996 Chin J Lung Cancer, September 9, Vol., No.9 9年9月第卷第9期肺癌是目前全球男女性患者的头号癌症杀手其. 试剂与方法所有组织标本均经%中性福尔马林固发病率仍居高不下严重地威胁着人们的健康非小细定常规脱水后石蜡包埋连续切片-6张

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1 9年9月第卷第9期 99 Chin J Lung Cancer, September 9, Vol., No.9 临床研究 TTF-和p6在NSCLC组织中的表达及临床意义张鹏韩一平黄玲李强马大烈摘要背景与目的 TTF-和p6近年被发现在肺癌中有高表达并可能与肺癌的发生发展相关本文旨在研究TTF-和p6在非小细胞肺癌 non-small cell lung cancer, NSCLC 中的表达并探讨其临床意义方法收集长海医院8年原发性NSCLC组织标本例和良性肺疾患 benign pulmonary disease, BPD 组织标本8例采集病例相关的临床病理资料采用免疫组化EnVision两步法分别检测TTF-和p6蛋白在NSCLC中的表达并对其结果进行分析结果 TTF- 和p6蛋白在 NSCLC中阳性表达率分别为.% 9/ 和.9% / 而在BPD对照组病灶均为阴性表达 TTF-蛋白在女性不吸烟及无症状者升高明显 P<. 主要表达于肺腺癌 9/ 其诊断敏感性和特异性分别达8.%和89.8% 阳性表达率随着腺癌分化程度的增加而增加 P<. p6蛋白阳性表达多见于男性吸烟人群 P<. 对肺鳞癌的诊断敏感性高达9.% 特异性为98.8% p6阳性表达与鳞癌的分化程度正相关 P=.8 与临床分期呈负相关 P=. 但与其他因素无关 Logistic多因素分析显示病人吸烟史及肿瘤病理类型为影响TTF- p6表达的因素两者联合检测 TTF-(+)/p6(-)表型腺癌占9.% TTF-(-)/p6(+)表型鳞癌占98.6% TTF-与p6的阳性表达呈负相关 r=-., P<. 结论 NSCLC中TTF- p6的表达与病人吸烟史及肿瘤病理类型密切相关二者分别是肺腺癌鳞癌有效的生物学标志物其联合应用有利于NSCLC的诊断及鉴别关键词非小细胞肺癌 TTF- p6 免疫组织化学中图分类号 R. DOI:.9/j.issn Expression and Clinical Significance of TTF- and p6 in NSCLC Peng ZHANG, Yiping HAN, Ling HUANG, Qiang LI, Dalie MA Department of Respiratory Medicine, Changhai Hospital, Shanghai, China; Department of Pathology, Changhai Hospital, Shanghai, China Corresponding author: Yiping HAN, yphan6@yahoo.com.cn Abstract Background and objective To detect the expressions of thyroid transcription factor- (TTF-) and p6 in non-small cell lung cancer (NSCLC) and to evaluate their clinical significance. Methods The expression of TTF- and p6 from NSCLC and 8 benign pulmonary disease (BPD) tissue specimens were detected by immunohistochemical EnVision two-step method, together with their clinicopathologic data. Results The positive rate of TTF- and p6 protein in NSCLC tissues was.% (9/) and.9% (/), respectively, while negative in the BPD group. There was overexpression of TTF- in female gender and non-smoking history (P<.) and asymptomatic patients (P=.). It was more frequently in adenocarcinoma () with sensitivity of 8.% and specificity of 89.8%, especially in well or moderately differentiated (P<.). The positive rate of p6 was closely related with male gender and smoking history (P<.). Its sensitivity and specificity to squamous cell carcinoma () was 9.% and 98.8%, respectively, which was positively correlated with differentiation of (P=.8), but negatively with tumor stage (P=.). Logistic multivariate analysis showed smoking history and histological type were significantly associated with TTF- and p6 expression. 9.% of those represent TTF-(+)/p6(-) were, while 98.6% of TTF-(-)/p6(+) were. p6 expression was negatively correlated with TTF- (P<.). Conclusion TTF- and p6 might be effective bio-markers for and in NSCLC. They may be a useful marker panel for the identification and differential of lung cancer. Key words NSCLC; TTF-; p6; Immunohistochemistry 作者单位上海上海长海医院呼吸内科张鹏韩一平李强病理科黄玲马大烈通讯作者韩一平 yphan6@ yahoo.com.cn

一直是人们研采用免疫组化EnVision两步法主要试剂鼠抗人究的热点甲状腺转录因子 thyroid transcription factor-, TTF- p6蛋白单克隆抗体及envision二步法试剂盒均为 TTF- 是新近认识的对肺和甲状腺组织有特异性的标记丹麦DAKO公司产品切片经常规脱蜡至水用%过氧物被认为在肺癌中有高表达 [-] p6作为肿瘤抑制基

2 996 Chin J Lung Cancer, September 9, Vol., No.9 9年9月第卷第9期肺癌是目前全球男女性患者的头号癌症杀手其. 试剂与方法所有组织标本均经%中性福尔马林固发病率仍居高不下严重地威胁着人们的健康非小细定常规脱水后石蜡包埋连续切片-6张每张切片厚胞肺癌 non-small cell lung cancer, NSCLC 作为肺癌的主 μm 张HE染色核实组织病理学诊断其它用于免要组成部分如何进一步探索其生物学特征寻找特异疫组织化学染色性肿瘤标志物判断其恶性程度和预后一直是人们研采用免疫组化EnVision两步法主要试剂鼠抗人究的热点甲状腺转录因子 thyroid transcription factor-, TTF- p6蛋白单克隆抗体及envision二步法试剂盒均为 TTF- 是新近认识的对肺和甲状腺组织有特异性的标记丹麦DAKO公司产品切片经常规脱蜡至水用%过氧物被认为在肺癌中有高表达 [-] p6作为肿瘤抑制基化氢去除内源性过氧化物酶高温抗原修复 TTF- 因P家族的新成员在肿瘤的发生发展中起着重要作 p6蛋白免疫组织化学染色方法和步骤严格按envision二用 [,] 本文通过免疫组织化学方法观察二者在NSCLC 步法试剂盒说明书进行光镜下观察分别用PBS代替组织中的表达情况旨在评价其在NSCLC诊断和鉴别诊一抗作空白对照已知阳性切片做阳性对照断中的临床应用价值以及潜在的预后预示作用. 结果判定免疫组化切片分别由两位有经验的病理科医生阅片审核 TTF- p6蛋白均定位于细胞核呈棕黄色材料与方法颗粒以细胞核中出现棕黄色为阳性信号图高倍镜下选取个不同视野各计数个瘤细胞按阳性细胞所. 材料收集上海长海医院8年肺活检或手术切除原占百分率分为-至++ 未观察到阳性瘤细胞或阳性瘤细胞发性NSCLC组织标本8例所有病例均为病理切片HE <%为- 阳性细胞占%-%为+ 阳性细胞>%为++ 染色确诊的原发性NSCLC 采集病例相关的临床病理资. 统计学方法采用SPSS.统计软件处理以P<.为料包括年龄性别吸烟史 PS评分病理类型分有统计学意义 TTF- p6蛋白表达率与临床病理资料化程度肿瘤大小有无淋巴结转移及TNM分期最后的比较采用χ 检验各因素经单因素分析后 P<.的因资料完整并排除黏液型细支气管肺泡癌研究已表明此素进行非条件Logistic模型分析 TTF- p6蛋白表达之型肺腺癌TTF-蛋白无表达能进行统计学分析的病例间的比较采用Spearman相关分析共例同时取良性肺疾患 benign pulmonary disease, 结果 BPD 组织标本8例作为对照组 PS评分根据Zubrod-ECOG-WHO ZPS 法病理类型根据年WHO肺胸膜肿瘤诊断标准肿瘤分期按. 临床病理资料例NSCLC患者男女比例.: 年国际抗癌联盟TNM分期标准中位年龄6岁岁-8岁吸烟者占6.6% 初诊 A B 图肺癌细胞核中TTF- p6蛋白的表达 Envision二步法 Fig Expression of TTF-, p6 in lung cancer (Envision two-step method, ) A: Lung adenocarcinoma with TTF- positive expression; B: Lung squamous cell carcinoma with p6 positive expression.

3 9年9月第卷第9期 99 Chin J Lung Cancer, September 9, Vol., No.9 表 TTF-蛋白和p6蛋白在NSCLC及BPD中的表达 Tab The expession of TTF- and p6 in NSCLC and BPD Histology * TTF- p6 Positive Negative Positive Negative NSCLC A 6..8 LCC BPD 8 8 * for Adenocarcinoma, for squamous cell carcinoma, A for adenosquamous cell carcinoma, LCC for large cell carcinoma. 有症状者为8.% 主要表现为咳嗽咳痰咯血胸腺癌中TTF-蛋白阳性表达与其分化程度呈正相关关系痛发热等腺癌最多例 6.% 其次为鳞癌 P<. 随着肿瘤分化程度的增加其表达程度随之 8.9% 腺鳞癌.% 和大细胞癌.% 低分增加选出P<.的因素进行多因素Logistic分析得出病人化NSCLC共8例包括9例低分化腺癌和9例低分化鳞吸烟史回归系数-. P=. 及肿瘤病理类型回归癌肿瘤分期Ⅰ-Ⅱ期的有例 6.% Ⅲ-Ⅳ例系数-.6 P<. 为NSCLC中TTF-表达的影响因素 6.6% 病人确诊时肿瘤原发病灶> cm和有淋巴结和TTF-相反男性吸烟者p6蛋白阳性表达率明转移的分别占89.%和6.% 8例肺良性疾患包括肺错显高于女性不吸烟者 P<. 其表达与病人TNM 构瘤例炎性假瘤9例支气管扩张症例结核球例分期呈负相关分期越高表达率越低 P=. 而与. TTF-和p6在NSCLC组织中的阳性表达 TTF-蛋白阳肺鳞癌分化程度呈正相关随着肿瘤分化程度的增加而性颗粒定位于细胞核胞质和胞膜无染色如表所示在 NSCLC组织中总体阳性表达为.% 9/ 主要表达于肺腺癌图A 包括细支气管肺泡癌肺腺鳞癌中的腺癌成分而鳞状细胞癌和腺鳞癌中的鳞癌成分几乎未见阳性表达其对肺腺癌的诊断敏感性达8.% 明显高于肺鳞癌和大细胞癌 P<. 特异性高达89.8% BPD对照组中TTF-阳性表达仅见于正常细支气管和肺泡上皮而病灶部位以及基质细胞炎症浸润细胞均无表达 p6蛋白在nsclc组织中的阳性表达率为.9% / 绝大多数表达于肺鳞状细胞癌图B 腺鳞癌中鳞癌部分及部分腺癌中鳞状细胞分化也可见其阳性但几乎所有腺癌和大细胞癌均呈阴性表达仅例腺癌呈轻度阳性 p6蛋白在肺鳞癌中的诊断敏感性高达 9.% 特异性98.8% 在BPD对照组 p6表达均为阴性增加 P=.8 但和其他临床特征包括病人年龄 PS评分原发肿瘤大小及是否有淋巴结转移无关表选出 P<.的因素进行多因素Logistic分析得出病人吸烟史回归系数.8 P=. 及肿瘤病理类型回归系数. P<. 为NSCLC中p6表达的影响因素. TTF-和p6蛋白在NSCLC中的联合检测表可见表型为TTF-(+)/p6(-)的NSCLC共例以腺癌为多占 9.% TTF-(-)/p6(+)8例鳞癌占98.6% TTF-(-)/ p6(-)例 TTF-(+)/p6(+)仅为例 Spearman相关分析发现 NSCLC中TTF-的阳性表达与p6的阳性表达负相关 r=-., P<. 讨论 TTF-又称甲状腺特异性增强子结合蛋白是一种. TTF-和p6阳性表达与NSCLC临床病理特征的关系在甲状腺肺及间脑早期发育过程中表达的组织特异性临床资料分析显示女性不吸烟者TTF-蛋白表达率明转录因子分子量为8 KDa 由q染色体上基因编显升高 P<. 尤以不吸烟女性为著 P=. 码本研究中 TTF-蛋白在腺癌及腺鳞癌中的表达明显临床症状有无直接与TTF-蛋白表达相关无症状即PS 高于鳞癌及大细胞癌 TTF-蛋白在肺腺癌中多呈弥漫性为分者TTF-蛋白阳性表达高于PS 分者 P=. 瘤细胞核内染色阳性在腺鳞癌则主要见于具有腺样结但在年龄临床分期不同的病例间无明显差异并且与构的细胞与此同时癌旁正常肺组织的细支气管和肺泡患者原发肿瘤大小是否有淋巴结转移无相关性在上皮也有TTF-蛋白的表达但鳞癌大细胞癌对照组病

4 998 Chin J Lung Cancer, September 9, Vol., No.9 9年9月第卷第9期表 TTF-和p6在不同类型NSCLC中的表达以及与临床病理学参数的关系 Tab The relationship between expression of TTF- and p6, and clinicopathologic variables in NSCLC Characteristic TTF- Age p6 P.8 < Gender female male < Smoking < ever. 6.. Differentiation well poor well poor 9.8 Tumor size.6.9 cm > cm Nodal metastasis.8.8 no yes TNM I-II III-IV p6. 8. <.. <. never PS P <. 8 Well : well or moderately differentiated; Poor: poor differentiated. 灶及它们周围的基质细胞炎症浸润细胞却很少表达这表 TTF-和p6在NSCLC中的联合表达些都提示TTF-蛋白在支气管肺泡上皮来源的细胞中有较 Tab The combined expression of TTF- of P6 in NSCLC 高表达其在NSCLC中表达的差异可能与肿瘤的起源不 Phenotype 同有关与国外文献报道结果相符 Pathological type A LCC [,] 此外 TTF-蛋白在 8.%的肺腺癌中表达阳性在不吸烟的女性当中阳性表 TTF-+/p6-- 9 达明显增高而不吸烟女性是肺腺癌的好发人群进一步 TTF-+/p6+ 表明其对肺腺癌的特异性由于TTF-的组织特异性表达 TTF---/p TTF---/p6+ 近年来它已被用作原发性及转移性肺癌的鉴别诊断标志 6 物尤其是可以用来明确转移性腺癌是否为肺源性新 [6] [] 近Berghmans等对篇文献的meta分析发现在NSCLC 中TTF-蛋白的阳性表达与病人较好预后相关尤其是在

5 9年9月第卷第9期 999 Chin J Lung Cancer, September 9, Vol., No.9 [] 早期局部进展的肺癌和肺腺癌中 Tan等报道一组6 综上所述 NSCLC中TTF- p6分别对肺腺癌例NSCLC患者中TTF-阳性表达者中位生存期超过.个鳞癌有较强的提示作用可用来作为肺癌的生物学标记月而阴性表达者仅为9.个月认为TTF-可作为肺癌的物其联合应用有利于NSCLC的诊断及鉴别二者表达预后评估指标我们的结果也显示 TTF-蛋白在PS评分与病人预后的关系以及在肺癌发生发展中所起作用都分的患者阳性表达率明显高于PS 分的患者其阳性表达值得进一步深入研究程度也随着肺腺癌分化程度的增加而增加提示TTF-在参考文献肺癌发生发展过程中可能起到重要作用其表达的缺失可能引起肿瘤侵袭性增强从而影响病人预后其确切的机制尚不明了但多因素分析显示 TTF-的表达仅与无吸烟史或腺癌病人正相关本组病人也在密切随访中以进一步探讨TTF-１与生存预后的关系 immunostaining in classification of lung carcinomas. Appl Immunohistochem Mol Morphol,, (): -. throughput tissue microarray and immunohistochemistry study. Hum 中广泛而有选择性的表达包括表皮宫颈泌尿道及前细胞我们实验中p6蛋白在9.%的鳞癌组织中表达腺癌中仅例轻度阳性表达特异性高达98.8% 这与余永 Pathol,, (6): 9-6. 表达明显增强与腺癌大细胞癌小细胞癌相比增多相关表明p6与肺癌的发生发展关系密切并可能对病, (): -. 6 导致侵袭转移相关基因的上调 Massion等的研究表明 Lung Cancer,, (): 9-. Berghmans T, Paesmans M, Mascaux C, et al. Thyroid transcription factor -a new prognostic factor in lung cancer: a meta-analysis. Ann Oncol, 6, (): Yu YW, Garber ME, Schlüns K, et al. Evaluation of p6 expression in lung cancer by use of complementary DNA and tissue microarray. Zhonghua p6基因在肺癌发生的早期扩增 p6过表达的肺癌病人预 Bing Li Xue Za Zhi,, (): -. [余永伟, Mitchell E Garber, 后较好其相关机制值得进一步的深入研究 Karsten Schlüns, 等. p6基因在肺癌组织中的表达. 中华病理学杂志, 本文结果可见 NSCLC中TTF-蛋白对腺癌有较高特异性其表达阳性对腺癌的敏感性为8.% 特异性 Chang YL, Lee YC, Liao WY, et al. The utility and limitation of thyroid transcription factor- protein in primary and metastatic pulmonary neoplasms. [9] 人预后有提示作用 Barbieri等发现内源性p6的丢失可 [] Au NH, Gown AM, Cheang M, et al. p6 expression in lung carcinoma: a tissue microarray study of 8 cases. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 在吸烟或鳞癌病人中明显增高值得提出的是 p6蛋白的表达与肺癌的分化程度呈正相关而与病人临床分期呈负 Uramoto H, Sugio K, Oyama T, et al. Expression of the P family in lung cancer. Anticancer Res, 6, 6(A): 8-9. 倍以上的结果相一致本研究中P6蛋白的表达与病人的性别是否吸烟密切相关多因素分析也显示p6的表达 Stenhouse G, Fyfe N, King G, et al. Thyroid transcription factor in pulmonary adenocarcinoma. J Clin Pathol,, (): 8-8. [8] 伟等报道p6蛋白mRNA转录因子在肺鳞状细胞癌标本 Tan D, Li Q, Deeb G, et al. Thyroid transcription factor- expression prevalence and its clinical implications in non-small cell lung cancer: a high- p6基因定位于人类染色体第q-9 在人和鼠组织列腺等具有鳞状上皮分化潜在能力的基底细胞和旁基层 Kargi A, Gurel D, Tuna B. The diagnostic value of TTF-, CK/6, and p6, (): -.] 9 Barbieri CE, Tang LJ, Brown KA, et al. Loss of p6 leads to increased cell 为89.8% 而p6蛋白对鳞癌的敏感性和特异性分别高达 migration and up-regulation of genes involved in invasion and metastasis. 9.%和98.8% 表明TTF- p6分别对肺腺癌鳞癌有 Cancer Res, 6, 66(): 较高的临床诊断价值由于TTF-蛋白与p6蛋白的表达 amplification and overexpression in lung cancer development and prognosis. 与肿瘤组织来源联系密切当两者联合检测时 8.% 的肺腺癌在TTF-蛋白表达阳性的同时为p6蛋白阴性 Massion PP, Taflan PM, Jamshedur Rahman SM, et al. Significance of p6 Cancer Res,, 6(): -. Wu M, Wang B, Gil J, et al. p6 and TTF- immunostaining, a useful marker 而9.%的肺鳞癌在p6蛋白阳性的同时TTF-蛋白为阴 panel for distinguishing small cell carcinoma of lung from poorly differenti- 性显示 TTF-(+)/p6(-)和TTF-(-)/p6(+)两种表型在 ated squamous cell carcinoma of lung. Am J Clin Pathol,, 9(): NSCLC中分别对肺腺癌及肺鳞癌有极大的提示作用有利于二者的诊断与鉴别还有研究显示TTF-与p6联用有助于区分小细胞肺癌和低分化肺鳞癌尤其是在标本量少分化程度差时 [,] 但我们同时也应注意到 Kalhor N, Zander DS, Liu J. TTF- and p6 for distinguishing pulmonary small-cell carcinoma from poorly differentiated squamous cell carcinoma in previously pap-stained cytologic material. Mod Pathol, 6, 9(8): -. 虽然二者联合特异性很高但仍有假阴性和假阳性的存在腺癌中TTF-阴性表达占.9% 因而在临床应用过程中仍应综合细胞形态学等多方面因素进行诊断 [] 收稿 9-- 修回 9--9 本文编辑李博

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