAGE 检测不同温度对 Y-box 重组蛋白表达的影响 M. 分子量,1. 诱导前菌液,2. 20 C 诱导表达菌液,3. 37 C 诱导表达菌液,4. 20 C 诱导表达沉淀,5. 37 C 诱导表达沉淀 Fig. 7 Effects of temperature on expression of Y-box recombinant proteins M represent protein molecular standard. 1 represent without induction, 2 represent induced expression for supernatant at 20 C, 3 represent induced expression supernatant at 37 C, 4 represent induced expression for precipitate at 20 C, 5 represent induced expression for precipitate at 37 C 循环系统, 本实验推测血淋巴是负责运输 Y-box 蛋白到其他组织的重要器官已有研究表明, 多种环境压力能够诱导 Y- box 基因表达量升高, 如免疫刺激 [19] [20] DNA 损伤 [21] 和低氧等在膜受体信号向细胞内转导过程中 Ras/MAPK 通路和 PI3K/ 丝苏氨酸蛋白激酶 (Akt) 通路尤为重要, 它们调控着细胞包括生长凋亡及一些重要基因的表达, 而 Y-box 基因具有丝氨酸磷酸化位点并在上述通路中发挥重要作用 [22], 因此, 无脊椎动物的 Y-box 并不像细菌中的冷应激蛋白那样只在冷应激下大量表达 [23] 本研究表明低温胁迫下青虾 Y-box 基因显著升高, 这与在脊椎动物民猪的研究结果不一致 [24], 其原因可能是当民猪长期处在低温应激环境中时, 低温抑制了 Y-box 基因的转录和翻译调控反应, 因此自身的转录水平有所下降, 据此推测青虾在短期低温胁迫时,Y-box 基因类似于热休克蛋白分子的分子伴侣, 能提高生物体应对恶劣环境的耐受性, 及时修正 mrna 的折叠错误, 使得处于低温应激下的细胞能够正常翻译, 然而其在细胞中的具体功能及作用机制尚不清楚本研究也发现青虾在低氧胁迫下, 其肝胰腺中 Y-box 基因显著升高, 这与本实验室前期急性与慢性低氧胁迫下青虾肝胰腺组织高通量测序结果相吻合 [25-26], 此前已经在哺乳动物 Y-box 基因启动子序列中发现含有缺氧反应元件 [21], 推测缺氧诱导因子通过激活 Y-box 基因来促使机体产生一系列缺氧适应性反应, 本课题组后续的研究将克隆 Y-box 基因启动子序列并分析其转录活性本实验还构建了 Y-box 的原核表达系统, 因为生物体内的天然抗冻蛋白含量低, 提纯过程繁琐得率低, 人工合成的成本高且效果差, 因此, 近年来主要通过基因工程技术在宿主细胞内进行抗冻基因表达, 以期获得相应蛋白, 为实现大规模生产提供理论基础本实验表明大肠杆菌表达系统则成为表达 Y-box 蛋白的首选, 且操作简单本实验构建了冷休克 Y-box 的原核表达体系, 为进一步制备冷休克 Y-box 多克隆抗体, 在蛋白水平验证 Y-box 基因环境胁迫响应的表达模式奠定了基础综上所述, 本实验系统分析了 Y-box 基因的结构特点组织表达特征以及低氧和低温胁迫后该基因的表达量变化模式 ; 并构建了 Y-box 的原核表达系统, 为研究其应答环境胁迫的调控机制奠定基础

8 1352 水产学报 41 卷参考文献 : [ 1 ] Graumann P L, Marahiel M A. A superfamily of proteins that contain the cold-shock domain[j]. Trends in Biochemical Sciences, 1998, 23(8): [ 2 ] Matsumoto K, Wolffe A P. Gene regulation by Y-box proteins: Coupling control of transcription and translation[j]. Trends in Cell Biology, 1998, 8(8): [ 3 ] Bouvet P, Wolffe A P. A role for transcription and FRGY2 in masking maternal mrna within Xenopus oocytes[j]. Cell, 1994, 77(6): [ 4 ] Chang B E, Lin C Y, Kuo C M. Molecular cloning of a cold-shock domain protein, zfy1, in zebrafish embryo[j]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Protein Structure and Molecular Enzymology, 1999, 1433(1-2): [ 5 ] Karlson D, Nakaminami K, Toyomasu T, et al. A coldregulated nucleic acid-binding protein of winter wheat shares a domain with bacterial cold shock proteins[j]. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(38): [ 6 ] Valadão A F, Fantappie M R, LoVerde P T, et al. Y-box binding protein from Schistosoma mansoni: Interaction with DNA and RNA[J]. Molecular and Biochemical Parasitology, 2002, 125(1-2): [ 7 ] Philippe B, Matsumoto K, Wolffe A P. Sequence- Specific RNA recognition by the Xenopus Y-box Proteins: An essential role for the cold shock domain[j]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(47): [ 8 ] Moss E G, Lee R C, Ambros V. The cold shock domain protein LIN-28 controls developmental timing in C. elegans and is regulated by the lin-4 RNA[J]. Cell, 1997, 88(5): [ 9 ] Skehel P A, Bartsch D. Characterization of a Y-box factor from Aplysia californica[j]. Gene, 1994, 145(2): [10] Zend-Ajusch E, Hornung U, Burgtorf C. Isolation and characterization of cold-shock domain protein genes, Oryzias latipes Y-box protein 2 (OlaYP2) and Fugu rubripes Y-box protein 1 (FruYP1), in medakafish and pufferfish[j]. Gene, 2002, 296(1-2): [11] 金萍, 张玮玮, 黄惠芳, 等. 日本七鳃鳗 (Lampetra japonica)lyb 基因的克隆与分析 [J]. 遗传, 2008, 30(12): [12] [13] [14] [15] [16] Jin P, Zhang W W, Huang H F, et al. Cloning and analysis of Lyb gene from Lampetra japonica[j]. Hereditas, 2008, 30(12): (in Chinese). 王家庆, 张丽丽, 马爽, 等. 虹鳟冷休克蛋白 Y-box 基因的 cdna 全长克隆与序列分析 [J]. 南京农业大学学报, 2014, 37(2): Wang J Q, Zhang L L, Ma S, et al. The cloning and sequence analysis of Y-box gene full-length cdna derived from Oncorhynchus mykiss[j]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2014, 37(2): (in Chinese). 孟庆国, 陈静, 黄艳青, 等. 红螯螯虾冷休克蛋白 Y- box 编码基因的克隆及表达分析 [J]. 淡水渔业, 2012, 42(6): Meng Q G, Chen J, Huang Y Q, et al. Molecular cloning and expression analysis of the cold shock protein Y-box coding gene of red claw crayfish, Cherax quadricarinatus[j]. Freshwater Fisheries, 2012, 42(6): 14-20(in Chinese). 张响, 乔慧, 傅洪拓, 等. 青虾 (Macrobrachium nipponense)kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制因子基因全长 cdna 的克隆及表达 [J]. 海洋与湖沼, 2012, 43(6): Zhang X, Qiao H, Fu H T, et al. The full length cdna cloning and expression analysis of kazal-type serine proteinase inhibitor gene from Macrobrachium nipponense[j]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2012, 43(6): (in Chinese). 金舒博, 王宁, 乔慧, 等. 青虾高血糖激素基因全长 cdna 序列的克隆及表达分析 [J]. 中国水产科学, 2013, 20(1): Jin S B, Wang N, Qiao H, et al. Molecular cloning and expression of a full length cdna encoding crustacean hyperglycemic hormone (CHH) in oriental river pawn (Macrobrachium nipponense)[j]. Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(1): 82-92(in Chinese). 陈超, 施兆鸿, 薛宝贵, 等. 低温胁迫对七带石斑鱼幼鱼血清生化指标的影响 [J]. 水产学报, 2012, 36(8): Chen C, Shi Z H, Xue B G, et al. Influence of lowtemperature stress on serum biochemical parameters in juvenile Epinephelus septemfasciatus[j]. Journal of Fisheries of China, 2012, 36(8): (in Chinese).

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10 1354 水产学报 41 卷 Molecular cloning and expression analysis of cold shock protein Y-box gene from oriental river pawn (Macrobrachium nipponense) SUN Shengming 1, FU Hongtuo 1,2, GE Xianping 1,2, ZHU Jian 1, QIAO Hui 1, JIN Shubo 1, ZHANG Wenyi 1 (1. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi , China; 2. Wuxi Fishery College, Nanjing Agricultural University, Wuxi , China) Abstract: The Y-box protein family is highly conserved nucleic acid binding proteins which are conserved from bacteria to human. In this study, the cdna encoding cold shock protein Y-box from oriental river pawn Macrobrachium nipponense (MnY-box) was cloned by using EST analysis and rapid amplification of cdna ends (RACE) approach. The full length cdna of MnY-box was 1501 bp, consisting of a 5 untranslated region of 84 bp, a 3 untranslated region of 541 bp, and an open reading frame of 876 bp. The deduced protein had 291 amino acid residues with molecular mass of kda. Based on the protein similarity comparison, the Y-box protein family was very conservative in CSD domain. Phylogenetic tree analysis stated that oriental river prawn has the closest relationship with Daphnia pulex. Quantitative real-time RT-PCR analysis showed that the MnY-box gene was expressed in haemocytes, hepatopancreas, muscles, gill, brain, testis, ovary and intestines with the highest level of expression in the hepatopancreas. After environmental low temperature and recovery challenge, the relative expression level of MnY-box in hepatopancreas was significantly higher compared to the control group at 3 h to 12 h post-low temperature, followed by return to control levels at recovery 12 h. What s more, we constructed prokaryotic expression system and obtained the recombinant proteins of M. nipponense Y-box, which may provide information for further functional study. Key words: Macrobrachium nipponense; cold shock protein; low temperature; hypoxia; prokaryotic expression Corresponding author: FU Hongtuo. fuht@ffrc.cn Funding projects: National Natural Science Foundation of China ( , ); National Twelfth Five- Year Plan for Science & Technology Support (2012BAD25B07)

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

1346 水产学报 41 卷 克蛋白 Y-box 编码基因在低温和低氧条件下的响 应机制具有重要意义 本实验采用 RACE (rapid amplification of cdna ends) 方法克隆了青虾肝胰腺中 Y-box 编码 基因的全长 cdna, 并通过研究序列特征 低温 和低氧以及恢复

1346 水产学报 41 卷克蛋白 Y-box 编码基因在低温和低氧条件下的响应机制具有重要意义本实验采用 RACE (rapid amplification of cdna ends) 方法克隆了青虾肝胰腺中 Y-box 编码基因的全长 cdna, 并通过研究序列特征低温和低氧以及恢复