2017医学版第1期分

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1 第 43 卷第 1 期 2017 年 2 月 Journal of Lanzhou University(Medical Sciences) Vol.43 No.1 Feb 文章编号 : (2017) JAK2/STAT3 信号通路在羟考酮预处理预防心肌缺血再灌注损伤中的作用 刘永强, 冷玉芳, 叶元梅, 马晓丽 兰州大学第一医院麻醉科, 甘肃兰州 摘要 : 目的研究 Janus 激酶 2 (JAK2) 信号转导因子和转录活化因子 3 (STAT3) 信号通路的激活在羟考酮预处理预防 心肌缺血再灌注损伤中的作用 方法健康雄性 SD 大鼠 48 只, 体重 g, 采用随机数字表法分为 4 组 : 假手术组 (S 组 ) 心肌缺血再灌注损伤组 ( ) 羟考酮预处理组 ( ) JAK2/STAT3 信号通路阻滞剂 AG490 组 (OA 组 ), 每组 只 结扎左冠状动脉前降支 30 min, 再灌注 0 min, 制备心肌缺血再灌注损伤模型, 持续记录 Ⅱ 导 联心电图 ;和 分别于结扎前 5 min 通过颈内静脉注射羟考酮 0.5 mg/kg,于羟考酮注射前 30 min 腹腔注 射 AG490 3 mg/kg 再灌注 0 min, 心脏采血 4 ml, 测定血清肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 和肌钙蛋白 (ctni) 浓度 ; 快速处死大鼠, 取下心肌组织, 采用 2, 3, 5- 三苯基氯化四氮唑染色法测定心肌梗死面积 ; 免疫组化法检测 Bax Bcl-2 蛋白在心肌组织中的表达, 计算 Bcl-2/Bax 比值, 评估心肌细胞凋亡率 结果与 S 组比较, 和 血清 CK-MB ctni 浓度升高, 心肌梗死面积明显增大, 心肌 Bcl-2 和 Bax 表达均上调,Bcl-2/Bax 比值下降 ( 均 P < 0.05); 与 比较,和 血清 CK-MB ctni 浓度下降, 心肌梗死面积明显减小, 心肌 Bcl-2 表达上调,Bax 表达下 调,Bcl-2/Bax 比值升高 ( 均 P < 0.05); 与 比较,血清 CK-MB ctni 活性均升高, 心肌梗死面积明显增大, 心肌 Bcl-2 表达下调,Bax 表达上调,Bcl-2/Bax 比值降低 ( 均 P < 0.05) 结论羟考酮预处理可通过激活 JAK2/STAT3 信 号通路, 降低心肌在发生缺血再灌注损伤时细胞的凋亡, 从而减轻心肌组织的损伤 关键词 :JAK2/STAT3 信号通路 ; 羟考酮 ; 心肌缺血再灌注损伤 ; 细胞凋亡 中图分类号 :R542.2 文献标识码 :A doi: /j.issn Role of Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway in attenuation of myocardial ischemia-reperfusion injury by oxycodone pretreatment in rats Liu Yong-qiang, Leng Yu-fang, Ye Yuan-mei, Ma Xiao-li Department of Anesthesiology, First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou , China Abstract:Objective To evaluate the role of Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 (JAK2/STAT3) signaling pathway in the attenuation of myocardial ischemia-reperfusion (I/R) injury by oxycodone pretreatment in rats. Methods Forty-eight male SD rats, weighing g, were randomly allocated into 4 groups (each of ): sham operation (group S); group I/R; oxycodone pretreatment group (group OP); AG490 group (group OA). Taking the left anterior descending coronary artery for ligation of 30 min, and 收稿日期 : 作者简介 : 冷玉芳, 女, 博士, 主任医师, 研究方向为神经病理性疼痛和器官保护, lengyf@lzu.edu.cn, 通信联系人

2 第 1 期刘永强, 等 :JAK2/STAT3 信号通路在羟考酮预处理预防心肌缺血再灌注损伤中的作用 27 reperfusion of 0 min, to prepare for the myocardial ischemia-reperfusion injury model. Continuous recording of Ⅱ lead electrocardiogram (ecg). At 5 min before ligation via the internal jugular vein injection of oxycodone 0.5 mg/kg and at 30 min before oxycodone injection, AG490 3 mg/kg was injected intraperitoneally in group OPA. Blood samples were taken from the heart at 0 min of reperfusion for measurement of serum creatine kinase isoenzyme (CK- MB) and troponin (ctni) activities. Myocardial infarct size was then measured by TTC staining method. The left ventricular myocardial tissues were obtained for histopathologic examination and for determination of the expression of Bax and Bcl-2 in myocardial tissues (immunohistochemically). Results Compared with group S, the serum CK-MB and ctni concentrations were significantly increased, myocardial infarction area increased, and the expression of Bax and Bcl-2 in myocardial tissues was up-regulated; the ratio of Bcl-2 / Bax was reduced in I/R group, OP group and OA group. Compared with group I/R, the serum CK-MB and ctni concentrations decreased, myocardial infarction area decreased, and the expression of Bax was down-regulated; Bcl-2 was up-regulated and the ratio of Bcl-2 / Bax was increased in myocardial tissues in OP group and OA group. Compared with group OP, the serum CK-MB and ctni concentrations were increased, myocardial infarction area increased, and the expression of Bcl- 2 was down- regulated; Bax was up-regulated and the ratio of Bcl-2 / Bax was reduced in OA group. Conclusion JAK2/STAT3 signaling pathway is involved in the attenuation of myocardial I/R injury by oxycodone pretreatment in rats. Keywords: Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3; oxycodone; myocardial ischemiareperfusion injury; cell apoptosis 随着静脉溶栓 冠状动脉旁路移植术 经皮 冠状动脉介入术等治疗技术在临床中的应用, 冠 心病 急性心肌梗死患者的症状及近期 远期预 后得到了很好的改善, 但由此引发的心肌缺血再 灌注损伤, 是其严重的并发症之一 [1] 本课题组 前期研究结果表明, 羟考酮预处理可减少心肌细 胞凋亡, 降低心肌缺血再灌注损伤 [2], 但其机制 有待于进一步研究 有研究表明, 在心肌细胞发 生缺血再灌注时,Janus 激酶 2 (janus kinase 2, JAK2) 信号转导因子和转录活化因子 3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3) 信号通路激活与心肌细胞凋亡的发生密切相 关 [3] 本研究旨在探讨 JAK2/STAT3 信号通路在羟 考酮预先给药预防心肌缺血再灌注损伤中的作用 1 材料与方法 1.1 实验动物 健康雄性 SD 大鼠 48 只, 体重 g, 由甘肃中医药大学实验动物中心提供 实验过程 中对动物的处置方法符合中华人民共和国科学技 术部 200 年颁布的 关于善待实验动物的指导性 意见 的相关要求 1.2 试剂及仪器 盐酸羟考酮注射液 ( 批号 :BB092, 英国 Hamol 公司 ),AG490 (CAS NO: , 美国 MCE 公司 ), 超敏两步法免疫组化试剂盒 2, 3, 5- 三苯基氯化四氮唑溶液 ( 武汉博士德生物工程有限公司 ), 二氨基联苯胺 ( 北京中杉金桥生物技术有限公司 ),BL-420S 生物机能实验系统 ( 型号 :ML408, 美国 AD Instruments 公司 ),HX- 100E 小动物呼吸机 ( 成都泰盟科技有限公司 ), Modular PPI 全自动生化分析仪 ( 瑞士 Roche 公司 ),Image-Pro Plus.0 图像分析软件 ( 美国 Media Cybemetics 公司 ) 1.3 动物模型制作采用随机数字表法将大鼠分为 4 组 : 假手术组 (S 组 ) 心肌缺血再灌注损伤组 ( ) 羟考酮预处理组 ( ),JAK2/STAT3 信号通路阻滞剂 AG490 组 ( ), 每组 只 术前禁食 h, 可自由进水 根据文献 [2,4 5] 介绍的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型 腹腔注射 10% 水合氯醛 3 ml/ kg 进行麻醉后, 固定于鼠架台, 右前肢和左右后肢分别插入电极针, 连接 BL-420S 生物机能实验系统, 记录 Ⅱ 导联心电图 备皮, 切开气管, 置入气管导管, 固定 连接 HX-100E 小动物呼吸机, 正压通气, 呼吸频率 0 80 次 /min, 潮气量 20 ml/kg, 呼吸比为 2 1, 气道压为 5 kpa 分离颈内静脉和颈总动脉, 置管, 固定备用 于

3 28 第 43 卷 第 4 5 肋间做一横行切口, 充分结扎胸骨旁动脉, 打开胸腔, 剥离心包膜, 暴露心脏 用 5 0 慕丝线于左心耳下方 2 mm 处进针穿过心脏表层, 深度约为 1.5 mm, 待心电图稳定后, 结扎血管 心电图出现 S-T 段弓背形抬高或 T 波升高, 结扎线以下的心肌组织呈现紫绀或者出现苍白色, 说明缺血成功 缺血 30 min, 松开结扎线, 抬高的 S-T 段明显降低, 心肌颜色逐渐复转为淡红色, 表明再灌注成功 于结扎前 5 min 通过颈内静脉注射羟考酮 0.5 mg 于结扎前 5 min 通过颈内静脉注射羟考酮 0.5 mg, 并在羟考酮注射前 30 min 腹腔注射 AG490 3 mg 1.4 指标检测 血清肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 和肌钙蛋白 I (ctni) 浓度测定再灌注 0 min 结束后, 心脏采血 5 ml, 离心 (10 min,3 000 r/min,4 C), 取血清置于 -20 C 冰箱冻存 采用 Modular PPI 全自动生化分析仪检测 CK-MB 和 ctni 的浓度 心肌梗死面积的测定每组随机抽取 只大鼠, 再次结扎左冠状动脉, 从主动脉内注入 5% 伊文氏蓝 1 ml, 以大鼠嘴唇变为蓝色为指标 处死, 取出心脏, 置于 0.9% 生理盐水中洗净, 分离左心室, 滤纸吸干, 置入 -20 C 冰箱冻存 15 min 取出, 将结扎线以下的心肌组织平行于房室沟方向切成 4 5 片, 厚约 2 mm 心肌组织置于 1% 2, 3, 5- 三苯基氯化四氮唑溶液 (1 磷酸盐缓冲溶液,pH 7.4,37 C) 中,37 C 孵育 20 min, 翻动心肌组织, 将其均匀染色 选择染色成功的心肌切片置于 10% 甲醛溶液中固定 15 min, 拍照, 红色为危险区, 白色为梗死区 应用 Image-Pro Plus.0 图像分析软件测量危险区和梗死区的面积, 计算心肌梗死面积 [ 梗死区面积 切片厚度 / ( 危险区面积 切片厚度 ) 100%] 免疫组化检测快速处死每组其余 只大鼠, 取出心脏, 游离左心室, 将左心室置于 4% 甲醛溶液中固定, 包埋, 切片, 常规脱蜡至水, 抗原热修复处理, 滴加封闭液, 室温 10 C 按超敏两步法免疫组化试剂盒说明书进行染色, 滴加兔抗大鼠 Bcl-2 Bax 多克隆抗体 ( 稀释度 1 100),4 C 孵育过夜, 0.01 mol/l 磷酸盐缓冲溶液洗 3 次, 每次 2 min 滴加聚合辣根过氧化物酶 IgG, 37 C 孵育 30 min, 磷酸盐缓冲溶液冲洗 3 次, 每次 2 min; 二 氨基联苯胺显色 ; 苏木素复染, 脱水, 透明, 封 片 细胞核呈棕黄色为阳性 随机选 4 个互不重 叠的视野拍照, 采用 Image-Pro Plus.0 图像分析 软件, 计算 Bax Bcl-2 蛋白表达的光密度 (OD) 值, 并计算二者的比值 1.5 统计学处理 采用 SPSS 21.0 统计学软件进行分析, 计量资 料以均数 ± 标准差 ( xˉ ±s) 表示, 组间比较采用单 因素方差分析,P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 大鼠再灌注 0 min 血清 CK-MB 和 ctni 活性 与 S 组比较, 和 血清 CK- MB ctni 活性明显升高 (P < 0.05); 与 比 较,和 血清 CK-MB ctni 活性明显降 低 (P < 0.05); 与 比较,血清 CK-MB ctni 活性明显升高 (P < 0.05), 见表 1 表 1 S 组 4 组大鼠再灌注 0 min 血清 CK-MB 和 ctni 活性的比较 n/ 只 CK-MB/(μg/L) 549.8± ±3.4 a 779.3±3. ab 89.3±4.28 abc ctni/(ng/ml) 0.28± ±1.278 a 28.49±1.027 ab 31.82±0.790 abc a: 与 S 组比较,P < 0.05;b: 与 比较,P < 0.05; c: 与 比较,P < 大鼠心肌梗死面积百分比 与 S 组比较, 和 心肌梗死 面积增大 (P < 0.05); 与 比较,和 OA 组心肌梗死面积减小 (P < 0.05); 与 比较, 心肌梗死面积明显增大 (P < 0.05), 见表 2 和图 1 表 2 S 组 4 组大鼠心肌梗死面积百分比的比较 n/ 只 心肌梗死面积百分比 /% 10.2± ±1.89 a 30.5±1.09 ab 33.7±0.81 abc a: 与 S 组比较,P < 0.05;b: 与 比较, P < 0.05;c: 与 比较,P < 0.05

4 第1期 刘永强 等 JAK2/STAT3 信号通路在羟考酮预处理预防心肌缺血再灌注损伤中的作用 B 图1 4 组大鼠心肌梗死面积 2.3 大鼠 再 灌 注 0 min 心 肌 组 织 Bcl-2 Bax 表达及 Bcl-2/Bax 比值 0.05 见表 3 图 2 和图 3 表3 与S组比较 I/R组 OP组和OA组心肌Bcl-2 Bax 表达上调 Bcl-2/Bax 比值降低 P < 0.05 与 比较 和 心肌 Bcl-2 表达上 调 Bax 表 达 下 调 Bcl- 2/Bax 比 值 升 高 P < 0.05 与 比 较 心 肌 Bcl- 2 表 达 下 调 Bax 表 达 上 调 Bcl- 2/Bax 比 值 降 低 P < 29 B S组 4 组大鼠再灌注 0 min 心肌组织 Bcl-2 Bax 表达及 Bcl-2/Bax 比值比较 n/只 Bcl ± ±0.21a 2.02±0.35ab 1.94±0.1abc Bax 0.59± ±0.0a 1.4±0.07ab 1.98±0.08abc Bcl-2/Bax 1.01± ±0.08a 0.83±0.0ab 0.4±0.04abc a 与 S 组比较 P < 0.05 b 与 比较 P < 0.05 c 与 比较 P < 0.05 图 2 大鼠再灌注 0 min 心肌组织 Bcl-2 表达水平 B 图 3 大鼠再灌注 0 min 心肌组织 Bax 表达水平 3 讨论 心肌细胞表面分布的阿片类受体参与了心肌 细胞缺血再灌注损伤的保护作用 羟考酮目前在 本研究参考文献[2 4 5]制备大鼠在体心 临床上主要应用于疼痛的治疗 属于阿片类受体 肌缺血再灌注损伤模型 开胸结扎左冠状动脉 激动剂 对阿片受体具有很强的亲和力 本研究 前降支 30 min 松开血管再灌注 0 min 血清 采用 0.5 mg/kg 的用量[2 4]对即将结扎冠状动脉的大 CK-MB ctni 的活性是衡量心肌细胞受损程度的 鼠进行预处理 结果表明 与 I/P 组比较 经典指标[ 7] 研究结果表明 与 S 组比较 I/P 组 大鼠血清 CK-MB ctni 活性明显降低 心肌梗死 血清 CK-MB ctni 的活性升高 心肌梗死面积 面积明显减小 提示羟考酮预处理可以预防心肌 增大 提示心肌缺血再灌注损伤模型制备成功 缺血再灌注损伤 结果与前期实验结果相符

5 30 第 43 卷 JAK2/STAT3 信号通路是细胞内一个重要的信号通路, 涉及细胞增殖 细胞凋亡 细胞免 [8] 疫 炎症以及肿瘤的发生等过程 在心肌组织中,JAK2/STAT3 信号通路与心肌的保护作用有 [9] 关 AG490 是 JAK2/STAT3 信号通路特异性阻滞剂, 可阻断下游的信号转导和转录活化因子 STAT3 的活化 本研究在羟考酮预处理前, 选择 AG490 进行 JAK2/STAT3 信号通路阻滞, 结果显示, 与 比较,血清 CK-MB ctni 活性增强, 心肌梗死面积增大, 提示 AG490 可以抑制羟考酮预防心肌缺血再灌注损伤的作用, 表明羟考酮预处理可以激活 JAK2/STAT3 信号通路预防心肌缺血再灌注损伤 Bcl-2 家族表达水平的高低与细胞凋亡的发生发展密切相关,Bcl-2 和 Bax 表达水平以及 Bcl-2/ [10] Bax 比值可反映细胞凋亡的发生率 本研究通过对 Bcl-2 和 Bax 表达水平的检测, 计算 Bcl-2/ Bax 比值, 间接评估心肌细胞凋亡的发生率 研究结果提示, 与 S 组比较,I/P 组心肌细胞发生明显凋亡,心肌细胞的凋亡发生率明显降低, 而用 JAK2/STAT3 信号通路阻滞剂 AG490 阻断该信号通路后, 心肌细胞的凋亡发生率再次增高, 说明心肌发生缺血再灌注损伤与细胞凋亡有关, 羟考酮预处理可以通过激活 JAK2/STAT3 信号通路, 抑制心肌细胞凋亡, 从而预防心肌缺血再灌注损伤 综上所述, 羟考酮预处理可激活 JAK2/ STAT3 信号通路, 降低心肌在发生缺血再灌注损伤时细胞的凋亡, 从而减轻心肌组织的损伤 但是羟考酮预处理是否还经过其他途径发挥保护作用还需要更进一步的研究 参考文献 [1] 张红, 冷玉芳. 氯胺酮对先天性心脏病患者心内直视手术下心肌热休克蛋白 72 mrna 表达的影响 [J]. 兰州大学学报 : 医学版, 2008, 34(2): 1 4 [2] 叶元梅, 冷玉芳, 杨佩宁, 等. 羟考酮预先给药对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与 PI3K/Akt 信号通路的关系 [J]. 中华麻醉学杂志, 201, 3(8): [3] Zhang M, Wang X, Wang X, et al. Oxymatrine protects against myocardial injury via inhibition of JAK2/STAT3 signal in rat septic shock[j]. Mol Med Rep, 2013, 7(4): [4] 杨珮宁, 冷玉芳, 叶元梅, 等. 羟考酮后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响 [J]. 中华麻醉学杂志, 201, 3(7): [5] Gao E, Lei YH, Shang X, et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse[j]. Circ Res, 2010, 107(): [] Li L, Luo W, Huang L, et al. Remote percondintioning reduces myocardial injury in adult valve replacement: a randomized controlled trial[j]. J Surg Res, 2010, 14(1): 21 2 [7] 刘杨, 吴安石, 吴迪, 等. 静脉输注利多卡因联合七氟醚对非体外循环冠状动脉旁路移植术患者的心肌保护作用 [J]. 中华麻醉学杂志, 2015, 35(2): [8] Kisseleva T, Bhattacharya S, Braunstein J, et al. Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges[j]. Gene, 2002, 285(1-2): 1 24 [9] 翟中云, 杨进辉, 张思甜, 等. JAK2/STAT3 信号通路在川芎嗪减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用 [J]. 中华麻醉学杂志, 2011, 31(8): [10] 韩迪. 丹参酮 ⅡA 对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响研究 [J]. 现代预防医学, 2011, 38(13):

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