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30 with the detection by ELSD. RESULTS The results showed that the chromatographic fingerprint was completed with 10 recognizable peaks, of which 8 peaks kaempferol-3-o-β-d (trilinolein, 1,2-linolein-3-olein, 1,2-linolein-3-palmitin, 1,2-olein-3- linolein, 1-palmitin-2-olein-3-linolein, triolein, 1,2-olein-3-palmitin and 1,2-olein-3-stearin) were determined. The linear range of triolein was 0.613 2 18.40 µg(r=0.998 9), the average recovery was 104.1%(RSD=1.8%). CONCLUSION The combination of specific chromatograms and determination of triolein is suitable for use in the quality control of Ganoderma lucidum spore. KEY WORDS: Ganoderma lucidum spore; triolein; fingerprint; HPLC 灵芝孢子粉为多孔菌科真菌赤芝 Ganoderma lucidum (Leyss.ex Franch.) Karst. 的干燥成熟孢子, 灵芝弹射孢子时采收, 具补气安神 健脾益肺作用, 用于调节免疫 抗肿瘤 调节血脂 降低血糖 调节神经系统及心血管系统等 [1-5] 新修订的灵芝孢子粉质量标准新增了杂质 水分 总灰分 重金属有害元素 破比率 过氧化值 微生物限度 指纹图谱等检查项目以及三油酸甘油酯和多糖含量测定等项目, 对灵芝孢子粉的真伪 品质 安全性等方面进行了全面的控制 一般认为灵芝孢子油的临床作用与其含有丰富的不饱和脂肪酸特别是油酸 亚油酸有密切的关系 [6] 油脂类成分具有抗肿瘤活性且含量高, 可作为灵芝孢子粉质量控制的指标性成分 [7-8] [8] 周晓宏等采用高效液相色谱蒸发光散射检测法 (HPLC-ELSD) 测定了灵 [9] 芝孢子油中三油酸甘油酯的含量, 秦臻等采用气相色谱法建立了破壁灵芝孢子粉中油酸和亚油酸的含量测定方法, 但缺乏对灵芝孢子粉进行真伪鉴别的手段, 且对灵芝孢子粉的指纹图谱研究鲜有报道 本实验在分析灵芝孢子粉油脂类成分的基础上, 采用 HPLC-ELSD 对该类成分进行指纹图谱研究, 对其中的特征峰进行指认, 同时控制指纹图谱中三油酸甘油酯的含量 1 仪器与试药 Agilent 1200 系列高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent 公司, 配备 G1322A 在线脱气机 G1311A 四元泵 G1329A 自动进样仪 G1316A 柱温箱 Chemstation 色谱工作站 );AG285 电子天平 ( 瑞士 METTLER TOLEDO);2000ES 蒸发光散射检测器 (Alltech); 数显式电热恒温水浴锅 ( 上海跃进医疗器械厂 ) 乙腈 (MERCK 公司, 色谱纯 ) ; 异丙醇 (MERCK 公司, 色谱纯 ); 试验用水为 Milli-Q 系统制备 ( 电阻率 18.2 MΩ.cm@25 ) 对照品 : 三亚油酸甘油酯 [Trilinolein(9c,12c), 批号 :K 259:1] 1,2- 二亚油酸 -3- 油酸甘油酯 [1,2- linolein-3-olein(rac), 批号 :J 239:5] 1,2- 二亚油酸 -3- 棕榈酸甘油酯 [1,2-linolein-3-palmitin(rac), 批号 :O 115:1] 1,2- 二油酸 -3- 亚油酸甘油酯 [1,2- olein-3-linolein(rac), 批号 :M 283:9] 1- 棕榈酸 -2- 油酸 -3- 亚油酸甘油酯 [1-palmitin-2-olein-3- linolein(rac), 批号 :L 356:11] 三油酸甘油酯 [Triolein(9c), 批号 :K 079:2] 1,2- 二油酸 -3- 棕榈酸甘油酯 [1,2-olein-3-palmitin, 批号 :N 256:8] 和 1,2- 二油酸 -3- 硬脂酸甘油酯 [1,2-olein- 3-stearin(rac), 批号 :J 139:5] 均购于 LarodanAB 公司 样品 : 灵芝孢子粉样品共 20 批,7 批破壁灵芝孢子粉由金华某中药饮片有限公司提供, 批号分别为 20120401 20120402 20120403 20150404 20120405 12121301 12121303, 对应表 1 中样品编号 S1~S7 其余 13 批购于市面上各种品牌灵芝孢子粉饮片 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱 :ACCHROM Unitary-C 18 (250 mm 4.6 mm,5 μm); 流动相 : 乙腈 - 异丙醇 (51 49), 等度洗脱 ; 流速 :1.0 ml min 1 ; 柱温 :30 ; 蒸发光散射检测器条件 : 漂移管温度 105, 载气流速 2.0 L min 1 2.2 混合对照品溶液制备精密称取各对照品, 加乙腈 - 异丙醇 (51 49) 溶液制成含三亚油酸甘油酯 1,2- 二亚油酸 -3- 油酸甘油酯 1,2- 二亚油酸 -3- 棕榈酸甘油酯 1,2- 二油酸 -3- 亚油酸甘油酯 1- 棕榈酸 -2- 油酸 -3- 亚油酸甘油酯 三油酸甘油酯 1,2- 二油酸 -3- 棕榈酸甘油酯 1,2- 二油酸 -3- 硬脂酸甘油酯浓度分别为 28.70, 146.8, 50.75, 279.6, 242.1, 613.2, 341.6, 69.15 μg ml 1 的混合对照品溶液 2.3 供试品溶液的制备精密称取灵芝孢子粉 0.4 g, 置具塞锥形瓶中, 精密加入乙腈 - 异丙醇 (51 49) 溶液 25 ml, 称定重 800 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 June, Vol.33 No.6 中国现代应用药学 2016 年 6 月第 33 卷第 6 期
量, 水浴回流提取 60 min, 放冷, 用乙腈 - 异丙醇 (51 49) 溶液补足减失的重量, 滤过, 取续滤液, 即得 2.4 定量分析 2.4.1 标准曲线分别精密吸取三油酸甘油酯对照品溶液 (613.2 µg ml 1 )1,5,10,20,25,30 µl, 注入液相色谱仪, 测定峰面积, 以进样量 (mg) 的对数 (X) 为横坐标, 峰面积的对数 (Y) 为纵坐标, 绘制标准曲线, 并以最小二乘法计算得回归方程, 结果显示, 三油酸甘油酯在 0.613 2~18.40 µg 内与峰面积呈良好的线性关系 2.4.2 仪器精密度试验取对照品溶液, 按 2.1 项下色谱条件, 重复进样 6 次, 测定峰面积, 结果 RSD<2.0% 表明仪器精密度良好 2.4.3 重复性试验取同一批号灵芝孢子粉样品 6 份, 按 2.3 项下方法制备并测定峰面积, 结果三油酸甘油酯平均含量为 57.03 mg g 1,RSD 为 4.6% 2.4.4 回收率试验采用加样回收法, 取已知含量的样品 6 份, 精密加入对照品溶液适量, 按 2.3 项下方法制备供试品溶液, 分别测定供试品中三油酸甘油酯的含量, 计算回收率, 结果平均回收率为 104.1%,RSD 为 1.8%, 说明本法的回收率良好 2.4.5 稳定性试验按 2.3 项下方法制备供试品溶液, 按 2.1 项下色谱条件, 分别在 0,5.5, 9,12.5,49 h 时注入液相色谱仪, 记录峰面积, 结果显示三油酸甘油酯峰面积 RSD 为 4.0%, 表明供试品溶液室温放置 49 h 稳定 2.4.6 样品测定结果用本实验建立的 HPLC, 测定不同生产企业灵芝孢子粉中三油酸甘油酯的含量, 结果见表 1 2.5 指纹图谱分析灵芝孢子粉三油酸甘油酯含量测定和特征图谱采用相同的前处理条件和色谱系统 2.5.1 精密度试验按 2.3 项下方法制备供试品溶液 1 份, 连续进样 5 次, 记录色谱图, 并按国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其相似度进行评价, 选取 10 个峰作为 Mark 峰, 以 Mark 峰模式进行相似度计算, 结果相似度均为 1.000, 说明该方法精密度良好 表 1 20 批样品测定结果 Tab. 1 The results of 20 samples 样品编号 甘油三油酸酯 / mg g 1 相似度 样品编号 甘油三油酸酯 / mg g 1 相似度 S1 65.6 1.000 S11 30.9 0.948 S2 66.2 1.000 S12 56.5 0.999 S3 66.7 1.000 S13 63.6 0.999 S4 67.7 1.000 S14 60.6 0.999 S5 67.8 1.000 S15 79.0 1.000 S6 66.1 0.999 S16 74.0 0.995 S7 67.2 0.999 S17 76.8 0.999 S8 61.7 0.996 S18 71.7 0.998 S9 42.0 0.999 S19 63.0 0.999 S10 52.0 0.997 S20 71.8 0.999 2.5.2 重复性试验精密称取灵芝孢子粉 6 份, 按 2.3 项下方法制备供试品溶液, 按 2.1 项下色谱条件测定, 记录色谱图, 并按国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其相似度进行评价, 以 Mark 峰模式进行相似度计算, 相似度均为 1.000, 结果表明本法具有较好的重复性 2.5.3 稳定性试验制备灵芝孢子粉供试品溶液 1 份, 分别在 0,5.5,9,12.5,49 h 时注入液相色谱仪, 记录色谱图, 并按国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其相似度进行评价, 与生成的对照色谱图比较, 结果表明供试品溶液在 49 h 内稳定 2.5.4 共有峰的确定和色谱峰的指认 20 批样品色谱图见图 1, 分析比较各批样品的色谱峰, 10 个峰为各样品所共有 采用对照品对照法对色谱峰进行指认, 其中 1,2,3,4,5,6,7,9 号峰分别是三亚油酸甘油酯 二亚油酸油酸甘油酯 二亚油酸棕榈酸甘油酯 二油酸亚油酸甘油酯 棕榈酸油酸亚油酸甘油酯 三油酸甘油酯 二油酸棕榈酸甘油酯 二油酸硬脂酸甘油酯, 见图 2 2.5.5 相似度测定以 10 批灵芝孢子粉样品的色谱特征图谱为基础, 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件建立共有模式, 计算 20 批样品与共有模式间的相似度, 结果见表 1, 色谱图见图 1 中国现代应用药学 2016 年 6 月第 33 卷第 6 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 June, Vol.33 No.6 801
图 1 灵芝孢子粉样品色谱图 Fig. 1 HPLC chromatograms of Ganoderma lucidum spore powder samples 图 2 对照品和供试品的 HPLC-ELSD 色谱图 A 对照品溶液 ;B 灵芝孢子粉样品 ;1 三亚油酸甘油酯 ;2 1,2- 二亚 油酸 -3- 油酸甘油酯 ;3 1,2- 二亚油酸 -3- 棕榈酸甘油酯 ;4 1,2- 二油酸 -3- 亚油酸甘油酯 ;5 1- 棕榈酸 -2- 油酸 -3- 亚油酸甘油酯 ;6 三油酸甘 油酯 ;7 1,2- 二油酸 -3- 棕榈酸甘油酯 ;9 1,2- 二油酸 -3- 硬脂酸甘油酯 Fig. 2 Representative HPLC-ELSD chromatograms of reference substance and samples A reference substance; B sample of Ganoderma lucidum spore powder; 1 Trilinolein; 2 1,2-linolein-3-olein; 3 1,2-linolein-3-palmitin; 4 1,2- olein-3-linolein; 5 1-palmitin-2-olein-3-linolein; 6 triolein; 7 1,2-olein- 3-palmitin; 9 1,2-olein-3-stearin. 3 讨论 本研究比较了石油醚 (60~90 ) 乙腈 - 异丙醇 (51 49) 不同提取溶剂以及不同提取时间对含量 的影响, 结果显示采用乙腈 - 异丙醇 (51 49) 溶液 回流提取 6 min 含量最高 比较了不同柱温 (25,30 和 35 ) 不同色谱 柱 (Agilent Zorbax SB-C 18 Kromasil C 18 ACCHROM Unitary-C 18 ) 不同色谱仪 (Agilent 和 Shimadzu) 对含量和指纹图谱的影响, 结果显示实 验条件对色谱峰的分离和油脂类成分的含量影响较小, 表明本方法耐用性良好 对所收集的 20 批灵芝孢子粉中三油酸甘油酯含量测定结果显示, 大部分批次含量在 60~ 80 mg g 1 之间,4 批次含量稍低, 推测与破壁工艺中孢子油的损失或孢子质量相关 样品相似度检测结果显示, 除 1 批相似度为 0.95 外, 其他不同生产企业产品间的相似度可达 0.99, 说明灵芝孢子粉成分一致性较好 本实验建立的特征图谱具专属性, 联合三油酸甘油酯含量测定, 可用于灵芝孢子粉的真伪鉴别及质量控制 REFERENCES [1] 唐柳, 张志军, 魏雪生, 等. 灵芝孢子粉药理作用研究进展 [J]. 天津农业科学, 2011, 17(3): 25-28. [2] TONG G H, MA L, WANG H M. Studies of G. lucidum spores powcder on the immunoregulation and antiradiation [J]. Chin J Food Hygiene, 2004, 16(2): 132-134. 和 802 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 June, Vol.33 No.6 中国现代应用药学 2016 年 6 月第 33 卷第 6 期
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