中国中西医结合杂志年月第卷第期!" # 类风湿关节炎 ( 0 1 0( 0 % 是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的慢性全身性自身免疫性疾病欧美等发达国家成年人患病率为 '9 9 是人类致残的主要疾病之一其基本病理表现为关节滑膜的慢性炎症血管翳形成关节滑膜异常增生形成绒毛状突入关节腔

Size: px

Start display at page:

Download "中国中西医结合杂志年月第卷第期!" # 类风湿关节炎 ( 0 1 0( 0 % 是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的慢性全身性自身免疫性疾病欧美等发达国家成年人患病率为 '9 9 是人类致残的主要疾病之一其基本病理表现为关节滑膜的慢性炎症血管翳形成关节滑膜异常增生形成绒毛状突入关节腔"

靠能
5 years ago
Views:

1 类风湿关节炎患者细胞凋亡与临床指标相关性分析曹永贺刘健摘要目的观察寒湿型类风湿关节炎 ( 0 1 0( 0 % 患者外周血,& 淋巴细胞凋亡基因表达探讨其与 % 疾病临床指标的相关性方法选取例寒湿型 % 患者 % 组和名健康人对照组应用检测 % 组及对照组,& 细胞凋亡率应用法检测凋亡基因 !4 5 #% 相对表达水平分析凋亡基因与临床活动指标 6 中医证候积分关节晨僵时间关节压痛数关节肿胀数关节功能分级及个关节数疾病活动度评分 ( 0 +! ,%6 相关性结果与对照组比较 % 组,& 细胞凋亡率降低 ".. 9 : % 组,& #% 相对表达降低 4+! 升高 :,& 细胞凋亡率与 6 呈负相关 :'+ 3 与关节肿胀数呈负相关 : '4+! 与中医证候积分和关节功能分级亦呈负相关 : :' 结论 % 患者外周血,& 淋巴细胞存在凋亡障碍并且与疾病的活动性密切相关关键词寒湿型类风湿关节炎凋亡基因,& 细胞凋亡率! 0 %! %3 30 1! +! ( 0 1 % 0( %- ; ( 1 2, ( %! ! 5 1 +!!! &', ( 0! 0 %! ! % ( ! ( 1 + %$6 % ( (! 4! 1,&! 3( ( 0 1 0( 0 % ( +! , ! 0 +! 0 0( +! +! %" 0( % (, 0( % 3 1 (!0( (! + 0! ",& +!! ( % 3 1 0(! + 0! 3 " #% ! "! ( ! +! % 6 0! ( 1! !! 4,%6!) 1"!0 ( ,& + 0!! 0( % 3 0( 0( + 0! ".. 9 :" #% 53! 7! #%,& + 0! ! #% ( % 3 :" ( ,& 0 7! +! 0 1 0( 6 : '" ( #% ! +! 0 1 0( 0!! 4 :'" ( #% 53 4+! 0 7! +! 0 1 0( 0! ( 1! ! + 0 : :'" +! % ! (! 4! 1,&! 3( +0 % !!! " ; -,6 +! ( 0 1 0( ,& +!! 基金项目国家科技支撑计划 # " $%$ 作者单位 " 新乡医学院第一附属医院中西医结合科河南 &'" 安徽中医药大学第一附属医院风湿科合肥通讯作者刘健!'' '!! ()*,-. '

2 中国中西医结合杂志年月第卷第期!" # 类风湿关节炎 ( 0 1 0( 0 % 是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的慢性全身性自身免疫性疾病欧美等发达国家成年人患病率为 '9 9 是人类致残的主要疾病之一其基本病理表现为关节滑膜的慢性炎症血管翳形成关节滑膜异常增生形成绒毛状突入关节腔导致软骨和骨的破坏最终可导致关节畸形和功能丧失细胞凋亡异常是 % 发病的重要机制 &,& 细胞 $ 细胞的异常活化与 % 的发生发展密切相关 ' % 属于中医学痹证历节范畴亦称为痹较多学者将活动期 % 分为湿热痹阻证及寒湿痹阻证本实验采用流式细胞术拟检测寒湿型 % 患者及健康人外周血,& 淋巴细胞凋亡率检测及相关基因 !4 5 表达旨在探讨 % 的发病机制分析寒湿型 % 患者细胞凋亡与临床症状实验指标的相关性资料与方法诊断标准 % 诊断标准参照 8. 年美国风湿病学会修订的 % 诊断标准. 凡符合以下. 项中 ' 项即可确诊为 % 晨僵 ( 对称性关节肿胀持续周个关节以上关节肿胀持续周 & 腕关节或掌指关节或近端趾指关节肿胀疼痛触痛并超过周 ' 类风湿因子 ( 阳性类风湿结节. 受累关节线片呈 % 改变中医辨证分型参照中药新药临床研究指导原则中寒湿痹阻证标准证见关节冷痛而肿遇寒痛增关节屈伸不利晨僵关节畸形口淡不渴阴雨天病情加重肢体沉重舌质淡苔白脉弦紧纳入及排除标准纳入标准符合诊断标准及辨证分型标准 :,%6 ' 年龄岁患者签署知情同意书排除标准重叠其他风湿病如系统性红斑狼疮干燥综合症等合并其他系统严重疾病或有严重感染者妊娠期及哺乳期妇女 & 近期内曾使用糖皮质激素慢作用药生物制剂 ' 精神病患者一般资料例均为年 & 年 & 月安徽省中医院风湿科门诊及住院 % 患者作为 % 组其中男性 & 例女性例年龄岁平均 &. 岁病程个月年平均 '. 年经本院伦理委员会批准批号 % 另选择本院健康医护人员名作为对照组其中男性 & 名女性名年龄 & 岁平均 &' 岁两组性别年龄比较差异无统计学意义 <' & 观察指标及方法于清晨. 点采两组上肢静脉血 2 & 细胞凋亡率检测取 2 新鲜血液加入 2 溶血剂后 ' 离心 ' 弃上清液加入 $6 混匀震荡 ' 离心 ' 弃上清液洗涤细胞次加入 2 +3'' 0 (,& 混匀避光孵育用 & 2 % 5 结合液悬浮细胞浓度约为 2 在细胞悬浮液中加入 ' 2 % 5 染色液轻轻混匀后于避光孵育 ' 加入 2 染色液后轻轻混匀后于避光孵育 ' 流式细胞仪! 美国 $ +=!0 公司检测,& 细胞凋亡指标 % 5 水平利用功能软件进行参数获取和数据分析细胞凋亡率 & 分离外周血单个核细胞 3 3(! 4! 1 +! +!! $ 取两组肝素钠枸橼酸钾抗凝静脉血 2 用 $6 按比例稀释用无菌滴管充分混勾取 ' 2 无菌离心管加入适量淋巴细胞分离液约 ' 2 将稀释过的全血用无菌滴管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面之上保持界限清晰 & 离心 ' 不设刹车制动 ' 离心后管内分为层上层为血浆和 $6 下层主要为红细胞和粒细胞中层为淋巴细胞分离液在上中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带小心吸取白色窄带层至 ' 2 无菌离心管中离心加入 ' 倍 $6 或 & 培养基混匀 & 离心洗涤细胞次. 定容计数重悬并定容细胞后从中取出 2 稀释 & 倍混匀后取出 2 滴入细胞计数板中计数分别计数四角 & 个大格中的细胞数取得总和为按 & 稀释倍数 & 计算得单个核细胞数根据细胞数定容使细胞密度为. 2 & 流式细胞分选仪分选纯化细胞将分离得到的 $ 转移至无菌流式管中加入抗体 2 的小鼠抗人标记的 0,& 抗体 & 避光孵育荧光抗体标记结束后加入无菌 $6& 离心洗涤细胞弃上清用无菌 $6 重悬细胞 & 用无菌目尼龙网过滤细胞至新的无菌流式管中 ' 用流式细胞分选仪进行目的细胞的分选纯化 &&! 0 测定 2

3 !4 5 #% 表达参照文献按照文献设计 !4 5 引物由 0 7 公司合成引物序列表基因名称表引物序列引物序列扩增片断长度正向 ' >>>%%%>>>>%%%%>> ' 反向 ' %>>%%>>%%>>>>%%>%>> 正向 ' %%%%>>>%>%> 反向 ' %%>>%%> 2 正向 ' >>%%>>>%%>%%%> 反向 ' >%%>%>%>>%%>%% + 3 正向 ' %>>>%%>>%%>>%%%%.. 反向 ' >%>%>>%%%>%>%>%%>%> + 3 正向 ' %%>%%%>>%>>>>% 8 反向 ' %>>%%%%%%%%%%% 4+! 正向 ' >%>%>%>>%>>%%%%%>>% 反向 ' %>>>%%%>%%%>%%>>% 4 5 正向 ' >>%%%>>%> 反向 ' %>%>%>>>%>%>>>% &' #% 提取收取分离纯化后的,& 细胞加入 2 )! 7 0 公司充分裂解加入 2 氯仿剧烈振荡 ' 室温放置 & 离心 ' 取上清约 ' 2 加入到另一管中 & 加入 ' 2 异丙醇温和混匀室温放置 '& 离心弃去上清加入 2.'9 乙醇, 水配制 & 离心 ' 弃上清. 室温放置干燥 #% 沉淀加入?' 2, 水 '' 促溶保存备用 & 在 2 管中加入总 #% 质量为!2 -! 12, 水补足至 2 轻轻混匀点动离心仪 ( - %2 8 上 ' 加热 ' 立即冰浴在上述管无 # 酶中加入 ' +0 $ & 2!2 1# 5 2 4! += ( % &&. ' ' 取出上述反应液即为 +,#% 保存备用 &. 荧光定量反应取出上述反应液 2 作为荧光定量的模板反应体系如下 6;$ > 0 0 6$ > = ' 2 正向!2 2 反向!2 2 +,#% 2 # 0 2 反应总体积为 2 反应条件如下 8' ' 8' & 个循环 & 个循环 & 临床指标观察检测 % 患者 6 反应蛋白抗环瓜氨酸肽 0 ++! + + 0!! 中医证候积分关节晨僵时间晨僵关节肿胀数肿胀关节压痛数压痛关节功能分级个关节数疾病活动度评分 ( 0 +! ,%6 8 < 关节功能分级参照文献级能照常进行日常生活和各项工作级可进行一般的日常生活和某种职业工作但参与其他项目活动受限级可进行一般的日常生活但参与某种职业工作或其他项目活动受限级日常生活的自理和参与工作能力均受限 ' 统计学方法采用软件进行统计学处理计量资料以 5 表示各变量间相关分析采用相关分析两样本比较采用独立 0 检验 :' 为差异有统计学意义结果两组,& 细胞凋亡率比较表与对照组比较 % 组,& 细胞凋亡率降低 0 A 88 : 表两组,& 细胞凋亡率比较 9 5 组别例数,& 细胞凋亡率 % 8 对照.. 注与对照组比较两组 !4 5 #% 表达比较表图与对照组比较 % 组 #% 表达降低 :4+! 表达升高 : 表两组 !4 5 #% 表达比较 5 组别例数 ! 4 5 对照 8... %.. & ' &' & & & 注与对照组比较

4 "! # (" 中国中西医结合杂志!"#$ 年 # 月第 %$ 卷第 # 期 &'()*+!',-.,0!"#$! 1234 %$! 52!# $$注#7 为 O,J &6 为 O,JP&& 为 C,JQ,J:# ;&D 为 C,JQ,J:# %&< 为 RC3#!&M 为 R,S 图 ##K)# &K 扩增曲线 $$ % $ K7 患者 &D8 L ) 细胞凋亡率) O,J ) O,JP ) C,JQ,J: # ; ) C,JQ,J: # % ) RC3 #! ) R,S 与各临床指标相胞成员而且在 K7 的发病中起重要作用 '##( * K7 关节软骨和骨组织的损害! 与滑膜细胞的过度增生活化关性分析$ 表 8 % $&D8 L ) 细胞凋亡率与 <TK 呈负相与凋亡不足有关! 凋亡机制在 K7 发病中占重要地位 '#!( * 关 $ X "! "9 %! C,JQ,J: # ; 与关节肿胀数呈负相关 $ X "! "9 %!RC3 #! 与中医证候积分和关节功能分级亦 K7 的主要病因病机多是因为体质素虚! 卫表不固!风)寒)湿邪乘虚侵袭!或脾虚湿盛!内外合邪!导致呈负相关$ X "! "#! X "! "9 % * 其余凋亡基因表达水平与各观察指标之间的相关性差异无统计学意义气血运行不畅! 邪郁经络关节而致!- 严氏济生方. 云 $ ` "! "9 % * + 皆因体虚!腠理空疏! 受风寒湿气而成痹也, '#%( * 刘讨$$论健教授根据多年临床研究! 认为脾虚湿盛是 K7 基本病机!并对急性期 K7 病机分为寒湿型和湿热型* 并我国 K7 患病率为 "! %!W &"! %$W!各年龄组均可发病!;"W 发病于 %9 &9" 岁! 女性高于男性! 女性且在以往对佐剂关节炎 $,I?.U,-H,H@>H>J! 77 % 大鼠的研究表明! O,J ) O,JP ) RC3 #! 等在 K7 中起重要作患者约 % 倍于男性 '%( * K7 是一种以血清中出现多种自身抗体及滑膜有显著淋巴细胞浸润为特征的自身免用 '#8!#9( * 有学者从血清蛋白组学的角度探讨其与中疫性疾病!在浸润的细胞中! &D8 L ) 细胞是主要的细医证候的关系 '#$( * 本研究即以寒湿型 K7 患者为研究对象!采用流式细胞术)K)# &K 检测相关基因 O,J ) 表 8#K7 患者 &D8 L ) 细胞凋亡率)O,J )O,JP)C,JQ,J:# ;)C,JQ,J:# %)RC3#!)R,S 与各临床指标相关性分析临床指标相关凋亡蛋白 =K57 L &D8 ) 细胞凋亡率 O,J O,JP C,JQ,J:# ; % C,JQ,J:# RC3#! R,S <TK " 9"V9 "#9 $$% #9! #V! F#9!FF 9V9 "%# V98 8"V 8!" 9F$!%! &K KM && " 8FV " #VF " "$$ "$# 8$$ ;"F " "9" " #V# #"F V!9 F#$ ;8# " "%9 " "$;!8% V8F ;VV $8! " "9# "F8 "!V8 V!% ;;V 9F! 8%; #9$ 8F# %;9 F$; %8$ "!"" FF" %9! F"8 "F% 8V8!;$ "$V #;9 9;% ;VF F!$ 中医证候积分 #"# F"V " F!" #"F "!%F $9# " $$! #9!!8" $8; " V%9 ""$ " 8F! %89 晨僵肿胀 "!F! "F$ %"V F;" %FV " $9F 89; #9$ "!$ " "%F V$# V88 "!#% " ;#$ $;9 "8; " %V# #V9 888 F## "!#$ " 9#9 $;#!V9 #8" " 9V; FV#!#" 压痛 %88 #V% " 9$!!8$ #;! F%" " 8V% %!# #;V F!" " 9%"!FV " F;% "$$ 关节功能分级!#$ 8!# " "9; V#% "98 V#V " "99 V#; " "8% V%$ " ;9% "%# "!F; 9V% D7T!; " 88; ";! %!% 9%! 88F %F8 " %$" 8;% #99 F$V #$9 F99 " "%% V9#

5 !4 5 表达探讨 % 的发病机制并分析寒湿型 % 患者细胞凋亡与临床症状实验指标的相关性结果显示与对照组比较寒湿型 % 患者,& 细胞凋亡率降低 % 患者,& 细胞促凋亡基因表达显著降低抑制凋亡基因 4+! 表达显著增高提示寒湿型 % 患者存在着细胞凋亡障碍从而使关节滑膜细胞凋亡不足滑膜细胞异常增殖和血管翳形成最终导致关节软骨和软骨下骨的破坏可能是 % 发病的重要机制本研究进一步探讨寒湿型 % 患者,& 细胞凋亡指标 % 5 水平及,& 细胞凋亡基因的表达与 % 临床指标的关系发现 % 患者的,& 细胞凋亡率与 6 呈负相关 + 3 的表达与关节肿胀数呈负相关抑制凋亡基因 4+! 的表达与中医症状积分呈明显负相关并与关节功能分级亦呈负相关结果表明 % 患者,& 细胞凋亡率越低则 6 数值越高疾病的活动性越高 + 3 表达越低关节肿胀数目越多 4+! 表达越高则中医症状积分就会越低关节功能分级越低可能机制是,& 细胞凋亡率下降是由于促凋亡基因表达降低从而使细胞凋亡不足致使致炎因子聚集在关节滑膜处引起关节滑膜的异常增生疾病处于活动状态与疾病活动相关的 6 明显上升 + 3 的表达降低细胞凋亡障碍致炎因子在关节滑膜处聚集增多从中医学的角度来说是湿邪过重关节肿胀数就越多疾病越重 4+! 和 4 5 是目前已知的在凋亡调控过程中功能相互对立的一对最重要的调控基因是一种重要的凋亡抑制基因能抑制多种因素引起的细胞凋亡 4 5 可以促进细胞凋亡. 由于 4+! 家族中抗凋亡成员与促凋亡成员的比例是决定细胞进入凋亡与否的关键因素二者之间的相互作用决定了细胞死亡的阈值因此出现抑制凋亡基因 4+! 与中医症状积分关节功能分级呈负相关综上所述寒湿型 % 患者体内存在,& 细胞凋亡率明显下降凋亡蛋白的表达异常这可能是导致 % 自身免疫系统异常免疫反应增强的原因临床相关症状实验室指标与之有较密切的关系由此可知通过调控凋亡基因蛋白的表达从而干预细胞的凋亡可能是今后治疗 % 的一个新的研究方向本研究病例较少仅采用不能与其他的试验方法相互印证是其不足之处今后将再加大试验标本数量合并使用如 0 4! 0 等方法相互对照参考文献 2 $ +( 2! %" > 3 1! " % 0 7. % %8" 6+ 00,2! ) 0!" ( 0 1 0( 0 " & 8& " 陆再英钟南山主编 " 内科学 " 北京人民卫生出版社 & ''" & 陆意 " 类风湿关节炎发病机制的研究进展 " 国外医学免疫学分册 &' ' '8" ' 王婷蒋觉安胡筱涵等 " 在类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞的表达及临床意义 " 中国免疫学杂志 '. 8.&" 何卫邱联群王翠柳等 " ' 例类风湿性关节炎中医证候特点及其与影像学关系的研究 " 新中医 & ' ". 中华医学会 " 临床诊疗指南风湿病分册 " 北京人民卫生出版社 '" 中华人民共和国卫生部 " 中药新药临床研究指导原则试行 " 北京中国医药科技出版社 " = > 7! 2" ( 0 1 0( 0 " % 0( 0 ( &8 6' & &" 姚媛王吉波李华 " 系统性红斑狼疮 $ + + #% 的表达及其与疾病活动性相关性研究 " 中国免疫学杂志 8' ' '" 陈丽娜王聪华朱平等 ",&,' ( ( 调节性细胞在类风湿性关节炎病程中的消长及其意义 " 细胞与分子免疫学杂志. & &" 陈安平袁国华罗雄燕等 " 类风湿关节炎滑膜组织及关节液中,+ 表达的研究 " 中国免疫学杂志 8 ' " 南宋严用和著刘阳校注 " 严氏济生方 " 北京中国医药科技出版社 " & 刘健张皖东陈光亮等 " 新风胶囊对佐剂性关节炎大鼠疗效及滑膜 2 及 4+! 表达的影响 " 中国中西医结合杂志 '88 " ' 刘健韩明向翟志敏等 " 新风胶囊对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的影响 " 中国临床保健杂志 ' & 8 88" 孙志玲王玲王富强等 " 类风湿关节炎寒湿痹阻证患者血清蛋白组学分析 " 中国中西医结合杂志. 8 8". 董雅洁高维娟 " 4+! 在细胞凋亡中的作用及其关系 " 中国老年学杂志 & & " 薛茜邹玉安赵宝民等 " 康脑液号对大鼠脑缺血再灌注半暗带细胞凋亡及 $+!$ 5 比值的影响 " 中国全科医学 &8 '" 收稿 & ' 修回 ' "

第一临床医学院 ( 江苏省中医院 ) 中医外科学 -01 普通外科疾病研究第一临床医学院 ( 江苏省中医院 ) 中医外科学 -02 肛肠外科疾病研究第一临床医学院 ( 江苏省中医院 )

第一临床医学院 ( 江苏省中医院 ) 中医外科学 -01 普通外科疾病研究第一临床医学院 ( 江苏省中医院 ) 中医外科学 -02 肛肠外科疾病研究第一临床医学院 ( 江苏省中医院 ) 2012 级七年制选择 5+3 培养模式转段结果学号录取学院录取专业方向 039012123 002 第一临床医学院 ( 江苏省中医院 ) 105701 中医内科学 -01 肾脏病临床研究 032012310 002 第一临床医学院 ( 江苏省中医院 ) 105701 中医内科学 -01 肾脏病临床研究 039012128 002 第一临床医学院 ( 江苏省中医院 ) 105701 中医内科学