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1 北京大学学报 医学版 ;:;;>:5:5$:;$:5>%*;%2'. 论著 类风湿关节炎患者外周血 细胞高表达核因子 受体活化因子配体 刘洪江 郭晓锋 胡凡磊 闫翠萍 崔向军 颜学良 栗占国 贾 园 宋书林 三峡大学人民医院风湿免疫科 湖北宜昌 北京大学人民医院风湿免疫科 北京 摘 要 目的 检测类风湿关节炎 &(')%! &(&!!" 患者外周血 细胞核因子 受体活化因子配体 &'.'%&.!A%&%#.*'&.%&0*!# ; 的表达 并分析其与 患者临床和实验室指标的关系 探讨 细胞在 发病中的作用及其免疫调节功能缺陷的潜在机制 方法 选取 患者 例 近半年未使用糖皮质激素 免疫抑制剂及生物制剂 和 名健康对照者 ('*(.%#&%*" $ 利用流式细胞仪 *%/.%)'& $ 聚合酶链式反应 %*)'&"'.(!# &'.!%# $ 检测 ; 在健康对照组和 患者外周血 细胞及非 细胞中的表达 分析表达 ; 的 细胞比例与 患者临床特征和实验室指标的相关性 体外刺激实验评价肿瘤坏死因子 )%&#'.&%"!".%& ; 和白细胞介素!#'&*'0!# 对 细胞表达 ; 的影响 数据分析采用独立样本 检验 '&"%# 和 5'&)# 相关分析 结果 健康人外周血 细胞能表达低水平 ; 患者外周血表达 ; 的 细胞比例较健康对照组显著升高 E E EE 患者表达 ; 的 细胞比例与关节压痛数 关节肿胀数及 关节疾病活动度分值!"'"'.!A!".%&'!# %!#"25 呈正相关 分别为 与年龄 病程 红细胞沉降率 '&(&%.'"'!)'#!%# &' :5$ 反应蛋白 $&'.!A'&% '!# $ 类风湿因子 &(')%!.%& 及抗环瓜氨酸多肽抗体 #!..*!..!& *!#' '!'#!% $ 无显著相关性 ; 能促进 细胞高表达 ; 结论 患者外周血表达 ; 的 细胞比例升高 与关节肿痛数及疾病活动度正相关 提示 患者 细胞免疫调节功能受损的同时可能参与了 的发病及骨破坏 关键词 关节炎 类风湿 细胞 ; 配体 骨破坏 中图分类号 文献标志码 文章编号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基金项目 国家自然科学基金 5%&' (';!%#*;&*5.!'#.'%#!%# %$(!# $%&'"%#!#(%&"')!*!#-"!#.%) "*!#-"!#.%) ('"'(%&".%#&!' '*%(!"/%&0 网络出版时间 网络出版地址 ( ///.#0!#'0.)"'!*()*

2 刘洪江 等 类风湿关节炎患者外周血 细胞高表达核因子 受体活化因子配体 &%*"E E EE ('&''#.!'"%('"'.'*".%&'*' % "!!A'*/!( '#'&%!#.%#" "/%*'# %!#.%#"#!"'"'.!A!".%&'!# %!#"25 %/'A'& #%.%&'*!%# /" %# '/''# ('"'.'*"#!'#'!"'"'&!%# %&('*'A'*"%'&(&%.'"'!)'#!%# &':5 $&'.!A'&%'!# $ &(')%!.%& # #!.!& *!#' '!'#!% $'& "!)*!%# ; #%.'*"!"%*' &%) ('*(%#%&" ')%#"&' #)'#*&'*' '+&'"!%# %;'+' &"!'""(%/' (' &''#.!'"%;&%.!#.'*"/'&')&0'*(!('&!#!'#" # ('!&&''#.!'" /'&'%"!!A'*.%&'*' /!( '#'&%!#.%#" "/%*'# %!#.%#"# 25('"'!#!#" "'"' (.'*")!('!#A%*A'!# %#''"&.!%# 0/"%#&(&!!" &(')%!.'*" ;*!# %#''"&.!%# 类风湿关节炎 &(')%! &(&!!" 是一种以慢性破坏性关节病变为主的全身性自身免疫病 是临床常见的主要致残性疾病之一 细胞免疫异常及免疫功能失衡是 发病和疾病进展的主要原因 研究表明 细胞中存在对免疫应答具有负向调节作用的 细胞 即调节性 细胞 &'*%&.'*" &' 其中分泌白细胞介素!#'&*' 0!# 的 &' 是当前最受关注的调节性 细胞亚群 研究者将这群细胞命名为 细胞 在人外周血中 细胞高度集中于表型为 $2 6 $2 (! $2 6 的 细胞亚群中 目前国际上基本公认上述表型为人的调节性 细胞表面标记 这将 有利于 细胞的进一步功能研究 近年来 多项研究证实 在 患者中外周血 细胞的数 量减少且免疫调节功能下降 然而 细胞在 患者外周血中数量和功能改变的确切机制仍不清楚 导致其在疾病发病机制中的作用也存在争议 关节骨破坏是导致 致残的重要因素 破骨 细胞在骨侵蚀中起关键作用 核因子 受体活化因子配体 &'.'%&.!A%&%#.*'&.%& 0*!# ; 是破骨细胞分化存活的关键分子之一 早期研究认为 关节滑膜细胞及活化的 细胞所产生的 ; 是促进 破骨细胞 分化和骨破坏的主要原因 但近年来 越来越多的研究提示 细胞也能分泌 ; 可能参与了 的骨破坏过程 本研究以 细胞是否高表达 ; 为切入点 探讨 细胞在 发病中的作用 并进一步揭示 细胞免疫调节功能缺陷的潜在机制 资料与方法 研究对象选取 年 月至 年 月于北京大学人民医院风湿免疫科住院的 例 患者 其中女性 例 男性 例 岁 平均年龄 岁 所有患者均符合 年美国风湿病学会 )'&!.# $%*''%(')%*%$ 修订的 分类标准 且近半年未使用糖皮质激素 免疫抑制剂及生物制剂治疗 另选取 例年龄和性别匹配的健康对照者 其中女性 例 男性 例 岁 平均年龄 岁 本研究经北京大学人民医院医学伦理委员会批准 获得所有患者及健康对照者的知情同意 主要试剂和仪器流式抗体 小鼠抗人 $2$$; : 购自美国!%''# 公司 $2$ $2 $ 购自美国 '!%".!'#.' 公司 鼠抗人 $2 抗体购自美国!%''# 公司 微量 ; 提取试剂盒购自德国!'# 公司.2; 合成反转录试剂盒购自美国 '&)'#" 公司 5&''# "'&!+ 购自美国 *!'!%""')" 公司 引物 $ 寡聚脱氧核苷酸 $%*!%'%+#.*'%!'" $2; 购自上海生工生物工程公司 肿瘤坏死因子 )%&#'.&% "!".%&; 白细胞介素!#'&*'0!# 购自美国 '&%'.( 公司 流式细胞仪 *%/.%)'& $ &! 由美国 2 公司制造 普通聚合酶链式反应 %*)'&"'.(!# &'.!%#$ 仪 实时定量 $ 仪由美国 公司制造 细胞表面 ; 染色及流式细胞术检测分离健康对照者和 患者抗凝全血得到新鲜外周血单个核细胞 '&!('&**%% )%#%#.*'&.'*$ 加磷酸盐缓冲液 (%"(' '&' "*!#'5 重悬 终浓度为 ) 取 加入抗人 $2$$ $2$ $2$ ;: 涡旋混匀 室温避光孵育 )!# 加入 )5 &)!# 离心 )!# 弃上清 加 E 体积分数 多聚甲醛固定 $ 检查 细胞 ; 表达比例 细胞分选及 $ 实验无菌分离健康对照者和 患者乙二胺四乙酸

3 北 ' %+#' 京 大 学 学 报! 医 学 版 # [ \]&Y)^\_OX`K Ya]YK bx&sk Uc! VX)^UVS6K XY6XS#!b 0 '#!Y 0 *!P 0$#".! 5; A 5 ;" XPU)# 抗凝血 得 $0 +!M"# 细胞体外刺激实验 _6L 分 选 健 康 对 照 者 外 周 血 6P"% T 到新鲜 OML6悬液"每测试孔分别加入抗人 6P"% )O6 6 +*6P$/ _K U6*6P$+ )O6抗体 ' +^和 "## +^ OMS"涡旋混匀"室温避光孵育 (# A 5 加入. A^ 6P$+ T M"# 细胞"每孔细胞数为 "0' p"# ' "加入 /. 无菌 OMS" " *## A 5 离心 ' A 5"弃上清"加入 / 组 每孔加入 5 6P/#!( A ^# *6:a!"# A ^# " OMS 重悬"过滤至无菌 A^$i! 体积分数# 胎牛血清 UY_ ^ " #组分别加入 UY_ ^# *K ^ )组*K )!$# + " #!/ + ^# $ 培 养 / ;" 收 集 细 胞 沉 淀$ O6&检 测 流式管"根据表面标记分选出 6P"% 6P$/ 6P$+ 孔板"每个样本分 ( 孔"即对照组*UY_ ^ "# )组和 K T M"# 细胞" 6P"% T 6P$+ 6P$+ Q 非 M"# 细胞分选的 M"# 细胞 &)Y`^的表达 细胞亚群至盛有 / A^"*/# 完全培养基的 "' A^离 $0 P!统计学分析 心管 中 分 选 完 毕 收 集 细 胞" ".## A 5 离心 采用 SOSS $#0 # 统计软件进行统计学分析"所 "# A 5"分选的细胞用于 O6&实验 有数值变量资料通过 S@ : g H! m'# # 进行正 O6&所 用 引 物% 人 甘 油 醛 ( 磷酸脱氢酶! 态性检验"当数据符合正态分布时以均数 o标准差 ; ; ( :@ :@ ; ; 5 " a)opv# % 正 表示" 非正态分布数据则以中位数! 最小值" 最大 ))aaua))aau6aa)au6)) "反向引 向引 物%'t >; 5'检 值# 表示 当数据符合正态分布时采用 S ))Ua))aaaaU6)UUa)Uaa $人 &)Y`^%正 物%'t 55 g@ 5 检 验"不符合正态分布时采用非参数 L )U)a))U)U6)a))a)Uaa6)6U6 "反 向引 物%'t 5! 数 据 符 合 正 态 分 布# 或 验$相关分 析 采 用 O 向引物%'t U))aa)aaaaUUaa)a)66U6a 普 S: A 5! 数据不符合正态分布# 检验 2m#0 #' 为 通 O6&反应体系!"# +^# %;YUOL C' +^*正向引 物! "# +A ^# #0" +^* 反 向 引 物! "# +A ^# 差异具有统计学意义 (%结果 #0 " +^* PY)#0' +^* ;;V$ \/0( +^$ 反 应 程 序% %/ q ' A 5!" 个循环# *%/ q (# T'* q (# T (0 $!健康人外周血 M"# 细胞能表达低水平 &)Y`^ +$ q (#!/# 个循环# *+$ q + A 5!" 个循环# 实 应用 _6L通过 6P"%*6P$/*6P$+ 表面分子将 时定量 O6&反应体系!"# +^# % S Ra 5 ' +^*正 ^##0 " +^*反向引物!"# +A ^# 向引物!"# +A M细胞分为 6P"% T M"# 细胞和 6P"% T #0 " +^* PY)" +^*;;V$ \(0. +^$反应程序%'# q $ A 5!" 个循环# *%' q "# A 5!" 个循环# *%' q "' &)Y`^的表达"具体设门策略见图 " _6L检测证 T*# q " A 5!/# 个循环# 低水平 &)Y`^! 图 ")# 6P$/ 6P$+ Q 非 M"# 细 胞" 分 别 检 测 这 两 群 细 胞 实健康对照外周血 M"# 细胞及非 M"# 细胞能表达 SS6" ; $ _S6" I G ; $ &)Y`^" : I5> I H ::M 5;$ OML6" : :@ R ; A 5 5> $ a)opv" ; ; ( :@ :@ ; ; 5 0)" : 5 I G A : ; : 5 I &)Y`^ C : 5 5 $ M" 6P"% T 5; 6P"% T6P$/ 6P$+ QM G ; RI G A 5; 5; ;> M"# 5; 5 5 M"# ; O6& 5 I&)Y`^0U@ : 5 > G50OML6G > 5 0 图 $%健康对照者外周血 M"# 细胞及非 M"# 细胞表达 &)Y`^ Q# D 0$%V 5; ;> M"# 5; 5 5 M"# G : R I: ;> 5&)Y`^!

4 刘洪江 等 类风湿关节炎患者外周血 细胞高表达核因子 受体活化因子配体 为进一步验证 细胞表达 ; 我们通过 $ 分选出健康对照者外周血 细胞 非 细胞 应用普通 $ 在 ); 水平检测这两群细胞 ; 的表达 结果证实 细胞及非 细胞在 ); 水平均表达 ; 图 患者外周血表达 ; 的 细胞比例较健康对照组显著升高 $ 检测发现 患者外周血表达 ; 的 细胞比例较健康对照者显著升高 E E EE 图 而两组间非 细胞表达 ; 的差异无统计学意义 图 为进一步验证 患者与健康对照者外周血 细胞表达 ; 的差异 我们通过 $ 分选了 例 和 例健康对照者外周血 细胞 在 ); 水平进行检测 结果发现普通 $ 图 $ 和实时定量 $ 图 2 均证实 患者 细胞表达 ; 较健康对照者显著升高 &'A!!%#""!#!&'('&''#.!'"%;&%.!#$2 6 $2 (! $2 6.'*"!# &(')%! &(&!!"!'# # ('*(.%#&%*"$ /'&'#*' *%/.%)'&('&''#.!'"%;&%.!##%#.'*"!# # ('*(.%#&%*"/'&' #*' *%/.%)'&$2 6 $2 (! $2 6.'*"&%) ('*(A%*#''&"#!'#"/'&'"%&' *%/.%)'&('# /'&'" '.' %$$ # &'*!)'$2 #*"'"%;'+&'"!%# 表达 ; 的 细胞比例与 患者临床和实验室指标的相关性上述研究已证实 患者表达 ; 的 细胞比例升高 为进一步探讨表达 ; 的 图 患者 细胞高表达 ; &#.&'"' ;'+&'"' %#.'*"!#!'#" 细胞在 发病中的作用 本研究收集了 患者的临床和实验室资料 表 并与外周血表达 ; 的 细胞比例进行相关性分析 研究结果表明 患者表达 ; 的 细胞比例与

5 北京大学学报 医学版 ;:;;>:5:5$:;$:5>%*;%2'. 关节压痛数 关节肿痛数 疾病活动度呈正相关 分别为 与年龄 病程 红细胞沉降率 '&(&%.'"'!)'#!%# &' :5 $ 反应蛋白 $&'.!A'&%'!# $ 类风湿因子 &(')%!.%& 及抗环瓜氨酸多肽抗体 #!..*!..!& *!#' '!'#!% $ 无相关性 图 ; 促进 细胞表达 ; 升高本课题组前期研究已发现 在 发病机制中起重要作用的炎性细胞因子 ; 和 可以导致 细胞表达 水平降低 而 等炎性因子对 的表达没有明显影响 然而 ; 和 是否会影响 细胞 ; 的表达需要进一步证实 基于此假设 我们通过 $ 分选出健康对照者的外周血 细胞进行体外培养 并给予 ; 和 刺激 应用普通 $ 和实时定量 $ 检测刺激后 细胞 ; 的表达 结果发现 ; 能 促进 细胞高表达 ; 而 刺激后 ; 的表达未见明显变化 图 表 患者临床及实验室指标 $*!#!.*# *%&%&&)''&"%!'#" ''&" # '#'&')*')*' 2&!%# '&" # ')" '#'&%!#.%#"% %!#" # 5/%*'# %!#.%#"% %!#" # 25 # :5))( # $) )'!# )!#!)))+!)) ) )'!# )!#!)))+!)) $) #!'#" &(')%! &(&!!" 25!"'"'.!A!".%&'!# %!#":5'&(&%.'"'!)'#!%# &'$$&'.!A'&%'!# &(')%!.%&$#!..*!..!& *!#' '!'#!% &'A!!%#""!#!&' # *'('&''#.!'"%;&%.!#$2 6 $2 (! $2 6.'*"/'&'%"!!A'*.%&'*' /!(!'#'#'&%!#.%#""/%*'# %!#.%#" # 25 $;%.%&'*!%# /"%# '/''# ('"'.'*"#!'#'2!"'"' &!%# :('*'A'*"%:5$$ # 讨论 图 表达 ; 的 细胞比例与 临床和实验室指标的相关性 &$%&'*!%# #*"!"%;&%.!#.'*"/!(!'#.*!#!.*)#!'"!%#" 的基本特征是滑膜炎伴软骨及骨的破坏 而骨破坏将直接导致关节畸形和功能障碍 研究证实 破骨细胞在骨侵蚀和关节破坏中起关键作用 中免疫介导的骨破坏机制十分复杂 早

6 刘洪江 等 类风湿关节炎患者外周血 细胞高表达核因子 受体活化因子配体 期研究认为 关节滑膜细胞及活化的 细胞所产生的 ; 是促进破骨细胞分化进而导致骨侵蚀的 主要原因 但近年越来越多的研究提示 细胞也可能参与了 的骨破坏过程 利妥昔单抗清除 细胞治疗不仅明显改善 患者的临床症状和炎症指标 而且通过增加骨形成和降低骨吸收抑制 了关节骨破坏的进程 但 细胞参与骨侵蚀 的具体机制仍不完全明确 目前多认为 细胞主要通过抗体依赖途径和异位增生间接参与骨侵 蚀 本研究发现 患者免疫调节功能受损的 细胞高表达 ; 可能促进破骨细胞分化并参与 骨侵蚀 这一结果可部分解释 细胞免疫调节功能受损的机制 且证实 细胞可能通过非抗体依赖途径参与 的骨破坏 ;)%&#'.&%"!".%&!#'&*'0!# %('&&'A!!%#""!#!&'*%/.%)'&"%&' $2 6 $2 (! $2 6.'*"&%) ('*(%#%&" /'&'"!)*' /!( ;%& %& "('# ('&'*!A';'+&'"!%# /"'A*' $ # &'*!)'$ 本研究首先鉴定了健康对照组外周血 细胞及对照细胞 非 细胞 ; 的表达 并对比了 患者 细胞及非 细胞表达的比例 结果发现 患者外周血表达 ; 的 细胞 比例显著升高 与最近 ''# 等的研究结果相似 该研究证实 患者转化后记忆性 细胞 $2 6 $2 6 2 高表达 ; 转化后记忆性 细胞与 $2 6 $2 (! $2 6 细胞存在部分重合 相关分析发现 患者表达 ; 的 细胞比例与关节压痛数 关节肿胀数及疾病活动度呈正相关 这一结果提示这群 细胞可能参与 的发病及骨破坏 在探讨 细胞表达 ; 升高的机制中发现 ; 能促进 细胞高表达 ; ; 是 发病机制中起关键作用的炎 性细胞因子 本课题组前期未发表的研究也证实 细胞经 ; 刺激后生成 的能力下降 上述研究提示 细胞在 疾病环境中 尤其是在炎性因子 ; 作用下 可能发生了致病性转变 即在生成 能力下降的同时表达 ; 能力升高 进而参与了 的发生和发展 多项研究证实 多种与骨破坏相关疾病的患者局部组织或外周血 细胞能产生 ; 且参与骨 破坏过程 另外 也有研究证实 细胞与破 骨细胞存在直接联系 #' 等证实 淋巴系 图 ; 促进 细胞表达 ; &;!#.' (''+&'"!%# %;!#.'*" 细胞在早期发展时期 &' 阶段之前 在巨噬细胞集落刺激因子 ).&%('.%*%#"!)*!#. %&$5 和 ; 刺激下能被直接诱导成破骨 细胞 *!'"' 等研究发现 小鼠的 细胞能分化为破骨样细胞 本课题组接下来将进行体外功能实验 探讨 细胞对破骨细胞分化和 骨侵蚀的作用 同时将结合 患者影像学表现 进一步分析表达 ; 的 细胞与 骨质破坏的相关性 此外 患者关节局部微环境在骨破坏中发挥更为直接的作用 今后将进一步研究关节液 细胞的分布及其表达 ; 的比例 是否外周血 细胞通过相关趋化因子进入关节液导致外周血 细胞比例下降 以及这群细胞是否高表达 ; 参与关节骨破坏 尚需进一步研究证实 细胞的免疫抑制作用为 等自身免疫病的治疗提供了新的方法和视野 通过对胶原诱导关节炎.%*'#!#.' &(&!!"$ 小鼠的研究证实 体内过继转移扩增的 细胞能够抑制 ( 和 ( 细胞介导的炎症反应 从而使 $ 小鼠的关节 炎得到缓解 然而 本研究发现在 疾病环境下 细胞高表达 ; 可能促进破骨细胞分化和骨侵蚀 因此 细胞在 患者治疗中的潜在应用尚需进一步研究证实 综上所述 本研究发现 患者外周血 细

7 北京大学学报 医学版 ;:;;>:5:5$:;$:5>%*;%2'. 胞高表达 ; 且与疾病活动度和关节肿痛数相关 可能参与 的发病和骨破坏 恢复 细胞的免疫调节功能并抑制其促进骨破坏的转变可能为治疗 提供新的思路 参考文献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收稿 本文编辑 赵 波

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