270 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2012 年 11 月第 2 卷第 4 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Nov 2012,Vol.2, No.4 Key words Peripheral blood; Natural kill

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1 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2012 年 11 月第 2 卷第 4 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Nov 2012,Vol.2, No 自然杀伤细胞分离 培养方法的建立 实验研究 建立自然杀伤细胞 (NK) 的分离 培养方法, 并检测其杀伤活性 抽取健康人外周血 20 ml, 采用淋巴分离液分离单个核细胞, 再用苯丙氨酸甲酯 (PME) 去 除单核巨噬细胞 B 细胞, 从而纯化单个核细胞 培养 3 ~ 5 h, 收集黏附于培养板底部表 面的细胞 ( 即 A-NK 细胞 ), 重新培养 2 周 实验过程中用显微镜观察细胞形态, 用流式细 胞术检测标志性抗原, 用 MTT 法检测杀伤率 单个核细胞在诱导的第 3 天开始出 现集落, 第 7 天时集落达到高峰 流式细胞术检测第 7 天的表面抗原,CD3 - 为 96.5 %, CD3 - 和 CD56 + 双阳性的占 31 % MTT 法检测诱导培养的第 1 天和第 4 天的 杀伤率, 效靶比在 20:1 时杀伤率最高分别是 (58.86 ± 4.12) %和 (54.42 ± 3.02) % ; 当检测 第 7 天, 效靶比在 5:1 时杀伤率最高 (46.71 ± 3.41) % ; 第 10 天, 效靶比在 10:1 时杀伤率最 高 (63.27 ± 3.18) % ; 检测第 14 天, 效靶比在 5:1 的情况下, 杀伤率是最高 (72.63 ± 2.65) % 本实验室通过贴壁和诱导的方法可以快速获得纯度高 杀伤活性强的 NK 细胞 外周血 ; 自然杀伤细胞 ; 纯化 The establishment of isolation and culture of NK cell ZHU Xiang-qing, LIU Ling, WU Qiong, CHEN Cui-zhu, LEI Li, WANG Qiang, MA Li-hua, PANG Rong-qing, ZHAO Jing, HE Jie, ZHANG Xiao-xiao, RUAN Guang-ping, PAN Xing-hua. The Research Center of Stem Cell, Tissue and Organ Engineering of Kunming General Hospital of Chinese People s Liberation Army, Kunming , China Corresponding author: PAN Xing-hua, xinghuapan@yahoo.com.cn Abstract Objective To establish the technique of isolation and culture of NK cell and investigate the anti-cell activity. Method We collected 20 ml of the peripheral blood of health adult, isolated single nucleus cell with lymphocyte separation medium and treated them with L-phenylalanine to remove mononuclear-macrophages and B cells. Monocyte cells were isolated. After 3-5h incubation, cells that adhered to the surface of plastic (A-NK cells) were harvested and incubated for additional 2 weeks. During the experiment, microscope was used to observe cellmorhpology. Cell marker antigen was detected with flow cytometry and the cytotoxic ability was examined with MTT. Results The cell colony appeared at the 3rd day and the number of colony peaked the 7th day. The percentage of CD3 - cell was 96.5 %. Of the CD3- cells, 31 % were CD16 + and CD56 +. The cytotoxicity index was highest when the ratio of target cells to effector cells was 20:1 at the first day (58.86 ± 4.12 ) % and fourth day(54.42 ± 3.02) %. The cytotoxicity index was highest at the 7th (46.71 ± 3.41) %, 10th day(63.27 ± 3.18) % and 14th (72.63 ± 2.65) % when the ratio of target cells to effector cells was 5:1, 10:1 and 5:1 respectively. Conclusion By combination of adherent culture and induction method, highly cytotoxic NK cell can be quickly obtained with high purity. DOI: /cma.j.issn 作者单位 : 昆明, 昆明总医院干细胞与组织工程研究中心 ( 朱向情 吴琼 陈翠竹 雷力 王强 马丽华 庞荣清 赵晶 何洁 张晓晓 阮光萍 潘兴华 ), 检验科 ( 刘凌 ) 通讯作者 : 潘兴华, xinghuapan@yahoo.com.cn

2 270 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2012 年 11 月第 2 卷第 4 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Nov 2012,Vol.2, No.4 Key words Peripheral blood; Natural killer cell; Purify 自然杀伤细胞 (natural killer cells,nk) 是 指一类无需预先致敏就可以杀伤某些血液系统 肿瘤和变异转化细胞的细胞类群 NK 细胞是机 体先天获得性免疫系统重要的组成细胞之一, 因 其杀伤靶细胞无需致敏, 可以在免疫应答早期发 挥作用 ; 同时 NK 细胞免疫应答的早期还能释放 多种趋化因子和细胞因子, 调节机体的特异性免 疫应答 因此 NK 细胞对肿瘤的治疗比较理想, 但是人体内 NK 细胞的数量很少, 只占外周血的 5 % ~ 10 %, 需要体外扩增到一定的数量后, 才能 进行治疗 本实验的目的是建立一种简单 高效 获得 NK 细胞的方法 一 材料 RPMI 1640( 美国 GIBCO 公司 ), 淋巴细胞 分离液 ( 上海荣盛生物试剂厂 ), 双抗 :100 万 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素 ( 华北制药厂 ),ril-2 10 万 U/ml( 昆明总医院制剂室生产 ), 苯丙氨酸 甲酯 (L-Phenylalanine methylamine ester,pme, 美 国 Sigma 公司 ) 二 方法 ( 一 ) 单个核细胞的分离 取健康人外周血 10 ml, 枸橼酸盐抗凝 无 菌室内, 转入 50 ml 离心管中, 加入 40 ml 生理 盐水, 混匀,2000 g 离心 3 min 除去上清, 加入 生理盐水至 50 ml, 重悬 将细胞悬液平均分配 至两支加有 20 ml 淋巴细胞分离液的离心管中, 2000 g 离心 20 min 吸取以单个核细胞为主的 白色云雾层至另一离心管中, 加入适量的生理盐 水,2000 g 离心 3 min 除去淋巴细胞分离液 ( 二 )NK 细胞的分离方法和培养扩增 1.NK 细胞的分离方法 : 采用 PME 法 因 PME 可进入细胞内, 代谢生成苯丙氨酸进入溶酶 体内, 降低溶酶体内渗透压, 使溶酶体破裂, 释放 出酶使细胞溶解, 从而有效去除富含溶酶体的单 个核巨噬细胞 B 细胞等, 但同时不改变淋巴细胞 的表型和细胞毒性 利用 PME 这一特性, 将分 离得到的单个核细胞, 用 5 mmol/l PME 室温处 理 40 min, 并轻轻的震荡 然后用生理盐水洗涤 2 次,1800 g 离心 3 min 2.NK 细胞的培养扩增 : 将 PME 处理后的单 个核细胞, 加入 RPMI 1640 完全培养基 [ 含 10 % 小牛血清 ph = 7.2], 在塑料培养瓶和 6 孔板中 分别加入 10 ml 和 2 ml, 每组加 rhil-2(6000 U/ ml) 并调整细胞浓度为 /ml 培养 3 ~ 5 h, 移去未黏附细胞的悬液, 收集黏附于板底表面的 细胞, 调成细胞浓度为 /ml, 同时补充 IL-2, 细胞终浓度为 6000 U/ml, 继续培养, 每 3 d 换液 1 次 ( 三 )NK 细胞活性的检测 1. 流式细胞术检测 : 取单细胞悬液于流式管 中, 加 1 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer, PBS) 4ml 1800 g 离心 5 min, 弃上清, 重复 3 次, 调节 细胞浓度为约 个 /100 μl; 加抗体 (CD16, CD56,CD3), 轻轻吹打混匀,4 避光孵育 30 min; 加 1 PBS 4 ml 1800 g 离心 5 min, 弃 上清, 重复 3 次, 加 500 μl 1 PBS, 轻轻吹打混匀 ; 上机检测 2. 四甲基偶氮唑盐 (MTT) 比色法 : 用 MTT 法检测 NK 细胞的杀伤活性 在培养的第 天分别取细胞, 充分洗涤, 以 /ml 的浓度将效应细胞和靶细胞 (A549) 加于 96 孔 板 ( 均为 3 个复孔 ) 中, 孵育 48 h 后, 加入 MTT 10 μl/ 孔,4 h 后离心弃上清, 加 500 ml/l 无水乙醇 和 500 g/l 二甲基亚砜混合液 200 μl/ 孔, 充分吹 打 混匀, 在酶标仪上读取 A 450nm 值, 并按下列公 式计算 NK 细胞的杀伤率 杀伤率 ( % ) = {1 - [ 杀伤孔的 A 值 - 效应孔 的 A 值 ] / 靶细胞孔的 A 值 } 100 % ( 四 ) 统计学分析方法 采用 SPSS17.0 软件进行统计学分析,NK 细 胞表面 CD16 CD56 CD3 的表达率用相对数表 示, 不同时间 NK 细胞杀伤率用 x ± s 不同效靶浓 度组间及不同培养时间 NK 细胞的杀伤率比较采 用随机区组方差分析, 以 P < 0.05 有统计学意义 一 NK 细胞的形态学观察 NK 细胞 3 ~ 5 h 开始贴壁, 贴壁后, 将悬浮细

3 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2012 年 11 月第 2 卷第 4 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Nov 2012,Vol.2, No 注 : 图 a 为培养 1 天时细胞形态 ; 图 b 为培养 3 天时细胞形态 ; 图 c 为培养 7 天时细胞形态 NK 细胞 3~5h 开始贴壁, 贴壁后, 将悬浮细胞弃掉, 重悬 NK 细胞 在 IL-2 的刺激下第 3 天开始增殖, 出现集落, 第七天的时候集落最多 奥林巴斯相差显微镜下观察 NK 细胞形态 ( 100) 胞弃掉, 重悬 NK 细胞 在 IL-2 的刺激下第 3 天 开始增殖, 出现集落, 第 7 天时集落最多 ( 图 1) 二 流式细胞术检测 NK 细胞表面抗原 收集培养 7 d 的 NK 细胞, 调整细胞浓度为 /ml 用流式细胞检测仪检测细胞表面 CD16,CD56,CD3 的表达率, 以确定 NK 细胞的 纯度 结果 CD3 - 表达率为 96.5 %,CD3 + 表达率 为 3.1 %,CD16 + 和 CD56 + 表达率为 31.0 %( 图 2) 下, 杀伤性是最差的 ; 当诱导培养到第 7 天的时候, 开始发生变化, 随着效靶比的比率增高, 杀伤性反而降低 ; 诱导培养的第 10 天, 效靶比在 10:1 的浓度下, 杀伤性最好 ; 诱导培养的第 14 天, 效靶比在 5:1 的情况下, 杀伤率是最好的 ( 表 1) 注 : 图 a 为诱导培养 7 天的单个核细胞中 CD %, CD %; 图 b 为其中 CD3 - 和 CD56 + 双阳性的比例是 31.0 % 诱导培养 7d 后单个核细胞中 CD3 + 与 CD3 - 流式细胞术检测结果 三 MTT 法检测 NK 细胞的杀伤活性 本实验检测了 5 个时间点 ( 第 1,4,7,14 天 ), 3 个效靶浓度比 (5:1 10:1 20:1)( 图 3) 从图中 可以看出, 第 1 天和第 4 天, 效靶比为 20:1 的情 况下, 杀伤性是最好的, 而效靶比在 10:1 的情况 注 : 收集第 7 天的 NK 细胞 /ml 用流式细胞检测仪检测细胞表面抗原 CD16 +,CD56 +,CD3 - 的表达率来确定 NK 细胞的数量 诱导培养的单个核细胞中 CD %,CD %, 其中 CD3 - 和 CD56 + 双阳性的比例是 31.0 % 不同时间不同效靶浓度的杀伤率 NK 细胞在感染性疾病中的研究取得了很大 的成果 Fortis 等 [1] 报道了 NK 细胞与 HIV-1 和 人 T 细胞白血病病毒的相互作用 还有研究报道 : 发现抗鼠巨细胞病毒需要 MHC 样糖蛋白活化

4 272 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) 2012 年 11 月第 2 卷第 4 期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Nov 2012,Vol.2, No.4 培养不同时间 NK 细胞的杀伤率 (%,x ± s) 效靶浓度比例数第 1 天第 4 天第 7 天第 10 天第 14 天 F 值 P 值 5: ± ± ± ± ± : ± ± ± ± ± : ± ± ± ± ± F 值 P 值 Ly49H, 阐明了不同种系小鼠对 CMV 敏感性不同 的可能原因 NK 细胞的激活大多是细胞因子或 趋化因子介导的间接作用, 而不是直接的 NK 受 体的作用, 所以对于利什曼病 NK 细胞主要是通 过细胞因子起作用的 ; 另外,NK 细胞还参与锥虫 病 鼠弓形体 疟原虫等早期感染的防御 [2-4] 研 究者们还利用高时间分辨膜电容测定和荧光成像 技术发现 NK 细胞产生分泌性溶酶体, 在对抗肿 瘤 抗病毒和细胞介导的异体移植排斥反应中发 挥重要的防御作用 [5] NK 细胞作为机体固有免疫的重要组成部分 是机体抗肿瘤 抗感染的第一道天然防线 随着 对 NK 细胞生物功能及活化机制的了解,NK 细 胞在造血干细胞 / 骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过 继免疫治疗方面的作用倍受关注 最近在异基因 造血干细胞移植中发现供者异源反应性 NK 细胞 可以发挥移植物抗白血病效应, 并减少移植物抗 宿主病的发生, 故输注供者异源反应性 NK 细胞 已经成为临床移植辅助治疗的新策略 [6-7] 本研究用淋巴分离液的方法从外周血分离 得到单个核细胞, 用 PME 处理除去单个核巨噬细 胞和 B 细胞, 得到较为纯化的 NK 细胞, 用 IL-2 诱导的方法, 纯化 NK 细胞 实验结果显示 :(1) 光镜显微镜下, 细胞在诱导的第 3 天开始出现细 胞集落, 第 7 天时, 细胞的集落最多 ;(2) 流式 细胞术的检测结果, 表明细胞在诱导的第 7 天, CD3 - 为 90.5 %,CD15 + CD56 + 为 31 % ;(3)MTT 检测结果显示, 单个核细胞在诱导培养的第 1 天 和第 4 天, 效靶比为 20:1 的情况下, 杀伤性是最 好的, 而效靶比在 10:1 的情况下, 杀伤性是最差的, 当诱导培养到第 7 天的时候, 开始发生变化, 随着效靶比的比率增高, 杀伤性反而降低, 诱导培养的第 10 天, 效靶比在 10:1 的浓度下, 杀伤性好, 诱导培养的第 14 天, 效靶比在 5:1 的情况下, 杀伤率是最好的 实验结果表明 : 本研究在用 NK 细胞治疗患者的时候应该选择诱导培养了 7 d 的细胞, 因为这时候的细胞首先扩增的数量是最多的, 其次杀伤性是最强的, 最后就是少量的细胞就能够达到一定的疗效 本实验为 NK 细胞应用于临床提供了理论依据 1 Fortis C, Tasca S, Capiluppi B, et al. Natural killer cell function in HIV-1 infected patients[j]. J Biol Regul Homeost Agents, 2002,16(1): Une C, Andersson J, Eloranta ML, et al. Enhancement of natural killer(nk) cell cytotoxicity and induction of NK cell-derived interferon-gamma (IFN-gamma) display different kinetics during experimental infection with Trypanosoma cruzi [J]. Clin Exp Immunol, 2000,121(3): SherA, Collazzo C, Scanga C, et al. Induction and regulation of IL-12-dependent host resistance to Toxop lasma gondii [J]. Immunol Res, 2003,27 (2-3): Stevenson MM, Su Z, Sam H, et al. Modulation of host responses to blood-stage malaria by interleukin-12: from therapy to adjuvant activity [J]. Microbes Infect, 2001,3(1):49-59.

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